斜带石斑鱼瘦素Leptin A蛋白表达纯化的方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了斜带石斑鱼瘦素Leptin A蛋白表达纯化的方法及其应用，瘦素蛋白Leptin A表达纯化的方法是将斜带石斑鱼瘦素Leptin A的编码基因克隆至表达载体，得到重组表达质粒，转化大肠杆菌，培养转化的大肠杆菌，经诱导后收集菌体，纯化、酶切，得到斜带石斑鱼瘦素Leptin A。本发明斜带石斑鱼瘦素Leptin A能够影响斜带石斑鱼下丘脑细胞的NPY和AgRP1基因的表达，上调垂体细胞中促性腺激素LH-β的表达，丰富了鱼类瘦素系统信号通路的理论，并可以用于制备鱼类新型催产剂，具有诱导鱼类生殖调控基因表达的作用。
【专利说明】斜带石斑鱼瘦素Leptin A蛋白表达纯化的方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程【技术领域】，具体涉及一种斜带石斑鱼瘦素LeptinA的蛋白表达纯化的方法及其应用。
【背景技术】
[0002]瘦素(Leptin)是一种由肥胖基因(Obese gene)编码的分泌型蛋白质,通过受体介导，作用于靶组织，抑制食欲并参与调节能量代谢、神经内分泌和免疫反应等多种生理功能。瘦素基因蛋白LeptinA由161个氨基酸残基组成，N端为20/21个氨基酸残基的信号肽，第21位的丙氨酸为酶的水解位点，瘦素基因蛋白在分泌入血的过程中，去除其信号肽形成瘦素。成熟瘦素含141个氨基酸，分子量约16kDa，具有强亲水性，单链、链内的二个半胱氨基酸残基构成一个二硫键，是保持其稳定性和生物活性的关键部位。
[0003]瘦素具备激素的许多共同特征，由分泌器官分泌入血，前体带有信号肽，作用于下丘脑具有昼夜节律(晚上分泌多，白天分泌少)，脉冲性分泌等。瘦素只有在游离状态下才具有活性，瘦素主要作用于中枢和外周两个部分，影响机体的代谢。瘦素与神经内分泌系统之间形成了一个双向闭合环路，一方面瘦素作用于下丘脑、胰腺、甲状腺、肾上腺和性腺?’另一方面，又接受这些神经内分泌器官的负反馈调节，发挥其调节机体能量代谢的生理功能。
[0004]由于L印tin的受体存在于多种组织上，瘦素可在生殖轴的不同水平对生殖活动予以调节，这些发现说明，瘦素与机体的生长发育和生殖有密切的关系。Leptin除具有调控动物机体能量代谢平衡、脂肪的沉积和体重的生物学作用外，对动物初情期的启动和正常发情周期的维持生殖器官和生殖腺的发育也具有非常重要的调节作用。
[0005]瘦素还可通过与下丘脑神经肽(NPY)神经元上受体结合而调控GnRH神经元的功能。NPY对生殖调节具有双重作用正常雌激素情况下，下丘脑NPY促进GnRH分泌，低雌激素时NPY抑制GnRH分泌。瘦素启动初情期可能通过抑制下丘脑NPY的基因表达与释放，因性成熟前雌激素水平低，NPY抑制GnRH mRNA表达，瘦素通过NPY的介导，启动GnRH神经元活动。同时发现禁食后LH分泌降低，而瘦素能抑制NPY mRNA的表达，促进LH分泌，提示NPY可能是能量平衡和生殖调节的联系通道，瘦素作为性成熟信号协同促性腺激素生长激素轴，与葡萄糖、胰岛素、丙炔黑色皮质素(POMC)基因产物、神经肽Y(NPY)相互作用，刺激、调节GnRH的分泌，从而引起促性腺激素、性腺激素分泌，导致生殖系统的发育和青春期启动。
[0006]在水产养殖业上，可以利用瘦素水平调控鱼类摄食，从而控制鱼类脂肪含量，提高水产品的适口性及营养价值；通过遗传育种手段，培育瘦型或肥胖型鱼类模型，以用于动物和人类肥胖的深入研究；另外，通过控制鱼类体内瘦素水平增强鱼类免疫力，提高鱼类生产性能；研发瘦素产品，提高鱼类生产性能并应用于相关的鱼类疾病治疗。
