专利名称：雷公藤属植物提取物在预防和治疗神经系统疾病中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药新用途，特别是一种雷公藤属植物提取物在预防和治疗神经系统疾病中的用途。
所述神经系统疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿氏神经退行性疾病。
老年神经退行性疾病是随年龄增长而出现的以脑实质特定区域内某些神经元进行性坏死为主要特征，以学习记忆障碍或运动、行为、心理障碍为主要表现的一类神经系统疾病。其中以阿尔茨海默病(Alzheimer s disease，简称AD)和帕金森病(Parkinson s disease，简称PD)最为常见，致残率高，对老年人健康的影响也最大。
所述PD是多发于中老年期的一种常见的神经系统锥体外系退行性疾病，病人多出现震颤、肌肉僵直、运动迟缓等症状。PD的主要病理学改变为中脑黑质和黑质纹状体通路的多巴胺(dopamine，DA)能神经元变性坏死，导致纹状体DA含量显著减少。因此，补充DA的前体一左旋多巴(L-DOPA)可以缓解PD的症状。但L-DOPA本身不能延缓多巴胺能神经元的进一步坏死，且有其它副作用，因此，人们一直试图找到一种可以延缓DA能神经元的变性坏死，对DA能神经元有营养保护作用的药物。
神经营养因子(neurotrophic factors，NTFs)是维持和促进神经细胞正常生存、生长和分化，在神经损伤情况下促进其再生的一类特定多肽或蛋白质。包括神经生长因子(nerve growth factor，NCF)、脑源性神经营养因子(brain-derived ncurotrophic factor，BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)、神经营养因子-3(neurotrophic-3，NT-3)等。其中GDNF能较为特异性地营养和保护DA能神经元，并可促进DA能神经元的再生，成为当前预防和治疗PD的一个热点。
但NGF、GDNF、BDNF等均为大分子蛋白，不能透过血脑屏障，不宜外周给药。解决这一难点的方法有两个1、由工程细胞、腺病毒等载体将外源GDNF基因导入脑内，使其长期表达、分泌GDNF蛋白，起到营养、保护和修复作用；2、寻找具有神经营养作用或促进内源性神经营养因子表达的小分子物质。
阿尔茨海默病，又称老年性痴呆，是一种发生于中老年的原发性脑退行性疾病。临床主要表现为认知和学习记忆功能障碍，甚至情感或人格方面的缺陷。AD主要病理改变为老年斑(又称淀粉斑)、神经纤维缠结和选择性胆碱能神经元及突触丢失。病理解剖显示，AD患者大脑的新皮质、海马区、迈内特基底核和蓝斑核等部位的神经元大量丢失，特别是皮层和海马的乙酰胆碱能神经的减少尤为显著。
现代研究认为，乙酰胆碱(acetycholine，ACh)是促进学习记忆的神经递质，M-胆碱能突触为记忆基础。而胆碱能神经元的退化被认为是造成痴呆的重要病理因素。因此，能阻止胆碱能神经退化的药物是未来AD治疗的首选。已证明NGF能有效防止模拟AD病变的动物基底前脑胆碱能神经元变性和死亡。但因NGF分子量大，口服或注射难以到达大脑。有人试图用侧脑室插管脑内反复给予NGF，并收到了肯定的效果。为了解决反复脑内给药所带来的问题，近年来，科研人员在努力寻找NGF给药的可替代途径，这些途径包括1、脑内移植基因工程化的NGF生成细胞；2、服用能促进脑内NGF生物合成的药物。
近年的研究发现，免疫抑制剂环孢菌素A(cyclosporin A，CsA)、FK506和Rapamycin(RAPA)等也具有神经营养作用。Snyder等人的体外实验研究表明，极微量(ng级)免疫抑制剂FK506和RAPA可以协同神经营养因子(NGF)的促PC12细胞轴索生长效应，使NGF诱发最佳轴索生长效应的有效浓度降低了20-50倍，半数最佳效应剂量也降至0.1ng/ml。在体外培养的鼠背根神经节细胞上，FK506单独应用就可产生明显的神经营养作用，认为其机制依然是凭借神经节中的雪旺氏细胞等胶质细胞产生的NGF发挥作用。
