黄瓜AG-like基因CsMADS24基因过表达载体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种黄瓜AG-like基因CsMADS24过表达载体及其在花器官改造中的应用，属于生物【技术领域】。该载体为含有双35S启动子和黄瓜CsMADS24基因植物表达载体。在拟南芥中过量表达CsMADS24，获得的CsMADS24转基因植株在花的发育早期呈开放状，在花的发育晚期，除少数能形成较细长的花外，大部分花的花瓣和雄蕊不能正常发育，仅见发育的萼片和心皮。以上结果表明CsMADS24在花器官发育方面发挥了重要的调控作用。利用CsMADS24基因获得的花器官发生变异的新材料可用于农作物和观赏植物的育种应用，具有一定的农业价值和观赏价值。
【专利说明】黄瓜AG-1 ike基因CsMADS24基因过表达载体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种黄瓜AG-1ike基因CsMADS24过表达载体及其应用。
【背景技术】
[0002]花的正常发育是植物赖以繁衍的基础，也是农业生产获得产品、提高产量的关键时期。通过分子生物学手段鉴定出控制花发育的基因并通过改变其表达方式，可有目的性地改变花型，产生变异的新材料可用于农作物和观赏植物的育种应用。随着对花发育相关问题的研究逐步的深入，发现花器官的发育是由一类MADS-box同源异形基因所控制。MADS-box基因家族得名于最先鉴定出来的四个成员的首字母:酵母的MCMl基因、拟南芥的AGAM0US基因、金鱼草的DEFICIENS基因和人的SRF基因。
[0003]目前，调控花发育的MADS-box基因已从一系列的物种中分离克隆出来，这些物种包括拟南芥、金鱼草、烟草、水稻、玉米、百合、蝴蝶兰等。研究表明，双子叶拟南芥花器官的发育可以归纳为花发育的ABCDE模型。该模型认为，花器官是A、B、C、D和E五类基因共同表达的结果，这五类基因基本上都为MADS-box基因。其中的C功能基因和D功能基因又称为AG-1ike基因，归属于AG subfamily。在模式植物拟南芥的基因组中共有4个基因:AGAM0US (AG)、SHATTERPROOF I (SHPl )、SHP2 和 SEEDSTICK (STK)属于该家族。这四个基因有着高度的序列一致性，并表现出各自不同但又相互重叠的表达方式。其中的AG作为C功能基因在第三轮雄蕊的决定、第四轮雌蕊心皮的发育及分生组织的决定性上起作用。在AG基因的突变体ag中，第三轮的雄蕊会转变为类似花瓣状的结构，第四轮的心皮处会转变为额外的小花。STK作为D类基因在胚珠的发育中起决定作用。另外的两个基因SHPl和SHP2兼有C和D两种功能，即在心皮和胚珠的发育中都起作用。
[0004]在拟南芥等物种中，通过改变AG-1ike基因的表达方式，按人们需要设计新的花型已成为可能。利用转基因技术抑制拟南芥AG基因的表达，其雄蕊被花瓣取代，心皮被新的花替代，形成重瓣花，为创造观赏价值较高的重瓣花展示了美好的前景。将矮牵牛同源异型基因FBP2与35S启动子相连，构建表达载体PBP2导入烟草，导致烟草雄蕊上产生花瓣。将英国梧桐的花器官决定基因PaAG(C类基因)转化烟草后，花瓣的形态发生了很大变化。黄瓜作为重要的蔬菜作物，有关MADS-box基因对花发育调控的研究还相对较少。2009年黄瓜基因组测序的完成为从分子水平上研究黄瓜基因的相关功能提供了可能。通过全基因组扫描发现，仅CsMADS24可以归属于AG-1ike家族，鉴于AG-1ike基因在花发育中的重要作用，值得深入研究。本发明从黄瓜中克隆了 I个在花瓣和雄蕊发育上发挥重要调控作用的CsMADS24基因，提出了利用该基因进行植物花器官改造的基因工程改良方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种黄瓜CsMADS24基因花特异表达载体及及其在花器官改造中的应用，该载体含有黄瓜AG-1ike基因CsMADS24，基因的上游连有双35S启动子。
[0006]本发明的上述植物表达载体为PHB_CsMADS24，由下述方法构建而成:
(I) 根据 CuGI (http://cucumber.genomics.0rg.cn/page/cucumber/index.jsp)上公布的黄瓜CsMADS24的序列(CsaO17355)，设计两端引物:CsMADS24_F:5，- aaaaCTGCAGATGAGTTGTTATGAGGAAG-3，(含 PstI 位点)CsMADS24_R:5，-aaaaTCTAGATTACACAAGTTGAAGAGAG-3’(含 XbaI 位点)。以黄瓜花蕾的 cDNA 第一链为模板进行PCR扩增，获得CsMADS24全长。
