专利名称：利用l－fmau联合治疗乙型肝炎病毒感染的制作方法
技术领域：
本发明描述了治疗或预防宿主乙型肝炎病毒(HBV)感染的方法和组合物，包括给予有效剂量的L-FMAU、FTC和干扰素。
背景技术：
虽然存在有效的疫苗，乙型肝炎病毒(HBV)感染仍然是一个严重的公众健康问题，全世界的慢性携带者达4亿。这些感染者有发生肝硬化和肝细胞癌的危险(Lee，W.M.1997，N.Engl.J.Med.3371733-1745)。目前估计美国境内慢性乙型肝炎病毒携带者约有125万，每年有20万人通过接触血液或体液新发感染。
乙型肝炎病毒(HBV)是仅次于烟草的导致人类发生癌症的原因。虽然有假说认为HBV可直接引发肿瘤的发生或通过慢性炎症、肝硬化和感染相关的细胞再生间接引发肿瘤的发生，但是HBV导致癌症的机制还不清楚。
感染HBV的人数已经达到了流行病的水平。在2-6个月的无症状潜伏期后，HBV感染可导致急性肝炎和肝脏损伤，表现为腹痛、黄疸、血液中某些酶水平升高。HBV可导致爆发型肝炎，一种急进性并常常是致死性的疾病，此时肝脏发生大面积坏死。急性病毒性肝炎后患者一般会痊愈。而某些患者在之后更长的时间内或无限期的，在血液中持续出现高水平的病毒抗原，导致慢性感染。慢性感染可导致慢性持续性肝炎。感染慢性持续性HBV的患者最常见于发展中国家。慢性持续性肝炎可导致疲乏、肝硬化和肝细胞癌，一种原发性肝癌。在西方工业化国家，HBV感染的高危人群包括那些接触HBV携带者或其血样的人群。事实上，HBV的流行病学与获得性免疫缺陷综合征非常相似，事实上，HBV感染在患AIDS或HIV-相关感染的患者中很常见。但HBV较HIV更易传染。
到目前为止，FDA只通过了3种治疗慢性HBV感染的药物α干扰素、3TC(Epivir，拉米夫定)和阿德福韦二叔戊酰氧甲酯(HepseraGilead Sciences)。
FDA批准用于治疗HBV的药物
α干扰素干扰素的一种制成品被用于治疗乙型肝炎。该治疗包括注射大约4个月的干扰素。
并非所有的患者都对干扰素有反应，有时需进行再次治疗。临床研究显示，因乙型肝炎接受A(重组α-2b干扰素，Schering公司)注射治疗的患者中，随着时间进展，只有45％的患者血液中检测不出乙型肝炎病毒的存在。另外，大多数患者耐受干扰素治疗有困难，干扰素治疗可导致严重的流感样症候群、体重下降及乏力和抵抗力降低。
3TCBCH-189(2′，3′-双脱氧-3′-硫代胞苷)的(一)一对映体，亦称为3TC(Epivir，拉米夫定)是一种具有抗HIV和HBV活性的抗病毒药。它属于核苷类逆转录酶抑制剂(NRTI)种类的药物，通过阻断HIV和HBV复制需要的逆转录酶的产生以发挥作用。3TC最初用于治疗HIV，但是，研究人员发现3TC对B型肝炎病毒也有治疗作用。1998年12月，美国食品与药物管理局(FDA)证明了Epivir HBV对于B型肝炎病毒感染有治疗效果。
尽管3TC可以有效抑制HBV复制，3TC治疗中灭活病毒的缓慢的动力学(Nowak，M.，S.Bonhoeffer，et al.1996.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 934398-4402)和自发的病毒基因组变异导致了抗药突变株的产生，它具有逆转录酶(RT)区的变异(Mason，W.S.，J.Cullen，et al.1998.Virology 24518-32.Nafa，S.，S.Ahmed，et al.2000.Hepatology 321078-1088；Melegari，M.，P.P.Scaglioni，and J.R.Wands.1998 Hepatology 27628-633.；Seigneres，B.，C.Pichoud，et al.2000.J.Infect.Dis.1811221-1233)。大约有50％接受治疗的病人在接受3TC治疗3年后产生了病毒的抗性(Leung，N.W.，C.L.Lai，et al.2001.Hepatology 331527-1532)。对核苷类似物的抗性与导致HBV RT氨基酸序列发生改变的多聚酶基因的核酸序列被替换有关，尤其是在催化位置的YMDD基序。最为常见的聚合酶变异是rtL180M-加-M204V改变(根据最近的对HBV抗药突变株的基因型-非依赖性命名法)(Stuyver，L.J.，S.A.Locarnini，et al.2001.Hepatology 33751-757)，此改变与催化位点(rtM204V)的变异有关，同时在RT(rtL180M)的B区的补偿性变异使催化位点的变异提供更高的复制能力(Allen，M.I.，M.Deslauriers，et al.1998.Hepatology 271670-1677.Chayama，K.，Y.Suzuki，et al.1998.Hepatology 271711-1716.Melegari，M.，P.P.Scaglioni，and J.R.Wands.1998.Hepatology 27628-633.Ono，S.K.，N.Kato，et al.2001.J.Clin.Investig.107449-455.Seigneres，B.，S.Aguesse-Germon，et al.2001.J.Hepatol.34114-122)。