体内实验也表明，CsA能够减缓6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)在小鼠脑内诱发的DA能神经元的退变。同样，FK506、CsA也能对抗MPTP诱导的C57/BLACK帕金森病模型小鼠脑中DA的耗竭。CsA和FK506都能明显升高纹状体中的DA和DOPAC的含量，具有显著意义。二者中尤以FK506为著。CsA还能保护脑组织的缺血一再灌注损伤。
目前认为免疫抑制剂的神经营养作用的机制在于，CsA、FK506、RAPA等分别作用于各自的胞内受体，CsA对应的是环菲林(Cyclophilin，Cyp)。FK506和RAPA对应的是FK506结合蛋白(FK506 binding protein，FKBP)。免疫抑制剂特异地与FKBP、Cyp形成复合物，再与磷脂酶2B(Calcineurin，CaN)结合，抑制了此酶催化蛋白去磷酸反应的活性。进一步研究发现CaN在脑内影响了两种酶的磷酸化过程1、一氧化氮合成酶(NOS)，NOS的磷酸化形式将会抑制它的催化活性，免疫抑制剂通过提高NOS的磷酸化程度而抑制NO的生成从而阻断过量谷氨酸的神经毒性作用；2、生长相关蛋白(GAP-43)。GAP-43参与了神经元的生长过程并且其磷酸化形式能增强此种促生长作用。PC12细胞在NGF的刺激下可发生轴索延长。很低浓度(nmol级)的FK506就可提高细胞对NGF的敏感性，诱发PC12细胞的轴索生长效应，可将NGF的作用提高100倍。因此，选择性抑制CaN某些作用底物的药物，如GAP-43脱磷酸反应的抑制因子可能在治疗神经退行性病变中有着重大的潜在治疗价值。
雷公藤为卫矛科(Celastraceae)雷公藤属植物，(Tripterygium WilfordiiHook.f)，雷公藤属植物还包括昆明山海棠[T.Hypoglacum(Levl)Hutch]和黑蔓(T.Regelli Sprague et Tak)，均具有药用价值。雷公藤含有生物碱、二萜、三萜、倍半萜等多种有效成份。其中，二萜类为主要活性成份，三萜和生物碱亦具活性。目前已知的雷公藤单体成分包括雷公藤内酯醇(triptolide)、雷公藤氯内酯醇(tripc hlorolide)、雷公藤内酯二醇(tripdiolide)、雷公藤内酯三醇等二萜类化合物以及雷公藤红素(tripterine)等三萜类化合物，见
图1。
图中，(1)为雷公藤内酯醇，(2)为雷公藤氯内酯醇，(3)为雷公藤内酯三醇，(4)为雷公藤酮，(5)为雷公藤内酯二醇，(6)为16-羟基雷公藤内酯醇，(7)为雷公藤红素。
雷公藤提取物具有免疫抑制、抗炎、抗肿瘤及抗生育等多种药理活性，特别是免疫抑制作用为其主要药理活性。雷公藤提取的单体成分中免疫抑制活性最强的为雷公藤内酯醇，其免疫抑制的ED50为0.06mg/kg。雷公藤煎剂、雷公藤“总甙”(TII)或雷公藤内酯醇及雷公藤红素对刀豆蛋白(concanavallin A，ConA)诱导的小鼠脾细胞分泌IL-2的作用均有明显抑制作用。
此外，雷公藤的主要活性成分之一的雷公藤氯内酯醇对小鼠脾NK细胞活性具有一种剂量依赖性的双向调节作用，表明雷公藤并非只具有免疫抑制作用。
以前，临床上主要将雷公藤总提取物用于治疗类风湿性关节炎及慢性肾小球肾炎、肾病综合征、过敏性紫癜肾炎等肾病。另外，对系统性红斑狼疮、多发性肌炎、皮肤炎等结缔组织病以及一些皮肤病均有一定疗效。然而，将雷公藤总提取物或其单体成分作为神经元保护剂，用于预防和治疗老年神经退化性疾病，迄今未见任何报道。
本发明的目的是提供一种雷公藤属植物提取物在预防和治疗神经系统疾病中的用途。
所述雷公藤属植物提取物包括雷公藤内酯醇、雷公藤氯内酯醇、雷公藤内酯二醇、雷公藤内酯三醇、16-羟基雷公藤内酯醇、雷醇内酯、雷酚内酯以及雷公藤红素和雷公藤春碱中的一种或多种。
