专利名称：用于脑胶质细胞疾病治疗的基因载体的制作方法
专利说明用于脑胶质细胞疾病治疗的基因载体 本发明涉及一种基因载体，特别是用于脑胶质细胞疾病的治疗的基因载体。目前国内外在脑胶质细胞疾病的治疗方面还缺乏理想的治疗方法。基因治疗因为缺乏理想的基因载体而限制了其在临床上的应用。目前基因载体有病毒载体和非病毒载体。病毒载体存在着免疫原性，潜在的致瘤性以及装载片段的大小有限制等缺陷。目前常用的非病毒转运体也存在着难以克服的缺陷，如细胞毒性大，转染效率低，尤其对于脑胶质细胞疾病来说，目前的非病毒载体因无法穿越血脑屏障，所以几乎无法用于脑胶质细胞疾病的治疗。为改善目前由于脑胶质细胞疾病缺乏理想的基因载体而阻碍基因治疗的状况，本发明提供一种无毒，安全，高效的用于脑胶质细胞疾病的新型纳米基因载体的制备方法及其使用方法。
本发明应用水解法合成氧化铁磁性纳米颗粒，由于其对细胞无毒性的特性，利用氧化铁纳米颗粒作为基因载体，经过表面改性成功地结合，浓缩，保护DNA、RNA，并在体内外高效的传递DNA、RNA进入细胞。具体技术参数如下(1)将葡聚糖，氯化亚铁，氯化铁按质量比葡聚糖Fe2+∶Fe3+为40～45∶1.0∶2.5～3的比例混合60～70℃反应1～2h，添加适量的氨水，反应产物高速离心15～30min，取上清，用滤膜过滤制成氧化铁纳米颗粒。
(2)将氧化铁纳米颗粒重悬于1.5mmol/L的NaCl溶液中，加入等质量的多聚赖氨酸，超声震荡1hr，离心后，弃上清，1.5mmol/L的NaCl洗涤后重悬于1.5mmol/L的NaCl中制成表面活性的氧化铁纳米颗粒，成为多聚赖氨酸-氧化铁纳米颗粒。
将表面活性的氧化铁纳米颗粒作为脑胶质细胞疾病治疗的基因载体，其使用方法为(1)将质粒DNA按10ug/ml～20ug/ml溶解于1.5mM的NaCl中，将等体积的多聚赖氨酸-氧化铁纳米颗粒按5∶1～10∶1的质量比滴加入质粒溶液中，剧烈震荡10s，室温静置1h，将复合物从尾静脉注射入Balb/C小鼠体内。
(2)或者将多聚赖氨酸-氧化铁纳米颗粒和反义寡核苷酸链按质量比为5∶1～10∶1混合，加入磷酸盐缓冲液和1.1％的戊二醛在25℃反应1hr，高速离心后，去上清，将沉淀重悬于1.5mmol/L的NaCl中，将复合物从尾静脉注射入Balb/C小鼠体内。
本发明制作方法简单，所制得的氧化铁纳米颗粒可穿越血脑屏障在脑胶质细胞中大量分布，可作为脑胶质细胞疾病基因治疗的良好基因载体，同时该载体也可用于药物的转运，而且氧化铁磁性纳米颗粒具有超顺磁性，外加磁场可进一步实现靶向治疗。制作的纳米颗粒径粒均匀，该纳米颗粒可高效携带和保护DNA，该纳米转运体系对细胞无毒性，在体内外将外源基因高效导入细胞内。
图1多聚赖氨酸-氧化铁纳米颗粒电镜图；图2将多聚赖氨酸-氧化铁纳米颗粒静脉注射BALB/C小鼠，24小时后处死小鼠，取脑组织做电镜检测，结果显示多聚赖氨酸-氧化铁纳米颗粒在脑胶质细胞大量分布。
