专利名称：二元活性抗体制剂及其制备方法
技术领域：
本发明是有效量的免疫球蛋白、益生菌及可接受辅料的组合物及其制备方法。
控制人和动物感染方面抗生素发挥了极其重要作用，但另一方面，其大量应用带来了抗药性、药物残留、环境污染等诸多问题。抗生素不仅能杀灭病原菌，同时也能杀灭对机体有益的正常微生物菌群，造成菌群紊乱，引起继发感染和内源性感染，长期使用抗生素产生耐药性，使机体免疫功能下降，治疗效果不佳或者引起死亡。更为严重的是抗生素的应用还可能引起人和动物的病原体间发生抗药性传递以及药物残留问题，对人类健康和自然环境造成很大威胁。在我国药物残留所引起的畜产品安全问题已成为影响我国畜产品出口的重要制约因素，造成巨大的经济损失。抗生素的使用在各国受到越来越受到限制。
在人们不断探索提高人和动物抗病能力的其他有效途径中，益生菌的研究与应用于近年来得到较大的发展。人和动物的消化道、泌尿生殖道、呼吸道以及体表均存在大量的微生物菌群。正常菌具有抑制病原微生物生长、维持肠道菌群平衡、调节胃肠功能、提高机体非特异性免疫能力等功效。美国、日本等国已批准乳酸杆菌、双歧杆菌、蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、丁酸芽孢杆菌等20多种微生物可以作为动物的保健产品，国内目前亦有上述微生态制剂产品。但由于微生态制剂不能直接杀灭有害微生物，因此对急性感染的治疗效果常常不够理想。
近年来研究发现，当用抗原免疫产卵母鸡后，其体内可产生相应的抗体并可转移和积累于卵黄中，此抗体被称为卵黄免疫球蛋白(Immunoglubulin of the Yolk，简称IgY)。与哺乳动物抗体IgG相比，IgY具有产量大、均一性好、不激活哺乳动物补体系统，不非特异性结合类风湿因子、不固定葡萄球菌A蛋白、不与哺乳动物免疫球蛋白之间发生交叉血清型反应等优点。目前已经陆续开发出用于预防和治疗人和动物某些疾病的产品。但由于IgY的作用机理是被动性免疫，因此效期较短。由于目前普遍采用冷冻干燥工艺提纯制备抗体粉，生产成本高，且保存与运输不便，因此限制了其应用。
本发明的目的是提供一种二元活性制剂及其制备方法，该制剂是益生菌与特异性免疫球蛋白的有机组合。其机理是利用免疫球蛋白特异性杀灭体内常见的有害病原体，减少感染机会；同时利用益生菌调剂体内的正常微生物菌群的平衡，提高机体非特异性抗感染能力；充分发挥二者的协同效应以达到针对多种感染性疾病的防治作用，降低发病率和死亡率，改善生长发育现状。其效果优于抗生素及单纯的益生菌类产品和单纯的免疫球蛋白。该制剂具有无污染、无抗药性、无残留和药效持续时间长，生产成本低等特点。用喷雾干燥法制成卵黄抗体干粉，保持了用造价高的冷冻干燥工艺生产的粉体的效价和疗效，并有效解决了产品的保存和运输问题。
为了实现上述目的，本发明采取以下技术方案所述二元活性制剂中的免疫球蛋白选自抗大肠杆菌免疫球蛋白、抗沙门氏菌免疫球蛋白、抗法氏囊病(IBD)免疫球蛋白，抗新城疫(ND)免疫球蛋白，抗猪流行性腹泻病毒免疫球蛋白，抗猪传染性胃肠炎病毒免疫球蛋白，抗轮状病毒免疫球蛋白、抗细小病毒免疫球蛋白、抗传染性支气管炎病毒免疫球蛋白、抗传染性喉炎病毒免疫球蛋白、抗IBD-ND多联免疫球蛋白等。
所述二元活性制剂中的益生菌包括双歧杆菌、乳酸杆菌、粪链球菌、芽孢杆菌、酵母菌，所配成的制剂如果包含一种或以上的益生菌，可分别发酵或混合发酵。
所述二元活性制剂中的免疫球蛋白在制剂中的含量为1-15％。