所述神经系统疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿氏神经退行性疾病和脊髓损伤、脊髓侧索硬化疾病。
所述雷公藤属植物提取物与神经营养因子联合使用，也用于神经系统疾病的治疗。所述神经营养因子包括神经生长因子、胶质源性神经营养因子、脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子。
为了从天然药物中寻找具有神经保护和营养作用的免疫抑制剂，对目前临床应用的有免疫抑制活性的多种单剂和复方天然药物进行了评价，结果发现，天然药用植物雷公藤提取物中的单体成分在离体和体内实验条件下均具有显著的免疫抑制活性。进一步的体内和体外研究表明，作为雷公藤提取物中的主要活性成分，雷公藤氯内酯醇(以下简称968)对培养的DA能神经元具有明显的营养作用。与作为对照组的环孢菌素相比，968在较低浓度(0.001ng/ml)和较高浓度(0.1ng/ml)下，在含10％胎牛血清的DMEM培养4天后，存活的DA能神经元分别比对照组高87％和29％。另外低于10-13mol/L的968就可促进中脑神经细胞的生长，轴突长度比对照组高出113％。968的神经营养作用似乎并不局限于DA能神经元，968在极低的浓度下就能促进原代培养的皮层神经细胞的突起延长。968的这种促轴突出生长作用对于PD、AD和脊髓损伤等疾病中神经细胞间的突触重新构建具有重要意义。
雷公藤氯内酯醇的另一个重要特点是能够拮抗一些神经毒素对神经细胞的损伤作用。环境毒素、内源性毒素和兴奋性神经毒素是PD、AD等神经退行性疾病发病的重要机制之一。实验中发现(1)、1pM的雷公藤氯内酯醇和雷公藤内酯醇(T10)都能拮抗DA能神经毒素MPP+对PC12的毒性作用，对细胞的存活有明显的保护作用；(2)、968能够对抗大剂量的兴奋性谷氨酸对原代皮层神经元的损伤作用，有利于维护神经细胞形态的完整性，降低由谷氨酸诱导的细胞凋亡；(3)、在整体动物实验中发现968能有效阻止DA能神经毒素MPTP诱导的小鼠脑内DA能神经元损伤。
下面结合附图和具体实验进一步描述本发明。
图1显示的是雷公藤提取物中主要的活性单体的化学结构。
图2显示的是不同浓度968对原代培养的大鼠中脑多巴胺能神经元存活的影响。
计数的多巴胺能神经元是指TH免疫组织化学阳性的细胞。每点数据为三组平行实验的平均计数。
图3显示的是不同浓度968对原代培养的大鼠中脑多巴胺能神经元存活百分率的影响。
图4显示的不同剂量968预处理对MPTP损毁的C57BL/6J小鼠纹状体内DA含量的影响。
图5显示的是不同剂量968预处理对MPTP损毁的C57BL/6J小鼠纹状体内DA代谢率(DOPAC+HVA/DA)的影响。
实验一、雷公藤氯内酯醇保护多巴胺能神经元的体外研究取胎龄为14-17天的SD孕鼠，断头处死，取胚胎鼠中脑在24孔细胞培养板行中脑DA能神经元原代培养。次日，换有血清培养基或无血清培养基并加入不同浓度968(10、1、0.1、0.01、0.001ng/ml)。TH免疫组化法鉴定DA能神经元的存活状态。实验发现，加入不同浓度的968后，在有血清培养基中培养的第四天，0.001、0.01、0.1ng/ml组的细胞数目分别为对照组的187％、148％、129％，NEWMAN-KEULS单因子方差分析具有显著性(表1、图2、图3)。表中所列为平均值±标准误，与对照组差别显著性用*标出，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01。结果说明968在有血清培养基中对体外培养的原代多巴胺能神经元具有明确的营养作用。
表1不同浓度968对胎鼠中脑多巴胺能神经元(TH阳性神经元)的保护作用。
