一种利用原花青素抑制镰刀菌产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素的方法和应用与流程

本发明属于食品安全领域，具体涉及一种利用原花青素抑制镰刀菌产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素的方法和应用。

背景技术：
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粮食和水果是人们赖以生存的主要食品来源。近年来随着物流保鲜技术的提高，粮食和水果得以远距离的运输到千家万户，然而从采收、运输、货架销售直至消费者的物流过程中，易受到的机械损伤，加上贮藏环境的高温、高湿和高二氧化碳，容易滋生病原菌。并且，食品在二次加工过程中，例如蔬菜腌制、水果榨汁，亦容易滋生病原菌。这些病原菌除了导致食品腐败，还会产生真菌毒素。目前常见的真菌毒素有：黄曲霉毒素、伏马毒素、玉米赤霉烯酮、单端孢霉烯族、赭曲霉毒素等。它们都能对人体造成严重的病理反应，在动物试验中发现长期微量毒素的摄入会有致癌、致畸现象。

镰刀菌属(Fusarium)是粮食和水果病原真菌中分布广泛并影响巨大的一类真菌。粮食中常见的有造成水稻恶苗病、马铃薯干腐病的串珠镰孢(F.moniliforme)，引起小麦赤霉病的禾谷镰孢(F.graminearum)等。而香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌(F.oxysporum)导致，香蕉冠腐病则是由串珠镰孢(F.moniliforme)、亚粘团串珠镰孢(F.moniliforme var.subglutinans)半裸镰孢(Fusarium semitectum)、双胞镰孢(F.dimerum)导致的。层出镰刀菌(F.proliferatum)，由杨桃分离，并被发现能够侵染多种作物，该菌具有镰刀菌属的典型产毒特征，能够产生的毒素有：伏马毒素，单端孢霉烯族毒素，玉米赤霉烯酮等主要的镰刀菌毒素。其中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)属于单端孢霉烯族，它对人或动物免疫具有抑制作用，轻者会导致呕吐现象，重者损害造血系统(Wayne L.Bryden.Mycotoxin contamination of the feed supply chain:Implications for animal productivity and feed security.Animal feed science and technology,2012,173(1-2):134-158)。

为防治病害，越来越多的抑菌剂和杀菌剂被投入使用。例如：丙酸、丙酸盐、异菌脲、噻菌灵、二氧化硫。尤其是在欠发达国家或地区，由于冷链物流技术、装备和条件相对落后，生产商偏向于选用廉价的防腐保鲜药剂如咪鲜胺、多菌灵，这些杀菌剂存在一定毒性；另一方面，杀菌剂的广泛使用使得病菌逐渐产生抗药性，因而人们不得不加大剂量。一个不容忽视的后果是，杀菌不彻底导致真菌抗逆性被激活，促进毒素相关基因表达，毒素生成量进而大幅度提高。此外，逆境胁迫，如：氧化胁迫和酸性环境也可以促进毒素的产生。因此杀菌剂使用不当不仅不能有效控制病害，而且为食品安全埋下隐患。

近年来，随着人们对食品安全的关注度越来越高，无论是国内还是国际上，均对毒素有严格的限量规定。在出口贸易方面，真菌毒素的最高限量极其严苛，相当大一部分的食品贸易损失是因毒素超标造成，所以如何在防控真菌感染的同时降低真菌毒素的产量，被视为食品产业的重中之重。当前抑制食品毒素累积的措施有：(1)前期预防，喷洒杀菌抑菌的药物；(2)中期清除，及时清理坏果病果；和(3)后期化学降解、物理降解或净化，例如采用铝矽酸盐、活性碳和聚合物吸附毒素物质。但是一旦毒素大量存在，现有的方法很难将其彻底脱除。因而降低毒素积累的措施主要为上述(1)和(2)。因而研发降低毒素的积累、食用安全，又可提高食品品质的毒素清除剂具有重要意义。

原花青素(procyanidins)最早是从山楂和葡萄皮、葡萄籽中提取的，加热后能产生花青素的一类多酚化合物。后来在黑枸杞、沙棘籽、马尾松树皮、荔枝皮等植物组织中均发现有原花青素存在。其中低聚体的原花青素(Oligimers procyanidolic,OPC/PCO)由儿茶素和表儿茶素缩合而成，通常为二到四聚体。OPC由于含有多个酚羟基，当被氧化后会释放出氢离子，因而具有良好的抗氧化活性，约为维生素E的50倍。有研究发现，植物果实中提取的原花青素能够提高动物体内超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性，对自由基具有良好的清除能力。同时，该物质对人体并无明显毒副作用，目前已常被用于药品、化妆品、保健品当中，起清除氧自由基、抗衰老、抗肿瘤、抗菌等作用(张妍，吴秀香。原花青素研究进展。中药药理与临床，2011，27(6)：112-115)。此外，OPC可作为一种天然安全的防腐剂用于食品的保鲜。OPC为暗红色粉末状，易溶于水，高温易降解，在40℃以下稳定，其光稳定性较差，Vc和亚硫酸氢钠能提高OPC的稳定性。

原花青素的结构式如式(Ⅰ)所示：

技术实现要素：
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本发明的第一个目的是提供一种原花青素在抑制镰刀菌产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)毒素中的应用。

