专利名称：双(氰基苯基)甲基－三唑在预防乳腺癌中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及下式(I)的双(氰基苯基)甲基-三唑(下文称“化合物I”)或其可药用盐的用途，用于制备药物组合物，其中所述药物组合物在哺乳动物中用于预防对芳香化酶抑制和对雌激素生物合成的抑制起反应的疾病。
化合物I也已知为来曲唑(Letrozole)[国际非专利商标名]。
化合物I，在1987年9月16日公开的欧洲专利0236940号，1990年12月18日公开的美国专利4,978,672号和日本专利2018112号中均以本申请人的名义，已经进行了明确描述。
化合物I最初鉴定为芳香化酶的抑制剂。
芳香化酶是负责雌激素合成最后一步的酶复合体，其将雄激素雄烯二酮和睾酮转化为雌激素雌酮(E1)和雌二醇(E2)。有相当多的数据显示雌激素促进乳腺癌。越来越多地认为女性乳腺自身为雌激素产生的另一个重要部位。乳腺脂肪组织的基质细胞以旁分泌和自分泌这两种方式产生有生物学活性的雌激素。这可能是观察到的在绝经后妇女的健康乳房中雌激素浓度比血清中雌激素浓度出乎意料的高(4至6倍)并和绝经前妇女健康乳房中雌激素浓度相似的原因。此外，达70％乳腺癌细胞显示由于细胞内芳香化酶表达而合成雌激素。这解释了为什么芳香化酶的表达和活性在乳腺肿瘤中高于肿瘤周围脂肪，并解释了为什么芳香化酶的表达和活性在乳房的荷瘤扇形区中较没有肿瘤的乳房高。在合成源抑制雌激素因此是治疗乳腺肿瘤合理的靶。
化合物I已经已知是一种芳香化酶抑制剂并用于治疗乳腺癌。
现在令人惊讶地发现化合物I具有治疗性质，使它在哺乳动物中用于预防对芳香化酶抑制和对雌激素生物合成的抑制起反应的疾病特别有用。这个化合物显示了消除雌激素介导的引发乳腺癌的出乎意料的高潜力。特别出乎意料的是这种化合物的较低剂量仍显示了消除雌激素介导的引发乳腺癌的高潜力，而不会影响正常生理功能。的确，特别惊讶的是使用对哺乳动物的雌二醇循环水平和/或促卵泡激素循环水平没有显著影响的化合物I的剂量，显示了消除雌激素介导的引发乳腺癌的高潜力。
本发明因此涉及化合物I用于制备药物组合物的用途，其中所述药物组合物用于预防对芳香化酶抑制和对雌激素生物合成的抑制起反应的疾病。
本发明更特别地涉及化合物I用于制备药物组合物的用途，其中所述药物组合物用于抑制妇女，特别是绝经后的妇女或易患乳腺癌的妇女乳腺癌的发展。
本发明更特别地涉及化合物I用于制备药物组合物的用途，其中所述药物组合物用于抑制妇女，特别是绝经后的妇女或易患乳腺癌的妇女乳腺癌的发展，其特征在于化合物I的剂量或日剂量对哺乳动物的雌二醇循环水平和/或促卵泡激素循环水平没有显著影响。
本发明更特别地涉及化合物I的用途，其用于制备单位剂型包含0.1至0.3mg，优选地包含0.125至0.25mg化合物I的药物组合物。
本发明更特别地涉及化合物I的用途，其用于制备单位剂型包含一定量化合物I的药物组合物，其中所述化合物I的量对哺乳动物的雌二醇循环水平和/或促卵泡激素循环水平没有显著影响。
在第二个优选的实施方案中，本发明涉及化合物I的用途，其用于制备单位剂型包含0.001至0.11mg，优选地包含0.001至0.099mg或0.001至0.09mg，最优选地包含0.002至0.02mg化合物I的药物组合物。
又在另一实施方案中，本发明提供了用于预防对芳香化酶抑制和对雌激素生物合成的抑制起反应的疾病的方法，该方法包括向需要此种治疗的哺乳动物施用治疗有效量的化合物I或其可药用盐。
又在另一实施方案中，本发明提供了用于预防对芳香化酶抑制和对雌激素生物合成的抑制起反应的疾病的方法，该方法包括向需要此种治疗的哺乳动物施用治疗有效量的化合物I或其可药用盐，其中化合物I的治疗有效量对哺乳动物的雌二醇循环水平和/或促卵泡激素循环水平没有显著影响。
优选的哺乳动物为人，特别是绝经后的妇女或易患乳腺癌的妇女。
优选地，在哺乳动物中该方法使用的化合物I的日剂量较对芳香化酶抑制和对雌激素生物合成的抑制起反应的疾病进行治疗性治疗需要的日剂量低8.3至25倍。用比这些疾病的治疗性治疗所需要的日剂量低10至20倍的剂量得到好的结果并用10至16.7倍的低剂量得到最好结果。
优选地，该方法用于抑制乳腺癌的发展。
在一个优选的实施方案中，抑制妇女乳腺癌发展的化合物I的日有效量为0.1至0.3mg，优选地为0.125mg至0.25mg，最优选地为0.15至0.25mg。
