用于检测人hla-b*27基因的引物、探针、荧光pcr试剂盒和方法

用于检测人hla-b*27基因的引物、探针、荧光pcr试剂盒和方法
【专利摘要】本发明提供用于人HLA-B*27等位基因检测的引物、探针、荧光PCR试剂盒和检测方法，根据“等位基因特异PCR”原理，在实时荧光定量PCR技术平台上检测人白细胞抗原HLA-B*27等位基因。
【专利说明】用于检测人HLA-B*27基因的引物、探针、荧光PCR试剂盒和 方法

【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学临床分子检测领域，具体涉及用于HLA等位基因型HLA-B*27 等位基因检测的引物、探针、荧光PCR试剂盒和检测方法。

【背景技术】
[0002] HLA抗原是人类主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex, MHC)的表达产物，在免疫系统中主要负责细胞之间的相互识别和诱导免疫反应，调节免疫 应答的功能。HLA抗原可分为三类：I类分子为HLA-A、-B、-C系列抗原，广泛分布于各组 织有核细胞表面，包括血小板和网织红细胞，成熟的红细胞一般不含HLA抗原；II类分子为 HLA-D/DR、-DP、DQ系列抗原，主要在B细胞和抗原提呈细胞上表达，这两类抗原都与移植有 关，其中II类抗原更为重要；III类分子为补体成分。编码人类HLA的基因位于第6号染色体 上，是迄今已知基因中等位基因多态性最商的基因复合体，全世界已发现超过2700多种等 位基因，虽然其中多数等位基因非常罕见。HLA基因是人类最复杂的遗传多态性系统，其多 态性分布存在明显的族群特征。
[0003] HLA-B*27属于HLA-B类，呈现显性遗传。研究发现HLA-B*27阳性者患强直性脊 柱炎的概率是阴性患者的200倍?300倍，超过90%的强直性脊柱炎患者携带HLA-B*27抗 原。强直性脊柱炎主要累及脊柱、骶髂关节和周围大关节，其致残率较高。从发病到明确诊 断往往需经过较长时间，在临床上依靠X线片进行诊断，但早期骶髂关节炎症较轻时判断 较为困难。在强直性脊柱炎的早期诊断中，检测HLAB27有着重要的价值，是辅助确诊该病 症的重要依据。HLA-B*27抗原可以通过免疫学的方法来检测。但基因检测可以更加准确， 敏感。
[0004] HLA-B等位基因有800多种。中国汉人中，HLA-B等位基因大概有150种左右， HLA-B*27的携带率达飞％，并呈区域性差异。等位基因间的差异由多个编码氨基酸的SNP 位点组成。
[0005] 目前，国内外对HLA-B*27等位基因进行分析，大多采用PCR-SSCP、测序法（SBT)和 荧光PCR法。测序法最为准备，但需要通过专业软件对测序结果进行分析，检测分析周期 长。PCR-SSCP法是一种经典的方法，通过几对HLA-B*27特异性引物扩增DNA并通过电泳结 果来分析，污染风险大，周期长，不适合临床应用。现行的荧光PCR法，采用染料对扩增的特 异片段产生信号，特异性较弱，而且无法进行PCR反应内控。


