人白细胞介素-1α蛋白质的制备方法
【专利摘要】一种人白细胞介素-1α(IL-1α)蛋白质的制备方法，通过在人类胚肾细胞293F细胞内表达重组人类IL-1α基因进行制备，其步骤如下：IL-1α基因的克隆、IL-1α蛋白表达筛选、IL-1α蛋白质纯化以及IL-1α内毒素检测。本发明的方法可以大剂量提纯精制其表达的融合蛋白产物，可进行严格的质量控制且有着非常强的实用性。
【专利说明】人白细胞介素-1a蛋白质的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物基因工程【技术领域】，尤其涉及一种白细胞介素_la蛋白质的制 备方法，该方法采用在人类胚肾细胞293F细胞内表达重组人类DNA制备蛋白的技术，具有 通用性，特别是表达质粒的设计。
【背景技术】
[0002] 人白细胞介素-1a，简称人白介素-1a，英文简称IL-1a。成熟的人白介素-1a 由159个氨基酸组成分子质量为17kDa多肽的蛋白质，在1984和1989年人白介素-la的 cDNA被克隆，它是由活化的巨噬细胞、单个核细胞或多核白细胞产生的一种炎性的细胞因 子，通过与其受体结合参与炎性反应和细胞坏死及免疫应答，其前体蛋白由271个氨基酸 组成，在细胞膜上的蛋白酶的作用下裂解成成熟蛋白。目前的蛋白质制备，在全球范围内多 数是把重组人类DNA表达在细菌内，然后从细菌里制备其表达的蛋白。其好处是成本低方 法简单容易，但缺点是制备的蛋白有诸多方面的缺欠。人类蛋白应该在人类细胞中制备以 符合人类自身的需求，但方法难、产量低一直困扰着人们对它的渴求，本方法可以大量制备 在人类细胞中表达的IL-1a人类蛋白，可以进行质量控制，有着极强的实用性。
【发明内容】
[0003] 本发明突破了重组人类DNA在人类细胞中表达制备蛋白质产量低的技术瓶颈，提 供了质粒结构的设计和制备方法。通常的方法在1升的培养液中只能制备出不到1毫克的 IL-1a蛋白，本发明可高达22毫克，方法可行，质量可控，实用性极强。
[0004] 因此，本发明的目的是提供一种可进行严格的质量控制且有非常强的实用性的人 白细胞介素-la蛋白质的制备方法。
[0005] 为了实现上述发明的目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] 一种人白细胞介素-1a(IL-1a)蛋白质的制备方法，包括如下步骤：
[0007]l)IL_la基因的克隆
[0008] 先通过PCR扩增连接物（KSS)和人IL-1a片段，然后利用琼脂糖凝胶回收PCR产 物KSS和IL-1a，将琼脂糖凝胶回收的载体PTT5与琼脂糖凝胶回收产物KSS及IL-1a连 接并转染入菌，经培养挑取菌落做PCR，根据PCR结果测序，最后将正确的pTT5-KSS-IL-la 进行克隆，提取质粒；
[0009] 2)IL_la蛋白表达筛选
[0010] 先进行人类胚肾细胞293F细胞瞬时转染优化实验，通过测定其蛋白在瞬时转染 293F细胞中的表达量，筛选出高表达的条件，进行IL-1a蛋白的表达；
[0011] 3)IL_la蛋白质纯化
[0012] 对目标IL-1a蛋白质进行分离纯化，并对其进行定量分析；
[0013] 4)IL_la内毒素检测
[0014] 将步骤3)中纯化后的IL-1a进行内毒素含量的检测。
[0015] 进一步地，所述步骤1)中PCR扩增KSS片段和IL-la片段所用的引物为： IL-1a-1F，序列如SEQIDN0 :1 所示，IL-1a-1R，序列如SEQIDN0 :2 所示，IL-1a-2F， 序列如SEQIDNO:3所示，IL-1a-2R，序列如SEQIDNO:4所示以及表达质粒的设计中引 物为：人工序列PTT5-KSS-IL-1a，序列如SEQIDN0 :5所示。
[0016] 进一步地，所述步骤1)中所述PCR反应条件为：在体系1中98°C预变性3min后 进行98°C变性30s、65°C复性30s、72°C延伸45s，进入体系2中进行30个循环的扩增，72°C 延伸10min后保存于16°C。
[0017] 进一步地，步骤1)中连接和转化pTT5-KSS-IL-la的步骤包括：将pTT5、KSS、 IL-1a、5XEnzymeBuffer以及10XEnzymeMix的连接反应体系混勻，在室温下放置 30min，将感受态细胞置于冰上溶化后加入8ul连接产物到50ul感受态细胞中并轻轻混 匀，冰上孵育30min;然后在42°C下准确热激30s,立刻立即转移至冰上放置2min;再加入 250ul室温的S0C培养基，在37°C，200rpm的条件下孵育lh;最后取100ul细胞均匀涂布于 LB平板（100ug/mlAmp)上，在37°C培养箱中培养过夜，观察平板上细胞生长情况。