阿德福韦二叔戊酰氧甲酯(Hepsera)2002年9月20日，美国食品与药物管理局证明阿德福韦二叔戊酰氧甲酯可以治疗慢性B型肝炎。HEPSERATM是阿德福韦二叔戊酰氧甲酯的商品名称，是adefovir的二酯药物前体。Adefovir是腺苷单磷酸盐的无环核苷酸类似物，可以通过竞争天然底物脱氧腺苷三磷酸盐和插入病毒DNA导致DNA链终止来抑制B型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶。阿德福韦二叔戊酰氧甲酯的化学名称是9-[2-[双[(新戊酰氧基)甲氧基]氧膦基]甲氧基]-乙基]腺嘌呤。阿德福韦被细胞激酶磷酸化成活性代谢物，阿德福韦二磷酸盐。参见，例如，美国专利号5,641,763 and 5,142,051，名为，N-氧膦基甲氧基烷基的嘧啶和嘌呤基衍生物和其治疗学组合物，从此具有抗病毒活性。
(-)-FTCβ-L-FTC((β-2-羟甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-草酰硫酸，Emtriva；emtricitabine)被证明可以用于治疗HIV并且目前人类临床试验中可治疗B型肝炎病毒感染。这种化合物在鸭和土拨鼠模型中表现出了强大的抗B型肝炎病毒活性(Aguesse-Germon，S.，S.-H，Liu，et al.Afatimicrob.Agents Chefnother.1998，42，369-376；Seigneres，B.，C.Pichoud，et al.2000)。在HBV的土拨鼠模型中，FTC被发现可以抑制病毒复制但是不能诱导病毒的清除(Cullen，J.M.，S.L.Smith，et al.Antimicrob.Agents Chemother.1997，41，2076-2082；Korba，B.E.，R.F.Schinazi，P.，et al.Antimicrob.Agents Chemother.2000，44，1757-60)。
L-FMAUL-FMAU(clevudine)代表另一种用于治疗B型肝炎病毒感染有潜力的候选药物(酶学分析和组织培养实验)，根据基于HBV感染的体外模型，以及B型肝炎感染的试验性感染动物模型，例如鸭和土拨鼠(Aguesse-Germon，S.，S.-H，Liu，et al.Antimicrob.AgentsChenaother.1998，42，369-376；Seigneres，B.，C.Pichoud，et al.，2000)。在土拨鼠模型中，发现L-FMAU可以迅速降低受感染肝细胞的数量(Zhu，Y.，T.Yamamoto，et al.J.Virol.2001，75，311-22)。Yung Chi Cheng，Chung K.Chu等于1994年首先报道了1-(2’-脱氧-2’-氟-β-L-阿糖呋喃)-胸腺嘧啶(L-FMAU)对B型肝炎病毒和Epstein Barr病毒具有超强的活性。参见美国专利号5,587,362；5,567,688；5,565,438和5,808,040及国际专利申请出版号为WO 95/20595。国际专利出版号WO 01/72294公开了使用2’-脱氧-2’-氟-β-L-阿糖呋喃-胸腺嘧啶(L-FMAU)治疗丁型肝炎感染。
干扰素干扰素是一种由人体天然合成的用于调节免疫系统和其它细胞功能的蛋白质。干扰素的主要种类有干扰素α、干扰素β、干扰素γ、干扰素ω和干扰素τ。干扰素可以通过修饰以增强其在体内的稳定性，例如聚乙二醇化等修饰，或其他可以增强分子稳定性的方法。
干扰素α家族的干扰素包括干扰素α-2a，干扰素α-2b，聚乙二醇化干扰素α-2a，聚乙二醇化干扰素α-2b ROFERON-A(干扰素α-2a，Roche)，PEGASYS(聚乙二醇化干扰素α-2a，Roche)，INTRONA(干扰素α-2b，Schering Corporation)，PEG-INTRON(聚乙二醇化干扰素α-2b，Schering Corporation)，一致(consensus)干扰素，InterMun的INFERGEN(干扰素alpha con-1)，Viragen的OMNIFERON(天然干扰素)，Human Genome Sciences的ALBUFERON，Amarillo Biosciences的口服干扰素A，和SuperFeron(天然人多亚型IFN-α，Genetrol，Inc.)。