【发明内容】

[0006] 本发明针对现有技术检测HLA_B*27等位基因时价格昂贵、周期长、低效率、数据 分析繁琐等不足，提供了一种基于Taqman实时荧光定量PCR技术平台的HLA_B*27等位基 因检测的引物和荧光探针、试剂盒及检测方法，用于检测人HLA-B*27等位基因。本方法针 对临床检测的要求，引入PCR反应内控，保证检测反应的真实性和准确性。本发明快速、成 本低，具有广泛推广价值。
[0007] 为达到上述目的，本发明采用的技术方案是： 一种用于检测人HLA-B*27等位基因的检测引物及其相应探针，根据HLA-B*27特异的 等位基因多态性设计，序列如下所示： 正向引物：HLA-B*27 F: 5, - GGCTACGTGGACGACACGCTGT-3'（ SEQ ID No. 1); 反向引物：HLA-B*27 R: 5，-GCAGGCTCTCTCGGTCAGTCTGTGCC-3'（ SEQ ID No.2) 荧光探针：TM-HLA-B*27: 5' 荧光基团-CGTGAGGITCGACAGCGACGCCGCG -3' 淬灭基团（ SEQ ID No. 3)。
[0008] 本发明还提供了一种用于检测人HLA_B*27等位基因的内控引物对及相应荧光探 针，序列如下所示： 内控引物对： 正向引物：GAPDH F: 5'-GCTGCTTTTAACTCTGGTAAAGTG-3'（ SEQ ID No.4); 反向引物：GAPDH R: 5'-TAGCACTCACCATGTAGITGAG-3'（ SEQ ID No.5); 内控荧光探针：TM-GAPDH: 5'荧光基团-TGATGCATCTATGAACGCTTC-3'淬灭基团（SEQ ID No. 6)。
[0009] 上述检测人HLA-B*27等位基因的探针和内控引物对应的荧光探针5'端的荧光基 团为适用于荧光PCR定量分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM，TET，VIC，HEX或R0X， 3'端的淬灭基团为适用于荧光PCR定量分析的常规使用的荧光淬灭基团，优选BHQ -1、BHQ -2、Dabcyl、Eclipse或TAMRA，更优选的方案为检测荧光探针的5'端连有的荧光基团为 FAM，3'端连有的淬灭基团为BHQ1 ;内控荧光探针的5'端连有的荧光基团为R0X，3'端连有 的淬灭基团为BHQ-2。
[0010] 本发明还提供了一种用于检测人HLA-B*27等位基因的荧光PCR试剂盒，包括本发 明所述检测人HLA-B*27等位基因的检测引物和相应的荧光探针和使用说明书。具体的说， 包括检测人HLA-B*27等位基因的PCR反应液，其中PCR反应液包含了 PCR反应必须的缓冲 液、镁离子、dNTP等物质外，还对应的包含上述检测引物与探针。上述各特异性检测的PCR 反应液分别包含的引物与探针的序列如下： (1)HLA-B*27 PCR 反应液 HLA-B*27 F :5' -GGCTACGTGGACGACACGCTGT -3' ； HLA-B*27 R::5' -GCAGGCTCTCTCGGTCAGTCTGTGCC-3' TM-HLA-B*27 : 5' 荧光基团-CGTGAGGITCGACAGCGACGCCGCG-3' 淬灭基团 上述试剂盒的PCR反应液优选方案中，除了包括检测人HLA-B*27等位基因的检测引 物和相应的荧光探针外，还包括一对内控引物及相应荧光探针，内控引物和探针的序列如 下： 内控引物： GAPDH F: 5' - GCTGCTTTTAACTCTGGTAAAGTG -3' GAPDH R: 5' - TAGCACTCACCATGTAGTTGAG -3' 内控荧光探针： TM-GAPDH: 5' 荧光基团-TGATGCATCTATGAACGCTTC -3' 淬灭基团。
[0011] 上述试剂盒使用说明书包含对PCR扩增条件的描述，优选的PCR扩增条件为：预变 性的条件为：温度为95°C，时间为3分钟； PCR反应由第一阶段和第二阶段构成： 第一阶段由10次扩增循环构成，其条件为： 变性：温度为95°C，时间为20秒； 退火延伸：起始温度为62°C，时间为45秒； 第二阶段由30次扩增循环构成，其条件为： 变性：温度为95°C，时间为20秒； 退火延伸：起始温度为62°C，时间为45秒；（设置荧光信号采集)。