对照组 968(ng/ml)n＝4分组n＝4 0.0010.01 0.1 1 10TH+神223±8.9 478±9.6** 357±10.3*289±7.3*279±15.6 220±8.3经元数另外，在原代的无血清培养基中没有发现968具有明确的DA能神经元的营养作用，实验组与对照组的神经元数目没有显著性差别。这与CsA和FK506在无血清培养基中未发现有营养作用是一致的。实验二 雷公藤氯内酯醇保护多巴胺能神经元的在体研究。
MPTP是一种特异性损伤DA能神经的毒素，外周注射可透过血脑屏障，特异性损毁黑质一纹状体多巴胺能神经元。C57BL/6J小鼠，每天ip MPTP 30mg/kg体重，连注三天，可使纹状体中DA含量的降低达到80％以上。
在968对C57/BLACK帕金森模型小鼠中脑多巴胺能神经元保护作用的实验中，我们共分8个组(1)N.S+N.S.组，作为空白对照；(2)N.S+MPTP，作为阴性对照；(3)-(7)组为不同浓度的968(10-6μg/kg体重-10-1μg/kg体重)实验组；(8)CsA(10mg/kg体重)+MPTP，作为阳性对照组。
在MPTP损毁的前一天下注射一次968或生理盐水；之后每天上午注射968或生理盐水，下午注射MPTP或生理盐水三天；再继续每天一次注射968或生理盐水至处死动物前一天，共注射11d。实验用HPLC方法对小鼠纹状体中DA及其代谢产物HVA(高香草酸)、DOPAC(二羟苯乙酸)的含量进行了检测，并对DA、(HVA+DOPAC)/DA的比值进行了计算及统计学分析。
我们发现，0.01ng/ml浓度组的968能使小鼠纹状体中DA的含量显著地增高(图4)；同时，(HVA+DOPAC)/DA的比值为所有组中最低(图5)。HVA和DOPAC是DA在脑内的最终代谢产物。(HVA+DOPAC)/DA比值升高，说明DA的代谢速率增快，代谢产物生成增多，多见于DA能神经元不完全损伤时。968能使(HVA+DOPAC)/DA的比值降低，说明其能减缓MPTP损伤鼠DA能神经元中的DA代谢更新速率，从而有效地保护了神经元的存活。对MPTP导致的帕金森小鼠中脑DA能神经元的损伤具有一定的保护作用。
表2 968预处理对MPTP损伤造成的C57BL/6J小鼠纹状体多巴胺含量的影响(x±SE)968(ng/kg) CsA分组正常组 对照组0.0010.01 1 10 100 (10mg/kg)纹状体多巴胺含量 5.01±0.32 0.98±0.11 0.96±0.03 0.97±0.23 1.32±0.21 2.44±0.31*1.37±0.13 1.34±0.11(ng/mg)从图4可以看出0.01-0.1μg/kg的968能够维持DA的正常代谢。
通过离体细胞实验和在体动物实验，我们发现968确实具有一定的神经营养效应。根据在有血清培养基和无血清培养基中968作用的不同，推测其机制可能是提高神经元对血清中的神经生长因子(NGF)等的敏感性，从而发挥神经营养作用的。实验三 968对原代培养的胎鼠中脑神经细胞突触长度的影响。
胎龄16天的SD孕鼠取胎鼠中脑行原代神经元培养，将中脑组织切碎、消化、吹散，使之成为单个细胞，以3×105个细胞/孔的密度种植在24孔培养板中。先用DMEM加入10％胎牛血清的培养基，37℃、5％ CO2孵箱培养24小时，然后换成DMEM/F-12(1∶1)培养基，加入N2添加剂继续培养(主要是抑制胶质细胞增生)，其它条件不变。同时加入10-15-10-6mol/L的968处理，每个剂量组4孔。72小时后，在倒置相差显微镜(200×)下观察，并用图像处理系统采集图像，每孔采集4个视野，用图像处理系统测量神经细胞的轴突长度，轴突定义为每个细胞最长的突起，每个视里取轴突最长的8个细胞。每个剂量组所得数据合并，求平均值，计算标准偏差，列于下表(表3)。数据用ANOVA分析，并用Dunnet多重比较检验，与对照组差别有显著性的用*标出，*p＜0.05，**p＜0.01。结果表明10-15-10-7mol/L968处理可明显促进中脑神经细胞的突起生长，轴突长度较之对照组长213％-150％，差别有显著意义。说明968对神经细胞的轴突生长具有促进作用，其有效浓度范围宽，增加了将来临床用药剂量的选择余地和用药的安全性。