其它类型的干扰素包括干扰素β，干扰素γ，干扰素τ，干扰素ω，Ares-Serono的REBIF(干扰素β-la)，BioMedicine的干扰素ω，InterMune的干扰素γ-lb，和HuFeron(人IFN-β，Genetrol，Inc.)。
联合治疗为了更好的控制病毒复制和推迟病毒-抗药性突变株的出现，发展基于联合治疗的抗病毒策略非常重要(Zoulim，F.2001.Antivir.Chez.Chemother.12(Suppl.1)131-142)，这将可以同时阻止交叉-耐药突变株的选择，如同人类免疫缺陷病毒所显示(Chow，Y.K.，M.S.Hirsch，et al.1993.Nature 361650-654；Snyder，S.，D.Z.D′Argenio，et al. 2000.Antimicrob.Agents Cher10ther.441051-1058.Villahermosa，M.L.，et al..1997.Biochemistry 3613223-13231)。少数研究已着重于检验联合使用聚合酶抑制剂用于治疗慢性肝DNA病毒感染的抗病毒效果，使用了一些试验模型(Korba，et al.2000.Antivir.Res.4519-32；Colledge，D.，S.Locarnini，and T.Shaw.1997.Hepatology 26216-225；Colledge，et al.2000.Antimicrob.AgentsChemother.44551-560)。发展用于B型肝炎病毒感染的联合治疗是当今一种必需的策略，将会降低慢性B型肝炎病毒感染的发病率和死亡率。
在鸭B型肝炎病毒感染模型中某种嘧啶和嘌呤核苷联合治疗的效果由Seigneres等评估，Antimicrobial Agents和Chemotherapy，47(6)1842-1852(2003)。Amdoxovir(DAPD)、emtricitabine((-)-FTC)和clevudine(L-FMAU)的联合治疗已经有了增强的抗病毒效果。
Lok和McMahon，AASLD Practice Guidelines，pp.1225-1241(2001)亦描述了B型肝炎病毒感染的治疗，包括使用包括干扰素的治疗。土拨鼠肝炎病毒(WHV)慢性感染东方土拨鼠被作为HBV感染模型研究1-(2-氟-5-甲基-β-L-阿糖呋喃)-尿嘧啶(L-FMAU)和WHV表面抗原疫苗的抗病毒效果。与L-FMAU和疫苗联合治疗相关的体液和细胞免疫类似于在自限性WHV感染中所观察到的(Menneet al.，J.Virology，76(11)5305-5314(2002))。
Jacquard等发表了使用L-FMAU和FTC，连同腺病毒传送重组干扰素γ多药治疗慢性B型肝炎病毒的研究。(Jacquard etal.，″Evaluation and Combination of Clevudine and Emtricitabine withAdenovirus Mediated Delivery of Interferon Г in the WoodchuckModel of GBV Infection″，Poster presented at the Boston AASLDmeeting，Nov.2-5，2002.See also the Asilomar meeting″The MolecularBiology of Hepatitis B Virus″Sept 29-Oct 3，2002.)这项研究表明干扰素不会增强L-FMAU和FTC的效果，但是，该研究限于土拨鼠中的土拨鼠肝炎病毒，而不是人体中的人B型肝炎病毒。
美国专利号5,808,040，乔治亚大学研究基金会和耶鲁大学公开了L-FMAU可以与FTC，3TC，卡波弗，阿昔洛韦，干扰素，AZT，DDI(2’，3’-双脱氧次黄苷)，DDC(2’，3’-双脱氧次黄苷)，L-DDC，L-F-DDC，和D4T联合使用。
