专利名称：含有卤代过氧化物酶的酶促抗微生物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及酶促抗微生物组合物及其应用。更具体地说，涉及含有钒卤代过氧化物酶(Vanadium haloperoxidase)，过氧化氢源和卤化物源的酶促抗微生物组合物。本发明还涉及采用重组DNA技术生产钒卤代过氧化物酶，该盐可用于酶促抗微生物组合物中。
现有技术背景各种酶促抗微生物组合物是本领域内已知的。例如，WO-A-94/04217公开了稳定的牙膏组合物，该组合物能够产生抗微生物有效浓度的低硫氰酸离子(OSCN-)。该组合物含有产生过氧化氢的氧化还原酶和能够将硫氰酸盐离子氧化为抗微生物的低硫氰酸离子(OSCN-)的过氧化物酶，所说的硫氰酸盐离子通常存在于唾液中。合适的过氧化物酶包括乳过氧化物酶，髓过氧化物酶，唾液过氧化物酶和氯过氧化物酶。
在EP-A-500387(Exoxemis)也公开了含有卤代过氧化物酶的酶促抗微生物组合物。该文献描述了在过氧化物和卤化物存在下卤代过氧化物酶选择性地结合到靶微生物上并抑制其生长。EP-A-500387介绍的合适的卤代过氧化物酶是髓过氧化物酶(MEP)，嗜酸性粒细胞(EPO)，乳过氧化物酶(LPO)，和氯过氧化物酶(CPO)。报道了就卤代过氧化物酶的稳定性和功能而言卤化物与过氧化氢的比例是关键因素。在非常低的比例时，过氧化氢可以抑制卤代过氧化物酶的功能，而在非常高的比例时，卤化物可以阻碍酶促反应。该比例可以在一个宽范围内变化，但是优选的是保持在约50以上。
由于存在过氧化氢的不希望有的副反应，在该抗微生物组合物中实际的过氧化氢浓度比预期的要低。因此，本发明人发现在该抗微生物组合物中使用高起始浓度的过氧化氢以及常规量的卤化物可能更令人满意。
再者，需要一种与已知酶促抗微生物组合物的抗菌活性谱不同的酶促抗微生物组合物。优选地，该组合物应该具有抗击难于抵抗的微生物例如粪链球菌的抗菌活性。在其它环境下，还能够抗击非致病微生物也是所期望的，因为这些微生物可以引起食品的腐败。
因此本发明的目的是提供一种酶促抗微生物组合物，该组合物克服了上面所说的一种或多种缺点。
现在我们惊奇地发现使用钒卤代过氧化物酶可以配制特别有效的酶促抗微生物组合物。
上面介绍的现有技术包括用于抗微生物组合物中的各种各样卤代过氧化物酶，但是至今为止没有特别注意到钒卤代过氧化物酶类。
钒卤代过氧化物酶类不同于其它的卤代过氧化物酶，不同点在于这些酶的辅基具有类似于钒酸盐(钒V)的结构特征，而其它的卤代过氧化物酶是血红素过氧化物酶。
本发明的进一步的目的是将编码一种钒卤代过氧化物酶的基因进行克隆并且测定其序列以便其在其它便于生长的微生物中进行表达，以及利用重组DNA技术提高该酶的产量。
在天然海藻的表面发现了一些钒溴过氧化物酶(Wever et al.，1991)。在海水中的完整植株中钒溴过氧化物酶易于受添加物质的影响并且通过加入过氧化氢能够释放HOBr。尚没有确立该酶的作用，但是在海水中形成高氧化性的HOBr可能是作为植物阻碍微生物或真菌在其表面上生长的防御系统的一部分。
在从结节囊叶藻中发现非血红素钒溴过氧化物酶之后，证明了大量的海藻品种也含有这些酶。特别是，已经对从结节囊叶藻中发现的溴过氧化物酶进行了广泛的研究和定性(作为评论，见参考文献)。这些酶的辅基具有类似于钒酸盐(钒V)的结构特征。这些酶的催化机理是过氧化物酶与该酶发生反应以形成过氧化氢-酶复合物，之后溴化物和一个质子与该复合物发生反应以形成一个酶-HOBr复合物。已经证明(De Boer et al.，1988)该复合物衰变形成酶和HOBr。还证明这些钒溴过氧化物酶(De Boer et al.，1988)在水和有机介质中具有操作上的高度稳定性。例如，在周转条件下三星期内这些酶是稳定的并且在有机溶剂例如丙酮，甲醇，乙醇(含量高达60％)和1-丙醇中可储存一个月以上的时间，而不丧失活性。但是，这些酶有不利的一面，即在实际应用时必须有溴化物的存在或加入，将编码海藻的溴过氧化物酶的基因克隆以及测定其氨基酸序列的尝试没有取得成功。
由于其遗传不稳定性和其低最适PH为2.75(J.R.Kanofsky，1984)(这些特性严重限制了其应用)现存的已知来自烟色卡尔黑酶的含有血红素的氯过氧化物酶几乎不适合于制备酶促抗微生物组合物，类似争论阻碍了来自人白血细胞的髓过氧化物酶(MPO)的应用，该酶也能产生HOCl(A.R.J.Bakkenist et al.，1980)。
也有人报道(见参考文献8，9)暗色孢丝状菌分泌具有明显稳定性的卤代过氧化物酶。特别是已经证明陆生真菌不等弯孢霉分泌一种钒氯过氧化物酶(J.W.P.M.Van Schijndel等人，1993)，该酶与氯化物具有高亲和力并且在参与氯化反应时具有最适pH5.5。在利用来自海藻的溴过氧化物酶时，氯过氧化物酶的辅基具有类似于钒酸盐(钒V)的结构特性。在随后的更详细研究(J.W.P.M.Van Schijndel等人，1993)中，由过氧化氢氧化氯化物的酶动力学类似于来自结节囊叶藻的钒溴过氧化物酶。此外，三种不同的方法显示该酶产生一种反应产物被氧化的氯类(HOCl)并且该产物对其本身有抗性。该酶显示高度热稳定性(Tm90℃)并且在有机溶剂例如40％甲醇，乙醇和丙醇中具有高度的稳定性。
发明概述第一方面，本发明涉及一种酶促抗微生物组合物，它含有钒卤代过氧化物酶，卤化物和过氧化氢源或过氧化氢源。
根据第二方面，本发明涉及钒卤代过氧化物酶的生产，包括借助于一种表达载体转化合适的宿主(载体中含有一复制原点，转录及终止控制序列和至少部分编码钒卤代过氧化物酶的DNA序列)，在允许结构基因表达的条件下培养该宿主并且分离钒卤代过氧化物酶。
发明详述
(a)钒卤代过氧化物酶本发明的酶促抗微生物组合物含有作为第一成分的钒卤代过氧化物酶。原则上该钒过氧化物酶选自于已在现有技术中公开的各种钒卤代过氧化物酶。例如可以使用从不等弯孢霉产生的钒卤代过氧化物酶(非血红素)，如US-A-4707466描述的。另一种可用的方法是根据J.W.P.M.Van Schijndel等人(1993)的描述从不等弯孢霉(CBS102.42)中分离或纯化氯过氧化物酶。