图3多聚赖氨酸-氧化铁纳米颗粒携带编码荧光蛋白的质粒DNA或荧光标记的反义寡核苷酸经静脉注射入BALB/C小鼠体内，24～48小时后处死小鼠，脑组织制成切片，荧光显微镜下显示在脑组织有大量荧光信号。1.葡聚糖，氯化亚铁，氯化铁按葡聚糖Fe2+∶Fe3+为40∶1.0∶2.7的比例混合60℃反应1h，添加适量的氨水，反应产物12,000r/min离心15min，取上清，用滤膜过滤制成氧化铁纳米颗粒。(2)将氧化铁纳米颗粒重悬于1.5mM的NaCl溶液中，加入等质量的多聚赖氨酸，超声震荡1hr，离心后，弃上清，1.5mM的NaCl洗涤后重悬于1.5mM的NaCl中制成表面该性的氧化铁纳米颗粒，成为多聚赖氨酸-氧化铁纳米颗粒。
(a)将报道基因质粒EGFP-C2按10ug/ml溶解于1.5mM的NaCl中，将等体积的多聚赖氨酸-氧化铁纳米颗粒按10∶1的质量比滴加入质粒溶液中，剧烈震荡10s，室温静置1h。
(b)或者将多聚赖氨酸-氧化铁纳米颗粒和反义寡核苷酸链按质量比为10∶1混合，加入磷酸盐缓冲液和1.1％的戊二醛在25℃反应1hr，高速离心后，去上清，将沉淀重悬于1.5mM的NaCl中。
2.将(a)、(b)所得两种复合物分别从尾静脉注射入BALB/C小鼠体内。处死小鼠，将小鼠的脑组织制成切片，荧光显微镜下观察(图3)。
权利要求
1.一种用于脑胶质细胞疾病治疗的基因载体的制备方法，其特征在于本发明应用水解法合成氧化铁磁性纳米颗粒，利用氧化铁纳米颗粒作为基因载体，经过表面改性成功地结合，浓缩，保护DNA、RNA，并在体内外高效的传递DNA、RNA进入细胞，具体技术参数如下(1)将葡聚糖，氯化亚铁，氯化铁按质量比葡聚糖Fe2+∶Fe3+为40～45∶1.0∶2.5～3的比例混合60～70℃反应1～2h，添加适量的氨水，反应产物高速离心15～30min，取上清，用滤膜过滤制成氧化铁纳米颗粒；(2)将氧化铁纳米颗粒重悬于1.5mM的NaCl溶液中，加入等质量的多聚赖氨酸，超声震荡1hr，离心后，弃上清，1.5mM的NaCl洗涤后重悬于1.5mM的NaCl中制成表面活性的氧化铁纳米颗粒，成为多聚赖氨酸-氧化铁纳米颗粒。
2.一种权利要求1所述基因载体，其特征在于其使用方法为采用多聚赖氨酸对氧化铁纳米颗粒进行表面修饰，将质粒DNA 10ug/ml～20ug/ml溶解于1.5mM的NaCl中，将等体积的多聚赖氨酸-氧化铁纳米颗粒按10∶1的质量比滴加入质粒溶液中，剧烈震荡10s，室温静置1h。
3.一种权利要求1所述基因载体，其特征在于其使用方法为采用改性的氧化铁纳米颗粒可用作双链环状质粒DNA，单链反义寡核苷酸，RNA及其它药物的载体，将多聚赖氨酸-氧化铁纳米颗粒和反义寡核苷酸链按质量比为10∶1混合，加入磷酸盐缓冲液和1.1％的戊二醛在25℃反应1hr，高速离心后，去上清，将沉淀重悬于1.5mM的NaCl中。
全文摘要
一种用于脑胶质细胞疾病治疗的基因载体，本发明用水解法制成氧化铁纳米颗粒，同时在其表面修饰了多聚赖氨酸，修饰后的氧化铁纳米颗粒直径约为50nm，分布均匀。该纳米颗粒可结合并保护链环状质粒DNA，单链反义寡核苷酸，RNA，体内实验证明氧化铁纳米颗粒可将外源基因高效的转运至脑胶质细胞并表达出来，可成为治疗脑胶质疾病的良好的基因载体和药物载体。
文档编号A61K47/02GK1456356SQ02114118
公开日2003年11月19日 申请日期2002年5月9日 优先权日2002年5月9日
发明者李桂源, 向娟娟, 朱诗国, 吕红斌, 李小玲, 沈守荣, 张必成, 聂新民, 周鸣, 唐珂, 曹利 申请人:中南大学