国际专利申请号码PCT/US99/25673，出版号WO 00/25797公开了在人体中用于治疗HBV感染和相关病症的联合用药和方法。特别是，这些组合物包括增效量的β-2-羟甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-草酰硫酸(FTC)和喷昔洛维(2-氨基-1，9-二氢-9-[4-羟-3-(羟甲基)丁基]-6H-嘌呤-6-酮，也称为″PCV″)、法昔洛韦或9-[2-(磷霉素甲氧基)乙基]6-氨基嘌呤(PMEA，以下也称为双-POM-PMEA或BP-PMEA)中的一种。或者，组合物包括增效量的2′-氟-5-甲基-p-L-阿糖呋喃尿嘧啶(L-FMAU)和喷昔洛维、9-[2-(膦-甲氧基)乙基]6-氨基嘌呤(PMEA)或β-D-1，3-二氧戊环核苷，例如DAPD中的一种。或者，组合物包括增效量的β-D-1，3-二氧戊环核苷，例如DAPD和PMEA。
PCT出版号WO 98/23285公开了一种治疗或预防B型肝炎病毒感染患病人类或动物的方法，该方法包括给予病人有效量或预防量的喷昔洛维(或其生物前体例如法昔洛韦)和α-干扰素。
美国专利号5,990,093和国际专利出版号WO 95/07086与WO96/40164，转让给Emory University，公开了治疗HBV的方法，包括给予β-L-2′，3′-双脱氧腺苷联合或交替使用2-羟基-甲基-5-(5-氟胞苷-1-基)-1，3-草酰硫酸；2-羟甲基-5-(胞苷-1-基)-1，3-草酰硫酸；2′-氟-5-碘-阿糖尿嘧啶(FIAU)；2′-氟-5-乙基-阿糖尿嘧啶(FEAU)、卡波佛或干扰素。
美国专利号5,703,058，5,905,070和6,232,300和国际专利出版号WO 96/22778公开了(5-carboximido或5-氟)-(2′，3′-不饱和或3′-修饰的)嘧啶核苷用于治疗HIV或HBV。特别是，此专利和国际专利出版公开了联合治疗HIV或HBV的方法，包括(5-carboximido或5-氟)-(2′，3′-不饱合或3′-修饰)嘧啶核苷联合2-羟-甲基-5-(5-氟胞苷-1-基)-1，3-草酰硫酸、2-羟甲基-5-(胞苷-l-基)-1，3-草酰硫酸；9-＞4-(羟甲基)-2-环戊-1-基-鸟嘌呤(卡波佛)、9-(2-羟基-乙氧基)甲基-鸟嘌呤(阿昔洛韦)、干扰素，3′-脱氧-3′-叠氮胸腺嘧啶(AZT)、2′，3′-双脱氧次黄苷(DDI)、2′，3′-双脱氧胞嘧啶(DDC)、(-)-2′-氟-5-甲基-β-L-ARA尿嘧啶(L-(-)-FMAU)和2′，3′-双脱氢-2′，3′-双脱氧胸腺嘧啶(D4T)中的一种或多种。
尽管在治疗B型肝炎和联合治疗方面已经有了进步，目前仍然不了解哪种联合治疗可以最有效的降低或终止人B型肝炎病毒在宿主中的载量。据观察尽管某些B型肝炎病毒药物和联合可以通过添加治疗而增加疗效，在其他的情况下，添加的治疗没有提供更多的益处，并且实际上对病人的健康有害。因此，提供健康保健者需要了解有益的和有利的联合治疗B型肝炎的信息以使他或她可以进行对病人最佳的治疗。
考虑到B型肝炎病毒已经达到全球流行程度的现状，并且对受到感染的病人具有严重和常常是不幸的影响，一直强烈需要新的、并且对宿主的毒性较低的有效的药学方法、用途和联合以治疗感染病毒的人。
另外，慢性B型肝炎病毒需要长期给予核苷类似物以清除感染肝细胞，这将容易导致抗药性病毒株的产生。由于抗药性突变株的选择性，治疗慢性B型肝炎病毒需要新的策略。
因此，这是现有发明的另外一个目标，即提供组合物和方法以治疗人类病人或者其他感染HBV的宿主。
本发明的另一个目的是提供方法和组合物，以治疗HBV耐药性菌株感染。
发明概述L-FMAU与FTC联合和/或轮流与干扰素，例如干扰素α或干扰素γ联合/或轮流给药可在人体中产生对B型肝炎病毒的超强疗效。在一种实施方案中，干扰素以蛋白质的形式给药，典型方式是直接输入静脉或动脉。在本发明的另一种实施方案中，干扰素通过核酸、基因或及其基因片段的形式给药以使之在宿主中表达。干扰素核酸可“裸体”输入宿主体内，即，不需要载体，或者另外可以通过载体，包括但不限于包括腺病毒载体的病毒载体。
在一种优选实施方案中，β-L-FTC和L-FMAU中至少有90％不是它们的相对的β-D-对映体。在更优选的实施方案中，β-L-FTC和L-FMAU独立地至少有95％、98％或99％不是它们的相对的β-D-对映体。