所述二元活性制剂中的益生菌的数量为5000万-5亿/克。
为提高免疫球蛋白的提纯纯度；使免疫球蛋白活性在制备过程中不被高温所破坏，采用HPMCP沉淀法，从强化免疫鸡群所产鸡蛋中提取相应的特异性免疫球蛋白(IgY)，并经过喷雾干燥工艺制成卵黄抗体干粉。
为使免疫球蛋白免受胃酸和胃蛋白酶、胰蛋白酶的破坏，加入肠包衣材料——丙烯酸树脂或羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯；蛋白稳定剂——包括甲醛和蔗糖。
本发明组合物通过选取不同的免疫球蛋白与相应的益生菌配合，可以制成具有预防和治疗以下疾病功能的食品添加剂、保健品、药品、饲料添加剂由大肠杆菌、沙门氏菌等病原体引起的幼畜禽、宠物幼子、婴儿腹泻，鸡法氏囊病(IBD)、新城疫(ND)，传染性支气管炎，传染性喉炎，鸭病毒性肝炎，猪细小病毒感染。
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但这些实施例不限制本发明。
实施例一。
用于预防、治疗大肠杆菌引起幼畜禽下痢的二元活性制剂的制备及疗效(一)、制备1.免疫原制备选取带有特定抗原的致病性大肠杆菌制苗菌株，按公知方法制备灭活苗、检验效价并保存。
2.动物免疫采用6月龄无特定病原体(SPF)产蛋母鸡，每只于胸部肌肉注射按步骤1所制备的免疫原。基础注射两次，间隔10天。10天后再加强免疫注射1次。定期检测血清及卵黄免疫球蛋白效价。
3.免疫球蛋白制备免疫鸡蛋表面无菌处理，去蛋清后均化处理，加入5-8倍体积蒸馏水稀释，加入含量为5％的由80％乙醇配制的HPMCP(羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯)悬液并混匀，使其终浓度为0.25％(V/V)，10-15℃静置18小时，1500g离心10分钟，收集上清夜，通过0.45μm膜过滤除菌，喷雾干燥制成抗体干粉，低温保存待用。
4.益生菌粉制备1)配制培养基，成分包括蛋白胨、酵母粉、水解乳蛋白、番茄汁、葡萄糖、乳糖、淀粉。
2)按公知方法分别或混合培养双歧杆菌、乳酸杆菌、肠连球菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、酵母菌。控制菌含量为5-10亿/ml时，用连续离心机回收湿菌体。
3)在上述湿菌体中加入蛋白稳定剂，淀粉吸附方法得到单一组分干菌粉或混合干菌粉，控制菌含量为5-15亿/克。
5.把卵黄抗体干粉以二元制剂总质量的20-50％与上述单一组分干菌粉或混合干菌粉混合，制成肠溶剂型二元活性制剂。(二)、疗效临床实验分别选取初生仔猪425头(其中常规药物对照组200头，试验组225头)、初生羔羊200只(其中常规药物对照组100只，试验组100只)、初生犊牛200头(其中常规药物对照组100头，试验组100头)、雏鸡100只(其中常规药物对照组50只，试验组50只)、幼犬100只(其中常规药物对照组50只，试验组50只)，试验组口服用于预防和治疗大肠杆菌引起幼畜禽下痢的二元活性制剂，对照组为常规药物组，两组其它饲养管理同常。结果表明，试验组较对照组成活率成活率和日龄平均体重增重量均有显著提高，发病率显著降低。试验数据见表1-5，数据经统计分析t检验，P＜0.05，差异显著。
表1二元活性制剂对初生仔猪的影响
表2二元活性制剂对初生羔羊的影响
表3二元活性制剂对初生犊牛的影响
表4二元活性制剂对雏鸡的影响
表5二元活性制剂对幼犬的影响
