专利名称：对囊性纤维化跨膜传导调节蛋白氯离子通道的抑制的制作方法
技术领域：
本发明涉及对囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)氯离子(Cl-)通道的抑制。更具体地，本发明涉及一个确定类别化合物的成员作为CFTR Cl-通道的阻断剂或抑制剂，以及这些物质在治疗由CFTR Cl-通道功能异常所引起的疾病中的用途。
CFTR(1)形成具有复杂调节的Cl-通道(2，3)。它主要在上皮的顶膜中表达，为Cl-离子的移动提供通路并且是调节盐和水跨上皮移动速率的关键点(4)。
图1CFTR Cl-通道的调节囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的域结构显示通道门控的调节如图1所示。通道门控的图示在模型下方显示C，关闭状态；0，开放状态。缩写MSD，跨膜域；NBD，核苷酸结合域；P，R结构域的磷酸化；PKA，cAMP-依赖性蛋白激酶；PPase，磷酸酶；R，调节域；In，胞内；Out，胞外。白色的框代表细胞膜。
CFTR由5个结构域组成2个跨膜域(MSDs)，2个核苷酸结合域(NBDs)，和1个调节域(R)(1)。MSDs使得形成Cl--选择性孔道，而NBDs和R结构域控制通道活性(2，3)。cAMP-依赖性蛋白激酶(PKA)的激活引起R结构域内多个丝氨酸残基的磷酸化。一旦R结构域发生磷酸化，通道闸门就由在NBDs的ATP水解循环控制。
CFTR的功能障碍与多种疾病相关。突变，一般来说破坏了CFTR的功能，引起遗传性疾病囊性纤维化(CF；4)。然而，某些形式的男性不育、弥散性支气管扩张和慢性胰腺炎也是由被认为保留了部分CFTR功能的突变引起的(4)。高于正常的CFTR Cl-通道活性被认为与某些其它疾病有关，例如多囊肾病和分泌性腹泻(5，6)。
核苷三磷酸，比如ATP，控制CFTR Cl-通道的活性。一旦被PKA磷酸化，就需要微摩尔级浓度的ATP来调节CFTR Cl-通道的开放和关闭。胞内ATP还调节一类K+通道，称为对ATP敏感的K+通道(KATP通道；7)。胰腺β细胞、肌细胞和某些神经元中KATP通道的开放与细胞质的ATP浓度相偶联。和ATP与NBDs相互作用控制通道闸门的CFTRCl-通道相比，ATP阻止K+流过KATP通道孔隙来抑制通道活性。
对KATP通道已经有很好的药理学认识。它们被一类被用于治疗非胰岛素依赖型糖尿病的降血糖药物磺脲类所抑制，并受一类新的称为K+通道开放剂的药物刺激(8)。相对而言，CFTR Cl-通道的药理学尚未认识清楚。已证实在表达野生型人 CFTR的细胞中磺脲类格列本脲和甲苯磺丁脲，以及K+通道开放剂二氮嗪、BRL38227(levcromakalim)和硫酸米诺地尔抑制cAMP刺激的Cl-电流(9)。数据显示格列本脲是CFTR Cl-电流的一种有效抑制剂。随后表明格列本脲是通过阻塞CFTR孔道的胞内端并阻止Cl-渗透来抑制CFTR的(10)。
US 5,234,922公开了某些磺脲类化合物，包括甲苯磺丁脲和格列本脲，作为CFTR Cl-通道的阻断剂或抑制剂用于分泌性腹泻的治疗。同时公开了具有开放钾离子通道活性的化合物具有CFTR Cl-通道阻断功能。
化合物荧光素的某些衍生物被发现能调节KATP通道的活性(11)。荧光素的衍生物被发现有两个相反的作用。第一，它们能够抑制KATP通道。第二，它们能够重新活化由于维持通道活性所需的胞质成分的缺乏而失活(称为“耗尽”)的KATP通道。
本发明是基于发现某些荧光素的衍生物能够用于抑制CFTR Cl-通道以及，作为结果，这些化合物可以用于治疗对抑制或阻断CFTR Cl-通道有反应的疾病或病症，比如多囊肾病和分泌性腹泻。
因此，本发明提供了式I化合物及其可药用盐的用途， 其中R1、R2和R3可以各自是选自H、1-6C烷基及卤素的相同或不同的基团，R4是选自H和1-6C烷基的基团，用于生产治疗活动物体包括人的疾病的药物，所述疾病对抑制囊性纤维化跨膜传导调节蛋白氯离子通道有反应。
本发明进一步提供了治疗活动物体包括人的对抑制CFTR Cl-通道有反应的疾病的方法，该方法包括给活动物体施用CFTR Cl-通道抑制量的式I化合物。
已被发现在本发明实施中有用的荧光素化合物具有式I， 其中R1、R2和R3可以各自是选自H、1-6C烷基及卤素的相同或不同的基团，R4是选自H和1-6C烷基的基团或形成可药用盐的阳离子基团。优选的化合物中R1、R2和R3是选自H、1-4C烷基的相同或不同的基团，或当R4是H时是该羧酸的可药用盐。更为优选的式I化合物中R1选自H、Cl、Br和I，R2选自H、Cl、Br和I，R3选自H、Cl、Br和I，R4选自H、甲基和乙基。
荧光素是一种已熟知的化合物。它以及它的于此所述的衍生物可以按照本领域已知的方法合成。