[0007]
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种斜带石斑鱼瘦素LeptinA的蛋白表达纯化的方法。
[0009]本发明的另一目的在于提供一种斜带石斑鱼瘦素LeptinA的应用。
[0010]本发明所采取的技术方案是:
斜带石斑鱼瘦素Leptin A蛋白表达纯化的方法,包括以下步骤:
(1)斜带石斑鱼肝脏总RNA的提取；
(2)Leptin A cDNA的克隆:将上述提取的RNA进行反转录PCR合成第一链cDNA ;再以合成的cDNA为模板以SEQ ID N0:1和SEQ ID NO: 2为引物，PCR扩增，获得L印tin A的cDNA片段，并将其连入pTZ57 R/T载体中，进行扩大培养；
(3)斜带石斑鱼LeptinA原核表达载体的构建:
以含L印tin A cDNA片段的pTZ57 R/T重组质粒为模板，以SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4为引物，进行PCR扩增；PCR产物、pQE-30 UA载体分别经!,Hind III双酶切后，进行连接，获得LeptinA原核重组表达载体pQE30_Leptin A ；
(4)Leptin A重组基因的表达:
将重组表达载体pQE30-Leptin A转化宿主大肠杆菌M15,获得可表达重组外源蛋白Leptin A的重组菌；挑取阳性重组单克隆菌进行扩大和诱导培养，收集菌液，离心获得菌体；
(5)Leptin A重组蛋白的纯化:
将上述收集的菌体裂解、离心，收集沉淀，沉淀即为L印tin A重组蛋白的包涵体；再将包涵体洗涤干净，离心去上清，将沉淀中加入盐酸胍裂解液，抽提得到可溶的LeptinA重组蛋白溶液，直接上样经固定化金属配体亲和层析纯化，收集洗脱的蛋白，即可。
[0011]进一步的，上述步骤(4)中所述的扩大和诱导培养具体为:将挑取的阳性重组单克隆菌落接种至3 ml含Amp抗性的培养基中，37°C，200 rpm，振荡培养12?16h ;按照1:100体积比接种到200ml含有Amp抗性的LB液体培养基中，30°C，200 rpm,培养至0D_达到0.4 ;加入IPTG至总浓度为0.8 mM,对重组菌诱导表达7h ;可以获得最大的可溶性重组蛋白表达量。
[0012]进一步的，上述步骤(5)中所述的菌体裂解、离心的具体操作为:将收集的菌体用Bug Buster Master Mix混勻重悬,收菌后可以免除细胞破碎,室温下将重悬的细胞液孵育
10?20min ;4°C下 16，OOOg 离心 20min,所得沉淀重悬于 Bug Buster Master Mix,吸打润旋，重悬沉淀，润旋I min ;4°C,5, OOOg离心15 min,移去上清,收集沉淀,沉淀即为包涵体。
[0013]进一步的，上述步骤(5)中所述洗涤的具体操作为:将包涵体重悬于经1:10稀释的Bug Buster Master Mix中，体积为原培养液体积的一半,润旋混勻，离心；取沉淀再加入相同稀释的Bug Buster Master Mix重复润旋2次，于4°C, 16，000 g离心15min并去除上清。
[0014]进一步的，上述步骤(5)中所述的盐酸胍裂解液的pH为7.8，含500mmol/L NaCl。
[0015]斜带石斑鱼瘦素L印tin A蛋白在制备鱼类饵料中的应用。
[0016]斜带石斑鱼瘦素L印tin A蛋白在制备鱼类催产剂中的应用。
[0017]本发明的有益效果是:
本发明利用硬骨鱼基因组数据库结合分子生物学方法设计了特异性引物，PCR扩增克隆得到L印tinA基因的ORF序列，并构建表达载体，转化到大肠杆菌中培养，可大量表达斜带石斑鱼瘦素LeptinA基因所编码的蛋白。本发明斜带石斑鱼瘦素LeptinA能够影响斜带石斑鱼下丘脑细胞的NPY和AgRPl基因的表达，上调垂体细胞中促性腺激素LH- β的表达，丰富了鱼类瘦素系统信号通路的理论，并能有效促进产生的新型鱼类催产剂。
[0018]通过对培养时间、诱导时间和温度等条件的摸索和优化，使得到的蛋白的表达量较高，LeptinA处于不溶状态,纯化时要经过变性,复性,得到可溶的LeptinA重组蛋白；优化了重组蛋白的纯化条件后，表达产物的超声裂解液经固定化金属配体亲和层析，得到的蛋白纯度在90%以上。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图I为斜带石斑鱼L印tinA成熟肽编码序列PCR扩增产物电泳结果，其中，M为DS2000 DNA Marker, NC为阴性对照，I为带酶切位点的L印tinA核苷酸片段；
图2为斜带石斑鱼LeptinA基因的重组表达质粒构建图；
图3为斜带石斑鱼L印tinA重组蛋白表达的SDS-PAGE分析图，其中，M为蛋白分子量标准，I为未诱导总菌，2为诱导后蛋白上清部分，3为诱导后蛋白沉淀部分；
图4为斜带石斑鱼LeptinA重组蛋白的Western Blotting验证，I为未诱导总菌,2为诱导后蛋白上清部分，3为诱导后蛋白沉淀部分；
图5为斜带石斑鱼LeptinA重组蛋白纯化过程的检测图，其中，M为蛋白分子量标准，
I:未诱导总菌蛋白；2 :诱导蛋白上清部分；3 ：ffashing Buffer过柱；4 ：Binding Buffer过柱；5 :诱导蛋白沉淀部分；6 :Elution Buffer I 过柱（100 mM 咪唑）；7 ：Elution Buffer2过柱（150 mM咪唑）；
图6为斜带石斑鱼LeptinA对下丘脑细胞中的摄食因子表达的影响，LeptinA对摄食因子NPY和AgRPl的基因表达显著下调，*表示与对照组有显著性差异（P〈0. 05)，LEP表示LeptinA ；
图7为斜带石斑鱼LeptinA对垂体细胞中的促性腺激素表达的影响，LeptinA对促黄体生成激素LH- β的mRNA水平表达显著上调，*表示与对照组有显著性差异（P〈0. 05)，LEP表不 LeptinA0
【具体实施方式】
[0020]斜带石斑鱼瘦素L印tin A蛋白表达纯化的方法
(1)斜带石斑鱼肝脏总RNA的提取；
(2)Leptin A cDNA 的克隆；
2.1 cDNA第一链的合成：将上述提取和肝脏总RNA进行DNAase I处理去除基因组DNA污染后，与RNA Oligo dT混合，进行反转录PCR，合成第一链cDNA ；
2.2斜带石斑鱼L印tinA cDNA全序列的克隆：以合成的第一链cDNA为模板，以SEQID NO: I (ATGGACTACACTCTGGCCCTG), SEQ ID NO: 2 (TCAGCAAGTCTCAAGATGGTCC)为引物，进行PCR扩增，获得L印tin A的cDNA片段，并将其连入pTZ57 R/T载体中，进行扩大培养；
(3)斜带石斑鱼LeptinA原核表达载体的构建
3.I目的片段的扩增：以含L印tin A cDNA片段的pTZ57 R/T重组质粒为模板，以SEQ ID NO:3 (GGATCCGCTCCTCTGCCAGTGGAGGTG)和 SEQ ID NO:4 (AAGCTTTCAGCAAGTCTCAAGATGGTCC)为引物，进行PCR扩增；
3.2酶切、连接：将上一步获得的PCR产物、pQE-30 UA载体分别经及I、Hind III双酶切后，进行连接，获得LeptinA原核重组表达载体pQE30_Leptin A ；
(4)Leptin A重组基因的表达