[0018] 进一步地，步骤1)中琼脂糖凝胶电泳检测菌落通过PCR结果进行显示，所用引物 为PTT5-F和pTT5-R，所述的PCR反应条件为：在体系1中94°C预变性10min后进行94°C变 性30s、55°C复性30s、72°C延伸lmin，进入体系2中进行30个循环的扩增，72°C延伸10min 后保存于16C。
[0019] 进一步地，所述步骤2)中以最佳IL-1a蛋白进行表达的步骤是先对人类胚肾细 胞293F细胞进行计数，计算细胞密度和活率，细胞活率必须> 90% ;然后将所述的293F细 胞密度调整至IX106,接种到玻璃三角细胞培养瓶内；再进行细胞的瞬时转染实验，具体为 分别取相应量的质粒与聚乙烯亚胺（PEI)混匀，室温孵育5min，加入接种293F细胞的三 角细胞培养；最后将转染后的细胞放置在二氧化碳培养箱中培养，在37°C，二氧化碳浓度 8%,摇床转速170印111/1]1；[11的条件下,培养7天,收细胞悬液,进行蛋白纯化。
[0020] 进一步地，步骤3)中所述的分离纯化步骤是先将层析系统和层析柱处理好，然后 再进行层析纯化，通过电泳检测纯化结果，纯化中的条件为离心样品速度4700rpm/min，在 4°C条件下离心40min，采用0. 22um滤膜进行无菌过滤，上样流速5ml/min。
[0021] 进一步地，步骤4)中所述的内毒素检测步骤是先取100ul准备好的标准品和样品 用加到去内毒素的管中，加l〇〇ul的鲎试剂到每个管中，盖上盖子，混匀，放入37°C恒温孵 箱中45min;然后加100ul显色基质到每个管中，混匀，放入37°C恒温孵箱中6min;再加不 同的500ul颜色稳定剂到每个管中，混匀；最后从每个管中取100ul液体加到酶标板中，用 读板机在545nm的波长下读板，利用内毒素标准曲线，计算出样品内毒素含量。
[0022] 由于采用以上技术方案，本发明的有益效果包括：
[0023] 本发明提供的人白细胞介素_la蛋白质的制备方法是可以在人类胚肾细胞 (HEK293)内表达重组人类白细胞介素-la基因并可以大剂量提纯精制其表达产物（融合 蛋白质）的一种方法，其可进行严格的质量控制且有着非常强的实用性。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1为本发明提供的人白细胞介素_la蛋白质的制备方法中PCR扩增KSS和PCR 扩增IL-1a片段的结果显示图，其中M表明DNA片段分子量的大小，泳道1-2表示IL-1a， 泳道3-4表示KSS;
[0025] 图2为本发明提供的人白细胞介素-1a蛋白质的制备方法中PTT5-KSS-IL-1a 连接鉴定的PCR结果显示图，其中M表明DNA片段分子量的大小，泳道1-3表示PCR结果；
[0026] 图3为本发明提供的人白细胞介素-1a蛋白质的制备方法中琼脂糖凝胶电泳检 测菌落实验1#菌液（PTT5-KSS-IL-1a#1)测序比对结果；
[0027] 图4为本发明提供的人白细胞介素-la蛋白质的制备方法中蛋白在瞬时转染 293F细胞中表达量检测实验电泳检测图，其中M表示蛋白质分子量大小，C是对照组，泳道 左1-6表示细胞培养液的上清液，泳道右1-6表示通过Nickel浓缩的细胞培养液的上清 液，B表不白蛋白；
[0028] 图5为本发明提供的人白细胞介素-1a蛋白质的制备方法中IL-1a蛋白质纯化 中的层析图谱；
[0029] 图6为本发明提供的人白细胞介素-1a蛋白质的制备方法中电泳检测纯化的电 泳检测图，其中M表示蛋白质分子量大小，泳道1-14表示从层析柱流出的精制蛋白质；
[0030] 图7为本发明提供的人白细胞介素-1a蛋白质的制备方法中SDS-Page电泳检测 蛋白纯度的电泳检测图；以及
[0031] 图8为本发明提供的人白细胞介素-la蛋白质的制备方法中内毒素标准曲线图。
【具体实施方式】
[0032] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例对 本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用 于限定本发明。