在一种实施方案中，干扰素是干扰素α，任选地，聚乙二醇化干扰素α。在另一种实施方案中，干扰素α选自包括但是不限于如下的组干扰素α-2a、干扰素α-2b，聚乙二醇化干扰素α-2a，聚乙二醇化干扰素α-2b ROFERON-A(干扰素α-2a，Roche)，PEGASYS(聚乙二醇化干扰素α-2a，Roche)，INTRONA(干扰素α-2b，Schering Corporation)，PEG-INTRON(聚乙二醇化干扰素α-2b，Schering Corporation)，一致干扰素，InterMune的INFERGEN(干扰素αcon-1)，Viragen的OMNIFERON(天然干扰素)，HumanGenome Sciences的ALBUFERON，Amarillo Biosciences的口服干扰素A，和SuperFeron(天然人多亚型IFN-α，Genetrol，Inc.)。在另一种实施方案中，干扰素为干扰素γ。还有另一种实施方案中，干扰素为干扰素β、干扰素ω或者干扰素τ。在另一种实施方案中，从以下选择干扰素，包括，但不限于Ares-Serono的REBIF(干扰素β-la)，BioMedicine的ω干扰素，InterMune的干扰素γ-lb，和HuFeron(人IFN-β，Genetrol，Inc.)。
另外，提供了用于治疗和/或预防宿主中HBV感染的组合物和方法，优选哺乳动物，甚至更优选人类，包含给予有效剂量的如下式的β-L-核苷 或其药用可接受的盐或药物前体，其中R是H、烃基、芳基、酰基、磷酸盐，包括单磷酸盐，二磷酸盐或三磷酸盐或稳定的磷酸盐部分，包括磷脂，或醚-脂，任选处于药用可接受的载体或稀释液中，联合和/或交替使用如下式的β-L-核苷 或其药用可接受的盐或药物前体，其中R1是H、烃基、芳基、酰基、磷酸盐，包括单磷酸盐，二磷酸盐或三磷酸盐或稳定的磷酸盐部分，包括磷脂，或醚-脂，R2和R3独立地为氢、烷基或者环烷基(例如环丙基)，在任选药用可接受的载体中，联合和/或交替使用免疫调节剂，例如TH1细胞因子，特别是干扰素，例如在这里描述的干扰素。
在本发明的一种实施方案中，干扰素以蛋白质的形式递送。在另一种实施方案中，干扰素以表达免疫调节蛋白的核酸、基因或其基因片段的形式递送。在一种特殊的实施方案中，干扰素通过核酸、基因或基因片段的形式以“裸体”或通过载体输送。
通常，在交替治疗中，每种药物按照有效剂量顺次给药，然而在联合治疗中，两种或更多药物按有效剂量一起给药。这些药物的剂量将根据每种药物吸收、生物-分布、代谢和排泄率等情况以及其它本领域技术人员所了解的因素确定。应当指出剂量值也要根据需要缓解的情况的严重程度而调整。更应当指出对于每种特殊情况，药物特定的剂量和计划将根据个体的需要和管理或监督组合物使用者的专业判断而被随时调整。合适的剂量范围的例子可以在科学文献和医师案头参考中找到。在这里提及的很多其它化合物的合适剂量范围的例子也可以在公共文献中找到或可以使用已知的程序鉴定。这些剂量范围可以根据需要取得的结果做调整。
附图简述
图1图解的非-限制性例子为用于递送包括土拨鼠干扰素γ的腺病毒载体。对编码区进行了描绘和定义。
图2为给予代表性土拨鼠的治疗模式的非限制性示意图，内容为使用1-(2-氟-5-甲基-β-L-阿糖基)尿嘧啶(L-FMAU)，和β-2-羟甲基-5-(5-氟胞苷-1-基)-1，3-草酰硫酸(FTC)，注射或不注射表达土拨鼠干扰素γ(Ad IFN)的腺病毒载体或者表达绿色荧光蛋白(Ad GFP)的腺病毒载体。
图3使用四个图形描述了在土拨鼠中注射不同剂量(pfu)表达土拨鼠干扰素γ(Ad IFN)的腺病毒载体前和后随时间变化(天)的土拨鼠B型肝炎(WHV)病毒DNA的数量(拷贝/ml)。箭头指示接种时间和活检时间。在左边的Y轴，显示了用内源性多聚酶分析测量(EPA，dpm/ml)的病毒正链DNA的数量，如例3所描述的，对时间作图。
图4使用5个图形描述了在土拨鼠中注射3×109pfu表达土拨鼠干扰素γ(Ad IFN GFP)的完全腺病毒载体前和后随时间变化(天)的土拨鼠B型肝炎(WHV)病毒DNA的数量(拷贝/ml)。箭头指示接种时间和活检时间。在左边的Y轴上，显示了病毒正链DNA的数量，如例3所描述的，用内源性多聚酶分析(EPA，dpm/ml)，对时间作图。在例5中更详细的描述了此数据。
图5的3个图形描述了在土拨鼠中注射3×109pfu表达绿色荧光蛋白(Ad GFP)的腺病毒载体前和后(顶部两图型)或未经治疗的对照(底部图形)随时间变化(天)的土拨鼠B型肝炎(WHV)病毒DNA的数量(拷贝/ml)。箭头指示接种时间和活检时间。在左边的Y轴，显示了病毒正链DNA的数量，如例3所描述的，用内源性多聚酶分析(EPA，dpm/ml)，对时间作图。在例5中更详细的描述了此数据。
图6是病毒DNA的southern印迹的拷贝，此病毒DNA是在感染了土拨鼠B型肝炎(WHV)的土拨鼠的肝活检中取得的，取得的时间为治疗前1月(M-1)和距离注射表达土拨鼠干扰素γ(Ad IFN GFP)的完全腺病毒载体、表达绿色荧光蛋白(Ad GFP)的腺病毒载体、或未经治疗后第5天(D5)。底部图形为共价闭合的环状病毒形式的DNA(CCC)DNA。图形下的数字说明了在D5/M-1的DNA之百分比。