[0007](2)回收CsMADS24的cDNA全长，将其连接到pMD18载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD18-CsMADS24。
[0008](3)使用 PstI 和 XbaI 酶切 pMD18_CsMADS24，回收 CsMADS24 片段，同时用 PstI 和XbaI酶切PHB，回收后连接，转化感受态细胞，获得植物表达载体PHB-CsMADS24。
[0009]本发明的另一目的是公开黄瓜CsMADS24在花器官改造中的基因工程应用，该基因导入拟南芥后，获得的CsMADS24转基因植株在花的发育早期呈开放状，在花的发育晚期，除少数能形成较细长的花外，大部分花的花瓣和雄蕊不能正常发育，只见发育的萼片和心皮。该基因可作为目的基因导入其它植物，改变植物的花型，以进行植物品种的改良。
[0010]
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为本发明中CsMADS24全长扩增后的电泳示意图；
图2为本发明表达载体PHB-CsMADS24的PstI和XbaI双酶切电泳检测图；
图3为转基因植株的PCR鉴定图；
图4为过量表达CsMADS24的转基因拟南芥植株的表达分析，其中WT为野生型；1_3为转基因植株株系；
图5为过量表达CsMADS24的转基因拟南芥表型分析，其中㈧和(C)为野生型；(B)和(D)为转基因植株。
【具体实施方式】
[0012]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，这些实施例仅用于举例说明本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。
[0013]实施例中所涉及的试剂主要分为分子生物学实验试剂、各种限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为日本宝生物工程有限公司(大连)产品，质粒提取试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取试剂购自invitrogen公司，高保真酶KOD-Plus购于Τ0Υ0Β0公司，DNase I购于天根生化科技(北京)有限公司，DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。其余试剂均为国产分析纯；仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。所有引物序列均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0014]实施例1:表达载体PHB_CsMADS24的构建
(I) 弓丨物设计:根据 CuGI (http://cucumber, genomics, org.cn/page/cucumber/index, jsp)上公布的黄瓜CsMADS24的序列(Csa017355)，设计两端引物:
CsMADS24-F:5，-aaaaCTGCAGATGAGTTGTTATGAGGAAG-3’(含 PstI 位点)
CsMADS24-R:5，-aaaaTCTAGATTACACAAGTTGAAGAGAG-3’(含 XbaI 位点)。
[0015](2)黄瓜花蕾总RNA的提取
所用黄瓜品种为华北型黄瓜。取长度约0.7 mm的花蕾lmg，取材后立刻冻到液氨中，米用 TRIzol (Invitrogen,USA)试剂法提取总 RNA:加 1.5 ml Trizol 后，室温放置 5 min,使其充分裂解。12，OOOrpm离心5 min，弃沉淀。加200 ul氯仿，振荡混匀后室温放置15min。4°C 12, OOOg离心15 min。吸取上层水相，至另一离心管中。加0.5ml异丙醇，混匀，室温放置30 min。4°C 12, OOOg离心10 min，弃上清。用Iml 75%乙醇洗涤2次沉淀。4°C 8, OOOg 离心 5 min,弃上清。室温晾干 10 min。用 50uL H2O (Rnase free)溶解 RNA。
[0016](3)黄瓜花蕾总cDNA第一链的合成