实施例二用于预防、治疗沙门氏菌引起幼畜禽腹泻的二元活性制剂的制备及疗效(一)、制备1.免疫原制备选取带有特定抗原的沙门氏菌制苗菌株，按公知方法制备灭活苗、检验效价并保存。
2.动物免疫按实施例一所述的动物免疫方法进行动物免疫。
3.免疫球蛋白制备按实施例一所述的免疫球蛋白制备方法，生产抗沙门氏菌免疫球蛋白。
4.益生菌粉制备按实施例一所述的益生菌粉制备方法，生产单一组分干菌粉或混合干菌粉。
5.把卵黄抗体干粉以二元制剂总质量的20-50％与上述单一组分干菌粉或混合干菌粉混合，制成肠溶剂型二元活性制剂。(二)、疗效临床实验分别选取仔猪200头(其中常规药物对照组100头，试验组100头)、羔羊200只(其中常规药物对照组100只，试验组100只)、犊牛200头(其中常规药物对照组100头，试验组100头)、雏鸡200只(其中常规药物对照组100只，试验组100只)、成年鸡200只(其中常规药物对照组100只，试验组100只)，试验组口服用于预防和治疗沙门氏菌引起幼畜禽腹泻的二元活性制剂，对照组为常规药物组，两组其它饲养管理同常。结果表明，试验组较对照组成发病率显著降低。试验数据见表6-10，数据经统计分析t检验，P＜0.05，差异显著。
表6二元活性制剂对仔猪的影响
表7二元活性制剂对羔羊的影响
表8二元活性制剂对犊牛的影响
表9二元活性制剂对雏鸡的影响
表10二元活性制剂成年鸡的影响
实施例三预防、治疗鸡新城疫、法氏囊症、传染性喉炎、传染性支气管炎用二元活性制剂的制备及疗效(一)、制备1.免疫原制备采用鸡新城疫病毒LaSota株、法氏囊病毒CJ801株，按公知方法制备制备乳剂灭活联苗，检验效价并保存；分别采用鸡传染性喉炎病毒、传染性支气管炎病毒制苗病毒株，按公知方法制备灭活苗、检验效价并保存。
2.动物免疫按实施例一所述的动物免疫方法进行动物免疫。
3.免疫球蛋白制备按实施例一所述的免疫球蛋白制备方法，生产抗沙门氏菌免疫球蛋白。
4.益生菌粉制备按实施例一所述的益生菌粉制备方法，生产单一组分干菌粉或混合干菌粉。
5.把卵黄抗体干粉以二元制剂总质量的20-50％与上述单一组分干菌粉或混合干菌粉混合，制成肠溶剂型二元活性制剂。(二)、疗效临床实验分别成年鸡800只，分四群，每群200只(其中常规药物对照组100只，试验组100只)，分别用于测试二元活性制剂对鸡新城疫、法氏囊病、鸡传染性喉炎、传染性支气管炎的疗效。实验组口服二元活性制剂，对照组为常规药物组，两组其它饲养管理同常。结果表明，试验组较对照组成发病率显著降低。试验数据见表11-14，数据经统计分析t检验，P＜0.05，差异显著。
表11二元活性制剂对鸡新城疫的疗效
表12二元活性制剂对鸡法氏囊病的疗效
表13二元活性制剂对鸡传染性喉炎的疗效
表14二元活性制剂对鸡传染性支气管炎的疗效
实施例四预防、治疗细小病毒、传染性肠胃炎病毒、流行性腹泻病毒引发的仔猪疾病用二元活性制剂的制备及疗效(一)、制备1.免疫原制备分别采用仔猪细小病毒、传染性肠胃炎病毒、流行性腹泻病毒制苗病毒株，按公知方法制备灭活苗、检验效价并保存。
2.动物免疫按实施例一所述的动物免疫方法进行动物免疫。
3.免疫球蛋白制备按实施例一所述的免疫球蛋白制备方法，生产抗沙门氏菌免疫球蛋白。
4.益生菌粉制备按实施例一所述的益生菌粉制备方法，生产单一组分干菌粉或混合干菌粉。