如上所述，式I化合物可以作为药物活性成分用于治疗动物体包括人的对抑制或阻断CFTR Cl-通道有反应的疾病或病症。给予需要治疗的动物体的药物剂量当然取决于实际所使用的活性化合物、治疗模式以及所需治疗的类型。当然，活性化合物可以以自身形式给药，或采取含有如适当的药用载体或稀释剂的适当的药物组合物形式给药。其它物质也可存在于这些药物组合物中，如其应用为本领域技术人员所熟知的辅剂和稳定剂。活性化合物可以以任何适当的方式给予需要治疗的动物体，包括人。通常将活性化合物或含有它的药物制剂通过口服或静脉内途径给药。
对抑制囊性纤维化跨膜传导调节蛋白氯离子通道有反应，并因此可以通过给予患有这些疾病或病症的动物体包括人CFTR氯离子通道抑制剂量的前述式I荧光素化合物来治疗的疾病或病症的实例包括多囊肾病、分泌性腹泻、心律失常、血管生成及肿瘤血管化。此外，我们相信如上所述的荧光素化合物还可以用作为男性避孕药。实验方法1.电生理实验方法细胞培养我们使用了稳定表达野生型人CFTR的小鼠乳腺上皮细胞(C127细胞)进行电生理实验(12)。将表达野生型CFTR的C127细胞按以前所述的方法(10)进行培养。将细胞被种于玻璃片上，48小时内使用。电生理学如以前所述(10，13)，在切除下来的膜内侧翻外的细胞膜片中，使用一台Axopatch 200A膜片钳放大器(Axon InstrumentsInc.，Foster City，美国)及pCLAMP数据获得和分析软件(6.03版本，Axon Instruments Inc.)记录CFTR Cl-通道。自始至终应用已建立起的符号规约；从胞内向胞外溶液移动的正电荷所产生的电流(阴离子向相反方向移动)表示为正电流。
移液管(胞外)溶液含有(以mM为单位)140N-甲基-D-葡萄糖胺(NMDG)、140天冬氨酸、5CaCl2、2MgSO4和10 N-三[羟甲基]甲基-2-氨基乙磺酸(Tes)，用Tris调pH 7.3([Cl-]，10mM)。浸泡(胞内)溶液含有(以mM为单位)140NMDG、3MgCl2、1乙二醇-双(β-氨基乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸铯盐(CsEGTA)和10 Tes，HCl调pH 7.3，([Cl-]，147mM；[Ca2+]游离，＜10-8M)。所有实验在37℃下进行。
从C127细胞切除细胞膜片后，通过向胞内溶液添加蛋白激酶A的催化亚单位(PKA；75nM)和ATP(1.0mM)而活化CFTR Cl-通道。ATP浓度随后降至0.3mM(胞内ATP活化CFTR Cl-通道的EC50)。在实验过程中维持胞内溶液中的PKA。除非特别指出，电压为-50mV。
为了研究焰红染料B对CFTR Cl-通道的作用，我们使用了含有大量活性通道的细胞膜片用于时间过程研究，并将含有5个或更少活性通道的细胞膜片用于单通道研究。每个膜片上的通道数目是按以前所述(10)，由一次实验过程中观察到同时通道开放的最大数目得出的。由于一些荧光素衍生物对CFTR Cl-通道的作用仅部分可逆(见结果)，特异性的干预未被采用相同浓度的ATP和PKA、但没有荧光素衍生物的对照过程所包括。然而，我们已经在以前表明了在PKA和ATP的持续存在下，从C127细胞切除的细胞膜片的CFTR Cl-通道的耗尽是最低限度的(10)。
首先使用一台数字磁带记录器(digital tape recorder)(Biologic Scientific Instruments，型号DTR-1204；IntracelLtd，Royston，英国)将CFTR Cl-电流记录在数字录音磁带(digital audiotape)上，带宽10kHz。回放时，使用一台8电极Bessel滤波器(Frequency Devices，型号902LPD2；Scensys Ltd，Aylesbury，英国)于转角频率500Hz将记录过滤并使用Digidata1200界面(Axon Instruments Inc.)和pCLAMP以2.5kHz(时间过程研究)或5.0kHz(单通道研究)的取样率获得记录。
在时间过程研究中，每一点为4秒内的平均电流，持续收集数据点；更换溶液时不收集数据。特定干预的平均电流(I)确定为干预过程中收集的所有数据点的平均值。将药物浓度和CFTR抑制之间的关系拟合Hill方程I药物/I对照＝1/{1+([药物]/Ki)n)(1)其中[药物]是药物浓度，I药物/I对照是在所指示药物浓度下的电流相对于不加药物的同样溶液中的电流的比值，Ki是引起半数最大抑制的药物浓度，n是斜率(Hill系数)。使用线性最小平方回归将平均数据拟合方程(1)的线性形式以获得Ki和n值。
为测定单通道电流振幅(i)，使电流振幅柱状图符合高斯分布。使用了半幅穿越标准探测事件来列出开放和关闭次数，用于研究开放可能性(PO)并进行动力学分析。持续时间小于1ms的转变被排除在分析之外。PO通过以下方程计算PO＝(T1+T2+…+TN)/(NTtot)(2)其中N是通道的数目；Ttot是被分析的总时间，T1是一个或多个通道开放的时间，T2是两个或多个通道开放的时间，依此类推。只将含单个活性通道的细胞膜片用于单通道动力学分析。