表3 不同浓度968处理对胎鼠中脑原代培养神经细胞突起长度的影响(X±SE)对照 968处理浓度(mol/L)组 10-1510-1410-1310-1210-1110-1010-910-810-710-6突起长85.9± 141.7± 141.8± 183.3± 168.5± 146.6± 156.8±128.8± 147.4±130.0±104.3±度(μm) 15.225.0** 25.1** 32.4** 29.8** 25.9** 27.2** 22.8* 26.1** 23.0* 18.4实验四 968对原代培养的胎鼠中脑神经细胞存活数目的影响胎鼠中脑原代培养的方法同实施例3，不同之处在于换成DMEM/F-12+1％N2培养基后，用968处理7天，于第8天吸走培养液，并用PBS冲洗。加入0.01％啶橙染色，在荧光显微镜(100×)下观察，细胞核呈现绿色荧光，每孔取三个视野，用手动计数器计数。数据采用ANOVA分析，并用Dunnet多重比较检验，发现10-12-10-11mol/L 968处理组存活细胞数明显高于对照组，说明968有助于神经细胞的存活。
表4 不同浓度968处理对胎鼠中脑原代培养神经细胞存活的影响(x±SE)968浓度(mol/L)对照组10-1210-1110-1010-910-810-710-6细胞数 173±16.9 427±64.2**355±40.2**201±34.8 228±29.4 258±77.4 148±13.5 17.8±6.5实验五 968可以拮抗多巴胺能神经毒素MPP+对PC12细胞的毒性。
PC12细胞采用RPMI 1640+10％新生牛血清培养，然后以1.5×105的密度均匀地种植到96孔板中，待细胞贴壁良好后加入968或T10预处理2小时，然后在实验组中加入多巴胺能神经毒素MPP+60μmol/L损伤PC12细胞。我们在另外的实验中已经证明MPP+损伤PC12细胞的半数致死浓度(LC50)为60μmol/L。72小时后吸走培养基，每孔中加入0.5mg/ml的噻唑蓝(MTT)100μl，37℃孵育4小时，此时原来黄绿色的MTT在活细胞所具有的琥珀酸酶的催化下形成蓝色的颗粒，每孔中加入100μl助溶剂(异丙醇∶Triton X-100∶水＝5∶1∶4)，37℃摇床过夜使蓝色颗粒完全溶解，用Bio-Rad ELISA读板机，在490nm波长下检测各孔的吸光度。同样条件下吸光度与各孔的细胞数成正比。实验组(包括对照组和968、T10处理组)的吸光度与MPP+未损伤组之比即为细胞的存活百分率。表5所列为每组8个孔的细胞存活率的平均值±标准偏差。*表示经过ANOVA分析，继之以Dunnet多重比较检验，与对照组差别有显著性，*P＜0.05，**P＜0.01。结果表明10-9-10-7mol/L的968和T10处理具有拮抗MPP+对PC12的毒性作用，使细胞的存活率提高了约30％。
表5 968和T10在10％血清条件下对MPP+的PC12细胞毒性的拮抗作用(x+SE)药物对照组药物浓度(log mol/L)-12 -11 -10 -9-8-7T4(968) 74.3±2.74 74.1±2.49 89.3±3.20**92.4±4.57**88.3±1.50**59.9±4.59T1080.1±3.00*73.8±7.11 72.9±7.24 83.6±1.34**80.3±4.17*80.9±1.33*上述实验是在RPMI1640+10％新生牛血清条件下的结果，为了排除血清在其中起的作用，我们降低了血清的浓度，由10％降为1％，其它条件不变，观察了968和T10对PC12细胞存活的影响。数据列于表6。