在第二个优选的实施方案中，抑制妇女乳腺癌发展的化合物I的日有效量为0.001至0.11mg，优选地为0.001至0.099mg或0.001至0.09mg，最优选地为0.002至0.02mg。
在一个最优选的实施方案中，抑制妇女乳腺癌发展的化合物I的日有效量对受治疗妇女的雌二醇循环水平和/或促卵泡激素循环水平没有显著影响。
优选地，化合物I向人类受试者施用至少3周以上，其中只在此时间期间的约14.2％天至约42.8％天施用。
优选地，化合物I向人类受试者施用3周或更长时间，其间1周施用1次或2次或3次，隔日进行。
优选地，将周剂量方案进行3、4、5、6、7或8周。每个治疗期可接着1至3周不施用药剂，例如2周不施用药剂。这个循环重复进行1至几个循环，例如从3或4个循环至8个或更多个循环。优选地，在治疗期间，为了对患者的雌二醇循环水平和/或促卵泡激素循环水平没有显著影响，实施该周剂量方案。
在治疗的备选方法中，化合物I向人类受试者每周施用7至4次，或在时间期间的约100％天至约50％天隔日施用，即一天一次或两天一次，施用1至3周，例如2周，接着1至3周不施用药剂，例如2周不施用药剂。这个循环重复进行1至几个循环，例如从3或4个循环至8或更多个循环。优选地，在治疗方法中，在治疗期间，为了对患者的雌二醇循环水平和/或促卵泡激素循环水平没有显著影响，实施该周剂量方案。
一个优选的实例为每两天一次施用0.01至0.04mg，优选施用0.02mg。第二个优选的实例为每天施用0.001至0.004mg，优选施用0.002mg。
在本发明的第三个方面，提供了一种制品，其包括包装材料和在所述包装材料中包含的化合物I或其可药用盐，其中所述包装材料包含标签说明书，其中所述标签说明书标明了所述化合物I或所述化合物I的可药用盐对妇女特别是绝经后的妇女遵循一个具体的剂量方案施用从约0.1mg至约0.3mg，优选地从约0.125mg至约0.25mg的量，以抑制乳腺癌的发展。在第二个优选的实施方案中，抑制妇女乳腺癌发展的化合物I的有效量为0.001至0.11mg，优选0.001至0.099mg或0.001至0.09mg，最优选0.002至0.02mg。
在一个进一步的实施方案中，本发明提供了这样的药物组合物，其中包含的化合物I的量比用于预防性治疗哺乳动物中对芳香化酶抑制和对雌激素生物合成的抑制起反应的疾病需要的日剂量低8.3至25倍。观察到的最好结果是比日剂量低10至20倍优选低10至16.7倍。
在本发明的另一方面，提供了一种制品，其包括包装材料和在所述包装材料中包含的化合物I或其可药用盐，其中所述包装材料包含标签说明书，其中所述标签说明书标明了所述化合物I或所述化合物I的可药用盐对妇女特别是绝经后的妇女遵循一个具体的剂量方案施用，施用量对雌二醇循环水平和/或促卵泡激素循环水平没有显著影响，以抑制乳腺癌的发展。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了单位剂型包含0.1至0.3mg，优选0.125至0.25mg化合物I的药物组合物，用于妇女中对芳香化酶抑制和对雌激素生物合成的抑制起反应的疾病的预防性治疗。
在一个最优选的实施方案中，本发明提供了包含0.15至0.25mg化合物I的药物组合物，用于人类对芳香化酶抑制和对雌激素生物合成的抑制起反应的疾病的预防性治疗。
在第二个优选的实施方案中，本发明提供了包含0.001至0.11mg，优选0.001至0.099mg或0.001至0.09mg，最优选0.002至0.02mg化合物I的药物组合物，用于人类对芳香化酶抑制和对雌激素生物合成的抑制起反应的疾病的预防性治疗。
优选地，包含0.125至0.3mg或0.002至0.02mg化合物I的药物组合物用于妇女中乳腺癌的预防性治疗。
在一个最优选的实施方案中，本发明提供了这样的药物组合物，其单位剂型包含的化合物I的量对哺乳动物中雌二醇循环水平和/或促卵泡激素循环水平没有显著影响，所述药物组合物用于乳腺癌的预防性治疗。
在以前的研究中显示通过用5μg化合物I/小鼠/天，这个剂量是基于以前动物研究的剂量，我们可完全消除芳香化酶诱导的肿瘤发生前的变化/肿瘤性变化。然而，所选择的剂量在这些动物中不仅对消除芳香化酶诱导的恶变前变化非常有效，也影响一些正常的内分泌功能。现在的发现表明用低剂量的化合物I可消除转基因小鼠中雌激素介导乳腺癌的引发而不影响正常生理功能。我们的数据清楚地表明了化合物I，甚至用如此处所述的较低剂量使用时，在消除芳香化酶诱导的乳腺增生中非常有效。我们的数据显示我们可通过用对子宫和卵巢的组织形态学特征无影响的低剂量化合物I(每只动物每天0.25、0.5μg或1μg，优选0.25和0.5μg)完全消除芳香化酶诱导的肿瘤发生前的变化。