为了研究荧光素衍生物对CFTR的抑制是否为电压依赖性，我们使用了电压斜线上升方案(voltage ramp protocols)。在缺乏和存在荧光素衍生物的情况下由各持续2秒的15-30个锯齿电压(rampsof voltage)所产生的平均电流获得了宏观的电流-电压(I-V)关系；保持电压(holding voltage)为-50mV。将缺乏PKA和ATP时记录的基础电流从荧光素衍生物缺乏和存在情况下记录的电流中扣除以确定这些物质对CFTR Cl-电流的影响。试剂PKA的催化亚单位购自Promega Ltd。ATP(二钠盐)、孟加拉玫瑰素B(bengal rose B)、黄色曙红、荧光素、格列本脲、焰红染料B、Tes和四氯荧光素获自Sigma-Aldrich有限公司(Poole，英国)。所有其它的化学品都是试剂级的。
荧光素衍生物基于上述的结构I。荧光素的R1、R2、R3和R4是H。四氯荧光素的R1、R2和R4是H，R3是Cl。黄色曙红的R1和R2都是Br且R3和R4都是H。焰红染料B的R1和R2都是Br，R3是Cl且R4是H。孟加拉玫瑰素B的R1和R2都是I，R3是Cl且R4是H。
于二甲基亚砜中制备荧光素衍生物的贮存液，在-20℃保存。使用前即刻将贮存液在胞内溶液中稀释以达到终浓度。介质不影响CFTR Cl-通道的活性(14)。统计学结果以n次观察的平均值±SEM的形式表达。为比较各组数据，我们使用了Student’s t检验。当P＜0.05时认为差异具有统计学上的显著性。所有的检验都使用SigmaStat(1.03版；JandelScientific GmbH，Erkrath，德国)进行。结果焰红染料B调节CFTR Cl-电流的活性为了检测焰红染料B对野生型人CFTR的作用，我们研究了从稳定表达野生型人CFTR的C127细胞中切取的膜内侧翻外的细胞膜片中的CFTR Cl-电流。在缺乏ATP(n＝4)或PKA(n＝4)时，向浸泡细胞膜胞内侧的溶液中添加焰红染料B对CFTR Cl-通道的活性没有影响(数据未显示)。然而，在PKA和ATP的持续存在下向胞内溶液中加入焰红柒料B时，通道活性被改变。图2焰红染料B调节CFTR的活性从稳定表达野生型CFTR的C127细胞切取的膜内侧翻外的细胞膜片中CFTR Cl-电流的时间过程。在线条所指示的时间内ATP(0.3mM)、PKA(75nM)和焰红染料B(Phlx B；5-50μM)存在于胞内溶液中。电压为-50mV，并存在跨膜Cl-浓度梯度(内[Cl-]＝147mM；外[Cl-]＝10mM)。每一点为4秒内的平均电流，更换溶液时不收集数据。为了图示的目的，时间过程被转化，以使向上偏斜代表向内的电流。
图2表明焰红染料B调节CFTR Cl-电流的活性。向胞内溶液中添加焰红染料B(1-5μM)刺激CFTR Cl-电流。与此相比，更高浓度的焰红染料B(20-50μM)造成CFTR Cl-电流浓度依赖性减少。
除焰红染料B外，我们还测试了其它的荧光素衍生物，包括荧光素、四氯荧光素、黄色曙红和孟加拉玫瑰素B。图3荧光素衍生物的浓度-反应关系A，数据为平均值±SEM；n＝每个浓度3-9次观测。荧光素衍生物用不同符号表示(孟加拉玫瑰素B，圆圈；焰红染料B，方块；黄色曙红，三角；四氯荧光素，菱形；荧光素，六角形)。点线上方的数值表示对CFTR的刺激，而线下方的数值表示抑制。B，A所显示数据的焰红染料B、黄色曙红和四氯荧光素抑制CFTR的Hill标绘图。连续的线为数据第一级回归的拟合。对于焰红染料B，Ki＝17μM且n＝2；对于黄色曙红，Ki＝48μM且n＝1.6；而对于四氯荧光素，Ki＝58μM且n＝0.7；其它细节见图2。
图3表明荧光素衍生物调节CFTR Cl-通道的活性。所有被检测的荧光素衍生物都抑制通道活性，而只有黄色曙红、焰红染料B和孟加拉玫瑰素B刺激通道活性。对CFTR抑制强度的次序依次为孟加拉玫瑰素B＞焰红染料B＞黄色曙红≥四氯荧光素＞＞荧光素。黄色曙红对CFTR的抑制是完全可逆的(n＝7；数据未显示)。相比之下，焰红染料B和四氯荧光素的抑制是部分可逆的(n＝3-6；图6，数据未显示)，而孟加拉玫瑰素B的抑制是不可逆的(n＝3；数据未显示)。
图3B表明对于黄色曙红、焰红染料B和四氯荧光素，药物浓度与电流抑制之间的关系很好地符合Hill方程。这些数据提示荧光素衍生物是CFTR Cl-通道的有效阻断剂。孟加拉玫瑰素B和焰红染料B抑制CFTR的效力高于或等于格列本脲，一种广泛使用的CFTR Cl-通道阻断剂(9)。黄色曙红和四氯荧光素对CFTR的抑制较格列本脲弱，但强于许多其它的CFTR Cl-通道阻断剂，包括芳氨基苯甲酸盐类二苯胺-2-甲酸盐(DPC)和5-硝基-2-(3-苯丙氨基)-苯甲酸(NPPB)、二磺二苯乙烯类(disulphonic stilbenes)4，4’-二异硫氰基二苯乙烯-2，2’-二磺酸(DIDS)和4，4’-二硝基二苯乙烯-2，2’-二磺酸(DNDS)以及类黄酮、染料木黄酮(15-18)。