[0012] 本发明还提供了 一种利用上述检测引物和荧光探针或者上述含有的检测 HLA-B*27等位基因的荧光PCR试剂盒进行HLA-B*27等位基因检测的方法，步骤包括： (1) 待测样品处理和模板提取 a. 从待检测者抽取血液样本； b.从血液样本中获取DNA，推荐使用商业化的试剂盒提取外周血基因组DNA ; c. 测定DNA浓度和纯度，要求浓度大于lOng/W ;0D260nm/0D280nm=l. 7?2. 0 ; (2) 荧光PCR扩增： 将待检测模板DNA与一定量的Taq DNA聚合酶加入含有本发明所述检测人HLA_B*27 等位基因的检测引物和相应的荧光探针PCR反应液内，在荧光PCR管内混合均匀离心后，放 入荧光定量PCR仪器按照特定的温度循环及信号采集程序进行PCR反应，优选将待检测模 板DNA与一定量的Taq DNA聚合酶加入含有内控引物及相应荧光探针的上述试剂盒优选方 案的PCR反应液内，在荧光PCR管内混合均匀离心后放入荧光定量PCR仪器按照特定的温 度循环及信号采集程序进行PCR反应，用以监测反应有效性。
[0013] 上述荧光PCR扩增方案优选采用以下温度循环及信号采集程序进行PCR反应： 预变性的条件为：温度为95°C，时间为3分钟； PCR反应由第一阶段和第二阶段构成： 第一阶段由10次扩增循环构成，其条件为： 变性：温度为95°C，时间为20秒； 退火延伸：起始温度为62°C，时间为45秒； 第二阶段由30次扩增循环构成，其条件为： 变性：温度为95°C，时间为20秒； 退火延伸：起始温度为62°C，时间为45秒；（设置荧光信号采集） (3) 分析结果 在上述PCR反应体系与温度循环程序条件下，观察特异性PCR反应体系内目的检测荧 光信号是否形成对数扩增"S"型曲线，如果形成对数扩增"S"型曲线则该待检DNA样本为 该特异性反应体系所代表的HLA-B*27等位基因为阳性。
[0014] 本发明还提供了一种检测人HLA-B*27等位基因的检测引物和相应的荧光探针以 及内控引物及相应探针在检测人HLA-B*27等位基因的应用。
[0015] 本发明还提供了一种含有检测人HLA-B*27等位基因的检测引物和相应的荧光探 针以及内控引物及相应探针的试剂盒在检测人HLA-B*27等位基因的应用。
[0016] 本发明所述技术方案中的有关内容解释如下。
[0017] 1.本发明工作原理是：等位基因特异PCR (Allele Specific PCR，ASPCR)，又称 为等位基因特异性扩增法（Allele Specific Amplification, ASA)或者扩增受阻突变系统 (Amplification Refractory Mutation System ARMS-PCR)，其基本原理是由于 Taq DNA 聚 合酶缺少3' 一 5'外切酶活性，在进行PCR反应时，若引物3'端形成错配，链延伸反应就会 因为3'，5'-磷酸二酯键形成的障碍而受阻，导致PCR产物量急剧减少，在一定扩增循环内， 不会检测出特异的扩增产物；反之，3'端配对则能够检测出扩增产物。于是，针对已知的多 态性位点，将其多态性碱基设计于检测引物的3'端，扩增反应后，通过凝胶电泳观察产物的 有无即可判断多态性位点的碱基类型。
[0018]突光定量 PCR 是（Real-time PCR)是 1996 年由美国 Applied Biosystems 公 司推出的一种新定量实验技术，在PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光 探针，该探针被称"TaqMan探"，为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告突光基团和一个淬灭 荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时，探针结合 在DNA任意一条单链上；PCR扩增时，Taq酶的5'一3'外切酶活性将探针酶切降解，使报 告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
[0019] 通过基于荧光探针的实时荧光PCR技术检测"等位基因特异PCR"反应体系的产 物，根据形成扩增曲线的荧光信号在特定阈值时循环数（Ct值)的大小可判断相应检测体系 内模板相应等位基因的类型。