这些出乎意料的好结果是通过如此处所述的试验中研究化合物I的作用获得的；
特别地，结果数据显示我们可通过用低剂量的化合物I(每只动物每天0.25或0.5μg)完全消除芳香化酶诱导的肿瘤发生前的变化。这些剂量对子宫和卵巢无影响。对照组(12.5pg/ml)和用低剂量化合物I(每只动物每天0.25或0.5μg)处理的个体组间在循环雌激素水平上(分别为12.1和12.5pg/ml)没有显著差异。对照组和用0.5μg化合物I处理的动物间在循环FSH水平上(200ng/ml)无显著差异。我们也注意到受治疗的动物用低剂量化合物I(每只动物每天0.25或0.5μg)在PCNA和细胞周期蛋白D1水平上无显著变化，其中所述PCNA和细胞周期蛋白D1也是雌激素介导的增生的好标志物。这与观察到的低剂量化合物(每只动物每天0.25或0.5μg)对子宫和卵巢的组织形态学特征没有影响一致。子宫标志物乳铁蛋白的表达显示对照与0.25和0.5μg处理的动物间没有差异。
这些研究表明用非常低浓度的芳香化酶抑制剂可消除转基因小鼠中雌激素介导的乳腺癌的引发，而不影响子宫和卵巢的正常功能。
血中雌激素和其它激素水平通常用ELISA(酶联免疫吸附测定法)或RIA(放射免疫测定法)进行测定，其中所述两种方法可从多个供应商处获得并为本领域熟知。更敏感和更复杂并因此不常用的方法为HPLC(高效液相色谱法)或质谱法。
因此，显示化合物I非常适用于预防哺乳动物中对芳香化酶抑制和对雌激素生物合成的抑制起反应的疾病，特别是用比哺乳动物中对芳香化酶抑制和对雌激素生物合成的抑制起反应的疾病的治疗性治疗需要的日剂量低8.3至25倍的日剂量。观察到的最好结果是用低10至20倍优选地用低10至16.7倍的日剂量。
因此，显示化合物I非常适用于预防哺乳动物中对芳香化酶抑制和对雌激素生物合成的抑制起反应的疾病，特别是用在哺乳动物中对雌二醇循环水平和/或促卵泡激素循环水平没有显著影响的剂量或日剂量。
此处应用的术语“对芳香化酶抑制和对雌激素生物合成的抑制起反应的疾病”包括但不限于乳腺癌。
此用应用的术语“在哺乳动物中对雌二醇循环水平和/或促卵泡激素循环水平没有显著影响”是指没有用化合物I治疗的患者和用化合物I治疗的患者间的雌二醇和/或促卵泡激素循环水平没有显著差异。
此处应用的术语“无显著影响”是指雌二醇和/或促卵泡激素循环水平的变化相对于治疗前的对照水平不超过15％，优选地不超过10％，最优选不超过5％。
乳腺癌是妇女，特别是35岁以上妇女的主要医学问题。现在，估计妇女在她们的一生中，9个人中有1个人有发展这种疾病的可能性。乳腺癌是引起妇女死亡的主要原因，也是引起劳动能力丧失、心理创伤和经济损失的原因。很多患此病的妇女最终死于它的直接影响或来自其并发症的间接影响。
此用应用的术语“治愈性”是指治疗哺乳动物中对芳香化酶抑制和对雌激素生物合成的抑制起反应的持久性疾病中有效。
在本说明书中，术语“预防性”包括治疗处于有患病危险或疑似患病的患者，以避免对芳香化酶抑制和对雌激素生物合成的抑制起反应的疾病的发生或复发(即抑制乳腺癌的发展)。
此处应用的术语“抑制乳腺癌的发展”主要是指抑制正常乳腺细胞向癌细胞或恶性细胞从头转化的状况。然而，可能有妇女临床上在她们的乳房中没有检测到癌细胞的情形，抑制这样的、迄今临床上不显著的癌的发展也形成本发明的一部分。治疗现存的、临床上可检测的乳腺癌不包括在本发明的范围内。
术语“易患乳腺癌的妇女”涉及与内科医生公知的一些特定标准有关的妇女，其中所述标准如年龄(这时，年龄是主要的可鉴别的危险度因子。超过80％的乳腺癌病例发生于50岁以上的妇女)、种族、遗传因素和家族史(所有患乳腺癌的妇女估计10％有该病的强家族史，这常出现在年龄低于50岁的年轻妇女——现在认为是基因中已知为BRCA1或BRCA2基因的遗传突变引起了30％至50％的乳腺癌)、过度暴露于雌二醇(因为乳房组织的生长对雌二醇高度敏感，妇女一生中暴露于雌二醇越多，患乳腺癌的危险性越高)、体格特征、某些乳房异常。
为了证明化合物I特别适用于预防对芳香化酶抑制和对雌激素生物合成的抑制起反应的疾病、化合物I具有好的治疗安全系数和其它优点，可用技术人员公知的方法进行临床试验。
现在应用于妇女对芳香化酶抑制和对雌激素生物合成的抑制起反应疾病的治疗性治疗的化合物I的剂量为每日口服量2.5mg。
