专利名称：马传染性贫血病毒弱毒疫苗株的感染性分子克隆的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是马传染性贫血病毒弱毒疫苗株(EIAV DLA)全长前病毒基因组的克隆及其感染性分子的构建。
含有该EIAV DLA感染性分子克隆质粒的菌种已存入中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGMCC NO.0501。菌种名称为EIAV-p8.2，分类为大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏日期为2000年11月7日。
马传染性贫血(Equine Infectious Anemia，EIA以下简称马传贫)是由逆转录病毒科慢病毒属的马传染性贫血病毒(Equine Infectious Anemia Virus，EIAV)感染马属动物引起的一种烈性传染病。1843年Lignee在法国的一份兽医学报告中描述了第一例马传贫。患马呈反复发热，出血，贫血，黄疸，消瘦，浮肿等症状，并且以病毒持续感染为特征。1904年，Vallee和Carre证实该病是由一种滤过性病毒引起的。马传贫是最早被证明由病毒所致的传染病之一。
EIAV是正链RNA病毒，病毒基因组由两条线状的RNA组成，两条链通过氢键形成二聚体。EIAV基因组结构与其它慢病毒相似。病毒RNA编码三个主要结构基因gag、pol和env，此外还有几个小开放阅读框架(S1、S2、S3)，其中gag和pol基因部分重叠。病毒RNA基因组两端是完全相同的重复区(R区)，在5’R下游是5’独特区(U5)；3’端R区上游是3’独特区(U3)。R-U5和U3-R构成了病毒基因组两端的非编码区。EIAV感染宿主细胞后，经自身编码反转录酶的作用，合成病毒cDNA。EIAV cDNA可以整合到宿主细胞基因组中形成前病毒。EIAV前病毒DNA具有长末端重复序列(Long Terminal Repeat，LTR)位于前病毒DNA的两端，包括R、U3、U5三个区。其排列顺序为5’-U3-R-U5-3’。EIAV前病毒基因组结构见示意图1。
慢病毒是严重危害人类和动物健康的一类病原体，这个家族还包括艾滋病的病原人免疫缺陷病毒(HIV-1&HIV-2)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、绵羊梅迪-维斯纳病毒(MVV)和山羊关节炎脑炎病毒(CEAV)。这一类病毒在基因组结构、复制的分子机制、病毒的生活周期、抗原漂移规律、免疫机理及病毒与宿主相互作用等方面都很相似。
以EIAV为致病因子的马传贫自发现以来，在世界范围内各养马国家广泛分布与流行。马传贫呈地方性流行，但有时也在小范围内爆发，本世纪50年代到80年代末，马传贫的流行使我国经济蒙受了巨大的损失。在美国，马传贫病毒的传播是通过有计划的检疫及大规模的捕杀计划得以控制的。尽管如此，在世界其他地方，由于缺乏有效的疫苗，马传贫仍然是一个令人头疼的问题。
近年来，艾滋病在全球范围内迅速蔓延。据联合国近日公布的报告显示，到今年12月，全球艾滋病患者和病毒携带者总人数达3610万，仅今年新增的艾滋病感染者和发病者就达530万，相当于平均每天有近1.5万人感染艾滋病。随着艾滋病在世界范围的流行，人类面临着十分严峻的威胁。但由于慢病毒的自身独特性质即病毒的持续感染和高度变异性，使得慢病毒特别是HIV疫苗研制存在严重的障碍。目前还没有有效治疗艾滋病的药物和特异性预防疫苗。迄今为止，国外还没有研制成功有效的慢病毒疫苗。
得益于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所科学家们的潜心研究，本世纪70年代，世界上第一个慢病毒减毒疫苗——马传贫驴白细胞弱毒疫苗诞生了。该疫苗免疫动物不但对同源毒株有效，而且可以抵抗异源强毒攻击，强毒攻击后免疫动物不受感染并产生持久坚强的免疫力。在中国及古巴的广泛应用使两国马传贫已得到有效的控制，并在世界范围内开创了慢病毒疾病免疫预防之先河。
马传贫驴白细胞弱毒疫苗株是将EIAV L株通过驴体传代，使其毒力明显增强，获得EIAV驴强毒，然后在驴白细胞培养物上连续传代致弱获得的。马传贫弱毒疫苗的成功应用，证明了慢病毒防制的现实可行性。