黄瓜花蕾RNA用DNase I处理后用于以Oligo (dT) 18为引物的反转录:取RNA 15 uL，加Oligo (dT)18 luL，混匀，70°C保温5min，立即冰水浴，稍离心，依次加入10XM-MLV Buffer 2uL、dNTP (1mM) I uL、RNasin (40U/uL) I uL、M-MLV (200U/uL) luL，总体积 20 uL，混匀，42°C保温 60min，95°C 1min 灭活 M-MLV 酶活性，_20°C保存。
[0017](4)CsMADS24 基因的扩增
设计特异性引物:CsMADS24-F:5’ - aaaaCTGCAGATGAGTTGTTATGAGGAAG- 3’(含 PstI位点)CsMADS24-R:5’ - aaaaTCTAGATTACACAAGTTGAAGAGAG_3’(含 XbaI 位点)，以第一链产物为模板，用长片段、高保真酶KOD-PIus进行PCR扩增，PCR反应条件为:94°C 5 min ；94V 30 s ；56V 30 s ；68V 1.0 min，40 个循环；68°C 5 min。PCR 产物用 1.5% 琼脂糖进行电泳检测，扩增片段大小约765bp，与预期大小一致(图1)。
[0018](5)CsMADS24片段的胶回收
对PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳后，切下目的片段，使用胶回收试剂盒，按照试剂盒说明书对目的片段进行回收。
[0019](6) CsMADS24 片段加尾
取1.5 ml灭菌的eppendorf管,依次加入回收的PCR产物14 μ 1、1X Taq DNA聚合酶缓冲液 2 μ l、10mM dNTP 2 μ l.Taq DNA 聚合酶 2 μ I ;72°C处理 45 min ;先加 0.18 mL 无菌水，再加20 μ I 3Μ醋酸钠，混匀，最后加入2倍体积的无水乙醇，_20°C沉淀2hr，12，OOOrpm,4°C离心lOmin。弃上清，75%乙醇洗涤沉淀2次。DNA晾干后加入20 μ L无菌水溶解沉淀，溶解的DNA置于_20°C保存备用。
[0020](7)CsMADS24片段的T/A克隆和测序
将回收片段连接到PMD18载体上，其具体步骤为:向1.5 ml离心管中分别加入:CsMADS24 片段的 cDNA 5 μ l、pMD18 载体(λ 5 μ 1、10XT4 DNA 连接酶缓冲液 I μ 1，Τ4 DNA连接酶1μ 1，加无菌水至10μ 1，用封口膜封好；置于16°C连接4-6h。将100μ I感受态肠杆菌E.coli DH5a加入连接体系中混匀；混合液冰浴30 min，42°C热刺激90 s后，冰浴5min;加入800μ1 LB液体培养基，37 °C、200 rpm摇床培养45min使菌体复苏；培养结束后，常规3，000 rpm离心2 min收集菌体；在超净台上吸去上清,剩余约0.1 ml时,使用移液枪混匀，接入带有Amp抗性的LB固体平板上，用无菌三角棒涂布均匀；37°C过夜培养；挑取菌落接种到带有Amp抗性的LB液体培养基中培养12h，收集菌体，采用质粒抽提试剂盒提取质粒。通过酶切检测获得的重组质粒pMD18-CsMADS24，具体方法为:向0.5 ml的离心管中分别加入:质粒 DNA (50ng/y I) 2μ 1、PstI 0.5 μ 1、XbaI 0.5 μ IUOXbuffer (M) 2 μ 1，使用无菌水补足20 μ I ;37°C反应4h ;然后将酶切正确的重组质粒pMD18-CsMADS24进行测序验证插入基因的正确性。
[0021](8)表达载体PHB_CsMADS24的构建
使用PstI和XbaI对质粒pMD18-CsMADS24和PHB载体进行双酶切，分别获得5’端带有PstI和3’端带有XbaI的CsMADS24片段和PHB载体，电泳后分别进行胶回收，16°C连接4-6h ;将100 μ I感受态肠杆菌Ε.coli DH5 α加入6 μ I连接体系中混匀；混合液冰浴30min，42°C热刺激90s后，冰浴5 min;加入800 μ I LB液体培养基，37°C、200 rpm摇床培养45min使菌体复苏；培养结束后,常规3，000 rpm离心I min收集菌体；在超净台上吸去上清，剩余约0.1 ml时，使用移液枪混匀，接入带有Kan抗性的LB固体平板上，用无菌三角棒涂布均匀；37°C过夜培养；挑取菌落接种于LB液体+Kan的培养基，37°C、180rpm培养12h后，提取质粒。通过酶切检测获得的重组质粒PHB-CsMADS24，具体方法为:向0.5 ml的离心管中分别加入:质粒 DNA (50ng/μ 1)2 μ l.Pstl 0.5 μ l.Xbal 0.5 μ IUOXbuffer (M)2 μ 1，使用无菌水补足20 μ I ;37°C反应4h ;经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测发现，重组质粒PHB-CsMADS24可酶切出预期大小(765bp)的片段(图2)。将酶切正确的重组质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序进行序列验证(其核苷酸序列如SEQ ID NOl所示)，最后获得表达载体PHB-CsMADS24。