用于预防对芳香化酶抑制和对抑制雌激素生物合成的抑制起反应的疾病的化合物I的精确剂量取决于几个因素，包括宿主、正在被治疗的疾病的性质和严重性及施用方式。然而，当化合物I在人中肠胃外施用(检查优选的施用途径)，如腹膜内注射、静脉内注射、肌内注射、皮下注射、瘤内注射或直肠施用、或肠内施用如口服时，日剂量0.1至0.3mg，优选0.125至0.25mg可达到满意的预防。最优选在哺乳动物中对雌二醇循环水平和/或促卵泡激素循环水平没有显著影响的剂量或日剂量。
最优选地，化合物I通过剂型如微乳剂、软凝胶剂或固体分散剂口服施用，剂量为0.1至0.25mg/天，每天最多施用3次。最优选在哺乳动物中对雌二醇循环水平和/或促卵泡激素循环水平没有显著影响的剂量或日剂量。
剂量上限是由副作用所决定并可通过试验确定正在进行治疗宿主的剂量上限。
预防性治疗常常是长期治疗，因此治疗方案应适应减少体内化合物I累积的危险和减少治疗起始后几周可能发生的随后肝脏酶升高的危险。所采用的治疗方案也应避免针对化合物I药理作用抗性的发展，或应避免对正在治疗的宿主药理作用的降低。
在进一步的方面，为了降低上述危险，本发明涉及这样的治疗方案，其中对至少3周的治疗方案，化合物I只在约14.2％天至约42.8％天施用。
备选地，化合物I向人类受试者每周施用7至4次或在时间期间的约100％天至约50％天隔日施用，即一天一次或两天一次，施用1至3周，例如2周，接着1至3周不施用药剂，例如2周不施用药剂。这个循环重复1至几个循环，例如3或4个循环至8个循环。
在所述治疗方案或制品中，双(氰基苯基)甲基-三唑的有效量可以为如于此描述的药物组合物形式。
化合物I以单位剂型包含0.1至0.3mg，优选0.125至0.25mg，最优选0.15至0.25mg施用。最优选地单位剂型对哺乳动物中雌二醇循环水平和/或促卵泡激素循环水平没有显著影响。
如此处应用的，表达“周”是指连续7天。因此3周为从日历周任何一天开始的连续21天。施用第一个剂量的那天认为是周的第一天。任何用日历周的讨论只用于阐述的目的。
化合物I可与一种或多种可药用载体组合，并任选地与一种或多种其它常规的药用辅剂组合，以片剂、胶囊剂、囊形片剂等的形式肠内施用，例如口服，或以无菌可注射溶液或无菌可注射悬液的形式肠胃外施用，例如腹膜内或静脉内施用。肠内和肠胃外组合物可通过常规方法制备。
本发明的输注液更优选为无菌的。这例如通过无菌滤膜过滤易于实现。液体形式的任何组合物的无菌形式、无菌填充小药瓶和/或本发明的药物组合物在无菌条件下与合适的稀释剂的组合是本领域人员公知的。
化合物I在这些病理中可单独应用或与至少一种其它的药学活性化合物组合应用。这些活性化合物可组合入同一药物制剂，或这些活性化合物可为组合制剂“组分包(kit ofb part)”的形式，因为组合的各组分可独立施用或可通过使用不同的固定组合施用，其中所述不同的固定组合为具有不同量的各组合组分，其中所述的施用即同时施用或在不同的时间点施用。然后组分包的各组分可例如同时施用或时间上错后地施用，其中所述时间上错后地施用即对组分包的任一组分在不同时间点并且以相同或不同的时间间隔施用。
此后描述的为有用组合物的两个非限制性实例。
组合物A制备10000片100mg片剂，每片包含0.2mg活性成分式(I)的双(氰基苯基)甲基-三唑 2.00g
胶态二氧化硅 2.00g微晶纤维素 100.00g喷雾干燥的乳糖 836.00g硬脂酸镁 10.00g羟甲基纤维素钠 50.00g1000.00g所有片芯的组分混合在一起。一旦获得均质的混合物，就压成片芯。
组合物B制备10000片100mg片剂，每片包含0.15mg活性成分式(I)的双(氰基苯基)甲基-三唑 1.5g结晶乳糖 741.50g微晶纤维素 237.00g胶态二氧化硅 10.00g硬脂酸镁 10.00g1000g所有片芯的组分混合在一起。一旦获得均质的混合物，就压成片芯。
组合物C制备10000片100mg片剂，每片包含0.015mg活性成分式(I)的双(氰基苯基)甲基-三唑 0.15g结晶乳糖 742.85g微晶纤维素 237.00g胶态二氧化硅 10.00g硬脂酸镁 10.00g1000g所有片芯的组分混合在一起。一旦获得均质的混合物，就压成片芯。
优选的较低剂量片剂可例如包含0.05mg、0.02mg、0.015mg、0.01mg、0.009mg、0.008mg、0.007mg、0.006mg、0.005mg、0.004mg、0.003mg、0.002mg或0.001mg活性成分。