5.把卵黄抗体干粉以二元制剂总质量的20-50％与上述单一组分干菌粉或混合干菌粉混合，制成肠溶剂型二元活性制剂。(二)、疗效临床实验分别选取仔猪600头，分三群，每群200头(其中常规药物对照组100头，试验组100头)，分别用于测试二元活性制剂对细小病毒、传染性肠胃炎病毒、流行性腹泻病毒引发的仔猪疾病的疗效。实验组口服二元活性制剂，对照组为常规药物组，两组其它饲养管理同常。结果表明，试验组较对照组成发病率显著降低。试验数据见表15-17，数据经统计分析t检验，P＜0.05，差异显著。表15二元活性制剂对细小病毒引发的仔猪疾病的疗效
表16二元活性制剂对传染性肠胃炎病毒引发的仔猪疾病的疗效
表17二元活性制剂对流行性腹泻病毒引发的仔猪疾病的疗效
实施例五用于预防、治疗轮状病毒引起的仔猪、羔羊腹泻二元活性制剂的制备及疗效(一)、制备1.免疫原制备选取带有特定抗原特性的原轮状病毒制苗病毒株，按公知方法制备灭活苗、检验效价并保存。
2.动物免疫按实施例一所述的动物免疫方法进行动物免疫。
3.免疫球蛋白制备按实施例一所述的免疫球蛋白制备方法，生产抗沙门氏菌免疫球蛋白。
4.益生菌粉制备按实施例一所述的益生菌粉制备方法，生产单一组分干菌粉或混合干菌粉。
5.把卵黄抗体干粉以二元制剂总质量的20-50％与上述单一组分干菌粉或混合干菌粉混合，制成肠溶剂型二元活性制剂。(二)、疗效临床实验分别选取仔猪200头(其中常规药物对照组100头，试验组100头)、羔羊200只(其中常规药物对照组100只，试验组100只)，试验组口服用于预防和治疗轮状病毒引起的仔猪、羔羊腹泻的二元活性制剂，对照组为常规药物组，两组其它饲养管理同常。结果表明，试验组较对照组成发病率显著降低。试验数据见表18-19，数据经统计分析t检验，P＜0.05，差异显著。
表18二元活性制剂对仔猪的影响
表19二元活性制剂对羔羊的影响
实施例六预防、治疗鸭病毒性肝炎用二元活性制剂的制备及疗效(一)、制备1.免疫原制备采用鸭病毒性肝炎病毒制苗病毒株，按公知方法制备灭活苗、检验效价并保存。
2.动物免疫按实施例一所述的动物免疫方法进行动物免疫。
3.免疫球蛋白制备按实施例一所述的免疫球蛋白制备方法，生产抗沙门氏菌免疫球蛋白。
4.益生菌粉制备按实施例一所述的益生菌粉制备方法，生产单一组分干菌粉或混合干菌粉。
5.把卵黄抗体干粉以二元制剂总质量的20-50％与上述单一组分干菌粉或混合干菌粉混合，制成肠溶剂型二元活性制剂。
(二)、疗效临床实验分别成年鸭200只，(其中常规药物对照组100只，试验组100只)，用于测试二元活性制剂对鸭病毒性肝炎的疗效。实验组口服二元活性制剂，对照组为常规药物组，两组其它饲养管理同常。结果表明，试验组较对照组成发病率显著降低。试验数据见表20，数据经统计分析t检验，P＜0.05，差异显著。
表20二元活性制剂对鸭病毒性肝炎的疗效
上面列示了数个实施例，其中数据只为清楚说明本发明。事实上，权利要求2所述的各种免疫球蛋白和权利要求3所述几种益生菌，可以在药学允许的范围内任意调整，有可能超出本发明实施例所述的免疫球蛋白与益生菌的组合及配比比例而制备出二元活性制剂，达到本发明的目的。因而本领域技术人员，依据本发明，可以变化出许多实施方案。
本发明所使用的菌种保存于中国微生物菌种包藏管理委员会农业微生物中心(北京白石桥中国农业科学院，邮编100081)
1.分类命名Lactobacillus acidophilus嗜酸乳杆菌，保存编号6006。
2.分类命名Bacillus subtilis(Ehrenberg)Cohn蜡样芽孢杆菌，保存编号ACC11060。