EIAV是遗传结构最简单的慢病毒，已构建成功多株不同毒力的感染性分子克隆，EIAV感染的潜伏期只有几天至几周，而且在EIAV感染过程中新的抗原变异株的出现与疾病的复发相关，因此是研究人及其他动物慢病毒理想的替代模型。我国具有自主研制开发的马传贫驴白细胞弱毒及其亲本驴强毒和原始L系EIAV。因此在分子水平上揭示强弱毒株间的基因表达调控，抗原变异，免疫机理，无疑对包括艾滋病病毒在内的人及其它动物慢病毒的免疫预防及治疗具有重要的理论意义和参考价值。
要揭示我国马传贫弱毒疫苗致弱的分子机制，为HIV-1及其他慢病毒疫苗的设计和研究提供极有价值的理论依据，急需构建我国EIAV弱毒疫苗株的感染性分子克隆，这是近年来发展起来的一种反基因操作系统，克隆的DNA分子经转染细胞后可以形成完整的病毒粒子，并具有感染性。利用感染性分子克隆可以进行反向遗传操作，通过在病毒分子克隆的特定位置引入突变或缺失，对病毒进行遗传修饰，检测其生物学特性的改变，可以验证病毒基因组序列变化与病毒蛋白功能的关系，对进一步在分子水平上阐明我国EIAV疫苗株的复制机制、减毒机理和免疫保护机制具有极其重要的意义，这可为人爱滋病基因缺失减毒疫苗的研究提供借鉴，有助于解决爱滋病研究中所遇到的困惑。
另外，目前我国使用的马传贫弱毒疫苗尚未进行克隆纯化，为多克隆疫苗，如果用马传贫弱毒疫苗感染性分子克隆衍生的病毒作为疫苗代替现有疫苗，使用效果可能更好，而且更接近国际标准，更易于被国际接受，可以在世界范围内推广，为国家创汇。因此，EIAV弱毒疫苗株感染性分子克隆的发明不仅具有理论价值，而且具有极大的经济价值。
本发明的目的是获得EIAV弱毒疫苗株的感染性分子克隆，为进一步研究该疫苗株的复制、致弱和免疫保护机制提供有价值的工具。
本发明构建的是马传染性贫血病毒弱毒疫苗株的感染性分子克隆，该克隆包含了EIAV弱毒疫苗株基因组从5’端长末端重复序列(LTR)，结构基因gag、pol、env，小开放阅读框架(ORF)S1、S2、S3及3’端LTR的全长前病毒基因组，该克隆具有感染性，导入宿主细胞后可形成完整的马传染性贫血病毒粒子。
马传染性贫血病毒弱毒疫苗株的感染性分子克隆的构建，首先在体外培养马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株(EIAV DLA)，提取前病毒，以EIAV DLA的前病毒DNA为模板，采用PCR方法分三个重叠片段扩增出EIAV DLA的前病毒DNA，这三个片段覆盖马传染性贫血病毒的全部基因组，PCR产物经克隆后顺次连接，获得一个含有EIAV全基因(8.0Kb)的重组质粒，将其命名为p8.0。将此8.0Kb EIAV全基因再亚克隆到含有一完整EIAV DLA株长末端重复序列的质粒中，获得一含有EIAV驴白细胞弱毒前病毒全基因的重组质粒，将其命名为p8.2，经核苷酸序列分析，证明p8.2含有EIAV前病毒的全基因。用p8.2转染驴白细胞，将其作为种毒进行传代，于感染该克隆毒的细胞培养上清中检测反转录酶，并将被感染的细胞经透射电镜观察，构建出具有感染性的EIAV DLA感染性分子克隆。
本发明具有如下积极效果EIAV DLA感染性分子克隆的构建成功，为广泛深入地研究该病毒提供了重要实验材料，利用EIAV DLA感染性分子克隆，可以从细胞水平到分子水平，从细胞模型到动物模型，从局部到整体等多方位、多角度地展开对EIAV DLA的致弱、免疫保护机制，复制、转录及翻译机制等广泛而深入的研究，并为爱滋病等其它慢病毒的研究提供借鉴。另外，用EIAV DLA感染性分子克隆衍生的病毒作为疫苗代替现有疫苗，使用效果可能更好，更接近国际标准，易于被国际接受，可在世界范围内推广，为国家创汇。
图1为马传染性贫血病毒前病毒基因组结构示意图。
图2为EIAV DLA感染性分子克隆的重组质粒结构示意图。
图3为用于PCR扩增的引物的位置图。
图4为pUC19及Bluescript SK载体质粒图谱。
图5为EIAV DLA前病毒全基因组重组质粒的构建流程图。
图6为EIAV DLA株前病毒全基因组核苷酸序列。