其它的钒卤代过氧化物酶的来源包括Drechslera biseptata(CBS 371.72)，Drechslera fuqax(CBS 509.77)，Drechslera nicotiae(CBS 655.74)，Drechslera subpapendorfii(656.74)，Embelisia hyacinthi(416.71)，Embelisia didymospora(CBS 766)，Ulocladium chartarum(200.67)和Ulocladium botrytis(452.72)。
另一种可用的方法，可采用重组DNA技术制备钒卤代过氧化物酶，包括借助于一种表达载体转化合适的宿主，所说载体含有一种复制原点，转录或终止控制序列和编码钒卤代过氧化物酶的DNA序列，在允许结构基因表达的条件下培养该宿主并且分离钒卤代过氧化物酶。在下文的实施例中将进行详细描述。
(b)卤化物离子源本发明的卫生组合物的第二组成成分是卤化物离子源。它们可以是任何卤化物离子源，但碘化物或氯化物离子是优选的，因为它们是最有效的。氯化钠是最有效的卤化物离子源。可将该卤化物加到本发明的酶促抗微生物组合物中，或者可用天然存在于自来水中的卤化物代替，其用量通常为2-5mM。
(c)过氧化氢源本发明的卫生组合物进一步包括过氧化氢源或者产生过氧化氢的系统。合适的产生过氧化氢的系统是过硼酸或过碳酸盐，优选的是过碳酸钠或者过硼酸钠。
由酶促过氧化氢产生系统也可以提供过氧化氢。原则上酶促过氧化氢产生系统可以选自于在现有技术中公开的各种酶促抗菌过氧化物产生系统。例如，可以使用胺氧化酶和胺，氨基酸氧化酶和氨基酸，乳酸氧化酶和乳酸，胆固醇氧化酶和胆固醇，尿酸氧化酶和尿酸或者黄嘌呤氧化酶和黄嘌呤，优选的是，葡萄糖氧化酶和葡萄糖的组合。
葡萄糖氧化酶的量将取决于其比活和可能存在的任何残留的过氧化物酶的活性，一般来说本发明的去污剂组合物每毫升或每克含有10-1000，优选的是20-500单位的葡萄糖氧化酶，每单位酶活性的定义是在标准状态下每分钟转化1μmol的底物所需的量。
(d)其它成分本发明的酶促抗微生物组合物通常含有重量百分比为0.01-50％，优选的是0.1-5.0％的一种或多种表面活性剂作为增湿剂。合适的表面活性剂或去污剂活性化合物是肥皂或非肥皂阴离子，非离子，阳离子，两性或两性离子化合物。表面活性剂系统通常含有一种和多种阴离子表面活性剂和一种或多种非离子表面活性剂。该表面活性剂系统另外还含有两性或两性离子去污剂化合物，但是由于其费用相对较高，通常不能令人满意。
一般地说，该表面活性剂系统的非离子和阴离子表面活性剂可以选自于由Schwartz&Perry，Interscience 1949，Vol.1“表面活性剂”，和由 Schwartz，Perry & Berch，Interscience 1958，Vol.2，由Manufacturing Confectioners Company出版的“McCutcheon’sEmulsifiers and Detergents”通行版或者“Tenside-Taschenbuch”，H.Stache，第二版.，Carl Hauser Verlag，1981描述的表面活性剂。
可以使用的合适的非离子去污剂化合物特别包括具有一个疏水基团和一个反应性氢原子的化合物例如脂族醇，酸，酰胺或者烷基酚与烯烃氧化物，尤其是单独的环氧乙烷或结合环氧丙烷的环氧乙烷的反应产物。特定的非离子去污剂化合物是C6-C22烷基酚-环氧乙烷缩合物(通常每分子含有5-25EO，即5-25单位的环氧乙烷)，和脂族C8-C18一级或二级线性或支链醇与环氧乙烷的反应产物，通常5-40 EO。
可以使用的合适的阴离子去污剂化合物通常是有机硫酸酯和磺酸酯的水溶性碱金属盐，它含有约8-22个碳原子的烷基，所使用的术语烷基包括高级酰基的烷基部分。合适的合成阴离子去污剂化合物的例子是烷基硫酸钠和钾(尤其是通过使高级的C8-C18醇硫酸化，从例如脂油或可可油产生的)，烷基C9-C20苯磺酸钠和钾，特别是线性二级烷基C10-C15苯磺酸钠，和烷基甘油醚硫酸钠，尤其是从脂油或可可油衍生的高级醇的醚和从石油衍生的合成醇的醚。优选的阴离子去污剂化合物是C11-C15烷基苯磺酸钠和C12-C18烷基硫酸钠。
也可以使用在EP-A-328177(Unilever)中描述的那些表面活性剂(这些表面活性剂显示对盐析有抗性)，在EP-A-070074中描述的烷基聚葡萄糖苷表面活性剂和烷基单葡萄糖苷。
优选的表面活性剂系统是阴离子和非离子去污剂活性物质的混合物，特别是在EP-A-346995(Unilever)指出的阴离子和非离子表面活性剂组和例子。尤其优选的是C16-C18一元醇硫酸碱金属盐和3-7 EO乙氧基化C12-C15一元醇混合物的表面活性剂系统。
优选地该非离子去污剂在表面活性剂系统中所占的重量大于10％，例如25-90％。例如阴离子表面活性剂在表面活性剂系统中所占的重量为约5％-40％的范围内。
本发明的酶促去污剂组合物还可以包括通常用于抗微生物组合物中的其它成分，例如增稠剂。有关这一点特别适用的是在EP-A-314232(Unilever)公开的表面活性剂的组合，该文献提供了可溶于水中的增稠凝胶。
本发明的抗微生物组合物可用于清洁坚硬表面和洗涤织物，但是也可以用于工业或研究机构例如医院的卫生和清洁以及用于清洁和消毒医疗设备。其它的应用是在制奶工业上用于消毒制奶设备。由于其具有抗引起恶臭的细菌的能力，该抗微生物组合物也可成功地用于除臭。
本发明的抗微生物组合物可以以在使用之前需溶于水中的粉末形式使用，但是也可以配制成液体产品或凝胶。在那些产品形式中直到该组合物被使用之前不会启动次卤酸盐的产生是重要的。通过将酶与其底物分隔开，例如通过采用已知技术将酶包被起来可做到这一点。
在使用抗菌酶促组合物时，通过加水稀释5-100倍以便制备具有效抗菌活性的介质。然后将它与待消毒和被允许使用的表面接触。参考文献1.R.Wever，M.G.M.Tromp.B.E.Krenn A.Marjani和M.van Tol.结节囊叶藻的溴化活性对生物圈的影响。Envir.Sc.Techn.25(1991)，446-449.