表6 968和T10在1％血清条件下对MPP+的PC12细胞毒性的拮抗作用(x+SE)浓度(log mol/L)药物 对照组-13-12 -11 -10 -9 -8-7 -6-538.6± 71.2± 80.2± 71.2±61.7±70.0±78.6± 66.7±59.9±50.0±9682.5711.7**10.9**10.4**9.44*10.0**10.1**9.82**8.74*7.2665.2± 80.4± 86.8± 122.3± 129.8± 113.2± 117.0± 110.5± 62.8±T105.8816.314.212.1**11.2**10.0*11.2*14.0*4.44上述结果表明，在低浓度血清(1％)的条件下，968和T10依然具有拮抗MPP+毒性的作用。实验六 968对谷氨酸诱发胎鼠大脑皮层神经细胞凋亡的抑制作用材料和方法1、铺板于接种前2-3天，用12.5μg/ml多聚L-赖氨酸铺板，6孔板，500μL/孔，24孔板400μL/孔，自然晾干。
2、接种培养无菌条件下分离孕期16-18d胎鼠大脑皮层置于预冷的DMEM/F-12培养基中，仔细剔除软脑膜和血管，将脑组织移至另一个含冰DMEM/F-12中(含体积分数为10％胎牛血清和10％马血清)的小烧杯中，用尖头抛光玻璃管轻轻吹打20-30次，直至全部脑组织分散成细胞悬液，并经200目尼龙筛过滤除去未消化的组织块，滤液用DMEM/F-12培养基，(10％胎牛血清，10％马血清，100kU.L-1链霉素，pH7.2-7.4)，台盘兰染色后，在倒置相差显微镜下计数500个细胞，着色细胞为死细胞，并调整密度至1×109个.L-1。将0.5ml细胞悬液接种到12.5μg/ml的过夜处理的6孔培养板中，置37℃，5％CO2孵箱中培养，24h后待细胞贴壁换液1次去除死细胞，以后每3-4d换液一次，第3天加入5-氟尿嘧啶(终浓度为10μmol.L-1)培养24h，以抑制非神经元的增殖。继续培养至第5d后开始实验。
实验结果1、968在有血清的培养基中对体外培养的原代皮层神经元有明显的营养作用用不同浓度的968(10-13-10-7mol/L)在有血清(10％胎牛血清+10％马血清)的DMEM/F-12孵育体外培养的原代皮层神经元(5d，Wistar乳鼠14-16d)，24h后固定并对细胞数目、突起长度和胞体面积进行显微图象分析。结果可见，胞体数目在24h内无显著变化，而胞体面积和突起长度在10-13-10-6各浓度均显著增加。
表7 968在有血清条件下对胎鼠大脑皮层神经元生长状况的影响(x+SE)968浓度(log mol/L)对照组-13 -12 -11 -10 -9 -8 -767.67±3 66.40± 78.00± 74.00± 79.20± 85.3± 82.20± 42.67±细胞数8413.383.56 10.306.30 6.7212.9212.2840.27±2 83.70± 120.83± 110.63±103.92±97.10± 68.36± 43.46±胞体面积(μm2).97 3.07**6.18**2.83**4.04**2.81**2.48**2.4350.11±8 73.98± 79.16± 83.78± 99.79± 97.11±75.83± 68.19±突触长度(μm).91 13.10**10.44**25.16**18.02**9.20**6.31**15.38**选取在含血清的培养基中神经营养作用最显著的三个浓度10-12，10-11，10-10mol/L的968孵育不含血清的DMEM/F-12(亦不含N2添加剂)中的原代皮层神经元(5b，Wistar乳鼠14-16d)，24h后固定同时对细胞数目、突起长度和胞体面积进行显微图象分析。发现细胞数目无明显变化，而胞体面积显著减小，突起长度也有一定的缩短。说明968在无血清的培养基中对体外培养的原代皮层神经元无营养作用。从机理上推测968是通过增强血清中NGF的营养作用发挥功能的。