EIAV DLA感染性分子克隆的具体构建方法见如下实施例一、EIAV前病毒DNA的提取感染EIAV驴白细胞弱毒疫苗株(由EIAV中国L系强毒在驴体内传70代，又在驴白细胞上传124代而成，见文献1)的驴白细胞出现病变后，将培养液倒掉，细胞于-20℃冻存，将冻存的细胞融化，用TNE(0.1mol/L Tris-HCl，PH8.0)将细胞悬浮，加10％SDS至终浓度0.4％，加蛋白酶K至终浓度100μg/μl，37℃消化2小时，用等体积酚和氯仿各抽提一次，加2倍体积冷无水乙醇，-20℃过夜，12000rpm离心20分钟，沉淀用适量灭菌去离子水悬浮备用。二、合成和扩增基因片段的引物(见表1及图3)表1.PCR引物序列位置表引物名称 序列位置P1 TTGCCAGGCAACTGCAGTGTGATAACCTTT 88P2 AGGGTGCCTCTTCCTGCAATTTATCCTCAG2879P3 GCCATCCATTAATCATCAGGAACCAG2625P4 ACTGCTCCATCACCTTTCCACAACAC5014P5 GCTAAGCAAGGGTTATTAATCAATGG4075P6 CAGCAGAGAAGGAGCTCAGACCGCAGAATC8123P7 ATTCCTTGCTGAAGCTTCCCACTATG7696P8 CTTCTCTAACTTCTTGAGCGCTTTGC 497三、PCR扩增以EIAV DLA前病毒DNA为模板，以PCR反应分别扩增3个基因片段。1、F1片段的扩增PCR反应组成(50μL反应体系)TaKaRa LA Taq(5u/μl)0.5μl10×LA pCRTMBuffer II(Mg2+free) 5μl25mM MgCL25μldNTP Mixture(各2.5Mm) 8μl模板(0.8μg/μl) 1μl引物P1(10pmol/μl) 2.5μl引物P2(10pmol/μl) 2μl灭菌去离子水 26μlPCR反应条件95℃预变性10分钟，94℃1分钟，55℃1分钟，72℃5分钟，进行5个循环，94℃1分钟，51℃1分钟，72℃5分钟，进行30个循环，反应结束前72℃延伸10分钟。2、F2片段的扩增PCR反应组成(50μL反应体系)TaKaRa LA Taq(5u/μl)0.5μl10×LA pCRTMBuffer II(Mg2+free) 5μl25mM MgCL25μldNTP Mixture(各2.5Mm) 8μl模板(0.8μg/μl) 1μl引物P3(10pmol/μl) 2μl引物P4(10pmol/μl) 2μl灭菌去离子水26.5μlPCR反应条件95℃预变性10分钟，94℃1分钟，54℃1分钟，72℃5分钟，进行5个循环，94℃1分钟，50℃1分钟，72℃5分钟，进行30个循环，反应结束前72℃延伸10分钟。2、F3片段的扩增PCR反应组成(50μL反应体系)
TaKaRa LA Taq(5u/μl)0.5μl10×LA pCRTMBuffer II(Mg2+free) 5μl25mM MgCL25μldNTP Mixture(各2.5Mm)8μl模板(0.8μg/μl) 1μl引物P5(10pmol/μl)1μl引物P6(10pmol/μl)1μl灭菌去离子水 28.5μlPCR反应条件95℃预变性10分钟，94℃1分钟，52.5℃1分钟，72℃4.5分钟，进行5个循环，94℃1分钟，52.5℃1分钟，72℃5分钟，进行30个循环，反应结束前72℃延伸10分钟。四、PCR的三个扩增片段的克隆及测序1.F1片段的克隆及测序1.1 PCR产物与载体质粒的酶切消化(1)在Eppendorf管中依次加入下列反应物去离子水65μl，10×buffer10μl，pCR产物或质粒DNA(0.5μg/μl)20μl，限制性内切酶HindIII5μl(10U)；(2)混匀，置于37℃水浴消化3小时；(3)60-70℃作用10分钟以终止酶切反应，取少量反应物(约3-5μl)用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果；(4)若酶切完全，则加2倍体积的无水乙醇和1/10体积的NaAC(3MpH5.2)，于-20℃冰箱放置1小时；(5)取出，40℃离心12000rpm，15分钟；(6)弃上清，沉淀加200μl70％乙醇，12000rpm，5分钟；(7)弃上清，吹干沉淀，加85μl灭菌无离子水，按上述方法继续用限制性内切酶pst I酶切；(8)用DNA回收试剂盒(原平皓生物技术有限公司)回收酶切产物。