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借助于下面非限制性实施例可进一步阐述本发明。
实施例1次氯酸盐的最低抑制浓度(MIC)材料在本实施例中使用的细菌菌株是大肠杆菌NCTC900，铜绿假单胞菌ATCC15442，金黄色葡萄球菌ATCC13565，粪链球菌NCTC1092和无害利斯特菌ATCC33090血清型6B。在脑心浸汁(BHI)肉汤培养基中，30℃将细菌培养15-18小时后，将菌株在pH5.5柠檬酸缓冲液(20mM柠檬酸三钠-NaOH缓冲液+10mM NaCl)中洗涤两次。将细菌悬液在Eppendorf离心机上离心(14000rpm，5分钟)，然后去除上清液并且将细菌沉淀悬浮于柠檬酸缓冲液中。对各种细菌悬液重复该洗涤步骤一次。然后用pH5.5柠檬酸缓冲液稀释该经过两次洗涤的细菌悬液以获得每毫升约107细菌的悬液。在洗涤步骤进行过程中，细胞保持在冰浴中。将缓冲液和BSA溶液(1％w/v溶于pH5.5柠檬酸缓冲液中)过滤灭菌并且储存于4℃。通过用无菌的去离子水稀释而从贮液(107,000ppm)制备次氯酸盐溶液。
方法利用无菌操作技术，制备溶于pH5.5柠檬酸缓冲液中的每毫升约107细菌的悬液。取该悬液1.9ml加入到无菌试管中。0.1ml各种浓度的冷次氯酸盐溶液加到这些试管中，以获得各种稀释度的次氯酸盐。然后用一个磁棒搅拌器分别将这些试管混匀。空白测定是使用无菌缓冲液替代次氯酸盐溶液。在30℃将样品准确保温5分钟。然后取1ml反应混合物，加入到9ml冷BSA(1％w/v)溶液中并且立即置于冰浴中，以终止次氯酸盐与微生物的反应。将样品从10-1稀释到10-5并且将各个稀释液的100μl样品置于标记的BHI琼脂平板上培养，以每毫升中的克隆形成单位(CFU)表示成活率。在30℃将平板培养15-18小时后，如果未检测到CFU，则在30℃将平板再培养24小时。
定义本文中最低抑制浓度(MIC值)定义为在所使用的实验条件下导致所检测的特定微生物的克隆形成单位至少降低六个数量级所需的次氯酸盐的浓度。
结果示于表1。其中的数值的范围与文献报道的相同。
表1.各种微生物的MIC值
实施例2次氯酸盐的最低抑制浓度和由来自不等弯孢霉的钒氯过氧化物酶(V-CPO)酶促产生的次氯酸盐在本实施例中，将次氯酸盐的致死效果与由来自不等弯孢霉的钒氯过氧化物酶(V-CPO)酶促产生的次氯酸盐的致死效果进行比较。为了进行比较，使用了一个微泵。这一步骤可以在按照类似于酶促产生次氯酸盐的实验制备次氯酸盐浓度。在该实验条件下还非常仔细地确定V-CPO活性，从而可以知道在实验的每个时间点存在的次氯酸盐的量。
材料在本实施例中使用的细菌菌株是大肠杆菌NCTC900，铜绿假单胞菌ATCC15442，金黄色葡萄球菌ATCC13565，粪链球菌NCTC1092和无害利斯特菌ATCC33090血清型6B。在脑心浸汁(BHI)肉汤培养基中，30℃将细菌培养15-18小时。在培养之后，将菌株在pH5.5柠檬酸缓冲液(20mM柠檬酸三钠-NaOH缓冲液+10mM NaCl)中洗涤两次。将细菌悬液在Eppendorf离心机上离心(14000rpm，5分钟)，然后去除上清液并且随后将细菌沉淀悬浮于柠檬酸缓冲液中。然后对于各种细菌悬液重复该洗涤步骤一次。然后用pH5.5柠檬酸缓冲液稀释该经过两次洗涤的细菌悬液以获得每毫升约107细菌的悬液。在洗涤步骤进行过程中，细胞保持在冰浴中。将缓冲液和BSA溶液(1％w/v溶于pH5.5柠檬酸缓冲液中)过滤灭菌并且储存于4℃。通过用无菌的去离子水稀释而从贮液(107,000ppm)制备次氯酸盐溶液。通过用无菌去离子水稀释从30％贮液制备过氧化氢溶液。酪蛋白水解物从Difco获得。根据Van Schijndel等人，(1993)的方法从不等弯孢霉纯化氯过氧化物酶。在30℃在20mM pH5.5柠檬酸钠缓冲液，10mM氯化钠，100μM过氧化氢，50μM一氯双甲酮中通过将一氯双甲酮(e290nm＝20.2mM-1.cm-1)转化为二氯双甲酮(e 290nm＝0.2mM-1.cm-1)之后用分光光度计确定氯过氧化物酶将Cl-转化为HOCl中的活性。一个单位的氯过氧化物酶的定义是在每分钟转化1μmol的一氯双甲酮(Sigma)所需的酶量。
方法利用无菌操作技术，制备溶于pH5.5柠檬酸缓冲液中的每毫升约107细菌的悬液。从该悬液取1.8ml样品加入到无菌的反应容器中，在整个实验期间用磁棒搅拌器连续搅动。随后0.2ml各种浓度的冷V-CPO溶液加到这些容器中，以获得不同稀释度的V-CPO溶液(其计算方法，见下文)。空白测定是用加入0.2ml无菌缓冲液替代0.2mlV-CPO溶液。在30℃将反应容器保温。然后加入0.5ml的过氧化氢贮液，以便启动V-CPO反应。所使用的过氧化氢贮液的浓度依据所产生的次氯酸盐浓度而定，并且按照与次氯酸盐的终浓度相比过氧化氢的终浓度(在流动结束时)是五倍摩尔过量的方式进行选择。在30℃将样品准确保温5分钟。然后取1ml反应混合物，加入到9ml冷BSA(1％w/v)溶液中并且立即置于冰浴中，以终止次氯酸盐与微生物的反应。将样品从10-1稀释到10-5并且将各个稀释液的100μl样品置于标记的BHI琼脂平板上培养，以每毫升的克隆形成单位(CFU)表示成活率。然后在30℃将平板培养15-18小时。如果未检测到CFU，则在30℃将平板再培养24小时。
将所获得的MIC值与使用一个微泵加入同样量的次氯酸盐获得的MIC值进行比较。该步骤按如下方法完成利用无菌操作技术，制备溶于pH5.5柠檬酸缓冲液中的每毫升约107细菌的悬液。从该悬液取1.8ml样品加入到无菌的反应容器中，在整个实验期间用磁棒搅拌器连续搅动。在30℃将反应容器保温。然后加入0.2ml的过氧化氢贮液，所使用的过氧化氢贮液的浓度依据所产生的次氯酸盐浓度而定，并且按照与次氯酸盐的终浓度相比过氧化氢的终浓度(在流动结束时)是五倍摩尔过量的方式进行选择。然后在30℃5分钟的时间内将已知浓度的次氯酸盐溶液0.5ml流出物(流速0.1ml/分钟)上样。分别利用不同浓度的各种次氯酸盐溶液完成一系列的实验，以便获得一系列的次氯酸盐终浓度(其计算见下文)。保温5分钟之后，取1ml反应混合物，加入到9ml冷BSA(1％w/v)溶液并且立即置于冰浴中，以终止次氯酸盐与微生物的反应。将样品从10-1稀释到10-5并且将各个稀释液的100μl样品置于标记的BHI琼脂平板上培养，以每毫升中的克隆形成单位(CFU)表示成活率。然后在30℃将平板培养15-18小时。如果未检测到CFU，则在30℃将平板再培养24小时。