[0020] 2.本发明所述技术方案中的引物和探针的设计：根据美国国立生物技术信息 中心NCBI的核酸序列数据库GeneBank公开的HLA-B基因的参考序列（NG_023187)以及 英国頂G/HLA数据库公开的HLA-B*27 (HLA00223)的信息，采用ABI公司的Primer Express 3. 0软件分别设计检测HLA-B*27等为基因的引物与探针。为了监测反应体系的有 效性，在检测体系内加入内控引物与探针，本发明选取人类保守基因GAPDH的一段序列（其 GeneBank参考序列编号为：NG_007073. 2)，采用ABI公司的Primer Express 3. 0软件设计 检测引物及探针。
[0021] 本发明所述技术方案中，所述引物（primer)是指由一定数量的dNTP构成的寡核 苷酸序列，通常由DNA合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯 化。在聚合酶链式反应中，引物可与待扩增目的核酸链上与之互补的区域结合，其功能是作 为核苷酸聚合作用的起始点，在引物的3' -0H上，核苷酸以二酯键形式进行合成，因此引物 的3' -0H必须是游离的。DNA聚合酶可由其3'端开始进行延伸，合成新的核酸链。
[0022] 本发明所述技术方案中，所述荧光探针是一种寡聚核苷酸探针，荧光基团连接在 探针的5'末端，而淬灭基团则在3'末端，通常采用DNA合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰 胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化。目前常用的荧光基团有？411，1￡1'，￥1(：，册乂，1?(?等。淬 灭基团有 BHQ -1、BHQ _2、0&1^71、￡(311口86、1六1狀等。
[0023] 3.本发明所述技术方案中，所述的内控引物及其相应的探针可以用来监测反应 有效性的指标，用以判断是否存在模板质量、机器故障、试剂稳定性等因素影响试验结果的 情况。正常情况下，PCR正常扩增会形成的指数级扩增曲线，形象的描述为"S"型扩增曲线， 表明体系正常扩增。当特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号形成对数扩增"S"型曲 线时，为多态性类型的阳性结果，也说明PCR体系扩增正常，无需采用内控引物及其相应的 探针进行结果的验证。然而，当特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号未形成对数扩增"S"型曲线，检测结果为该特异性反应体系所代表的多态性类型的阴性结果，但也有可能是 模板质量、机器故障、试剂稳定性等因素影响试验结果，这种情况下，可以采用内控引物及 其相应的探针进行排除。当特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号未形成对数扩增"S" 型曲线，而内控信号形成正常对数扩增"S"型曲线时，可以验证多态性类型的阴性结果的准 确性。而当特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号未形成对数扩增"S"型曲线，且内控 信号也未形成正常对数扩增"S"型曲线时，则说明实验条件或仪器上出现问题影响试验结 果，而非多态性类型的阴性结果。
[0024] 由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点和效果： 1.本发明技术方案中的检测人HLA-B*27等位基因的检测引物和相应的荧光探针以及 内控引物及相应探针，其PCR检测特异性非常高，并且采用实时荧光PCR技术，检测结果判 读容易，更加适合临床检测。本发明技术方案采用Taqman探针，检测信号比荧光染料根据 特异。
[0025] 2、本发明技术方案中的检测引物与探针价格低廉，而且在实验过程中不需测序， 在节省了检测成本的同时，大大缩短了检测周期，提高了检测的效率。
[0026] 3、本发明技术方案中的检测引物与探针，采用实时荧光PCR技术平台，可实现高 通量检测。
[0027]