1.2外源DNA片段与载体连接及转化将HindIII和Pst I双酶切的PCR产物和载体质粒pBluescript(见图3及文献2)以摩尔比3∶1混匀，置60℃水浴10分钟，缓慢退火，再加入连接缓冲液及T4DNA连接酶(做10μl体系)，混匀，置17℃水浴过夜。将连接产物转化到大肠杆菌Ecoli JM109株感受态细胞(购自大连宝生物工程公司)中。涂布于含有X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的Amp LB平板上，37℃培养12-16小时，挑选培养基上的白色菌落进行分析。
1.3阳性克隆的筛选与鉴定随机挑取一些白色菌落，用碱裂解法小量提取质粒，然后用HindIII及SalI进行酶切及双酶切，0.8％琼脂糖凝胶电泳，从中筛选出含有2.8kb大小外源片段的重组质粒(命名为p2.8)。
1.4重组质粒p2.8的序列测定将筛选鉴定的重组质粒，送大连宝生物工程公司，用Thermol Cycling全自动序列分析仪进行序列测定。
2.F2片段的克隆及测序PCR产物F2片段(2.4kb)用Apa I、HindIII双酶切，连接，转化，筛选，鉴定，得到重组质粒p2.4(方法同上)。
3.F3片段的克隆及测序PCR产物F3片段(4.0kb)用Sac I、Cla I双酶切，连接，转化，筛选，鉴定，得到重组质粒p4.0(方法同上)。五、含有EIAV DLA前病毒全基因组重组质粒的构建1、F1和F2片段的拼接将重组质粒p2.8和p2.4分别用HindIII、Apa I双酶切，回收p2.8酶切的5.7kb片段作为载体，p2.4酶切的2.0kb片段作为外源片段，连接、转化，筛选出含EIAV4.7kb片段的重组质粒，命名为p4.7。
2、PUC4.0载体的构建由于F3片段在pBluescript+载体上是反向的，需要转移到其它载体质粒中，以便于与p4.7的连接。本实验选择了pUC19载体质粒(见图4及文献2)。将pUC19和p4.0分别用Sac I，Cla I双酶切，回收2.7kb和4.0kb，连接、转化，经酶切鉴定，筛选出含正向EIAV4.0kb片段的重组质粒，命名为pUC4.0。
3、F1-F2和F3片段的拼接将p4.7用pst I全部酶切，Nco I部分酶切，回收4.7kb片段，做为外源片段。将pUC4.0用pst I，Nco I双酶切回收约6.0kb片段，做为载体。将二者连接、转化，经酶切鉴定筛选出含有EIAV全基因的重组质粒，命名为p8.0。
4、含有EIAV DLA全基因重组质粒的构建EIAV前病毒全基因重组质粒的构建过程见图5。将重组质粒p8.0经限制性内切酶Mlu I(Mlu I酶切位点位于LTR内)完全酶切，获得含有EIAV全基因的8kb线形分子，回收该8kb片段，将此8kb片段低浓度连接成含有单一LTR的环状分子，根据测得的疫苗株的核苷酸序列设计一对引物(表1)，以该环状分子为模板，经PCR扩增一0.76kb片段，该片段含有一个完整的LTR，将这一0.76kb片段克隆至质粒载体pUC19内，获得含有一完整LTR的重组质粒，将其命名为p0.76。将回收的8kb片段亚克隆到质粒p0.76中，获得一含有EIAV驴白细胞弱毒前病毒全基因的重组质粒(图2)，将这一重组质粒命名为EIAV-p8.2，经核苷酸序列分析(图6)，证明EIAV-p8.2含有EIAV DLA前病毒的全基因，EIAV DLA前病毒基因组全长为8266bp。六、转染用质粒纯化试剂盒(Promega，Genomic DNA Purification Kit)提取质粒EIAV-P8.2，通过脂质体法用6ul脂质体将1ug质粒转染到长满60-80％单层的驴白细胞中(35mm培养皿)，按试剂盒说明书操作。细胞经转染后4天收取2ml培养上清，用于测定反转录酶活性，剩余培养液及细胞冻融三次，作为种毒继续传代，结果传数代，于接毒后第四天细胞出现病变，细胞变暗、圆缩或变成线状，部分细胞脱落。