使用同样的实验设置(就空白实验而言没有加入微生物)，以及分光光度计，通过将一氯双甲酮(e 290nm＝20.2mM-1.cm-1)转化为二氯双甲酮(e 290nm＝0.2mM-1.cm-1)，在290nm处按时测定次氯酸盐浓度而证实在上文中描述的分别用V-CPO获得的次氯酸盐类似来自于贮液的次氯酸盐。
计算用V-CPO产生的次氯酸盐的终浓度按如下方法计算用每毫升0.01U的V-CPO，在每分钟内每毫升产生0.01μmol的次氯酸盐，相当于每5分钟内每ml产生0.05μmol的次氯酸盐。由于0.5ml流出物的稀释效果(其加入到2.0ml的起始体积中)，5分钟后的终浓度为(2.0/2.5)×0.05μmol/ml＝5分钟后每ml产生0.04μmol次氯酸盐。随后将该浓度表示为0.04μmol次氯酸盐/ml＝0.04×52.5ppm次氯酸盐＝2.10ppm次氯酸盐。通过提高或降低V-CPO浓度获得其它次氯酸盐终浓度。所加入的次氯酸盐终浓度按如下方法计算由于向2.0ml的反应体积中加入了0.5ml流出物，终体积是2.5ml，相当于稀释5倍。为了获得2.10ppm的次氯酸盐终浓度，使用10.50ppm贮液。通过提高或降低次氯酸盐贮液获得其它的次氯酸盐浓度。
定义本文中最低抑制浓度(MIC值)定义为在所使用的实验条件下导致所检测的特定微生物的克隆形成单位至少降低六个数量级所需的次氯酸盐的浓度。
结果显示于表II中。将由V-CPO生产的或者在次氯酸盐流出结束时的次氯酸盐的各种终浓度进行比较。从表II可以看出，由V-CPO酶促产生的次氯酸盐在次氯酸盐浓度低至0.4ppm时对除金黄色葡萄球菌以外的所有生物体具有生长抑制作用，而获得同样的生长抑制效果需要2ppm次氯酸盐。这显示含钒的卤代过氧化物酶是比其次氯酸盐更有效的卫生成分。显然V-CPO也具有杀死所检测的所有致病和非致病微生物的能力，而据称含血红素的卤代过氧化物酶仅具有杀死致病细菌的效力(参见EP-A-500387)。
表II各种微生物的MIC值
实施例3次氯酸盐和在蛋白质水解物存在下由V-CPO酶促产生的次氯酸盐的致死效力为了达到卫生的目的，已知对于实际碰到的情形，使用过量的次氯酸盐是必要的，由于该反应活性分子不仅与微生物发生反应，而且与存在的其它化合物发生反应。因此在含有例如蛋白质水解物的流体中检测含有钒的卤代过氧化物酶的行为是重要的。
材料在本实施例中使用的细菌菌株是大肠杆菌NCTC900。在脑心浸汁(BHI)肉汤培养基中，30℃将细菌培养15-18小时。在培养之后，将菌株在pH5.5柠檬酸缓冲液(20mM柠檬酸三钠-NaOH缓冲液+10mM NaCl)中洗涤两次。将细菌悬液在Eppendorf离心机上离心(14000rpm，5分钟)，然后去除上清液并且随后将细菌沉淀悬浮于柠檬酸缓冲液中。然后对于各种细菌悬液重复该洗涤步骤一次。然后用pH5.5柠檬酸缓冲液稀释该经过两次洗涤的细菌悬液以获得每毫升约108细菌的悬液。在洗涤步骤进行过程中，细胞保持在冰上。将缓冲液和BSA溶液(1％w/v溶于pH5.5柠檬酸缓冲液中)过滤灭菌并且储存于4℃。通过用无菌的去离子水稀释而从贮液(107,000ppm)制备次氯酸盐溶液。通过用无菌去离子水稀释从30％贮液制备过氧化氢溶液。酪蛋白水解物从Difco获得。根据Van Schijndel等人(1993)的方法从不等弯孢霉纯化氯过氧化物酶。
方法利用无菌操作技术，制备溶于pH5.5柠檬酸缓冲液中的每毫升约108细菌的悬液。从该悬液取1.3ml样品加入到无菌的反应容器中，在整个实验期间用磁棒搅拌器连续搅动，随后分别加入0.5ml的0.5mg/ml酪蛋白水解物(溶于pH5.5柠檬酸缓冲液)溶液，0.5ml的pH5.5柠檬酸缓冲液溶液，以获得3.2ppm或者6.5ppm次氯酸盐的浓度的方式向这些容器中加入各种浓度的冷V-CPO溶液各0.2ml(其计算方法，见下文)。空白测定是仅加入0.2ml的无菌缓冲液以替代0.2ml的V-CPO溶液。在30℃将反应容器保温。然后加入0.5ml的过氧化氢溶液，以便启动V-CPO反应。过氧化氢溶液的浓度的选择依据在流动结束时获得五倍摩尔过量的过氧化氢。在30℃将样品准确保温5分钟。培养之后取1ml反应混合物，加入到9ml冷BSA(1％w/v)溶液并且立即置于冰浴中，以终止次氯酸盐与微生物的反应。将样品从10-1稀释到10-5并且将各个稀释液的100μl样品置于标记的BHI琼脂平板上培养，以每毫升中的克隆形成单位(CFU)表示成活率。然后在30℃将平板培养15-18小时。如果未检测到CFU，则在30℃将平板再培养24小时。
将所获得的致死效果与使用一个微泵加入同样量的次氯酸盐获得的致死效果进行比较。该步骤按如下方法完成利用无菌操作技术，制备溶于pH5.5柠檬酸缓冲液中的每毫升约108细菌的悬液。从该悬液取1.3ml样品加入到无菌的反应容器中，在整个实验期间用磁棒搅拌器连续搅动，随后分别加入0.5ml的0.5mg/ml酪蛋白水解物(溶于pH5.5柠檬酸缓冲液)溶液，0.5ml的pH5.5柠檬酸缓冲液溶液。然后加入0.2ml的无菌pH5.5柠檬酸缓冲液。反应容器在30℃保温。然后在30℃5分钟的时间内将0.5ml的次氯酸盐溶液的流出物上样，产生3.2ppm或者6.5ppm的次氯酸盐终浓度(浓度的计算参见实施例2)。保温之后取1ml反应混合物，加入到9ml冷BSA(1％w/v)溶液并且立即置于冰浴中，以终止次氯酸盐与微生物的反应。将样品从10-1稀释到10-6并且将各个稀释液的100μl样品置于标记的BHI琼脂平板上培养，以每毫升克隆形成单位(CFU)表示成活率。然后在30℃将平板培养15-18小时。如果未检测到CFU，则在30℃将平板再培养24小时。结果示于表III。表III酪蛋白水解物对由V-CPO产生的HOCl的致死效力的影响
实施例4含钒的卤代过氧化物酶和含血红素的卤代过氧化物酶致死效力的比较材料在本实施例中使用的细菌菌株是大肠杆菌NCTC900，粪链球菌NCTC1092和无害利斯特菌ATCC33090血清型6B。在脑心浸汁(BHI)肉汤培养基中，30℃将细菌培养15-18小时。在培养之后，将菌株在pH5.5柠檬酸缓冲液(20mM柠檬酸三钠-NaOH缓冲液+10mM NaCl)中洗涤两次。将细菌悬液在Eppendorf离心机上离心(14000rpm，5分钟)，然后去除上清液并且随后将细菌沉淀悬浮于柠檬酸缓冲液中。然后对于各种细菌悬液重复该洗涤步骤一次。然后用pH5.5柠檬酸缓冲液稀释该经过两次洗涤的细菌悬液以获得每毫升约107细菌的悬液。在洗涤步骤进行过程中，细胞保持在冰浴中。将缓冲液和BSA溶液(1％w/v溶于pH5.5柠檬酸缓冲液中)过滤灭菌并且储存于4℃。根据Van Schijndel等人(1993)的方法从不等弯孢霉纯化氯过氧化物酶。含血红素的氯过氧化物酶是从Sigma获得(来自烟色卡尔黑霉)。在30℃在20mM pH5.5柠檬酸钠缓冲液，10mM氯化钠，100μM过氧化氢，50μM一氯双甲酮中将一氯双甲酮(e 290nm＝20.2mM-1.cm-1)转化为二氯双甲酮(e 290nm＝0.2mM-1.cm-1)，用分光光度计测定氯过氧化物酶在Cl-转化为HOCl中的活性。一个单位的氯过氧化物酶的定义是在每分钟转化1μmol的一氯双甲酮(Sigma)所需的酶量。对两种酶使用相同的分析(和活性定义)，以便能够在相同活性时确定两种酶的剂量。