2、968可以明显对抗Glu诱导的原代皮层神经细胞损伤首先将968(10-12-10-10mol/L)与体外培养的原代皮层细胞(5d)在DMEM/F-12+10％胎牛血清中共同孵育24h，以加入100ng/mlNGF作为阳性对照。然后加入250μmol/L的Giu作用30min，立即固定进行显微图象分析。Glu的兴奋性神经毒作用可以使细胞突触缩短或缺失，而968可以显著保护Glu引起的皮层神经细胞的胞体面积和突起长度的减小。
表8 968对谷氨酸造成胎鼠皮层神经细胞损伤的影响(x±SE)NGF 968浓度(log mol/L)对照组(100ng/ml) -12 -11 -10细胞数19.00±4.7342.20±3.88*28.67±3.18 31.00±4.01 32.33±2.75胞体面积(μm2) 50.98±4.7580.06±1.64**72.28±2.75**75.40±2.56**69.20±2.36**突触长度(μm) 34.51±2.3559.94±2.01**49.02±2.75**49.19±1.45**39.49±1.29大量文献报道，细胞凋亡是PD、AD等神经退行性疾病中大量神经元死亡的主要形式，而大剂量Glu处理可以诱导神经细胞的凋亡，我们在原代培养的胎鼠大脑皮层神经细胞中加入Glu 250μmol/L孵育30min诱导细胞凋亡，收集细胞，进行碘化丙啶(PI)荧光染色，用流式细胞仪检测、分析凋亡细胞的百分率。发现Glu在给定浓度和作用时间下可以使38.9％的神经细胞发生凋亡，而10-10mol/L968处理组只有22.5％的细胞发生凋亡，与100ng/ml的NGF的作用相当(21.9％)。
表9 不同浓度968处理对谷氨酸诱导原代培养的胎鼠皮层神经细胞凋亡的影响(x±SE)NGF968浓度(log mol/L)正常组 对照组(100ng/ml) -12-11 -10凋亡细胞百分率(％) 16.13±1.44 38.91±1.92 21.94±1.01**25.2±3.25**29.91±1.89**22.45±1.85**
权利要求
1.雷公藤属植物提取物的用途，其特征是用于预防和治疗神经系统疾病。
2.如权利要求1所述的用途，其特征是所述雷公藤属植物包括雷公藤、昆明山海棠和黑蔓。
3.如权利要求1所述的用途，其特征是所述雷公藤属植物提取物包括雷公藤内酯醇、雷公藤氯内酯醇、雷公藤内酯二醇、雷公藤内酯三醇、16-羟基雷公藤内酯醇、雷醇内酯、雷酚内酯以及雷公藤红素和雷公藤春碱中的一种或多种。
4.如权利要求1所述的用途，其特征是所述神经系统疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿氏神经退行性疾病和脊髓损伤、脊髓侧索硬化疾病。
5.如权利要求1所述的用途，其特征是雷公藤属植物提取物与神经营养因子联合使用，用于神经系统疾病的治疗。
6.如权利要求5所述的用途，其特征是所述神经营养因子包括神经生长因子、胶质源性神经营养因子、脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子。
全文摘要
本发明为一种雷公藤属植物提取物在预防和治疗神经系统疾病。所述神经系统疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿氏神经退行性疾病和脊髓损伤、脊髓侧索硬化疾病。雷公藤属提取物中的单体成分在离体和体内实验条件下不仅具有显著的免疫抑制活性,还对培养的DA能神经元具有明显的营养作用,可促进中脑神经细胞的生长,促进原代培养的皮层神经细胞的突起延长,能够拮抗环境毒素、内源性毒素和兴奋性神经毒素对神经细胞的损伤作用,对细胞的存活有明显的保护作用。
文档编号A61K31/56GK1276209SQ00107779
公开日2000年12月13日 申请日期2000年5月26日 优先权日2000年5月26日
发明者王晓民, 韩济生, 李丰桥, 马端端, 蒋延文, 田如锦, 吴晓东 申请人:北京大学医学部, 北京纬晓生物技术开发有限责任公司