[0033] 下面通过具体的实验来对本发明进行解释。
[0034] 实施例1:人白细胞介素-1a(IL-1a)目的基因的克隆
[0035] 1)连接物（KSS)、人白细胞介素-1a(IL-1a)片段的扩增
[0036] 所用材料如下：
[0037] 引物（生工生物工程（上海）股份有限公司，北京合成部）：
[0038]IL-1a-1F，序列如SEQIDN0 :1所示，IL-1a-1R，序列如SEQIDN0 :2所示， IL-1a-2F，序列如SEQIDN0 :3所示以及IL-1a-2R，序列如SEQIDN0 :4所示
[0039]Piiusion? 超保真PCRMasterMix
[0040]dNTP(2. 5mM) (TaKaRa)
[0041]PCR扩增KSS片段的实验步骤是：先按照反应体系，配制PCR反应液：PCR混 合液 100ul、H20 64ul、5XHFbuffer20ul、dNTP(2.5mM)6ul、ILla-lF(10umol)4ul、 IL1a-lR(l〇umol) 4ul、Phusion超保真DNA聚合酶lul、Template:KSS_IL_1a(l〇〇ng/ ul)lul，然后进行PCR扩增，反应条件为：在体系1中98°C预变性3min后进行98°C变性 30s、65°C复性30s、72 °C延伸45s，进入体系2中进行30个循环的扩增，72 °C延伸10min后 保存于16°C;
[0042]PCR扩增IL-1a片段的实验步骤是：先按照反应体系，配制PCR反应液：PCR混 合液 100ul、H20 64ul、5XHFbuffer20ul、dNTP(2.5mM)6ul、ILla-2F(10umol)4ul、 IL1a-2R(10umol)4ul、Phusion超保真DNA聚合酶lul、Template:IL_1a(l〇〇ng/ul)lul， 然后进行PCR扩增，反应条件为：在体系1中98°C预变性3min后进行98°C变性30s、65°C复 性30s、72°C延伸45s，进入体系2中进行30个循环的扩增，72°C延伸lOmin后保存于16°C。 [0043] 通过上述实验操作，成功的完成了KSS片段和IL-1a片段的扩增，结果见图1。
[0044] 2)琼脂糖凝胶回收PCR片段KSS、IL-1a
[0045] 采用琼脂糖1*TAEbuffer琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收操作，所得琼脂糖凝胶 回收片段浓度：
[0046]KSS浓度：15. 2ng/ulOD260/OD280:1. 95
[0047]IL-1a浓度：14. 9ngAlOD260/OD280 : 2 . 04
[0048] 3)连接和转染pTT5-KSS-IL_la
[0049] 所用材料如下：
[0050] 琼脂糖凝胶回收载体片段pTT5
[0051] 琼脂糖凝胶回收片段KSS
[0052] 琼脂糖凝胶回收片段IL-la
[0053] SOC培养基
[0054]LB平板（Amp)
[0055] (HZN13八RT.jiSeamlessCloningandAssemblyKit(Invitrogen)
[0056] 步骤如下：
[0057]先准备连接反应体系：pTT5 (79. 9ng/ul) 1. 50ul、KSS(15. 2ng/ul) 2. 75ul、 IL_la(14.9ng/ul)2.75ul、5XEnzymeBuffer2.00ul、10XEnzymeMixl.OOul;轻轻混勻 上述连接体系，在室温下放置30min，将OneShot?T0P10感受态细胞置于冰上溶化后加入 8ul连接产物到50ul感受态细胞中并轻轻混匀，冰上孵育30min;然后在42°C下准确热激 30s，立刻立即转移至冰上放置2min;再加入250ul室温的S0C培养基，在37°C，200rpm的 条件下孵育lh;最后取l〇〇ul细胞均匀涂布于LB平板（100ug/mlAmp)上，在37°C培养箱 中培养过夜，观察平板上细胞生长情况。
[0058] 通过上述实验，平板生长情况次日可见。
[0059] 4)通过PCR检测连接和转染，并挑取菌落制备质粒DNA测序和克隆
[0060] 所用材料如下：
[0061]LB液体培养基（100ug/mlAmp)
[0062]引物：pTT5_F(生工生物工程（上海）股份有限公司，北京合成部）、
[0063]pTT5_R(生工生物工程（上海）股份有限公司，北京合成部）