然而，应清楚理解它只用作阐述的目的。
本发明也可与较低剂量的其它芳香化酶抑制剂如，阿那曲唑、醋酸甲地孕酮、伏罗唑、法倔唑、依西美坦(exemestane)、氨鲁米特实施。通过代号、属名或商品名确定的活性剂结构可从标准提纲“Merck索引”的目前版本中或从数据库，例如国际专利(例如IMS国际公开)得到。其相应的内容在此引用作为参考。
化合物I用于预防对芳香化酶抑制和对雌激素生物合成的抑制起反应的疾病的功效已通过此处提到的药理试验进行了证明。在较低剂量下该出乎意料的药理活性也可用临床研究如通过Harper-Wynne C和col.描述的方法(Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2002 Jul；11(7)614-21)进行证实。其相应的内容在此引用作为参考。
药理试验通过以下药理方法进行实施。
这些试验用来说明本发明而不以任何方式限制其范围。
1.过表达芳香化酶的转基因小鼠和动物的治疗雌性芳香化酶转基因小鼠在标准群中进行维持。小鼠在AAALAC和USDA认证的集中动物设施中饲养并根据NIH用于实验动物的照料和应用指南制定的方法进行维持。乳腺中过表达芳香化酶的转基因小鼠(以前称为int-5/芳香化酶转基因小鼠)的产生以前进行了描述(R.R.Tekmal等人，转基因小鼠乳腺中int-5/芳香化酶的过表达诱导增生和核异常，Cancer Res.56(1996)3180-3185)。用Southern印迹分析对所有动物进行基因分型并在所有实验中用年龄一致的非转基因同窝出生小鼠作为对照。
2.乳腺和其它组织的形态学和组织学评估包含乳房脂肪垫的皮肤在10％中性缓冲福尔马林中固定至少24小时。然后将乳腺与皮肤分离开并进行组织学检查(D.Medina，小鼠乳房肿瘤发生中的瘤前病变，Methods Cancer Res.7(1973)3-53.514)。通过石蜡包埋固定后制备乳房组织、子宫和卵巢的常规切片，切成5μM，并用H&E染色。为免疫定位芳香化酶的表达，用芳香化酶转基因小鼠和非转基因小鼠乳腺组织的5μM厚的切片。脱蜡和在二甲苯和乙醇中再水化后，非特异位点通过用含1％正常山羊血清的0.05M Tris-HCl缓冲液中孵育进行封闭。倒出试剂后，切片用1∶100稀释的针对大鼠芳香化酶合成肽的兔多克隆抗体覆盖(芳香化酶抗体获自得克萨斯大学西南医学中心，Dallas，TX；现在在澳大利亚Prince Henry′s Institute，Clayon，Vic.的Dr.EvanSimpson)。样本在湿盒中4℃孵育过夜。用0.05M Tris-HCl缓冲液洗3次后，载玻片于室温与碱性磷酸酶连接的二级抗体孵育30分钟并反复洗涤，切片与1％坚牢红/萘酚AS磷酸溶液孵育5分钟。切片再进行洗涤并盖上盖玻片，用光学显微镜观察染色模式。
3.细胞的制备和特性来自我们芳香化酶群体的芳香化酶转基因雌性小鼠和非转基因雌性同窝出生小鼠为乳腺组织源。乳房上皮细胞和基质细胞按以前描述[B.K.Levay-Young等人，用于乳房生物学研究的原代培养系统，在D.Medina(编辑)的癌的细胞与分子生物学，Plenum Press，New York一书中的第181-204页(1987)-F.S.Kittrel，C.J.Oborn，D.Medina，来自体内小鼠上皮细胞系的体内乳房的副瘤形成的发展，Cancer Res.52(1992)1924-1932.]进行分离。对来自16周龄的处女雌性小鼠的乳腺进行解剖，在含有抗生素的无菌磷酸缓冲盐水中洗涤，用剃刀刀片仔细切碎，在存在0.15％胶原酶(A型；Boehirnger-Mannhem，Indianapolis，IN)的旋转水浴中37℃分离4小时。
如前述对细胞悬液进行差速离心以获得上皮细胞和基质细胞。为确定上皮细胞和基质细胞的纯度，用上皮细胞和基质细胞特异抗体对细胞类型进行免疫组织化学鉴别。上皮细胞和基质细胞铺到有孔玻片上并用Bouin’s溶液固定。进行细胞角蛋白和波形纤维蛋白免疫染色。基质细胞被波形纤维蛋白抗体(Zymed)免疫染色但不被细胞角蛋白抗体免疫染色，这证实了它们的基质细胞表型。上皮细胞通过细胞角蛋白抗体(Dako)免疫染色证实了它们的上皮细胞来源。