4.I :重组表达载体pQE30-Leptin A转化宿主大肠杆菌Ml5,获得可表达重组外源蛋白Leptin A的重组菌；
4.2 :挑取阳性重组菌单克隆菌落至3 ml含有Amp抗性的培养基中，37°C，200 rpm，振荡培养12?16h ;按照1:100体积比接种到200ml含有Amp抗性的LB液体培养基中，30°C，200 rpm,培养至OD6tltl达到O. 4 ;加入IPTG至总浓度O. 8 mM,对重组菌诱导表达7h ;可以获得最大的可溶性重组蛋白表达量，收集菌液，离心获得菌体；
(5)Leptin A重组蛋白的纯化
5.I收集包涵体：将上述收集的菌体用Bug Buster Master Mix混勻重悬,收菌后可以免除细胞破碎，室温下将重悬的细胞液孵育10?20min ;4°C下16，OOOg离心20min，所得沉淀重悬于Bug Buster Master Mix,吸打润旋，重悬沉淀，润旋I min ;4°C, 5，OOOg离心15 min,移去上清,收集沉淀,沉淀即包涵体；
5. 2获得可溶性目的蛋白：将包涵体重悬于经1:10稀释的Bug Buster Master Mix中，体积为原培养液体积的一半，润旋混勻，离心；取沉淀再加入相同稀释的Bug BusterMaster Mix重复润旋2次,于4°C, 16，000 g离心15min并去除上清；将沉淀中加入盐酸胍裂解液洗涤，这样抽提得到可溶的L印tinA重组蛋白溶液，直接上样经固定化金属配体亲和层析纯化，收集洗脱的蛋白，即可。
[0021]优选的，所述盐酸胍裂解液的pH为7. 8，含500mmol/L NaCl。
[0022]优选的，所述洗脱过程中的洗脱液为100?150mM咪唑洗脱液，最优选为150 mM咪唑洗脱液。
[0023]优选的，所述诱导过程中的IPTG浓度为O. 8 mM。
[0024]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0025]实施例I斜带石斑鱼L印tinA的基因克隆
I、斜带石斑鱼肝脏总RNA的提取
取斜带石斑鱼(母coioiofes),体长30?40 cm,体重约I?I. 5kg,以冰浴麻醉约2min后，杀鱼取样，分离出肝脏组织，于液氮中速冻后，存放于_80°C冰箱备用。采用Trizol试剂法提取获得斜带石斑鱼肝脏总RNA，其
OD260/280 " I. 90ο
[0026]2、Leptin A cDNA 的克隆 cDNA第一链的合成
取10 Pg斜带石斑鱼肝脏总RNA样品进行DNAase I处理以去除基因组DNA的污染，与RNA Oligo dT混合，进行反转录PCR，所得的产物置于_20°C保存备用。
[0027]斜带石斑鱼L印tinA基因cDNA全序列的克隆
根据红鳍东方飩和黑青斑河豚的Leptin A序列，在Leptin A开放读码框两端设计引物上游序列如SEQ ID NO: I (ATGGACTACACTCTGGCCCTG)，下游引物序列如SEQ ID NO: 2(TCAGCAAGTCTCAAGATGGTCC),以上述合成的第一链cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增片段大小为500 bp。所得PCR产物上样进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，以低电压电泳分离DNA片段，从凝胶中纯化回收目的产物。将纯化后的目的产物连接至PTZ57 R/T载体转化DH5a大肠杆菌，挑选阳性克隆测序。Blast同源比对分析表明，目的产物为L印tin A基因的cDNA序列片段。
[0028]实施例2斜带石斑鱼LptinA原核表达载体的构建