[0064]2*TaqMasterMix(北京康为世纪生物技术有限公司）
[0065] 步骤如下：
[0066] 先在每个平板挑取6个单菌落进行菌落PCR，同时接入1.5ml环氧树脂（EP) 管中，在37°C，200rpm的条件下培养6h;然后进行菌落PCR，鉴定载体pTT5与DNA片段 KSS-IL-la的连接，其中PCR反应体系为：菌落、2*TaqMasterMix10ul、引物pTT5_Flul、 引物PTT5-Rlul、ddH20 8ul，反应条件为：在体系1中94°C预变性lOmin后进行94°C变性 30s、55°C复性30s、72°C延伸lmin，进入体系2中进行30个循环的扩增，72°C延伸lOmin后 保存于16°C。
[0067] 如图2所述，通过上述琼脂糖凝胶电泳检测菌落实验，PCR结果1-3显示载体pTT5 与DNA片段KSS-IL-la全部连接到位。pTT5-KSS-IL-la正确序列如SEQIDN0:5所示。选取上述PTT5-KSS-IL-1a#1菌液进行测序，结果如图3所示。
[0068] 5)正确的pTT5-KSS-IL_la进行克隆，提取质粒
[0069] 在150mlLB液体培养基（100ug/mlAmp)中分别接入pTT5-KSS-IL-la克隆的甘 油菌，在37°C，200rpm条件下过夜培养；采用PureYield?PlasmidMindiSystem试剂盒 进行提取质粒，所得pTT5-KSS-IL_la浓度为：
[0070] 301.lng/ulOD260/OD280:1. 90
[0071]实施例2:IL_la蛋白表达筛选
[0072] 1) 293F细胞瞬时转染条件的优化实验
[0073] 所用材料如下：
[0074] 质粒样品经0? 22um过滤器过滤除菌，用Nanodrop2000测定浓度；
[0075]Freestyle293F细胞，Invitrogen，Cat#R790_07 ;
[0076]Freestyle293F细胞表达培养基，Invitrogen，Cat#2338_〇2 ;
[0077]Polyethylenimine(PEI)，Polysciences，Cat#23966,lmg/ml:将 500mg的PEI粉 末溶于450mLDDH20中，用HCL将其pH值调至7. 0,加入DDH20定容体积至500mL，0. 22um过 滤器过滤除菌，分装成每管10mL，-80°C冻存备用；
[0078]0?22um过滤器，Sartorius，I7597 ;
[0079] 6 孔细胞培养板，NUNU，Cat#，140675 ;
[0080]二氧化碳培养箱，SANYO,MC0-20AIC，ID# 为BINC010 ;
[0081]托盘摇床，IKA，KS260basic，ID# 为B0SC015 ;
[0082]pH计，梅特勒-托利多，FE20，ID#为BPHM001;
[0083]Nanodrop2000,Thermo，ID#为BN0P001。
[0084] 步骤如下：
[0085] 先对人类胚肾细胞293F细胞进行计数，计算细胞密度和活率，细胞活率必须 彡90% ;然后将293F细胞密度调整至IX10%1，接种6孔细胞培养板，4ml/孔；按下表1 的优化方案进行细胞瞬时转染实验，具体操作为分别取相应量的质粒与PEI混匀，室温孵 育5min，再取相应的体积加入到6孔细胞培养板对应的孔内将转染后的细胞放置在二氧化 碳培养箱中培养，37°C，二氧化碳浓度8%，摇床转速170rpm/min的条件下，培养7天，收细 胞悬液，待检测目的蛋白的表达量。
[0086] 表1IL-Ia蛋白的表达优化条件
【权利要求】
1. 一种人白细胞介素-la (IL-1 a)蛋白质的制备方法，通过在人类胚肾细胞293F细 胞内表达重组人类IL-1 a基因进行制备，其特征在于如下步骤： 1. IL_la基因的克隆 先通过PCR扩增连接物（KSS)和IL-la片段，然后利用琼脂糖凝胶回收PCR产物KSS 和IL-1 a，将琼脂糖凝胶回收的载体PTT5与琼脂糖凝胶回收产物KSS及IL-1 a连接并转 染入菌，经培养挑取菌落做PCR，根据PCR结果测序，最后将正确的pTT5-KSS-IL-l a进行克 隆，提取质粒； 2. IL-la蛋白表达筛选 先进行人类胚肾细胞293F细胞瞬时转染优化实验，通过测定其蛋白在瞬时转染293F 细胞中的表达量，筛选出高表达的最佳条件，进行IL-1 a蛋白的表达； 3. IL-la蛋白质纯化 对目标IL-1 a蛋白质进行分离纯化，并对其进行定量分析； 4. IL-la内毒素检测 将步骤3)中纯化后的IL-la进行内毒素含量的检测。