4.用芳香化酶抑制剂的治疗用年龄(约16-20周龄)的芳香化酶转基因雌性处女小鼠研究芳香化酶抑制剂化合物I的效果，化合物I作为这些小鼠乳腺中诱导肿瘤前和瘤形成变化的化学预防性药剂。在本研究中，年龄一致的转基因雌性小鼠分为四组。一组(n＝10)作为对照组，其它组每天皮下注射化合物I，并为3种不同剂量；每只动物施用在100μl的0.3％羟丙基纤维素(溶于磷酸缓冲盐水)中的0.25、0.5、1.0μg化合物I。对照动物皮下注射赋形剂。化合物I为Novartis Pharma(Basel，瑞士)的Drs.Ajay Bhatnagar和Dean Evans的赠送。在6周的治疗后，去除乳腺并将每组中一个乳腺用于组织学分析。所有其它乳腺混合然后用于如下描述的生物化学分析。同乳腺一起，收集子宫和卵巢用于生物化学和组织学分析。
5.RNA分析对来自小鼠乳房组织和子宫组织的总RNA进行分离，在对组织进行匀浆化后，根据制造商的方法，用Tri试剂(Sigma，St.Louis，MO)进行。ER、PR、PCNA、细胞周期蛋白D1和其它基因的特异表达通过RT-PCR进行验证，用GeneAmp RNA PCR试剂盒(Perkin-Elmer，Foster City，CA)进行。应用的特异引物和RT-PCR条件如前述(N.Kirma，K.Gill，U.Mandava，R.R.Tekmal，芳香化酶的过表达导致转基因小鼠乳腺的增生和参与编程性细胞死亡、细胞周期、生长和肿瘤抑制功能基因表达的变化，Cancer Res.，2001，待发表)。根据特异mRNA种类的丰度，将70ng-1.0mg总RNA用作反转录(RT)反应混合物的起始模板。RT-PCR产物在溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶上进行观察。为证明每个样本用等量的总RNA用于估计各种基因的表达，管家基因甘油醛-3磷酸脱氢酶(GAPDH)用作不变的对照。来自琼脂糖凝胶上溴化乙锭染色的RT-PCR产物用Bio-Rad(Hercules，CA)GS-700图象光密度仪测得的光密度数据用于计算不同组织样本中多种mRNA表达水平的相对差异。
6.Western印迹分析为了从对照和化合物I治疗的芳香化酶转基因小鼠的乳腺和子宫组织分离蛋白质，组织在裂解缓冲液中进行匀浆化。来自每个样本的等量蛋白质(60μg)于变性聚丙烯酰胺凝胶上分离并转移到尼龙膜上。抗体的非特异结合通过用包含0.05％Triton X-100(TBST)和5％脱脂奶粉的Tris-缓冲盐水(TBS)室温孵育至少4小时进行封闭。然后将膜与各自的一级抗体(肌动蛋白、ER、PR、乳铁蛋白、PCNA和细胞周期蛋白D1)于TBST-奶中4℃孵育过夜，通过用种特异(二级抗体)IgG并随后通过增强的化学发光检测(ECL试剂盒；Amersham Pharmacia Biotech，NJ)和ECL X-射线胶片曝光观察特异结合。Western印迹的光密度数据(化学发光检测抗体结合蛋白的X射线显象)用于计算各个蛋白质表达的差异。如果需要，管家蛋白肌动蛋白的表达作为不变的对照用于校正。
7.血清中雌二醇和FSH水平收获组织前，对来自对照组和化合物I治疗组的血液通过直接心脏穿刺进行收集。雌二醇的血清浓度用商业上可获得的试剂(Diagnostic ProductsCorp.，洛杉矶，CA)通过双抗体放射免疫分析进行测量。用等量的双份200μl血清，本测定法有较低灵敏度为2.5pg/ml，上限为500pg/ml。从50至200μl增加血清体积的测定产生与标准曲线平行的替代线。测定内和测定间的变异系数分别平均＜10.0和6.7％，用标准双抗体放射免疫分析测量FSH水平。获自NIH激素源获得的纯化FSH用作标准品。比较了平均雌二醇或FSH水平的差异，并用成对学生t检验确定了显著性。
结果芳香化酶抑制剂(化合物I)对哺乳动物乳腺、卵巢和子宫中雌激素诱导的增生的影响。
为检验芳香化酶抑制剂对转基因小鼠中芳香化酶诱导的肿瘤前/肿瘤性变化是否可完全消除或降低，我们用不同剂量的芳香化酶抑制剂(化合物I)(每只动物每天0.25，0.5，1.0和5g)治疗芳香化酶转基因雌性小鼠可完全消除或降低乳房组织中芳香化酶诱导的增生和其它变化。以前研究显示每只动物每天用5g化合物I(基于肿瘤减小)可完全消除或降低乳房组织中芳香化酶诱导的增生和其它变化。化合物I治疗6周后，对对照组和多种浓度化合物I治疗的芳香化酶转基因动物的乳腺进行了检查。我们的发现表明与没有治疗的芳香化酶转基因雌性小鼠相反，用化合物I治疗6周的芳香化酶转基因雌性小鼠显示了在这些动物中芳香化酶过表达诱导的增生和其它肿瘤前和肿瘤性变化完全降低/消失。这些结果清楚证实通过芳香化酶过表达诱导的乳腺增生和其它肿瘤前/肿瘤性变化可通过强效芳香化酶抑制剂如化合物I消除。我们的数据显示我们可通过用低剂量的化合物I(每只动物每天0.25或0.5μg)消除芳香化酶诱导的肿瘤前变化。