图7描绘的图形为例6所描述的用1-(2-氟-5-甲基-p-L-阿糖基)尿嘧啶(L-FMAU)，和p-2-羟甲基-5-(5-氟胞苷-l-基)-1，3-草酰硫酰，Emtriva；emtricitabine(FTC)治疗土拨鼠中和治疗土拨鼠后，注射或未注射表达土拨鼠干扰素γ(Ad IFN)的腺病毒载体随时间变化(天)的土拨鼠B型肝炎(WHV)病毒的浓度(拷贝/ml)。结果使用例3中描述的点印迹分析取得。
图8显示了例6中所描述的注射土拨鼠干扰素γ(Ad IFN)或者注射表达绿色荧光蛋白(Ad GFP)的腺病毒载体治疗中和治疗动物后随时间变化(天)的土拨鼠B型肝炎(WHV)病毒的浓度(拷贝/ml)。此结果使用例3中描述的点印迹分析取得。对照土拨鼠仅使用Ad IFN治疗而病毒血症没有出现明显变化。
图9的图形为例6中描述的未经治疗的动物随时间变化(天)的土拨鼠B型肝炎(WHV)病毒的浓度(拷贝/ml)。此结果使用例3中描述的点印迹分析取得。
图10描绘的三个图形为例6中所描述的用1-(2-氟-5-甲基-p-L-阿糖基)尿嘧啶(L-FMAU)，和p-2-羟甲基-5-(5-氟胞苷-l-基)-1，3-草酰硫酸，Emtriva；emtricitabine(FTC)对土拨鼠进行治疗中和治疗后，注射或未注射表达土拨鼠干扰素γ(IFN)的腺病毒载体，随时间变化(天)的土拨鼠B型肝炎(WHV)病毒DNA载量(拷贝/ml)，使用例3中描述的实时PCR计量。
图11是分析病毒DNA的southern印迹的拷贝，此病毒DNA是在感染了土拨鼠B型肝炎(WHV)的土拨鼠的肝活检中取得的，取得的时间为用1-(2-氟-5-甲基-p-L-阿糖基)尿嘧啶(L-FMAU)，和p-2-羟甲基-5-(5-氟胞苷-l-基)-1，3-草酰硫酸，Emtriva；emtricitabine(FTC)、表达土拨鼠干扰素γ(Ad IFN)的腺病毒载体、表达绿色荧光蛋白的腺病毒载体(Ad GFP)治疗前(TO)，治疗1月(M1)和治疗2月(M2)，或未治疗。底部图形为共价闭合的环状病毒形式的DNA(CCC)DNA。图形下的数字说明了在D5/M-1的DNA之百分比。
图12的图形描述了在使用1-(2-氟-5-甲基-p-L-阿糖基)尿嘧啶(L-FMAU)，和p-2-羟甲基-5-(5-氟胞苷-l-基)-1，3-草酰硫酸，Emtriva；emtricitabine(FTC)，或者表达土拨鼠干扰素γ(Ad IFN)的腺病毒载体治疗的动物体内土拨鼠B型肝炎(WHV)病毒DNA和共价闭合的环状病毒形式的DNA(CCC)DNA的百分比，显示了病毒的减少。MO指样本恰好取自治疗前，MI指样本取自治疗开始后1个月，M2指样本取自治疗开始后2个月。
图13的图形描述了在使用1-(2-氟-5-甲基-p-L-阿糖基)尿嘧啶(L-FMAU)，和p-2-羟甲基-5-(5-氟胞苷-l-基)-1，3-草酰硫酸，Emtriva；emtricitabine(FTC)治疗的动物体内土拨鼠B型肝炎(WHV)病毒DNA和共价闭合的环状病毒形式的DNA(CCC)DNA的百分比，显示了病毒的减少。T0指样本恰好取自治疗前，MI指样本取自治疗开始后1个月，M2指样本取自治疗开始后2个月。
图14的图形描述了经过注射表达土拨鼠干扰素γ(Ad IFN)的腺病毒载体，表达绿色荧光蛋白(Ad GFP)的腺病毒载体治疗或未经治疗的动物体内土拨鼠B型肝炎(WHV)病毒DNA和共价闭合的环状病毒形式的DNA(CCC)DNA的百分比，显示了病毒的减少。T0指样本恰好取自治疗前，MI指样本取自治疗开始后1个月，M2指样本取自治疗开始后2个月。
图15的图形描述了在例2中的炎症活动性的数值(Metavir评分)，治疗使用了1-(2-氟-5-甲基-p-L-阿糖基)尿嘧啶(L-FMAU)，和p-2-羟甲基-5-(5-氟胞苷-l-基)-1，3-草酰硫酸，Emtriva；emtricitabine(FTC)、注射表达土拨鼠干扰素γ(Ad IFN)的腺病毒载体和表达绿色荧光蛋白(Ad GFP)的腺病毒载体，或未经治疗的对照。
发明详述L-FMAU与FTC联合和/或轮流、与干扰素，例如干扰素α或干扰素γ联合/或轮流给药可在人体中产生对B型肝炎病毒的超强疗效。在一种实施方案中，干扰素以蛋白质的形式给药，典型方式是直接输入静脉或动脉。在本发明的另一种实施方案中，干扰素通过核酸、基因或其基因片段的形式给药以使之在宿主中表达。干扰素核酸可“裸体”或通过载体被输送到宿主体内，使用本领域普通技术人员所了解的技术。