[0022]实施例2:PHB-CsMADS24 转农杆菌 GV3101 (I)农杆菌感受态细胞制备
挑取农杆菌GV3101单菌落接种于5ml YEB培养基中，28°C摇培过夜，按1:100的比例接种于50 ml YEB培养基中扩培，28°C继续培养约6_7h至0D600=0.4-0.6。将菌液置于冰上30min ；5, 000 rpm, 4°C离心 5min,弃上清，将菌体悬于 10 ml 0.15 M NaCl 中；5，000 rpm,4°C离心5min，弃上清，菌体用I ml 20 mM CaCl2,4°C )轻轻悬浮，每管200μ1分装，或加入终浓度为20%的无菌甘油，-70°C保存。
[0023](2)农杆菌的转化及鉴定
将10 μ I质粒DNA加入200 μ I农杆菌感受态中，混匀，冰浴30min，液氮冷冻3_5min，37°C水浴5min,加入Iml YEB培养基，28°C摇培3_4h。I, OOOOrpm,室温离心30s,弃上清，加入200 μ I YEB培养基重悬菌体，涂于YEB培养基上，28°C培养2天；碱裂解法提取农杆菌质粒DNA，酶切验证。质粒再重新转化大肠杆菌(DH5 α )，过夜培养后，挑取单菌落液体培养，提取质粒DNA，再用酶切鉴定。
[0024]实施例3:含PHB_CsMADS24的农杆菌GV3101转化拟南芥 (I)拟南芥的种植
①)所用的拟南芥为野生型拟南芥，为江西农业大学作物生理生态与遗传育种重点实验室保存。将当年收获的种子种植后4度春化72 h，隔年种子种植后春化24 h。然后转入人工培养室中在相对湿度80%，恒温20-24°C，光照强度80-200 μ mol/M2/S,光照周期为8 h黑暗、16 h光照培养。所用的土为3份蛭石，I份珍珠岩和2份黑土混合而成。
[0025]②将营养土用塑料盆装好，在托盘里加入营养液，待营养土吸水潮湿后，开始点种。
[0026]③将拟南芥的种子放在平铺的纸上，用牙签将拟南芥的种子点在土上。用保鲜膜盖好，暗培养两天，四天后揭掉保鲜膜正常培养。
[0027]④土稍干时可再浇一次营养液，以后浇水即可。若要做转化，待抽薹2到3cm时，剪除顶花序，用营养液再浇灌一次。
[0028]⑤种子的收集:拟南芥完全成熟后，停止浇水待植株干燥后将拟南芥剪下放在一张干净的光面纸上收集种子，尽量将杂物去干净，便于筛选。
[0029](2)拟南芥的转化和转化子的筛选
①制备好已转化了相应质粒的农杆菌菌液10 ml，在转化前一天晚上，转入大瓶培养过夜，第二天取出使用时农杆菌液0D600当在1.2到1.6之间。室温5，000 rpm离心10min。弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基里，使0D600在0.8左右。
[0030]②先将植株上已长出的果荚及开放的花剪掉，再将农杆菌悬浮液直接喷洒至整个植株，主要喷洒在花序上。盖上透明的塑料盖子以保持湿度，移入恒温室避光培养，第二天可开盖，正常光照培养。
[0031]③一周后再喷洒一次，收种子，在相应的抗性1/2 MS平板上筛选转化子。
[0032]④转化子的筛选:种子消毒，先用70%乙醇浸泡10 min，在上述处理时要不时地使种子悬浮，并换一次70%乙醇。最后用无菌水洗四次。
[0033]⑤处理后的种子用Top agar (0.1%琼脂水溶液)均匀涂布在相应的抗性固体筛选培养基表面，每块150 mm直径的平皿最多种1500棵。
[0034]⑥4°C春化2到3天，移入22°C恒温室培养。将筛选得到的转化子长到合适的大小后移栽到土壤中。
[0035]实施例4:转基因植株的鉴定和分析 (I)拟南芥DNA的提取