根据L印tin A编码基因的两端序列合成一对引物，上游引物含有ife? HI切割位点，序列如 SEQ ID N0:3 (GGATCCGCTCCTCTGCCAGTGGAGGTG)所示，下游引物含有历III 切割位点，其序列如 SEQ ID Ν0:4 所示(AAGCTTTCAGCAAGTCTCAAGATGGTCC)。
[0029]以含有L印tinA编码基因的pTZ57R/T质粒为模板，进行PCR扩增，得到特异扩增的单一条带，产物大小为550 bp左右，电泳结果如图1。将PCR扩增产物克隆至原核表达载体pQE-30 UA上，得到原核重组表达载体:pQE30-L印tin A (构建流程图如图2所示)。表达载体中的外源基因序列经测序鉴定正确。
[0030]实施例3重组斜带石斑鱼L印tin A基因的表达转化表达宿主:
将上述构建好的原核重组表达载体pQE30-Leptin A转化到大肠杆菌M15中，获得可表达外源蛋白Leptin A的重组菌。用含氨节霉素(Amp)和卡那霉素(Kana)的培养基,进行筛选培养，挑取阳性单克隆菌落，进行菌液PCR验证，PCR扩增的片段大小与目的片段大小相似，约550bp，验证正确后，再进行后续的实验。
[0031 ] 重组蛋白的诱导表达:
在诱导表达过程中，先对重组菌的培养时间、温度和IPTG诱导浓度等条件进行优化，得到重组菌的最佳培养和诱导表达条件为:挑阳性克隆的单菌落至3 ml含有Amp抗性的培养基中，37 °C，200 rpm,振荡培养过夜；按照1:100体积比接种到200ml含有Amp抗性的LB液体培养基中，370C，200 rpm,培养至OD6tltl达到0.4 ;加入IPTG至总浓度0.8 mM,对Leptin A蛋白表达重组菌诱导7h ;收集菌液，离心获得菌体，加入IxN1-NTA结合缓冲液重悬菌体，超声波破碎，离心，将上清和沉淀分开。
[0032]分别将诱导前的总菌体、诱导后的上清和沉淀加入蛋白Loading buffer,混勻，沸水浴中煮5分钟，分别取1PL进行SDS-PAGE电泳和Western blotting检测，检测结果如图3和图4所示。从图3的SDS-PAGE电泳结果中，在诱导后的沉淀蛋白中，在17 kDa的位置明显出现了一条蛋白条带，与预计的L印tin A重组蛋白的分子量大小一致，可看出Leptin A重组蛋白主要存在菌体沉淀中。从图4的western blotting检测结果中，可看出用His-tag的抗体能够杂出阳性信号，表明表达出来的蛋白带有His-tag标签，分子量大小与预期的一致；LeptinA重组蛋白主要存在菌体沉淀中，且在上清中有少量的蛋白表达。
[0033]实施例4重组斜带石斑鱼L印tin A蛋白的纯化
收集上述诱导表达后的菌体，用Bug Buster Master Mix混勻重悬,室温下将重悬的细胞液孵育10?20min ;无需超声波破碎，4°C下16，OOOg离心20 min收集沉淀，将沉淀重悬于Bug Buster Master Mix,吸打润旋，重悬沉淀，润旋I min ;4°C, 5，OOOg离心15min，移去上清，收集沉淀，沉淀即包涵体；将包涵体重悬于相当于原培养体系体积一半的经1:10稀释的Bug Buster Master Mix中，润旋混勻，离心；取沉淀再加入1:10稀释的BugBuster Master Mix重复润旋2次，于4°C, 16，000 g离心15min并去除上清；最终沉淀(LeptinA包涵体)加盐酸胍裂解液洗涤，这样抽提得到的可溶蛋白溶液可以直接上样，经固定化金属配体亲和层析纯化，收集洗脱的蛋白，即可获得纯化的LeptinA蛋白，SDS-PAGE电泳图如图5所示。盐酸胍裂解液的pH优选为7.8，含500mmol/L NaCl。洗脱过程中的洗脱液为100?150mM咪唑洗脱液，最优选为150 mM咪唑洗脱液。