七、反转录酶(RT)活性的测定分别收取转染质粒p8.2的驴白细胞及用该转染细胞作为种毒接种的细胞的培养上清，于4℃2,000×g离心30分钟，去掉细胞碎片，上清于4℃ 100,000×g离心30分钟，弃净上清，沉淀于-70℃冻存，用于反转录酶活性的测定。通过BOEHRINGER MAINNHEIM公司的反转录酶非放射性检测试剂盒检测细胞培养上清中反转录酶的含量，按试剂盒说明书操作。结果传至第4代，于接种的驴白细胞培养上清中检出反转录酶，说明在驴白细胞中由EIAV-p8.2衍生出了EIA病毒。八、EIAV病毒的电子显微镜检测以转染质粒EIAV-p8.2的细胞作为种毒，在细胞上传数代后，通过透射电镜可观察到典型的马传染性贫血病毒粒子，直径约90nm，具有锥形的核心，进一步说明确实由EIAV-p8.2衍生出了EIA病毒粒子，证明EIAV-p8.2具有感染性。结果表明，我们已成功地构建了EIAV DLA的感染性分子克隆。
EIAV DLA感染性分子克隆的构建成功，为深入研究该病毒提供了重要实验材料，以EIAV DLA感染性分子克隆为基础可以进行多方面的研究和应用，例如1、以EIAV DLA感染性分子克隆为基础进行有关EIAV DLA在体外细胞系统的复制及翻译机制的研究。
2、以EIAV DLA感染性分子克隆为基础进行减毒机理的研究。
3、以EIAV DLA感染性分子克隆为基础进行免疫保护机制的研究。
4、以EIAV DLA感染性分子克隆为基础，构建强-弱毒嵌合病毒，对EIAV的致病性进行研究。
5、以EIAV DLA感染性分子克隆为基础进行逆转录病毒转移载体的构建。EIAV慢病毒载体与其它以鼠白血病病毒为基础的逆转录病毒载体相比，EIAV载体的优点是可以转导非分化的细胞。
6、以EIAV DLA感染性分子克隆为基础进行人类爱滋病及其它慢病毒动物模型的研究。
7、以EIAV DLA感染性分子克隆为基础衍生的病毒可用于生产马传染性贫血病毒弱毒疫苗(克隆毒)。
参考文献1.沈荣显，徐振东，何云生，等。1979.马传染性贫血免疫的研究。中国农业科学.(4)1-15。2.Sambrook J，E F Fritsch and T Maniatis.Molecular cloninga laboratory manual.2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press.Cold Spring Harbor，N.Y 1989.
权利要求
1.马传染性贫血病毒弱毒疫苗株(EIAV DLA)感染性分子克隆，其特征在于该克隆包含EIAV DLA的前病毒全长基因组。
2.根据权利要求1所述的克隆，其中含有该质粒特征的菌种已存入中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGMCC NO.0501。菌种名称为EIAV-p8.2。
3.根据权利要求1所述的克隆，其特征在于该克隆中的核苷酸序列包括EIAVDLA前病毒从5’端长末端重复序列(LTR)，结构基因gag、pol、env，小开放阅读框架(ORF)S1、S2、S3及3’端LTR的全长基因组。
4.根据权利要求1所述的克隆，其特征在于该克隆具有感染性，导入宿主细胞后可形成完整的马传染性贫血病毒粒子。
5.根据权利要求1所述的克隆，其特征在于所用的载体为PUC19。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域,是马传染性贫血病毒弱毒疫苗株(EIAV DLA)的感染性分子克隆。该系统包含一个克隆,该克隆包含的核苷酸序列为EIAV DLA的全长前病毒基因组,该克隆具有感染性,导入宿主细胞后可形成完整的马传染性贫血病毒粒子。EIAV DLA感染性分子克隆构建的成功,为研究EIAV DLA的复制、致弱和免疫保护机制及作为人类艾滋病的动物模型提供了重要材料,并可用于生产马传染性贫血病毒弱毒克隆疫苗。
文档编号A61K39/21GK1366053SQ0110148
公开日2002年8月28日 申请日期2001年1月18日 优先权日2001年1月18日
发明者童光志, 王柳, 杨志彪, 刘红全, 仇华吉, 孔宪刚 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所