将适量的经筛选的拟南芥叶片放入1.5 ml的离心管中，加入400 μ I的SDS抽提缓冲液，用蓝色小棒研磨成浆状，加入等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，猛烈摇匀，12，000rpm，离心10 min。取上清至新的离心管中，加入2倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的3M醋酸钠(PH5.2)，剧烈混匀使DNA成团，放入_20°C沉淀2hr以上。随后12，000 rpm,离心10 min。弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤一次后室温晾干，加适量的TE或超纯水溶解。
[0036](2)转基因拟南芥植株的鉴定
以抽提的 DNA 为模板、使用引物 CsMADS24-Fl:CTGCAGCGTCTTCTCCTCCCG TGGTC 和CsMADS24-Rl:TCTAGATCTGTCTCGGCTATCTTTGC 进行 PCR 扩增 CsMADS24 片段，PCR 的 25 μ I体系为:PCR 缓冲液(10Χ ) 2.5μ 1、Taq 0.5 μ 1、cDNA 模板 2 μ 1、1mM dNTP 0.5μ1、10 μ M CsMADS24-Fl和CsMADS24-Rl引物各1μ 1、使用无菌水补足25μ I。反应条件为:94°C 5min，35 个循环，94°C变性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 60s，72。。反应 1min0 检测结果如图3所示。抽提阳性植株花蕾的总RNA，反转录后合成cDNA第一链，以CsMADS24_Fl和CsMADS24-Rl引物为引物进行RT-PCR分析，反应体系和程序同上。内参为CsACTIN基因，弓丨物序列为:CsACTIN-F: GACATTCAATGTGCCTGCTATG, CsACTIN-R: CATACCGATGAGAGATGGCTG,PCR 的 25 μ I 体系为:PCR 缓冲液(10 X ) 2.5 μ 1、Taq 0.5 μ 1、cDNA 模板 2 μ 1、1mM dNTP0.5 μ 1、10μΜ CsACTIN-F 引物 I μ IUOyM CsACTIN-R 引物 I μ 1、使用无菌水补足 25 μ I。反应条件为:94°C 5min，26个循环，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸60s，72°C反应1min0检测结果见图4所示。
[0037](3)转基因拟南芥植株表型分析通过PCR和RT-PCR的结果，对获得的阳性植物进行观察，获得的CsMADS24转基因植株在花的发育早期呈开放状，在花的发育晚期，除少数能形成较细长的花外，大部分花的花瓣和雄蕊不能正常发育，只见发育的萼片和心皮(图5)。
【权利要求】
1.黄瓜(?嫩0324基因，其特征在于，其核苷酸序列为如3即10勵1所示。
2.—种黄瓜(^1/10324基因花特异表达载体，其特征在于，植物表达载体为户冊-化嫩0324，其含有黄瓜‘-11&6基因嫩0324，基因的上游连有双353启动子。
3.—种黄瓜0^/10324基因花特异表达载体，其特征在于，由下述方法构建而成: 根据。以上登录号为0^017355的仏嫩0324序列设计两端引物，其中嫩0324-？弓丨物引入了？位点，08^0824-1？引物引入了 乂1^1 位点:(?嫩0324-？:5^-88880160^16^611611^16^66^6-3% (?嫩0324-尺:5，- 8888101^6^11^0^0^6116^6^6^6-3^ ,以黄瓜花蕾的⑶嫩第一链为模板进行扩增，获得0^0324全长； 回收0^0324的⑶嫩全长，将其连接到？1018载体上，采用碱裂解法提取质粒0嫩，通过检测和酶切检测获得重组质粒1)1018-(?嫩0324 ； (3)使用和乂1^1酶切1)1018-(?嫩0324，回收(?嫩0324片段，同时用和乂1^1酶切？耶，回收后连接，转化感受态细胞，获得植物表达载体9118-(:8^03240
4.如权利要求3所述黄瓜0^/10324基因花特异表达载体的应用，其特征在于，将获得的植物表达载体？耶48嫩0324转入农杆菌(^3101，再转入到拟南芥中，成熟后收获植株的种子，晾干后通过潮霉素筛选获得抗性苗，再通过卩⑶鉴定和奶-卩⑶检测后获得转基因植株。
【文档编号】C12N15/82GK104450736SQ201410659872
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月19日 优先权日:2014年11月19日
【发明者】胡丽芳, 刘世强, 贺浩华, 杨寅桂, 蒋伦伟, 王义华 申请人:江西农业大学