有趣的是，数据还提示焰红染料B和黄色曙红对CFTR的抑制是通过在两个相互合作作用的位点上结合，而四氯荧光素结合单一位点来抑制CFTR。焰红染料B抑制CFTR的机制以前的研究已经证实一些物质通过在CFTR孔道内结合以阻止Cl-渗透来抑制CFTR，而其它的药物通过显著减缓通道开放的速率来抑制CFTR(18-20)。为了研究焰红染料B如何抑制CFTR，我们使用含有≤5个活性通道的细胞膜片测定了焰红染料B(20μM)对CFTR单通道活性的作用。图4焰红染料B(20μM)抑制CFTR单通道活性A，显示焰红染料B(20μM)对3个CFTR Cl-通道活性的作用的代表性记录。ATP(0.3mM)和PKA(75nM)持续存在于胞内溶液中。电压为-50mV，并存在跨膜Cl-浓度梯度(内[Cl-]＝147 mM；外[Cl-]＝10mM)。虚线表示通道关闭状态而向下偏斜相当于通道开放。左侧的轨迹为20秒；线条表示的1秒部分在右侧以扩展时间刻度显示。B和C，分别为焰红染料B对i和PO的影响。柱形和误差线表示平均值+SEM；n＝每个浓度6次观测。星号表示与对照值有显著差异的值(P＜0.05)。其它细节同A。
图4A显示在由PKA磷酸化后焰红染料B(20μM)对3个CFTRCl-通道活性的作用。对这些轨迹的肉眼观察提示焰红染料B(20μM)能大大地改变通道门控的方式。野生型CFTR的门控方式特征为受由脉冲之间更长时间的关闭分隔的短暂闪烁关闭中断的活性脉冲(bursts of activity)(图4A，上方轨迹)。焰红染料B(20μM)通过3种途径改变了CFTR的门控行为。第一，它极大地延长了脉冲之间的关闭时间间隔(图4A)。第二，它使得中断通道活性脉冲的闪烁关闭大大增加(图4A)。第三，它似乎表现出对脉冲持续时间的延长(图4A)。为了对这些作用进行定量，我们测定了i和PO。图4B和C显示焰红染料B(20μM)显著降低了i和PO(P＜0.05)。
我们还测定了黄色曙红、四氯荧光素和孟加拉玫瑰素B对CFTR单通道活性的作用。图5黄色曙红和四氯荧光素对CFTR单通道活性的抑制左侧，荧光素衍生物对i的影响。右侧，荧光素衍生物对PO的影响。A和B为黄色曙红(100μM)，C和D为四氯荧光素(TCF；100μM)。柱形和误差线表示平均值+SEM；n＝每个浓度6-7次观测。星号表示与对照值有显著差异的值(P＜0.05)。其它细节同图4。
图5表明黄色曙红(100μM)和四氯荧光素(100μM)通过减少i和PO来抑制通道活性。当存在孟加拉玫瑰素B(10μM)时，我们始终未能分辨离散的通道开放，提示它显著减少了i和/或PO(n＝3，数据未显示)。
荧光素衍生物抑制格列本脲与KATP通道结合(11)。基于这些数据，我们对测定焰红染料B对格列本脲抑制CFTR Cl-通道的影响产生了兴趣。图6格列本脲和ATP对焰红染料B抑制CFTR的影响A和B，CFTR Cl-电流的时间过程，分别显示格列本脲和ATP浓度对焰红染料B抑制CFTR的影响。在线条所指示的时间内，ATP(0.3或5mM)、PKA(75nM)、焰红染料B(20μM)和格列本脲(Glib；50μM)存在于胞内溶液。其它细节同图2。
焰红染料B(1μM)对CFTR的刺激不能阻止格列本脲(50μM；n＝5，数据未显示)对通道的阻断。并且，图6A表明格列本脲(50μM)加强了焰红染料B(20μM)对通道的阻断。焰红染料B(20μM)将I降低到对照值的59±4％(n＝5)，而焰红染料B(20μM)和格列本脲(50μM)将I降低到对照值的10±2％(n＝5；P＜0.001)。
增高浓度的CFTR活化剂5’-腺苷酰亚胺二磷酸(AMP-PNP)和染料木黄酮通过极大地降低NBD1-介导的通道开放速率而抑制通道活性(18，19，21)。如同染料木黄酮(18，21)，焰红染料B延长了分隔通道开放的长时间关闭的持续时间。这提示染料木黄酮和焰红染料B可能通过相似的机制抑制CFTR Cl-通道。为了证实这一想法，我们研究了高浓度的ATP是否减弱焰红染料B对CFTR的抑制。与染料木黄酮阻断CFTR相比(21)，图6表明ATP(5mM)不能解除焰红染料B(20μM)对CFTR Cl-电流的抑制。在ATP(0.3和5mM)的存在下，焰红染料B(20μM)将I分别降低到对照值的56±6％和51±5％(n＝6；P＞0.05)。相似地，黄色曙红(100μM)对CFTR的抑制不受升高浓度的ATP影响(n＝5；数据未显示)。