方法利用无菌操作技术，制备溶于20mM pH5.5柠檬酸钠缓冲液，10mM氯化钠中的每毫升约107细菌的悬液。从该悬液取1.9ml样品加入到无菌试管中。随后以获得两种酶稀释度的方式加入含有钒的氯过氧化物酶以及含有血红素的过氧化物酶的贮液各0.1ml。然后加入0.5ml 25mM的过氧化氢溶液，在30℃将样品准确保温5分钟。取1ml反应混合物，加入到9ml冷BSA(1％w/v)溶液并且立即置于冰浴中，以终止次氯酸盐与微生物的反应。将样品从10-1稀释到10-5并且将各个稀释液的100μl样品置于标记的BHI琼脂平板上培养，以每毫升中的克隆形成单位(CFU)表示成活率。然后在30℃将平板培养15-18小时。如果未检测到CFU，则在30℃将平板再培养24小时。
结果示于表IV中。这些结果明显地表明即使以相同活性加入时，含有钒的氯过氧化物酶也能提供比含有血红素的氯过氧化物酶更有效的卫生系统。
表IV
实施例5各种来源的过氧化氢对V-CPO抑制作用的影响在前面的实施例中，作为V-CPO反应底物之一的过氧化氢是从贮液中加入的。在该实施例中描述了其它来源的过氧化氢的作用。在30℃在一个生物氧监测器YSI5300型(氧仓5301)中分析氧化酶，其中利用pH5.5柠檬酸缓冲液(20mM柠檬酸钠-氢氧化钠缓冲液+10mM氯化钠)作为缓冲液监测氧的消耗。在30℃用空气饱和该缓冲液。利用15g/l(终浓度)葡萄糖作为葡萄糖氧化酶的底物。在该实施例中使用的细菌菌株是大肠杆菌NCTC900。在脑心浸汁(BHI)肉汤培养基中，30℃将细菌培养15-18小时。在培养之后，将菌株在pH5.5柠檬酸缓冲液(20mM柠檬酸三钠-NaOH缓冲液+10mM NaCl)中洗涤两次。将细菌悬液在Eppendorf离心机上离心(14000rpm，5分钟)，然后去除上清液并且随后将细菌沉淀悬浮于柠檬酸缓冲液中。然后对于各种细菌悬液重复该洗涤步骤一次。然后用pH5.5柠檬酸缓冲液稀释该经过两次洗涤的细菌悬液以获得每毫升约108细菌的悬液。在洗涤步骤进行过程中，细胞保持在冰浴中。将缓冲液和BSA溶液(1％w/v溶于pH5.5柠檬酸缓冲液中)过滤灭菌并且储存于4℃。通过用无菌的去离子水稀释而从贮液(107,000ppm)制备次氯酸盐溶液。通过用无菌去离子水稀释从30％贮液制备过氧化氢溶液。酪蛋白水解物从Difco获得。根据Van Schijndel等人(1993)的方法从不等弯孢霉分离和纯化氯过氧化物酶。从Sigma获得来自黑曲霉的葡萄糖氧化酶。
方法利用无菌操作技术，制备溶于pH5.5柠檬酸缓冲液中的每毫升约108细菌的悬液。从该悬液取1.3ml样品加入到无菌的反应容器中，在整个实验期间用磁棒搅拌器连续搅动，随后加入0.5ml的0.5mg/ml酪蛋白水解物(溶于pH5.5柠檬酸缓冲液)溶液，向该反应容器中加入V-CPO溶液0.2ml以得到终浓度为6.5ppm的次氯酸盐。空白测定是仅加入0.2ml的无菌缓冲液以替代0.2ml的V-CPO溶液。在30℃将反应容器保温。随后加入下列三种过氧化氢产生系统各0.5ml1.来自3mM贮液的过氧化氢；2.来自3mM贮液的重碳酸钠；3.葡萄糖氧化酶(0.39U/ml)和75mg/ml葡萄糖的混合物。
在30℃将样品准确保温5分钟。取1ml反应混合物，加入到9ml冷BSA(1％w/v)溶液并且立即置于冰浴中，以终止次氯酸盐与微生物的反应。将样品从10-1稀释到10-5并且将各个稀释液的100μl样品置于标记的BHI琼脂平板上培养，以每毫升克隆形成单位(CFU)表示成活率。然后在30℃将平板培养15-18小时。如果未检测到CFU，则在30℃将平板再培养24小时。将所获得的值与使用一个微泵加入同样量的次氯酸盐获得的MIC值进行比较。该步骤按如下方法完成利用无菌操作技术，制备溶于pH5.5柠檬酸缓冲液中的每毫升约108细菌的悬液。从该悬液取1.3ml样品加入到无菌的反应容器中，在整个实验期间用磁棒搅拌器连续搅动，随后加入0.5ml的酪蛋白水解物(溶于0.5mg/ml pH5.5柠檬酸缓冲液中)溶液，然后加入0.2ml的无菌pH5.5柠檬酸缓冲液溶液。然后在30℃5分钟的时间内上样0.5ml32.5ppm的次氯酸盐溶液流出物(流速0.1ml/分钟)。保温5分钟之后取1ml反应混合物，加入到9ml冷BSA(1％w/v)溶液并且立即置于冰浴中，以终止次氯酸盐与微生物的反应。将样品从10-1稀释到10-6并且将各个稀释液的100μl样品置于标记的BHI琼脂平板上培养，以每毫升中的克隆形成单位(CFU)表示成活率。然后在30℃将平板培养15-18小时。如果未检测到CFU，则在30℃将平板再培养24小时。结果示于表V中。表V不同来源的过氧化氢与V-CPO的反应
实施例6确定氯过氧化物酶基因(cDNA)的编码序列的方法以及来自不等弯孢霉的基因(Centraal Bureau voor Schimmelcultules，rheNetherlands，strain No 102.42)和可能的表达系统根据Van Schijndel等人(1993)的方法从不等弯孢霉液体培养物分离和纯化氯过氧化物酶，所不同的是在DEAE层析之后使用FPLC系统(Pharmacia LKB)进行另外的两个纯化步骤。首先在溶于50mM Tris-HCl(pH8.3)中的2M NaCl存在下用苯基-Sepharose Cl-4B疏水作用柱结合酶，随后用从溶于50mM Tris-HCl(pH8.3)中的2MNaCl下降的梯度进行洗脱。对于最后的纯化步骤，用MonoQ HR 5/5阴离子交换柱(ex Pharmacia)结合酶，随后用溶于20mM哌嗪-HCl(pH5.4)中的0M-0.5M NaCl进行洗脱。随后利用旋转蒸发对酶进行浓缩，随后在50mM Tris-SO4缓冲液(pH8)中渗析。