不同浓度的化合物I对乳腺、卵巢和子宫组织形态学特性的影响。对来自对照和不同浓度化合物I处理的芳香化酶转基因小鼠的乳腺进行了组织学分析。所得数据显示了我们可通过用低剂量的化合物I(每只动物每天0.25或0.5μg)完全消除芳香化酶诱导的肿瘤前变化。这些剂量对子宫和卵巢没有影响。这些低剂量的化合物I(每只动物每天0.25或0.5μg)对子宫和卵巢的组织形态学没有影响。
化合物I对芳香化酶转基因小鼠中雌二醇循环水平的影响。对照的循环雌激素水平(12.5pg/ml)和低剂量化合物I(每只动物每天0.25或0.5μg)治疗的各组间循环雌激素水平(分别为12.1和12.5pg/ml)没有显著差异。每只动物每天0.5μg剂量的化合物I导致雌二醇循环水平为2pg/ml。
化合物I对芳香化酶转基因小鼠中促卵泡激素的循环水平的影响。对照和用0.5μg化合物I治疗的动物间循环FSH水平(200ng/ml)没有显著差异。对照和用5.0μg化合物I治疗组间循环FSH水平(480ng/ml)的差异非常显著(成对学生t检验)化合物I对芳香化酶转基因小鼠的乳房组织中雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)、细胞周期蛋白D1和增殖细胞核抗原(PCNA)的蛋白质水平的影响。基于肌动蛋白水平校正任何差异后用来自Western印迹的光密度数据进行图解表示。与对乳腺增生的降低一致，我们也看到化合物I治疗动物的乳房组织中ER、PR的蛋白质水平降低。我们也注意到用低剂量的化合物I(每只动物每天0.25或0.5μg)治疗动物对PCNA和细胞周期蛋白D1的水平没有显著变化，其中所述PCNA和细胞周期蛋白D1也为雌激素介导增生的好标志物。用5μg剂量的化合物I，PCNA水平降低了50％。这与观察到的低剂量化合物I(每只动物每天0.25或0.5μg)对子宫和卵巢的组织形态学特性没有影响一致。
化合物I对芳香化酶转基因小鼠的子宫组织中乳铁蛋白、ER和PR的蛋白质水平的影响。根据肌动蛋白水平校正任何差异后用来自Western印迹的光密度数据进行图解表示。为检查化合物I治疗是否影响这些动物的内分泌功能，我们通过Western印迹分析检验了子宫中雌激素调节下的基因表达。对照和0.25和0.5μg药物治疗的动物间的子宫标志物乳铁蛋白的表达显示没有差异；然而，观察到每只动物每天用1.0μg药物治疗的动物乳铁蛋白表达比对照降低了1.8倍。发现治疗动物子宫中ER和PR的表达没有差异。
权利要求
1.双(氰基苯基)甲基-三唑或其可药用盐用于制备药物组合物的用途，其中所述药物组合物在哺乳动物中用于预防对芳香化酶抑制和对雌激素生物合成的抑制起反应的疾病。
2.根据权利要求1的用途，用于抑制妇女乳腺癌的发展，特别是用于抑制绝经后妇女或易患乳腺癌的妇女乳腺癌的发展。
3.根据权利要求1或2的用途，其特征在于双(氰基苯基)甲基-三唑或其可药用盐的剂量对哺乳动物中雌二醇的循环水平和/或促卵泡激素的循环水平没有显著影响。
4.在哺乳动物中预防对芳香化酶抑制和对雌激素生物合成的抑制起反应的疾病的方法，其包括向需要此种治疗的哺乳动物施用治疗有效量的双(氰基苯基)甲基-三唑或其可药用盐。
5.根据权利要求4的方法，其中哺乳动物为人，特别是绝经后的妇女或易患乳腺癌的妇女。
6.根据权利要求4或5的方法，用于抑制乳腺癌的发展。
7.根据权利要求4或6的方法，其中在哺乳动物中双(氰基苯基)甲基-三唑的日剂量比预防性治疗对芳香化酶抑制和对雌激素生物合成的抑制起反应的疾病所需要的日剂量低8.3至25倍。
8.根据权利要求5的方法，其中双(氰基苯基)甲基-三唑的日剂量比预防性治疗此类疾病所需要的日剂量低10至20倍，优选地低10至16.7倍。
9.根据权利要求4至6中任意一项所述的方法，其中用于抑制妇女乳腺癌发展的双(氰基苯基)甲基-三唑的日有效量为0.1至0.3mg，优选地为0.125mg至0.25mg，最优选地为0.15mg至0.25mg的双(氰基苯基)甲基-三唑。
10.根据权利要求4至6中任意一项所述的方法，其中用于抑制妇女乳腺癌发展的双(氰基苯基)甲基-三唑的日有效量为0.001至0.099mg，优选地为0.002mg至0.02mg的双(氰基苯基)甲基-三唑。
11.根据权利要求4至6中任意一项所述的方法，其中双(氰基苯基)甲基-三唑的日剂量对哺乳动物中雌二醇的循环水平和/或促卵泡激素的循环水平没有显著影响。