[0034]上述纯化后的蛋白的纯度达90%以上。
[0035]实施例5斜带石斑鱼瘦素LeptinA对摄食相关因子表达影响的活性分析鱼类的基因功能跟哺乳类的基因功能存在较大的差异，一些相关基因的功能也不一样，比如说哺乳类大多数基因都只有一种，而硬骨鱼类有两种亚型，且功能不一样，这就是硬骨鱼跟哺乳的差异；如哺乳类L印tin基因主要是在脂肪细胞中表达，而鱼类L印tin基因在脂肪细胞中不表达，主要在肝脏中进行表达。虽然，在哺乳动物类，Leptin基因在脂肪细胞的作用已经研究得比较清楚，其作为脂肪组织和中枢神经系统间网络联系的外周信号，可能通过血脑屏障作用于中枢神经系统，影响摄食行为和调整自主神经系统活动等，参与保持机体脂肪量恒定的自稳态调节机制，而在鱼类肝脏中表达的Leptin蛋白究竟怎样起作用，目前仍没有相关信息报道。
[0036]实验方法:
取12条斜带石斑鱼体长30?40 cm,体重约1-1.5kg，以冰浴麻醉约2min后，杀鱼取样，分离下丘脑组织，将下丘脑(hypothalamus)放入6孔培养板中，将组织磨至下丘脑碎片，向各孔中加入2 ml细胞悬浮液,分别向各孔中加入含100ng/ml LeptinA蛋白的M199培养基2ml，并设置阴性对照组(未加L印tin A蛋白)。将细胞培养板置于27°C，5% CO2培养箱中培养，孵育3 h后收集各孔细胞，Real-time PCR检测LeptinA蛋白对下游摄食因子NPY，P0MC，AgRPl和AgRP2基因表达的影响。18S rRNA作为内参基因来校正各样品模板量，反映L印tinA蛋白的活化能力及对上下游基因表达的影响。每组6个平行样品，数据用平均值土标准误表示，*表示与对照组有显著差异(P〈0.05)，检测结果如图6所示。结果表明，100 ng/ml的L印tinA蛋白孵育下丘脑细胞3小时后能显著性的下调NPY和AgRPl的mRNA表达水平，而对POMC和AgRP2没有显著性影响。
[0037]实施例6斜带石斑鱼瘦素L印tinA对促性腺激素表达的影响
取12条斜带石斑鱼体长30?40 cm,体重约1-1.5kg，以冰浴麻醉约2min后，杀鱼取样，分离垂体组织(Pituitary)，将垂体放入6孔培养板中，将组织磨至碎片，向各孔中加入
2ml细胞悬浮液，分别向各孔中加入含100ng/ml L印tinA蛋白的M199培养基2ml，并设置阴性对照组(未加Leptin A蛋白)。将细胞培养板置于27°C，5% CO2培养箱中培养，孵育3 h后收集各孔细胞，Real-time PCR检测LeptinA蛋白对垂体细胞中的促性腺激素FSH-β和LH-PmRNA表达水平的影响。18S rRNA作为内参基因来校正各样品模板量，反映L印tinA蛋白的活化能力及对上下游基因表达的影响。每组6个平行样品，数据用平均值土标准误表示，*表示与对照组有显著差异(P〈0.05),检测结果如图7所示。结果表明，100 ng/ml的L印tinA蛋白孵育垂体细胞3小时后能显著性的上调LH- β的mRNA表达水平，而对FSH- β没有显著影响。
[0038]综上所述，石斑鱼L印tinA是调控生长和生殖枢纽，当机体生长快的时候，生殖方面就弱；当机体处于生殖期的时候，生长速度就慢。在这个能量平衡的调控过程中，Ieptin起到关键的调控作用。鱼类Leptin可以通过抑制摄食，同时加强促性腺激素水平的释放来调控机体生殖活动。故可将斜带石斑鱼瘦素Leptin A蛋白或其重组蛋白作为催产剂促进鱼类的生殖，也可应用于鱼类饵料中。
【权利要求】