在一种优选实施方案中，β-L-FTC和L-FMAU至少有90％不是它们的相对的β-D-对映体。在更优选的实施方案中，β-L-FTC和L-FMAU独立地至少有95％、98％或99％不是它们的对应的β-D-对映体。
在优选的实施方案中，免疫调节剂是干扰素。在一种实施方案中，干扰素是干扰素α，任选地，聚乙二醇化干扰素α。在另一种实施方案中，从其中选择干扰素α，包括，但是不限于干扰素α-2a、干扰素α-2b，聚乙二醇化干扰素α-2a，聚乙二醇化干扰素α-2bROFERON-A(干扰素α-2a，Roche)，PEGASYS(聚乙二醇化干扰素α-2a，Roche)，INTRONA(干扰素α-2b，ScheringCorporation)，PEG-INTRON(聚乙二醇化干扰素α-2b，ScheringCorporation)，一致干扰素，InterMune的INFERGEN(干扰素alphacon-1)，Viragen的OMNIFERON(天然干扰素)，Human GenomeSciences的ALBUFERON，Amarillo Biosciences的口服干扰素A，和SuperFeron(天然人多亚型IFN-α，Genetrol，Inc.)。在另一种实施方案中，干扰素为干扰素γ。还有另一种实施方案中，干扰素为干扰素β、干扰素ω或者干扰素ι。在另一种实施方案中，从以下选择干扰素，包括，但不限于Ares-Serono的REBIF(干扰素β-la)，BioMedicine的ω干扰素，InterMune的干扰素γ-lb，和HuFeron(人IFN-β，Genetrol，Inc.)。
另外，用于治疗和/或预防宿主中HBV感染的组合物和方法，优选哺乳动物，甚至更优选人类，包含给予有效剂量的如下式的β-L-核苷 或它的药用可接受的盐或药物前体，其中R是H、烃基、芳基、酰基、磷酸盐，包括单磷酸盐，二磷酸盐或三磷酸盐或稳定的磷酸盐分子，包括磷脂，或醚-脂，任选药用可接受的载体或稀释液，联合和/或交替使用此化学式的β-L-核苷 或它的药用可接受的盐或药物前体，其中R1是H、烃基、芳基、酰基、磷酸盐，包括单磷酸盐，二磷酸盐或三磷酸盐或稳定的磷酸盐部分，包括磷脂，或醚-脂，R2和R3独立地为氢、烷基或者环烷基(例如环丙基)，在任选药用可接受的载体中，联合和/或交替使用免疫调节剂，例如TH1细胞因子，特别是干扰素，例如在这里描述的干扰素。
在本发明的一种实施方案中，干扰素以蛋白质的形式递送。在另一种实施方案中，干扰素以表达免疫调节蛋白的核酸、基因或其基因片段的形式递送。在一种特殊的实施方案中，干扰素通过核酸、基因片段的形式输送，输送是通过病毒载体或者“裸体”完成的。
通常，在交替治疗中，每种药物按照有效剂量顺次给药，然而在联合治疗中，两种或更多药物按有效剂量一起给药。这些药物的剂量将根据每种药物吸收、生物-分布、代谢和排泄率等情况以及其它本领域技术人员所了解的因素确定。应当指出剂量值也要根据需要缓解的情况的严重程度而调整。更应当指出对于每种特殊情况，药物特定的剂量和计划将根据个体的需要和管理或监督组合物使用者的专业判断而被随时调整。合适的剂量范围的例子可以在科学文献和医师案头参考中找到。在这里提及的很多其它化合物的合适剂量范围的例子也可以在公共文献中找到或可以使用已知的程序鉴定。这些剂量范围可以根据需要取得的结果做调整。
I.定义此处所用名词“烷基”，如果没有其它特殊情况，指含有饱和的直的、分支的或者环状的，第一、第二或第三烃基的典型情况下C1到C10，特定情况下包括甲基，三氟甲基，CCl3，CFCL2，CF2Cl，乙基，CH2CF3，CF2CF3，丙基、异丙基、环丙基、丁基、异丁基、t-丁基、戊基、环戊基、异戊基、新戊基、己基、异己基、环己基、环己基甲基、3-甲基戊基，2，2-二甲基丁基和2，3-二甲基丁基。此名词包括取代和未取代的烷基基团。烷基可被替换的部分是从包含卤素的基团(氟、氯、溴或碘)，羟基、氨基、氨基烷基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺酸基、硫酸基、磷酸基、磷酸盐或者膦酸盐，未保护或者进行必要保护的，正如本领域技术人员所熟知的，例如，Greene等所述，有机合成中的保护性基团，John Wiley and Sons，Second Edition，1991，在此引入作为参考。
名词“低级烷基”，在此使用的，如果没有其它特殊情况，指的是饱和直的，分支的C1到C4，或者如果适宜，环状的(例如，环丙基)烷基，包括取代和未取代形式。除非在此应用中特别说明，当烷基为合适的部分时，优选低级烷基。类似的，当烷基或低级烷基是合适的部分时，优选未取代烷基或低级烷基。