由抑制浓度的焰红染料B所引起的闪烁关闭所中断的延长的通道开放提示，焰红染料B可能是CFTR开放通道阻断剂。为了研究这一想法，我们检测了通道抑制的电压依赖性。细胞膜片被浸泡于均匀对称的147mM Cl-溶液中，在焰红染料B(40μM)缺乏或存在的情况下使用电压斜性上升方案在电压范围-±100mV内记录CFTR Cl-电流。图7焰红染料B、黄色曙红和四氯荧光素对CFTR Cl-电流抑制作用的电压依赖性A、B和C，分别为当细胞膜片被浸泡于均匀的147mM Cl-溶液中时，在焰红染料B(40μM)、黄色曙红(100μM)和四氯荧光素(100μM)缺乏和存在的情况下所记录的CFTR Cl-电流的I-V关系。ATP(1mM)和PKA(75nM)持续存在于胞内溶液中。I-V关系如方法中所述产生；保持电压为-50mV。D，为电压对受焰红染料B(40μM；方块)、黄色曙红(100μM；三角)和四氯荧光素(100μM；菱形)抑制的CFTR Cl-电流的分数的作用。数值为每个电压下的平均值±SEM(n＝5-6)。
图7A-D表明荧光素衍生物焰红染料B、黄色曙红和四氯荧光素对CFTR的抑制是电压依赖性的。在负电压下，焰红染料B(40M)、黄色曙红(100μM)和四氯荧光素(100μM)降低CFTR Cl-电流。在正电压下，由焰红染料B(40μM)和四氯荧光素(100μM)造成的通道阻断被解除，而黄色曙红(100μM)刺激通道活性。因此，数据说明荧光素衍生物焰红染料B、黄色曙红和四氯荧光素对CFTR的抑制是电压依赖性的，并且不受ATP浓度变化的影响。它们还说明焰红染料B结合位点的位置可能与格列本脲的不同。讨论我们的数据说明荧光素衍生物，如焰红染料B，抑制CFTR Cl-通道。数据说明它们通过两条途径抑制CFTR减缓通道开放和阻断开放的通道。它们还说明焰红染料B和孟加拉玫瑰素B与一种广泛使用的CFTR抑制剂格列本脲相比，具有相等或更大的抑制CFTR的效力(9，本研究)。
已证实多种刺激CFTR Cl-通道的物质在高浓度下抑制通道的活性。它们包括AMP-PNP(19)、染料木黄酮(18，21)和焦磷酸盐(22)。这些物质中的每一种通过与NBD2紧密结合，极大地延缓NBD2-介导的通道关闭速率，从而大大延长通道活性脉冲的持续时间而刺激CFTR Cl-通道(18，23，24)。
荧光素衍生物对CFTR抑制的特征与AMP-PNP和染料木黄酮有某些相似性。AMP-PNP和染料木黄酮通过强烈抑制NBD1-介导的通道开放来阻断CFTR Cl-通道(18，19，21)。此外，染料木黄酮具有较弱的堵塞CFTR孔道的作用(21)。染料木黄酮和焰红染料B都可以造成闪烁阻断，其延长脉冲持续时间并大大延长脉冲之间的关闭时间间隔(18，21，本研究)。然而，ATP(5mM)和电压对这些物质阻断通道的影响是显著不同的。染料木黄酮的抑制是电压非依赖性的，并由ATP(5mM；21)解除。与此相比，焰红染料B的抑制是电压依赖性的，但是不受ATP(5mM)的影响(本研究)。ATP(5mM)不能解除焰红染料B对CFTR的抑制并非药物从通道缓慢解离的结果，因为我们观察到在使用黄色曙红，一种从CFTR快速解离的荧光素衍生物时获得了相同的结果(n＝5，数据未显示)。我们观察到荧光素衍生物对CFTR的抑制是电压依赖性的，提示这些药物在细胞膜的电场内结合。尽管荧光素衍生物对CFTR的阻断可能通过变构机制发生，对数据最简单的解释是这些药物在CFTR孔道内结合来阻止Cl-渗透(20)。这说明焰红染料B阻塞CFTR孔道既造成了焰红染料B引起的对通道开放的闪烁阻断，又延长了脉冲之间的关闭时间间隔。
荧光素衍生物有效抑制CFTR Cl-通道这一发现对治疗与CFTR功能异常相关的疾病具有提示作用。强烈抑制CFTR Cl-通道的荧光素衍生物被认为在如多囊肾病和分泌性腹泻这些可能涉及CFTR Cl-通道活性增加的疾病的治疗中有价值(5，6)。因为CFTR在心肌细胞和内皮细胞中表达(2，25)，CFTR的抑制剂可能还可以被用于预防心律失常、血管生成和肿瘤血管化。2.囊肿生长实验方法细胞培养为了进行囊肿生长和细胞增殖试验，我们使用了I型Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞。我们选择I型MDCK细胞是因为它们在cAMP激动剂的存在下在胶原胶中生长时形成囊肿(26)并且它们表达CFTR Cl-通道(27)。将MDCK细胞在MDCK培养基(Dulbecco’sModified Eagle培养基(DMEM)和Ham’s F-12营养培养基的1∶1混合物，添加100 U ml-1青霉素和100μgml-1链霉素，以及10％胎牛血清(FBS；囊肿生长)或5％FBS与1％胰岛素-转铁蛋白-硒-X(ITS-X)添加剂(细胞增殖)；全部购自Life Technologies Ltd，Paisley，英国)中于37℃，含5％CO2的湿润空气中培养。囊肿生长为使囊肿生长，使用改良的Grantham等人的方法(26)用胶原胶培养MDCK细胞。用0.25％(重量/体积)的胰蛋白酶在37℃消化细胞30分钟，用含10％FBS的MDCK培养基稀释以形成1-3×104细胞/毫升的悬液，等分接种于24孔培养板的各孔中(每孔0.1毫升)。每孔含有0.4毫升冰冷的Vitrogen(3.0mgml-1胶原；CohesionTechnologies Inc.，Palo Alto，美国)，并添加10％(体积/体积)的10×极限必需培养基、10mM N-[2-羟乙基]哌嗪-N’-[2-乙磺酸](Hepes)、27 mM NaHCO3、100Uml-1青霉素和100μgml-1链霉素，并用NaOH调节到pH 7.4。轻轻摇动24孔板使细胞分散在Vitrogen中，置于37℃水浴中温育90分钟以促进Vitrogen胶凝。