1.斜带石斑鱼瘦素LeptinA蛋白表达纯化的方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)斜带石斑鱼肝脏总RNA的提取； (2)LeptinA基因cDNA的克隆:将上述提取的RNA进行反转录PCR合成第一链cDNA ；再以合成的cDNA为模板以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2为引物，PCR扩增，获得L印tin A的cDNA片段，并将其连入pTZ57 R/T载体中，进行扩大培养； (3)斜带石斑鱼LeptinA原核表达载体的构建: 以含L印tin A基因cDNA片段的pTZ57 R/T重组质粒为模板，以SEQ ID NO:3和SEQID NO:4为引物，进行PCR扩增；PCR产物、pQE-30 UA载体分别经汉.Η !,Hind III双酶切后，进行连接，获得LeptinA原核重组表达载体pQE30_Leptin A ； (4)Leptin A重组基因的表达: 将重组表达载体pQE30-LeptinA转化宿主大肠杆菌M15,获得可表达重组外源蛋白LeptinA的重组菌；挑取阳性重组单克隆菌进行扩大和诱导培养，收集菌液，离心获得菌体； (5)Leptin A重组蛋白的纯化: 将上述收集的菌体裂解、离心，收集沉淀，沉淀即为L印tin A重组蛋白的包涵体； 再将包涵体洗涤干净，离心去上清，将沉淀中加入盐酸胍裂解液，抽提得到可溶的LeptinA重组蛋白溶液，直接上样经固定化金属配体亲和层析纯化，收集洗脱的蛋白，即可。
2.根据权利要求1所述的斜带石斑鱼瘦素LeptinA蛋白表达纯化的方法，其特征在于:步骤(4)中所述的扩大和诱导培养具体为:将挑取的阳性重组单克隆菌落接种至3 ml含Amp抗性的培养基中，37°C，200 rpm，振荡培养12?16h ;按照1:100体积比接种到200ml含有Amp抗性的LB液体培养基中，300C，200 rpm,培养至OD6tltl达到0.4 ;加入IPTG至总浓度为0.8 mM，对重组菌诱导表达7h ;可以获得最大的可溶性重组蛋白表达量。
3.根据权利要求1所述的斜带石斑鱼瘦素LeptinA蛋白表达纯化的方法，其特征在于:步骤(5)中所述的菌体裂解、离心的具体操作为:将收集的菌体用Bug Buster MasterMix混匀重悬,收菌后可以免除细胞破碎,室温下将重悬的细胞液孵育10?20min ;4°C下16, OOOg离心20min,所得沉淀重悬于Bug Buster Master Mix,吸打润旋,重悬沉淀，润旋I min ；4°C,5, OOOg离心15 min,移去上清,收集沉淀,沉淀即为包涵体。
4.根据权利要求1所述的斜带石斑鱼瘦素LeptinA蛋白表达纯化的方法，其特征在于:步骤(5)中所述洗漆的具体操作为:将包涵体重悬于经1:10稀释的Bug BusterMaster Mix中，体积为原培养液体积的一半，润旋混勻，离心；取沉淀再加入相同稀释的Bug Buster Master Mix重复润旋2次，于4°C, 16，000 g离心15min并去除上清。
5.根据权利要求1所述的斜带石斑鱼瘦素LeptinA蛋白表达纯化的方法，其特征在于:步骤(5)中所述的盐酸胍裂解液的pH为7.8，含500mmol/L NaCl。
6.斜带石斑鱼瘦素L印tinA蛋白在制备鱼类饵料中的应用。
7.斜带石斑鱼瘦素LeptinA蛋白在制备鱼类催产剂中的应用。
【文档编号】C12N15/70GK104450763SQ201410617687
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月4日 优先权日:2014年11月4日
【发明者】刘晓春, 张辉贤, 李水生, 张勇, 蒙子宁, 林浩然 申请人:中山大学