按照本领域内已知的标准方法分别用葡萄球菌蛋白酶V8和胰蛋白酶酶促消化，或者用CNBr化学裂解(Gross，E.(1976)，Methods Enzymology 11，238-255)纯化的氯过氧化物酶。按照Laemmli(Laemmli，U.K.(1970)Nature227，680-685)利用SDS-PAGE将得到的肽分离或者按照Schagger和Von Jagow(1987)的方法在麦黄酮凝胶上分离，然后利用Matsudaira(1987)描述的CAPS转移缓冲液(10mM 3-(环己胺)-1-丙烷黄酸，10％甲醇，PH11)转移到PVDF膜上(Immobilon-P ex Millipore。在电泳洗脱后用蒸馏水将该膜浸洗5分钟，在室温下用溶于50％甲醇中的0.1％考马斯亮兰R-250染色5分钟，并且在50％甲醇，10％乙酸中脱色10分钟并且风干。用一个Porton LF 3000蛋白质测序仪(Backman Instruments，Inc.，USA)将肽谱带进行Edmann自动测序。氨基酸序列测定结果概述于
图1。
根据该肽的氨基酸序列设计完全简并的寡核苷酸(见表VII)，利用第一链cDNA作为模板在聚合酶链反应(PCR)中使用这些简并的引物。第一链cDNA按如下制备为了分离RNA，将不等弯孢霉的孢子接种到一种发酵培养基中，该发酵培养基每升含有4克酵母提取物和2ml的微量元素溶液(Van Schijndel等人，(1993))。在生长几天之后通过过滤收集菌丝体并且冻干。在液氮中将冻干的不等弯孢霉菌丝体研磨。通过加入RNA提取缓冲液(42mM柠檬酸钠PH7，8.3％M-月桂酰肌氨酸，50mMβ-巯基乙醇，1％Triton x-100和4M异硫氰酸胍)，并且在室温下保温1小时提取RNA。加入0.1份体积的2M乙酸钠(PH4)和一份体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)并且将该混合物置于冰上15分钟。以10000×g(4℃)离心10分钟之后，收集水相，加入1倍体积的无水乙醇并且在-20℃将该混合物保温1小时随后以10000×g进行离心。将该沉淀重新悬浮于合适体积的RNA提取缓冲液中并且在氯化铯梯度中进行超离心分级(Sambrook等人，1989)。将该沉淀小心地洗涤并且在-70℃贮存于75％乙醇溶液中。为了分离mRNA，将RNA沉淀并且重新悬浮于没有RNA酶的水中，之后用polyAtract mRNA分离试剂盒(Promega公司，USA)提取mRNA。利用Pharmacia第一链cDNA合成试剂盒(Pharmacia BioTech)在从不等弯孢霉分离的mRNA上合成第一链cDNA。根据氯过氧化物酶肽的氨基酸序列设计4个20聚体简并寡核苷酸(参见表VII)并且在以不等弯孢霉的第一链cDNA作为模板的聚合酶链反应中用作引物。利用热循环仪(Eppemdorfmastercycler5330)和Taq聚合酶(Promega公司)完成聚合酶链反应。为了利用这些简并的引物使编码氯过氧化物酶的cDNA得到最大的扩增，在46℃(退火步骤)使聚合酶链反应循环30次。将得到的两个特异片段连接到pUC18载体上，克隆并对两条链进行测序，根据DNA测序结果设计下面的两种特异引物5’-CATAGCGATAGCGACGCGGA-3’和5’-CTAACCCCGGCGCCAACATC-3’这两种引物用于以第一链cDNA作为模板的聚合酶链反应中。因此通过连接两个已知的DNA序列获得基因特异性DNA片段。将该片段克隆到pUC18载体上，随后进行测序。为了获得编码氯过氧化物酶的mRNA的5’区使用5’扩增RACE试剂盒(Clometech公司)。按如下所说从不等弯孢霉中分离氯过氧化物酶基因组基因从在液氮中研磨的冻干的不等弯孢霉菌丝体分离不等弯孢霉基因组DNA，并且用合适量的提取缓冲液(200mM Tris-HCl，PH8.5，25mMEDTA，250mM NaCl，1％SDS和0.2mg/ml蛋白酶K)提取。在室温下保温过夜之后，加入0.7体积的苯酚和0.3体积的氯仿彻底混合。以10000×g离心试管并且将水层转移到一个清洁的试管中。用2倍体积的无水乙醇沉淀基因组DNA。在以5000×g离心5分钟之后。将沉淀重新悬浮于2ml的10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA。并且按制造商的推荐用RNA酶(Boehringer，Mannheim)处理。用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)提取含有基因组DNA的溶液，在乙醇沉淀之后，最后溶于合适体积的10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA缓冲液中。为了进行基因组DNA的Southern分析，用几种限内酶联合消化DNA，在琼脂糖凝胶电泳之后吸印到硝酸纤维素膜(Sambrook et al.，1989)上。利用放射性标记的特异片段(已用上文组描述的两个特异引物进行扩增)完成杂交，所说的片段用α-32P标记的dATP(Sambrook et al.，1989)随机引发。基于获得的结果用插入到pUC18载体上的PstI消化的基因组DNA制备小文库。用与Southern分析相同的探针筛选该文库。分离阳性克隆并且也对两条链进行测序，证实cDNA测序结果。在图2中给出了编码不等弯孢霉氯过氧化物酶的基因及其推测基因产物。
按如下所述制备啤酒酵母的氯过氧化物酶产生系统从野生型啤酒酵母GAL1基因(Molecular and Cellular Biology 10，4757-4769，1990)获得EcoR1-BamH1片段已知GAL1诱导型酵母启动子，并且分别克隆到质粒YCplac33和YEplac95(Gietz和Sugino(1988)Gene 74，527-534)的EcoR1、BamH1位点。将所获得的质粒分别称为TNT1和TNT2。在不等弯孢霉氯过氧化物酶基因的5’起始点的前面通过利用亚克隆到pUC18中的不等弯孢霉氯过氧化物酶基因的PstI-EcoRI5’片段作为模板和以M13/pUC22-聚体反向序列引物作为引物进行PCR实验而在不等弯孢霉氯过氧化物酶基因的5’起始点的前面制备一个BamH1限制性位点，并且引物是5’GAG AGA GGA TCC ACT CAC TAC TTA CAA TCA CAC3’用EcoR1和BamH1消化扩增的片段。将含有该基因的3’部分的来自不等弯孢霉氯过氧化物酶基因的EcoRI-PvuII片段亚克隆到EcoR1-SmaI消化的pUC18。用EcoRI和XbaI消化之后，从该克隆纯化出含有不等弯孢霉氯过氧化物酶基因3’部分。