本发明的第二个目的是提供原花青素在脱除或降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素中的应用。本发明具体提供原花青素在制备抑制镰刀菌产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素的制剂中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种利用原花青素抑制镰刀菌产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素的方法，将镰刀菌接种于添加有原花青素的培养基中进行培养。

优选地，所述的镰刀菌为层出镰刀菌。

本发明所述的层出镰刀菌，选择能够导致多种粮食、水果发病的致病菌层出镰刀菌。

优选地，所述的添加有原花青素的培养基为添加了浓度为0.05～1.0g/L的原花青素的察氏培养基。本发明所述的察氏培养基为察氏固体培养基和察氏液体培养基。

根据实际情况可以添加Vc和Ve混合使用，以增加效果。

本发明的有益效果是：本发明提出的利用原花青素抑制镰刀菌产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素的方法，其按照本发明提出的量来添加原花青素，能够降低镰刀菌30％～80％产毒量，其可以降低毒素的积累，从而保证食品的安全。

附图说明：

图1是实施例1的OPC对真菌菌落生长的影响情况；

图2是实施例1的OPC对真菌菌落生长大小的影响记录；

图3是实施例1的OPC对真菌产毒的抑制影响。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：原花青素A₂制备分离和结构鉴定。

1、材料：

真菌：层出镰刀菌(F.proliferatum)，由杨桃分离并进行形态和分子鉴定，发现能侵染多种植物。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato dextrose agar medium，PDA)：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000mL煮沸30min，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000mL，加葡萄糖20g和琼脂15g，溶化分装后121℃灭菌20min。

察氏固体培养基(Czapek’s agar medium，CA)：硝酸钠3.0g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.5g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，蔗糖30g/L，琼脂20g/L，将上述成分按其含量溶于水中，于121℃灭菌20min。

察氏液体培养基(Czapek’s broth medium，CB)：硝酸钠3.0g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.5g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，蔗糖30g/L，将上述成分按其含量溶于水中，于121℃灭菌20min。

2、处理方式：

将层出镰刀菌接种PDA后，28℃培养7天，以活化菌种待用。

将高温灭菌的CA放置于超净工作台中，待冷却至60℃以下，分别添加0.05g/L、0.10g/L、0.20g/L、0.50g/L、1.00g/L的OPC(原花青素)后，迅速摇匀，分装20mL培养基到每一个培养皿中，待凝固后从PDA平板上接种层出镰刀菌到各个CA板，28℃培养箱中倒置培养7天。

用打孔器在PDA平板上的菌落边缘打直径为5mm的菌碟。在每个盛100mL CB的三角瓶(250mL)中分别添加0.05g/L、0.10g/L、0.50g/L、1.00g/L的OPC后，每瓶接种3片菌碟，于28℃下振荡(120rpm)培养7d后，过滤除去菌丝，待进行毒素的提取鉴定。

3、抑菌影响及抑毒影响

培养1、4、7天时，对CA培养平板上的菌落情况进行观察，并用游标卡尺测量菌落生长大小，进行记录。

取20mL的菌液，与20mL正己烷混合分层后，除去上层正己烷相。加入20mL乙酸乙酯提取，混合后离心3000g，4℃，5min分层。用乙酸乙酯提取3次后，对所得乙酸乙酯相进行旋蒸得到样品，溶于100％甲醇待测。

对样品进行毒素的定量分析是由高效液相色谱-串联质谱系统(AB SCIEX公司，美国)即HPLC-MS/MS进行的。样本(10μL)被注入到一个Ekspert 100高效液相色谱柱(C18色谱柱，100×2.1mm，3μm颗粒大小，Thermo,USA)。使用温度35℃，流动相(A：乙腈和B：0.1％乙酸)。流动相1分钟内从10％增加至15％，1到7.5分钟增加至65％，然后从7.5至9.5分钟下降到10％，并于该浓度持续额外的0.5分钟，最后返回到初始条件。

泵的流量为0.5mL/min，在450℃条件下以氮气作为雾化气体。电喷雾电离(ESI)选择[M-H]-。脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的母离子设置为m/z 295.1，子离子设置为m/z 265.1和138。质谱分析条件为：离子喷雾电压-4500V，入口电压-10V，出口电压-17V，锥孔电压-60V及碰撞能量-15/-21V，定量的检测限为0.1ng/mL。

4、实验结果及分析

结果如图1、2所示，OPC处理CA培养基后，层出镰刀菌的菌落形态与对照组的差异在低浓度时有轻微的促进的现象，0.5g/L和1.0g/L的处理对菌落并没有明显的影响。

如图3所示，OPC处理CB培养基后，对层出镰刀菌产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)毒素具有明显的影响，随着处理浓度的提高，其产生毒素的量明显下降。说明OPC抑制了真菌产生该毒素。

从结果可以看出：OPC具有显著的降低真菌产毒的作用，1.0g/L的OPC处理保鲜效果最好；OPC处理有浓度效应，即浓度越高降低效果越好。

本发明提出的利用原花青素抑制镰刀菌产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素的方法，其按照本发明提出的量来添加原花青素，能够降低镰刀菌30％～80％产毒量，其可以降低毒素的积累，从而保证食品的安全。

以上对本发明提供的原花青素抑制镰刀菌产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素的方法进行了详细的介绍，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。