3.分类命名Candiba utilis Henneberg Lodeler et.Kreger Van Rig产原假丝酵母菌，保存编号ACC2059。
4.分类命名Bacillus licheniformis地衣芽孢杆菌，保存编号20386。
5.分类命名Streptococcus faecalls粪链球菌，保存编号6049。
6.分类命名Bifidobacteriun bifidum两歧双歧杆菌，保存编号1-1852。
权利要求
1.一种二元活性制剂该二元活性制剂是有效量的免疫球蛋白、益生菌及可接受的辅料的组合物。
2.根据权利要求1所述的二元活性制剂，其特征在于，所述免疫球蛋白选自抗大肠杆菌免疫球蛋白、抗沙门氏菌免疫球蛋白、抗法氏囊病(IBD)免疫球蛋白，抗新城疫(ND)免疫球蛋白，抗猪流行性腹泻病毒免疫球蛋白，抗猪传染性胃肠炎病毒免疫球蛋白，抗轮状病毒免疫球蛋白、抗细小病毒免疫求蛋白、抗传染性支气管炎病毒免疫球蛋白、抗传染性喉炎病毒免疫球蛋白和IBD-ND多联免疫球蛋白等。
3.根据权利要求1所述的二元活性制剂，其特征在于，所述益生菌选自双歧杆菌、乳酸杆菌、粪链球菌、芽孢杆菌、酵母菌，在组合物中的活菌数为5000万-5亿个/克。
4.根据权利要求1所述的二元活性制剂，其特征在于该组合物为肠溶剂型。
5.根据权利要求1所述的二元活性制剂可用于预防、治疗由细菌、病毒等病原体引发的多种畜禽及婴幼儿感染性疾病。
6.根据权利要求1或4所述的二元活性制剂，其特征在于该组合物可制成微囊剂、膏剂、冲剂。
7.根据权利要求6所述的二元活性制剂，其特征在于所述辅料选自肠包衣材料、蛋白稳定剂。
8.根据权利要求1或6所述的二元活性制剂，其特征在于其中的免疫球蛋白含量为组合物质量的1-15％。
9.根据权利要求7所述的二元活性制剂，其特征在于所述肠包衣材料为丙烯酸树脂，羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素。
10.根据权利要求7所述的二元活性制剂，其特征在于所述蛋白稳定剂为甲醇、蔗糖。
11.根据权利要求1所述的二元活性制剂，其特征在于该制剂可以用作食品添加剂、保健品、药品、饲料添加剂。
12.一种制备权利要求1或11所述的二元活性制剂的生产工艺，其特征在于该二元活性制剂是经过以下步骤制备而成1)用无特定病原体(SPF)鸡进行强化免疫；2)采用HPMCP沉淀法从强化免疫鸡群所产鸡蛋中提取权利要求2所述的特异性免疫球蛋白(IgY)，并经过喷雾干燥工艺制成卵黄抗体干粉；3)采用常规培养基培养双歧杆菌、乳酸杆菌、粪链球菌、酵母菌(可以分别发酵，也可以混合发酵)，收集菌体，制备干菌粉。4)根据权利要求9所述的免疫球蛋白含量，把卵黄抗体干粉以二元制剂总质量的20-50％与干菌粉混合，最后制成肠溶剂型二元活性制剂。
全文摘要
本发明是一种二元活性制剂及其制备方法,该制剂是益生菌与特异性免疫球蛋白的有机组合。充分发挥二者的协同效应达到预防和治疗多种感染性疾病的作用,降低幼畜禽和宠物幼子的发病率、死亡率,改善其生长发育现状。本制剂采用喷雾干燥法制备卵黄抗体,并与多种益生菌干粉混合,既保持了抗体粉的效价,又有效解决抗体与益生菌混合产品的保存和运输问题。该制剂具有无污染、无抗药性、无残留和药效持续时间长,生产成本低等特点。
文档编号A61K39/395GK1340359SQ0012371
公开日2002年3月20日 申请日期2000年8月31日 优先权日2000年8月31日
发明者秦泽荣 申请人:北京好友巡天生物技术有限责任公司