完成三点连接反应，其中含有分别用BamH1和XbaI消化的TNT1或TNT2，5’BamH1-EcoRI片段和3’EcoRI-XbaI片段。在连接和克隆之后，检查获得的质粒的等同性。由此获得的质粒分别称为TNT3(由TNT1衍生)和TNT4(由TNT2衍生)。
按照本领域内已知的方法用质粒TNT3和TNT4转化酵母菌株BJ1991并且选择ura+转化体。将ura+转化体复制到含有葡萄糖(2％)和半乳糖(2％)的YP平板上。在生长之后从平板上获取细胞并且重新悬浮于200μl 20mM Tris-HCl，pH8.1中。在培养5分钟之后，取10μl液体并且点样到硝酸纤维素滤膜上。在100mM乙酸钠缓冲液(pH5.5)，1mM正联茴香胺，100mM KBr和2mM过氧化氢中保温硝酸纤维素滤膜。在生长于半乳糖的酵母菌株的所有点上观察到清晰的颜色生成，而生长于葡萄糖的酵母菌株的所有点上没有观察到颜色。这表明在啤酒酵母中构建了不等弯孢霉氯过氧化物酶基因的半乳糖诱导型生产系统。使用100mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)，100mM KBr和1mM过氧化氢和40μM酚红(BDH)进行的类似分析清楚地显示来自生长于半乳糖的酵母菌株的液体形成蓝/紫色，而用来自生长于葡萄糖的酵母菌株的液体没有颜色的变化。为了进一步证实在酵母中产生了能表达具有类似于不等弯孢霉氯过氧化物酶功能的异源氯过氧化物酶基因的表达系统，从半乳糖诱导的TNT3或TNT4转化的酵母菌株纯化重组酶。在含有半乳糖的培养基上生长之后，收集酵母细胞并且重新悬浮于20mM Tris-HCl，(pH8.1)中。然后加入无菌的玻璃珠，彻底振荡悬液。在以10,000×g离心15分钟之后，获取上清液并加到DEAE柱上，利用基本上类似于野生型不等弯孢霉酶(上文)的纯化方法纯化该重组酶。在纯化之后，获得比活性为22U/mg蛋白质的重组氯过氧化物酶(在100mM乙酸钠缓冲液pH5.0，1mM过氧化氢，5mM氯化钾和50μM MCD中测定，也可参见van Schijndel et al.，1993)，它相当于从不等弯孢霉本身纯化的氯过氧化物酶的20U/mg蛋白质的比活性。在附图3中显示了野生型氯过氧化物酶和重组氯过氧化物酶的pH活性情况。附图3进一步提供了重组酵母产生的酶具有类似于野生型酶的功能。
实施例7在其它微生物中筛选合适的卤代过氧化物酶在本实施例中使用的微生物是不等弯孢霉(CBS 371.72)，Drechslera biseptata(CBS 371.72)，Drechslera fuqax(CBS 509.77)，Drechslera nicotiae(CBS 655.74)，Drechslera subpapendorfii(656.74)，Embelisia hyacinthi(416.71)，Embelisia didymospora(CBS 766)，Ulocladium chartarum(200.67)和Ulocladium botrytis(452.72)。将各种真菌在琼脂平板上生长。生长完成之后，将胞外蛋白转移(复制吸印)到硝酸纤维素滤膜上，该滤膜预先在50mM Tris-HCl缓冲液(8.3)中浸湿。在琼脂平板上培养15分钟之后，通过在有或没有0.1M溴化钾存在下将滤膜在100mM乙酸钠(5.5)或磷酸钾缓冲液(pH6.5和7.5)，1mM正联茴香胺和2mM过氧化氢中吸胀而检测滤膜的卤代过氧化物酶活性。因此可以检测到产生的溴过氧化物酶和/或氯过氧化物酶。为了检测产生的卤代过氧化物酶是否是含有钒的卤代过氧化物酶，在有和没有10和100μM钒酸钠存在下重复上文描述的检测。对于含有钒的卤代过氧化物酶，在补充钒酸盐的情况下观察到增长信号。为了检测鉴别出的氯过氧化物酶是否的确类似于不等弯孢霉的钒卤代过氧化物酶，按照van Schijndel et al.，1993的方法从Ulocladiumchartarum，Embelisia didymospora，Drechslera subpapendorfii纯化小量的氯过氧化物酶。这些酶的最适PH为4.5-5.5。由于加入钒盐这些酶的氯化活性增加，显然这些酶的确是钒卤代过氧化物酶。为了进一步检测所识别的这些酶是否类似于不等弯孢霉的氯过氧化物酶，进一步对所识别的一种卤代过氧化物酶进行定性。为此选择由真菌Drechslera biseptata(CBS 371.72)产生的氯过氧化物酶。它具有类似于不等弯孢霉的氯过氧化物酶的特性，具有高热稳定性和对其底物的高亲和性。对于其它钒卤代过氧化物酶(de Boer et al.，1988；Wever etal.，1988)，被氧化的酶无EPR信号；但是用连二亚硫酸钠还原之后，观察到典型的钒基化EPR谱(结果未示)。各向同性EPR参数g0＝1.969和A0＝9.0几乎与不等弯孢霉酶的相同(Wever et al，1985)。此外，利用蛋白酶和溴化氰已将纯化的酶裂解为肽。肽结构图谱显示相同的形式，表明这两种酶有很大的序列同源性。的确对于这种情况，对用蛋白酶处理并且纯化得到的酶的两个肽链进行测序。该两序列显示非常大的同源性并且可以总结出两种酶是非常相似的。
得自不等弯孢霉的肽的氨基酸序列(Asp)-leu-arg-gln-pro-tyr-asp-pro-thr-ala-pro-ile-glu-asp-gln-pro-gly-ile-val-arg-thr-来自Drechslera biseptata类似肽的氨基酸序列Asp-leu-arg-gln-pro-tyr-asp-pro-thr-ala-pro-ile-glu-glu-gln-pro-gly-ile-val-arg-thr-因此通过使用复制技术(在加入钒盐之后检测出活性提高)和/或通过(部分)纯化酶以及在加入钒盐之后检测活性的提高可以鉴别合适的含有钒卤代过氧化物酶。