【专利附图】

【附图说明】
[0028] 附图1为某HLA_B*27等位基因携带者样本试剂盒检测图。
[0029] 附图2为某样本HLA_B*27等位基因携带者样本测序图。

【具体实施方式】
[0030] 在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理 解的含义。
[0031] 下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只 是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
[0032] 在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，通 常米用常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（NewYork:ColdSpringHarbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的方法。本发明所使用的 荧光定量PCR仪型号为ABI7500或BioRadCFX96。
[0033] 实施例1?引物和探针的设计： 根据美国国立生物技术信息中心NCBI的核酸序列数据库GeneBank公开的HLA-B基因 的参考序列（NG_023187)以及英国IMG/HLA数据库公开的HLA-B*27 (HLA00223)的信息， 采用ABI公司的Primer Express 3. 0软件分别设计检测HLA-B*27等为基因的引物与探针。 引物与探针，具体如下： 正向引物： HLA-B*27F: 5' -GGCTACGTGGACGACACGCTGT-3' 反向引物： HLA-B*27 R: 5' -GCAGGCTCTCTCGGTCAGTCTGTGCC-3' 荧光探针： TM-HLA-B*27:5' Fam- CGTGAGGTTCGACAGCGACGCCGCG-3' BHQ1 为了监测反应体系的有效性，在检测体系内加入内控引物与探针，本发明选取人类 保守基因GAPDH的一段序列（其参考序列编号为：NG_007073. 2)，采用ABI公司的Primer Express 3. 0软件设计检测引物及探针，具体序列如下所示： 内控引物对： 正向引物：GAPDH F:5' - GCTGCITTTAACTCTGGTAAAGTG -3' ； 反向引物：GAPDH R:5' _ TAGCACTCACCATGTAGTTGAG _3' ； 内控荧光探针： TM-GAPDH: 5' Rox- TGATGCATCTATGAACGCTTC -3' BHQ2。
[0034] 实施例2.引物的制备 将设计好的引物及探针序列交由合成公司合成，一般采用仪器自动化学合成，需提供 合成检验合格报告。
[0035] 实施例3 :荧光PCR检测人HLA-B*27等位基因的试剂盒的准备 制备检测人HLA-B*27等位基因反应液，其中PCR反应液包含了 PCR反应必须的缓冲 液、镁离子、dNTP等物质外，还包含了检测引物与探针和内控弓丨物与探针。上述各特异性检 测的PCR反应液组分浓度及包含的引物与探针的序列信息如下： 表1. PCR反应液组分

【权利要求】
1. 一种用于检测人HLA-B*27等位基因的检测引物及其相应探针，其特征在于所述检 测引物及探针根据HLA-B*27等位基因特异位点设计，序列如下所示： 正向引物： HLA-B*27 F: 5' - GGCTACGTGGACGACACGCTGT -3' 反向引物： HLA-B*27 R: 5' - GCAGGCTCTCTCGGTCAGTCTGTGCC -3' 荧光探针： TM-HLA-B*27: 5' 荧光基团-5' CGTGAGGITCGACAGCGACGCCGCG -3' 淬灭基团。
2. -种用于检测人HLA-B*27等位基因的内控引物对及相应荧光探针，其特征在于所 述内控引物对及相应荧光探针的序列如下所示： 内控引物对： 正向引物：GAPDH F: 5 ' -GCTGCTTTTAACTCTGGTAAAGTG-3 ' 反向引物：GAPDH R: 5' -TAGCACTCACCATGTAGTTGAG-3' 内控荧光探针： 荧光探针：TM-GAPDH: 5' 荧光基团-TGATGCATCTATGAACGCTTC-3' 淬灭基团。
3. 如权利要求1-2所述的引物对及相应荧光探针，其特征在于所述荧光探针5'端的荧 光基团为？41^￡1\￥1(：、冊乂或1?(?，3'端的淬灭基团为冊〇-1、8即-2、〇31^71、￡(311口86、 或 TAMRA。
4. 一种用于检测人HLA-B*27等位基因的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括权利要 求1所述的检测引物及其相应探针和/或括权利要求2所述的检测引物及其相应探针。
5. 如权利要求4所述的检测人HLA-B*27等位基因的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还 包括如权利要求2所述内控引物对及相应荧光探针。
6. -种人HLA-B*27等位基因的检测方法，所述方法包括使用权利要求1和/或权利要 求2所述的引物及探针。
7. -种人HLA-B*27等位基因的检测方法，所述方法包括使用权利要求4-5所述的试剂 盒。
8. 权利要求1-2所述的引物及探针在检测人HLA-B*27等位基因中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK104450913SQ201410746943
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月10日 优先权日:2014年12月10日
【发明者】王进, 吴梦华, 吴子侠, 赵小龙, 彭飞 申请人:苏州旷远生物分子技术有限公司