形成凝胶后，向24孔板的每个孔中添加1.5毫升含有10％FBS的MDCK培养基。为了促使囊肿生长，我们向MDCK培养基中添加了cAMP激动剂(福斯高林(10μM)，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX；100μM)，及8-(4-氯苯基硫代)环腺苷酸(CPT-cAMP；500μM))。培养板被置于37℃，含5％CO2的湿润空气中，每3天更换含cAMP激动剂的MDCK培养基。
将MDCK细胞接种于胶原胶后12天，通过装有相差镜片的倒置显微镜(Leica，型号DMIL，Milton Keynes，英国)放大100倍可以容易地检测到囊肿。为检测CFTR调节剂对囊肿生长的影响，在cAMP激动剂的持续存在下向MDCK培养基中加入药物。每3天更换含有cAMP激动剂和CFTR调节剂的MDCK培养基，共9天。在加入CFTR调节剂前和在实验过程中以3天为间隔拍下各个囊肿的照片。为了识别各个囊肿，在24孔板下放置一个栅格赋予每个囊肿独特的编号。囊肿体积测定囊肿直径从相同倍数放大的囊肿照片上直接测定。假设囊肿形状为球形，我们计算了囊肿体积(4/3·π·r3)。细胞增殖为测定CFTR调节剂对MDCK细胞增殖的作用，我们使用了生长于含5％FBS和1％ITS-X添加剂的培养基中的I型MDCK细胞。在第-1日，将MDCK细胞按7.5×104细胞/毫升接种于35mm的培养皿中，培养皿中含添加1％FBS和1％ITS-X添加剂的MDCK培养基。第0日，FBS的浓度被进一步减至0.01％并向MDCK培养基中加入CFTR调节剂。每2天更换含CFTR调节剂的MDCK培养基，共6天。为确定每个35mm培养皿中的细胞数，使用胰蛋白酶(0.25％重量/体积)收获I型MDCK细胞，于1200rpm离心5分钟，用1毫升MDCK培养基重悬细胞后用血细胞计数器计数。试剂丁苯氧酸、CPT-cAMP、DIDS、福斯高林、染料木黄酮、格列本脲、Hepes、IBMX、毒毛花苷G和焰红染料B购自Sigma-Aldrich有限公司(Poole，英国)。NPPB获自Semat Technical(英国)Ltd.(St.Albans，英国)。焰红染料B的化学结构如上所述。所有其它化学品都是试剂级的。
将CPT-cAMP溶于蒸馏水，福斯高林溶于甲醇，IBMX溶于乙醇；所有其它药物都溶于DMSO。贮存液在-20℃下保存并在使用前即刻用MDCK培养基稀释以达到终浓度。在使用丁苯氧酸、毒毛花苷G和CFTR调节剂时采取了对抗光敏反应的措施。介质DMSO对囊肿的生长没有影响(对照，第12到21天之间增加112±20％；n＝29；DMSO(0.4％体积/体积)，第12到21天之间增加99±36％；n＝8；P＞0.5)，对细胞增殖也没有影响(n＝8；P＞0.05)。
为检测DIDS的功效，我们向切除的膜内侧翻外的细胞膜片的胞内侧加入了DIDS，并检测了它对CFTR Cl-通道的作用。与Linsdell和Hanrahan的数据(17)一致，DIDS(200μM)有效抑制CFTR的活性(n＝3；数据未显示)。统计学结果以n次观察的平均值±SEM的形式表达。为比较各组数据，我们使用了Student’s t检验或Mann-Whitney秩和检验。当P＜0.05时认为差异具有统计学上的显著性。所有的检验都通过使用SigmaStatTM(1.03版，Jandel Scientific GmbH，Erkrath，德国)完成。结果我们首先在MDCK细胞被接种于胶原胶并在含cAMP激动剂(福斯高林(10μM)，IBMX(100μM)和CPT-cAMP(500μM))的培养基中温育后3-6天观察囊肿。图8在用CFTR抑制剂处理之前(A，C，E和G)和之后(B，D，F和H)囊肿的相差影像A和B，对照。C和D，格列本脲(100μM)。E和F，NPPB(400μM)。G和H，DIDS(200μM)。在MDCK细胞被接种于胶原胶后的第12天(A，C，E和G)和第21天(B，D，F和H)进行显微照相。短线＝200μM。
囊肿的大小进行性增加，到第12天使用安装相差镜片的倒置显微镜放大100倍可以容易地检测到囊肿(图8A)。在cAMP激动剂的持续存在下，囊肿继续增大。图8A和B表明在第12天到第21天之间囊肿大小显著增长。在这段时间里，囊肿体积增长了112±20％(n＝29)。基于这些数据，我们检测了第12天和第21天之间CFTR阻断剂对囊肿生长的影响。