实施例8利用抗体进一步在其它微生物中筛选合适的氯代过氧化物酶在本实施例中使用的菌株是不等弯孢霉(CBS102.42)，Drechslera biseptata(CBS 371.72)，Drechslerasubpapendorfii(CBS 656.74)，Embelisia didymospora(CBS 766.79)，UloCladium chartarum(200.67)。将微生物按两个阶段生长。首先，用微生物的孢子接种无菌繁殖培养基(Van Schijndel et al.，1993)。在23℃振荡培养3天，之后将培养物转移到含有1升发酵培养基(每升蒸馏水中含有5克酪蛋白(Gibco BRL)，3克酵母提取物和1克果糖)的3升三角瓶中。在23℃振荡培养14-17天之后，收集培养基，过滤并且基本按照Van Schijndel et al.，1994的方法纯化氯过氧化物酶。在一只兔(二月龄的雌兔)中制备抗纯化(按照Van Schijndel et al.，1994的方法)的不等弯孢霉氯过氧化物酶的多克隆抗体(第一次注射使用弗氏完全助剂，加强注射使用弗氏不完全助剂)。在最后一次加强注射之后6天从兔取血。在56℃将血清加热30分钟以使补体失活并且然后离心。获取上清液。制备各种纯化氯过氧化物酶和Ascophylum nodosrm的溴过氧化物酶(按照Wever et al，1985纯化)的系列稀释液，每一种从50μl的蛋白质(约0.1mg/ml)开始，并且每一种样本依次稀释两次。利用一个点印迹仪(Bio-Rad)在硝酸纤维素滤膜上点稀释液，用2％BSA洗涤并依次用兔抗氯过氧化物酶血清，生物素化的山羊抗兔(稀释1∶3000)，碱性磷酸盐结合的链霉抗生物素蛋白(稀释1∶2000)的1∶800稀释液和显色剂(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，4-硝基蓝四唑嗡氯化物)(Boehinger Mannheim)进行保温。所有的步骤按照标准方法进行。结果显示于表VI中。
表VI
基于表VI中公开的结果，可以总结出用抗不等弯孢霉氯过氧化物酶的抗体进行的氯过氧化物酶适合于识别其它合适的含有钒的卤代过氧化物酶。这些卤代过氧化物酶可以是粗制形式的，部分或全部纯化形式的。纯化技术是本领域内已知的技术，如凝胶过滤，离子交换层析，疏水作用层析，沉淀技术，(超)过滤技术，亲和层析，凝胶电泳和其它技术。
实施例9在其它微生物中筛选合适的氯过氧化物酶在本实施例中描述了怎样利用来自不等弯孢霉的氯过氧化物酶基因的放射性探针在其它微生物中检测同源基因。可按如下所述完成基本按照不等弯孢霉染色体DNA的纯化方法(描述于实施例6)纯化不等弯孢霉(CBS102.42)，Drechslera biseptata(CBS 371.72)，Embelisia didymospora(CBS 766.79)，的染色体DNA。对于基因组DNA的Southern分析，用几种限制性酶结合消化该DNA，在琼脂糖凝胶电泳之后吸印到硝基纤维素滤膜(Sambrook et al.，1989)上。利用放射性标记的基因特异性片段进行杂交，所述片段利用α-32P标记的dATP(Sambrook et al.，1989)随机引发。利用第一链cDNA(参见实施例6)作为模板并且使用下列引物在聚合酶链反应中扩增(在放射性标记之前)所使用的基因特异性片段5’-CACGATGGGGTCCGTTACAC和5’-GTACCGCTATCGCTGCGCCTG杂交条件如下在预杂交和杂交中利用6×SSPE，5×Denharts，0.5％SDS和10mg鲑鱼精子DNA作为缓冲液。在55℃预杂交1小时。然后将放射性探针煮沸1分钟再直接加入。随后继续杂交过夜。附图4中给出了用不等弯孢霉和Drechslera biseptata获得的放射自显影照片。在该图中，泳道1λDNA；泳道2非消化的不等弯孢霉基因组DNA；泳道3idem，用EcoRI消化；泳道4用BamH1消化；泳道5用EcoRI和BamH1消化；泳道6用XbaI消化；泳道7用PstI消化；泳道8用XbaI和PstI消化；泳道9-14用Drechslera biseptata，idem。如在该图中可看到，用来自Drechslera biseptata的染色体DNA获得阳性克隆，表明两种基因高度相似。用来自Embelisiadidymospora的DNA获得相似结果。因此我们总结出可以利用不等弯孢霉氯过氧化物酶基因，或该基因衍生的部分或基于不等弯孢霉氯过氧化物酶基因的序列制备的探针可以检测两种其它微生物的钒卤代过氧化物酶。
表VII基于两种不等弯孢霉氯过氧化物酶氨基酸序列的寡核苷酸引物(20聚体)。
I肌苷A/G在该部位A和G均等混合使用。
C/T在该部位C和T均等混合使用。
G/A/T/C在该部位G，A，C和T均等混合使用。
寡核苷酸15’ -TAC/TATGAAA/GCCIGTIGAA/GCA-3’
寡核苷酸25’-AG/AT/CTGGCG/ATAIGCG/ATTG/ATC-3’寡核苷酸35’-GAC/TGAA/GACIGCIGAA/GTAC/TGA-3’寡核苷酸45’-AG/AIGCT/CTGIGCICCG/A/T/CCCCAT-3’
权利要求
1.酶促抗微生物组合物，含有钒卤代过氧化物酶，卤化物和过氧化氢源或者过氧化氢源。
2.权利要求1的酶促抗微生物组合物，其中钒卤代过氧化物酶是氯过氧化物酶。
3.前面任一权利要求中的酶促抗微生物组合物，其中钒卤代过氧化物酶是从不等弯孢霉获得的氯过氧化物酶。
4.前面任一权利要求中的酶促抗微生物组合物，其中钒卤代过氧化物酶是氯过氧化物酶，它与从不等弯孢霉CBS102.42获得的氯过氧化物酶有免疫交叉反应。
5.前面任一权利要求中的酶促抗微生物组合物，其中过氧化氢源是酶促过氧化氢生成系统。
6.权利要求5的酶促抗微生物组合物，其中酶促过氧化氢生成系统是葡萄糖/葡萄糖氧化酶或者乳酸/乳酸氧化酶系统。
7.前面任一权利要求中的酶促抗微生物组合物，所述的组合物基本上没有催化酶活性。
8.抑制微生物生长的方法，包括将前面任一权利要求所述的组合物应用到待消毒的表面。
9.钒卤代过氧化物酶作为卫生处理剂的应用。
10.DNA序列，含有编码来自不等弯孢霉CBS102.42的钒氯过氧化物酶的结构基因。
11.DNA序列，如附图2所示，含有编码来自不等弯孢霉CBS102.42的钒氯过氧化物酶的结构基因。
12.表达载体，含有一个复制原点，转录和终止控制序列和至少权利要求10或11的DNA序列的一部分。
13.制备钒卤代过氧化物酶的方法，包括用权利要求12的表达载体转化合适的宿主，在允许结构基因表达的条件下培养宿主并且分离钒卤代过氧化物酶。
全文摘要
提供了抗微生物组合物，包括钒卤代过氧化物酶，一种卤化物和过氧化氢源或者过氧化氢源。优选地，钒卤代过氧化物酶是从不等弯孢霉获得的氯过氧化物酶。
文档编号C12N15/09GK1146782SQ95192407
公开日1997年4月2日 申请日期1995年3月31日 优先权日1994年3月31日
发明者P·巴内特, D·H·洪曼, L·H·西蒙斯, P·F·特施蒂格, R·韦弗 申请人:尤尼利弗公司