12.根据权利要求4至6中任意一项所述的方法，其中将治疗有效量的双(氰基苯基)甲基-三唑向人类受试者施用至少3周，其中只在此时间期间的约14.2％天至约42.8％天施用。
13.根据权利要求4至6中任意一项所述的方法，其中将治疗有效量的双(氰基苯基)甲基-三唑向人类受试者施用3周或更长期间，其间每周施用1至3次，隔日进行。
14.根据权利要求13的方法，其中将周剂量方案实施3、4、5、6、7或8周。
15.根据权利要求12至14中任意一项所述的方法，其中治疗期之后接着1至3周不施用药剂的期间，并将此循环重复进行1至几个循环。
16.根据权利要求4至6中任意一项所述的方法，其中将治疗有效量的双(氰基苯基)甲基-三唑向人类受试者每周施用7至4次，或在此时间期间的约100％天至约50％天施用，施用1至3周，接着1至3周不施用药剂，并将此循环重复进行1至几个循环。
17.根据权利要求16的方法，其中将治疗有效量的双(氰基苯基)甲基-三唑向人类受试者每天施用一次或每两天施用一次。
18.根据权利要求12至16中任意一项所述的方法，其中治疗有效量的双(氰基苯基)甲基-三唑对哺乳动物中雌二醇的循环水平和/或促卵泡激素的循环水平没有显著影响。
19.根据权利要求12至16中任意一项所述的方法，其中用于抑制妇女乳腺癌发展的双(氰基苯基)甲基-三唑的有效量为0.1至0.3mg，优选地为0.125mg至0.25mg，最优选地为0.15mg至0.25mg的双(氰基苯基)甲基-三唑。
20.在单位剂型中包含一定量双(氰基苯基)甲基-三唑或其可药用盐的药物组合物，其中所述双(氰基苯基)甲基-三唑或其可药用盐的量比在哺乳动物中预防性治疗对芳香化酶抑制和对雌激素生物合成的抑制起反应的疾病所需要的日剂量低5至20倍。
21.根据权利要求20的药物组合物，其中双(氰基苯基)甲基-三唑的量比在哺乳动物中预防性治疗对芳香化酶抑制和对雌激素生物合成的抑制起反应的疾病所需要的日剂量低8.3至25倍，优选地低10至20倍，且最优选地低10至16.7倍。
22.药物组合物，其在根据权利要求20的单位剂型中包含0.1mg至0.3mg，优选地包含0.125mg至0.25mg，最优选地包含0.15mg至0.25mg的双(氰基苯基)甲基-三唑。
23.在单位剂型中包含一定量双(氰基苯基)甲基-三唑或其可药用盐的药物组合物，其特征在于双(氰基苯基)甲基-三唑的量对哺乳动物中雌二醇的循环水平和/或促卵泡激素的循环水平没有显著影响。
24.在单位剂型中包含一定量双(氰基苯基)甲基-三唑或其可药用盐的药物组合物，其特征在于该活性成分的量为0.001至0.099mg，优选地为0.002至0.02mg的双(氰基苯基)甲基-三唑，用于在哺乳动物中预防性治疗对芳香化酶抑制和对雌激素生物合成的抑制起反应的疾病。
25.根据权利要求20至24中任意一项所述的药物组合物，用于妇女乳腺癌的预防性治疗。
26.包含包装材料和在所述包装材料中含有双(氰基苯基)甲基-三唑或其可药用盐的制品，其中所述包装材料包含标签说明书，所述标签说明书标明了所述双(氰基苯基)甲基-三唑或双(氰基苯基)甲基-三唑的可药用盐将遵循一个特定的剂量方案施用于妇女，优选地施用于绝经后的妇女或易患乳腺癌的妇女，其施用量为从约0.1mg至约0.3mg，优选地施用量为从约0.125mg至约0.25mg，以抑制乳腺癌的发展。
27.包含包装材料和在所述包装材料中含有双(氰基苯基)甲基-三唑或其可药用盐的制品，其中所述包装材料包含标签说明书，所述标签说明书标明了所述双(氰基苯基)甲基-三唑或双(氰基苯基)甲基-三唑的可药用盐将遵循一个特定的剂量方案施用于妇女，优选地施用于绝经后的妇女或易患乳腺癌的妇女，其施用量为对哺乳动物中雌二醇的循环水平和/或促卵泡激素的循环水平没有显著影响，以抑制乳腺癌的发展。
28.根据权利要求27的制品，其中双(氰基苯基)甲基-三唑的有效量为如权利要求20至24中所述的药物组合物形式。
全文摘要
本发明涉及较低剂量下式(I)的双(氰基苯基)甲基－三唑或其可药用盐的用途，用于制备药物组合物，其中所述药物组合物在哺乳动物中用于预防对芳香化酶抑制和对雌激素生物合成的抑制起反应的疾病，特别是乳腺癌。
文档编号A61K31/4196GK1602302SQ02824842
公开日2005年3月30日 申请日期2002年12月10日 优先权日2001年12月11日
发明者R·R·泰克默 申请人:埃默里大学