我们检测了磺脲类格列本脲、芳氨基苯甲酸盐NPPB和类黄酮染料木黄酮对囊肿生长的影响。格列本脲和NPPB通过阻止Cl-离子渗透通过CFTR孔道来抑制CFTR Cl-通道(10，16)，而染料木黄酮通过极大减缓通道开放速率来抑制CFTR Cl-通道(18，21)。作为对照，我们测定了二磺二苯乙烯DIDS对囊肿生长的影响。当向细胞膜的胞外侧加入DIDS时，它对CFTR Cl-通道没有作用(28)。这使CFTR区别于被胞外DIDS抑制的其它上皮Cl-通道(28)。图8C-F表明用格列本脲(100μM)和NPPB(400μM)处理的囊肿大小明显减小。对染料木黄酮获得了相似的结果(100μM，数据未显示)。与此相比，DIDS(200μM)对囊肿生长没有影响(图8G和H)。
为了对CFTR Cl-通道抑制剂对囊肿生长的作用进行定量，我们测定了囊肿体积。作为对照，我们检测了两种抑制囊肿生长的物质毒毛花苷G和丁苯氧酸对囊肿体积的影响(26)。毒毛花苷G抑制Na+-K+-ATP酶，而丁苯氧酸阻断Na+-K+-2Cl-协同转运蛋白。图9CFTR阻断剂抑制囊肿生长数据显示了毒毛花苷G(1μM)、丁苯氧酸(bumet；100μM)、格列本脲(glib；100μM)、NPPB(400μM)、染料木黄酮(100μM)和DIDS(200μM)对囊肿体积的影响；未处理的囊肿作为对照。空心和阴影柱分别代表第12天和第21天测定的囊肿体积。数值为每种药的平均值+SEM(n＝23-30个囊肿，来自4-5次实验)。
图9显示了MDCK细胞被接种于胶原胶后的第12天到第21天之间对照囊肿的体积显著增加(P＜0.001)。除了DIDS(200μM；P＞0.5)以外，所有检测的抑制剂都使囊肿体积缩小，顺序为格列本脲(100μM)≥毒毛花苷G(1μM)≥NPPB(400μM)≥染料木黄酮(100μM)＞丁苯氧酸(100μM；P＜0.001；图9)。
我们的数据说明CFTR Cl-通道的阻断剂抑制囊肿的生长。基于这些数据，我们推测荧光素衍生物可能抑制囊肿生长。为了检验这一假设，我们研究了焰红染料B的作用。图10焰红染料B(40μM)抑制囊肿生长A-D，是用焰红染料B(40μM)处理之前(A和C)和之后(B和D)MDCK囊肿的相差影像。A和B为对照。C和D为焰红染料B(40μM)。在MDCK细胞被接种于胶原胶后的第12天(A和C)和第21天(B和D)进行显微照相。短线＝200μM。E是焰红染料B(40M)和格列本脲(100μM)对MDCK囊肿体积的影响。空心和画阴影线的柱分别代表第12天和第21天测定的囊肿体积。数值为平均值+SEM；n＝29-30个囊肿，从5次实验中获得。对照和格列本脲的数据由图8和9获得。
图10A-D显示了在MDCK细胞被接种于胶原胶后的第12天和第21天焰红染料B(40μM)缺乏和存在的情况下囊肿生长的相差显微照片。当缺乏焰红染料B时，囊肿的大小增加(图10A和B)。与此相比，焰红染料B(40μM)存在时，囊肿大小明显减小(图10C和D)。囊肿体积的平均减小与格列本脲(100μM)一种CFTR Cl-通道和囊肿生长的有效抑制剂相似(9；图10E)。
在多囊肾病中，囊肿的发生和生长涉及未成熟上皮细胞的增殖、胞外基质的变化和囊腔内液体的积聚(5)。由于CFTR Cl-通道的阻断剂抑制囊肿的生长而不使囊壁增厚(图8和10)，我们推测这些物质可能同时抑制了液体积聚和细胞增殖。为了检测CFTR Cl-通道的抑制剂对细胞增殖的作用，我们使用了I型MDCK细胞。图11CFTR阻断剂抑制MDCK细胞增殖数据显示了细胞增殖的时间过程(A)对照(实心圆圈)，格列本脲(100μM；空心圆圈)，焰红染料B(40μM；空心方块)和DIDS(200μM；空心三角)；(B)对照(实心圆圈)，毒毛花苷G(1μM；空心圆圈)和丁苯氧酸(100μM；空心方块)；(C)对照(实心圆圈)，cAMP激动剂(福斯高林(10μM)，IBMX(100μM)和CPT-cAMP(500μM)；空心圆圈)，NPPB(400μM；空心方块)和染料木黄酮(100μM；空心三角)。数值为每个时间点观测的平均值±SEM(n＝6-10)。除了标明的地方，误差线小于符号大小。
图11表明CFTR Cl-通道的阻断剂抑制I型MDCK细胞的增殖。在第0和第6日之间对照细胞的数量大大增加。除了DIDS(200μM)和丁苯氧酸(100μM)以外，所有被检测的抑制剂都阻止细胞生长，顺序为毒毛花苷G(1μM)＝焰红染料B(40μM)＝染料木黄酮(100μM)＝NPPB(400μM)＞格列本脲(100μM)。如同焰红染料B一样，孟加拉玫瑰素B(5μM)、黄色曙红(200μM)和四氯荧光素(200μM)抑制I型MDCK细胞的增殖(n＝3-8；数据未显示)。
以前的工作显示cAMP激动剂可以刺激或者抑制细胞的生长(29)。图11证实cAMP激动剂减缓I型MDCK细胞的生长。然而，在第6天，有cAMP激动剂存在的细胞的数目与对照没有差异(P＞0.05；图11C)。cAMP激动剂对CFTR阻断剂造成的细胞生长抑制没有影响(格列本脲和焰红染料B(n＝7-8)；NPPB和染料木黄酮(n＝2)；数据未显示)。讨论我们的数据证实CFTR Cl-通道的阻断剂抑制囊肿的生长。如同对CFTR Cl-通道(10，16，18，本研究)，格列本脲、NPPB及高浓度的染料木黄酮和焰红染料B抑制囊肿增大和细胞增殖。与此相对，一种抑制其它上皮Cl-通道而非CFTR的物质DIDS(28)对囊肿的生长和细胞增殖没有作用。