2. 根据权利要求1所述的人白细胞介素-la (IL-la)蛋白质的制备方法，其特征 在于，所述步骤1)中PCR扩增KSS片段和IL-la片段所用的引物为：IL-la-lF，序列如 SEQ ID NO :1 所示，IL-1 a -1R，序列如 SEQ ID NO :2 所示，IL-1 a -2F，序列如 SEQ ID NO : 3所示，IL-1 a-2R，序列如SEQ ID NO :4所示以及表达质粒的设计中引物为：人工序列 PTT5-KSS-IL-1 a，序列如 SEQ ID NO :5 所示。
3. 根据权利要求2所述的人白细胞介素-la (IL-la)蛋白质的制备方法，其特征在 于，所述步骤1)中所述PCR反应条件为：在体系1中98°C预变性3min后进行98°C变性30s、 65°C复性30s、72°C延伸45s，进入体系2中进行30个循环的扩增，72°C延伸lOmin后保存 于 16°C。
4. 根据权利要求2或3所述的人白细胞介素-la (IL-la)蛋白质的制备方法，其特征 在于，步骤1)中连接和转化PTT5-KSS-IL-1 a的步骤包括：将pTT5、KSS、IL_l a、5X Enzyme Buffer以及10X Enzyme Mix的连接反应体系混匀，在室温下放置30min，将感受态细胞置 于冰上溶化后加入8ul连接产物到50ul感受态细胞中并轻轻混匀，冰上孵育30min ;然后 在42°C下准确热激30s，立刻立即转移至冰上放置2min ;再加入250ul室温的S0C培养基， 在37°C，200rpm的条件下孵育lh ;最后取100ul细胞均匀涂布于LB平板（100ug/ml Amp) 上，在37°C培养箱中培养过夜，观察平板上细胞生长情况。
5. 根据权利要求4所述的人白细胞介素-la (IL-la)蛋白质的制备方法，其特征 在于，步骤1)中琼脂糖凝胶电泳检测菌落通过PCR结果进行显示，所用引物为pTT5-F和 PTT5-R，所述的PCR反应条件为：在体系1中94°C预变性lOmin后进行94°C变性30s、55°C 复性30s、72°C延伸lmin，进入体系2中进行30个循环的扩增，72°C延伸lOmin后保存于 16。。。
6. 根据权利要求1所述的人白细胞介素-la (IL-la)蛋白质的制备方法，其特征在 于，所述步骤2)中以最佳IL-la蛋白进行表达的步骤是先对人类胚肾细胞293F细胞进 行计数，计算细胞密度和活率，细胞活率必须> 90% ;然后将所述的293F细胞密度调整至 1 X 106,接种到玻璃三角细胞培养瓶内；再进行细胞的瞬时转染实验，具体为分别取相应量 的质粒与聚乙烯亚胺（PEI)混匀，室温孵育5min，加入接种293F细胞的三角细胞培养；最 后将转染后的细胞放置在二氧化碳培养箱中培养，在37°C，二氧化碳浓度8%，摇床转速 170rpm/min的条件下，培养7天，收细胞悬液，进行蛋白纯化。
7. 根据权利要求1所述的人白细胞介素-la (IL-1 a)蛋白质的制备方法，其特征在 于，步骤3)中所述的分离纯化步骤是先将层析系统和层析柱处理好，然后再进行层析纯 化，通过电泳检测纯化结果，纯化中的条件为离心样品速度4700rpm/min，在4°C条件下离 心40min，采用0. 22um滤膜进行无菌过滤，上样流速5ml/min。
8. 根据权利要求1所述的人白细胞介素-la (IL-1 a)蛋白质的制备方法，其特征在 于，步骤4)中所述的内毒素检测步骤是先取lOOul准备好的标准品和样品用加到去内毒素 的管中，加l〇〇ul的鲎试剂到每个管中，盖上盖子，混匀，放入37°C恒温孵箱中45min ;然后 力口 lOOul显色基质到每个管中，混匀，放入37°C恒温孵箱中6min ;再加不同的500ul颜色稳 定剂到每个管中，混勻；最后从每个管中取lOOul液体加到酶标板中，用读板机在545nm的 波长下读板，利用内毒素标准曲线，计算出样品内毒素含量。
【文档编号】C12N15/85GK104328139SQ201410617695
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年11月5日 优先权日:2014年11月5日
【发明者】王长征 申请人:太仓思源生物医药有限公司