我们的数据对多囊肾病的治疗具有重要的提示作用。目前，该疾病尚无治疗方法。取而代之，对多囊肾病的患者用药物进行治疗以控制疼痛、感染和高血压(30)。然而，一旦肾衰竭发生，就需要长期透析和肾移植来维持多囊肾病患者的生命(30)。在对多囊肾病的新疗法的探寻中，过去已研究了抑制细胞增殖的物质对囊肿生长的作用。例如，紫杉醇(太平洋紫杉素)能够大大减缓患有多囊肾病的cpk小鼠的疾病进展(31)。然而，紫杉醇对于该疾病的其它啮齿类动物模型无效(32)。我们观察到CFTR Cl-通道的阻断剂延缓囊肿生长突显了CFTR抑制剂在多囊肾病治疗中的治疗潜能。通过减缓囊肿生长，具有治疗活性的CFTR抑制剂可能阻止肾脏结构的破坏，从而保存肾功能。这种药物将极大地改善多囊肾病患者的生活质量。
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权利要求
1.式I化合物及其可药用盐的用途， 其中R1、R2和R3可以各自是选自H、1-6C烷基和卤素的相同或不同基团，而R4是选自H和1-6C烷基的基团，用于生产治疗活动物体包括人的对抑制囊性纤维化跨膜传导调节蛋白氯离子通道有反应的疾病的药物。
2.根据权利要求1的用途，其中式I化合物中R1、R2和R3相同或不同并选自H、Cl、Br和I，R4选自H和1-4C烷基，及其可药用盐。
3.根据权利要求2的用途，其中式I化合物中R1选自H、Cl、Br和I，R2选自H、Cl、Br和I中选择，R3选自H、Cl、Br和I，R4选自H、甲基和乙基。
4.根据权利要求3的用途，其中式I化合物中R1和R2都是Br，R3是Cl，R4是H。
5.根据权利要求3的用途，其中式I化合物中R1和R2都是I，R3是Cl，R4是H。
6.根据权利要求3的用途，其中式I化合物中R1、R2和R4是H，R3是Cl。
7.根据权利要求3的用途，其中式I化合物中R1和R2都是Br，R3和R4都是H。
8.根据权利要求3的用途，其中式I化合物中R1、R2、R3和R4都是H。
9.根据权利要求1-8中任何一项的用途，其中所述对抑制囊性纤维化跨膜传导调节蛋白氯离子通道有反应的疾病是多囊肾病。
10.根据权利要求1-8中任何一项的用途，其中所述对抑制囊性纤维化跨膜传导调节蛋白氯离子通道有反应的疾病是分泌性腹泻。
11.根据权利要求1-8中任何一项的用途，其中所述对抑制囊性纤维化跨膜传导调节蛋白氯离子通道有反应的疾病是心律失常。
12.根据权利要求1-8中任何一项的用途，其中所述囊性纤维化跨膜传导调节蛋白氯离子通道的抑制剂用于预防血管生成和肿瘤血管化。
13.治疗活动物体包括人的对抑制囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)氯离子通道有反应的疾病的方法，所述方法包括给活动物体施用CFTR氯离子通道抑制量的式I化合物及其可药用盐， 其中R1、R2和R3可以相同或各不相同，选自H、1-6C烷基及卤素，R4是选自H和1-6C烷基的基团。
14.根据权利要求13的方法，其中式I化合物中R1、R2和R3相同或不同并选自H、Cl、Br和I，R4选自H和1-4C烷基，及其可药用盐。
15.根据权利要求14的方法，其中式I化合物中R1选自H、Cl、Br和I，R2选自H、Cl、Br和I，R3选自H、Cl、Br和I，R4选自H、甲基和乙基。
16.根据权利要求15的方法，其中式I化合物中R1和R2都是Br，R3是Cl，R4是H。
17.根据权利要求15的方法，其中式I化合物中R1和R2都是I，R3是Cl，R4是H。
18.根据权利要求15的方法，其中式I化合物中R1、R2和R4是H，R3是Cl。
19.根据权利要求15的方法，其中式I化合物中R1和R2都是Br，R3和R4都是H。
20.根据权利要求15的方法，其中式I化合物中R1、R2、R3和R4都是H。
21.根据权利要求13-20中任何一项的方法，其中所述待治疾病是多囊肾病。
22.根据权利要求13-20中任何一项的方法，其中所述待治疾病是分泌性腹泻。
23.根据权利要求13-20中任何一项的方法，其中所述待治疾病是心律失常。
24.根据权利要求13-20中任何一项的方法，用于治疗或预防血管生成和肿瘤血管化。
25.式I化合物的用途，所述化合物如权利要求1所定义，用于生产男性避孕药。
全文摘要
荧光素和衍生物可以用于治疗活动物体包括人的对抑制囊性纤维化跨膜传导调节蛋白氯离子通道有反应的疾病，如多囊肾病和分泌性腹泻。
文档编号A61P9/00GK1447690SQ0181447
公开日2003年10月8日 申请日期2001年7月12日 优先权日2000年7月13日
发明者D·N·谢帕尔德, 蔡志伟 申请人:布里斯托尔大学