名词“芳基”，在此使用的，如果没有其它特殊情况，指的是苯基、联苯或萘基，优选苯基。此名词包括取代和未取代部分。芳基基团可以用选自以下基团的一个或者更多部分取代，包括卤素(氟、氯、溴或碘)、羟基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、硝基、磺酸基、硫酸基、磷酸基、磷酸盐或者膦酸盐，未保护或者进行必要保护的，正如本领域技术人员所熟知的，例如，Greene等所述，有机合成中的保护性基团，John Wiley and Sons，Second Edition，1991。
名词“酰基”指的是一种羧酸酯，其中酯基基团的非羰基部分选自直链的、支链的或环状烷基或低级烷基，烷氧基包括甲氧基甲基、芳烷基包括苄基、芳氧基烷基如苯氧基甲基、芳基包括苯基优选的由卤素(例如F，Cl，Br或I)，C1到C4烷基或者C1到C4烷氧基，磺酸酯如烷基或芳烷基磺酰基包括甲烷磺酰基，单、二或三磷酸盐酯，三苯甲基或单甲氧基三苯甲基，取代的苯甲基，三烷基甲硅烷基(例如二甲基-t-丁硅烷基)或二苯基甲基甲硅烷基。酯中的芳基优选地包括苯基。名词“低级酰基”指的是非羰基部分是低级烷基的酰基。
名词“基本纯净形式”的使用贯穿本说明书以描述一种化合物包括大约90％或更高，或至少95％、96％、97％、98％或99％或更多这种化合物的单一对映体。当一种特殊构造的核苷(D或L)用这种规格表示时，意味着此核苷用基本纯净的形式给药。
名词“免疫调节剂”，如这里使用的，指的是一种直接或间接调节免疫反应的化学因子或者细胞因子。免疫调节剂的非限制性的例子包括TII1细胞因子，特别是，干扰素，干扰素-α，纯化干扰素-α，干扰素-α2a，干扰素-α2b，干扰素-β，干扰素-γ，一致(consensus)干扰素，聚乙二醇化干扰素，聚乙二醇化干扰素-α，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，白细胞介素，白细胞介素-2，和白细胞介素-12。在优选的实施方案中，免疫调节因子是干扰素，甚至更优选干扰素-γ。
名词“宿主”，如这里使用的，指的是一种单细胞的或者多细胞的生物体，病毒可在其中复制，包括细胞系和动物，优选人类。备选地，宿主可以携带一部分病毒基因组，其复制或功能可以随本发明的化合物而改变。名词宿主特指感染的细胞，此细胞转染了所有或一部分病毒基因组和动物，尤其是，灵长类(包括黑猩猩)和人类。在大多数本发明的动物应用中，宿主是人类病人。然而兽医学应用，在某些情况下，很可能利用本发明。
II.药用可接受的盐和药物前体在这里公开的每一种化合物都具有足够的碱性或酸性以形成稳定的非毒性酸或碱性盐，将化合物以药用可接受的盐的形式给药可能是适宜的。药用可接受的盐的例子是与酸一同形成的有机酸加成盐，它形成生理上可以接受的阴离子，例如，甲苯磺酸盐，甲磺酸盐，醋酸盐，柠檬酸盐，丙二酸盐，酒石酸盐，琥珀酸盐，苯酸盐，抗坏血酸盐，α-酮戊二酸，和α-甘油磷酸盐。适合的无机盐也可以形成，包括，硫酸盐，硝酸盐，碳酸氢盐和碳酸盐。
药用可接受的盐可以通过使用在本领域中熟知的标准方法取得，例如使用足够碱性的化合物例如氨与提供生理上可接受的阴离子的适合的酸反应。也可以制造羧酸的碱金属(例如，钠，钾或者锂)或者碱土金属(例如钙)盐。
“药用可接受的药物前体”指的是化合物经过代谢，例如水解或者氧化，在宿主中形成目前发明中的化合物。药物前体的典型的例子包括在活性化合物的功能部分具有生理上不稳定的保护基团的化合物。药物前体包括可以被氧化、降解、氨基化、去氨基化、羧化、脱羧化、水解、去水、烷基化、去烷基、酰化、去酰化、磷酸化、去磷酸化以生产活性化合物。药用可接受的盐包括那些起源于药用可接受的无机或者有机碱或酸的盐。合适的盐包括那些起源于碱金属例如钾和钠，碱土金属例如钙和镁，在制药学领域中熟知的的众多种其它的酸。本发明的化合物可以具有抗病毒活性，或者经代谢成为可以有此活性的化合物。
任何一种在此描述的核苷可以当作一种核苷药物前体给药以增加活性、生物利用度、稳定性或者也可改变核苷的性质。大量的核苷药物前体配体是已知的。一般来说，对化合物的羟基或者核苷的单、二或三磷酸盐进行烷基化、酰化或者其它亲脂性修饰将增加核苷的稳定性。可以取代一个或多个磷酸部分上氢的取代基的例子是烷基、芳基、类固醇、碳水化和物，包括糖、1，2-二酰基甘油和醇类。R.Jones和N.Bischofberger，Antiviral Research，27(1995)1-17描述了许多例子。任何这些都可以与公开的核苷结合使用以取得预想的效果。
任何这里所描述的用于联合和/或交替治疗的化合物都可以作为一种酰化药物前体给药，在这里名词酰化指的是羧酸酯，其中酯基的非羰基部分是从直链的、分支的或者环状的烷基或者低级烷基、烷氧烷基包括甲氧基甲基，芳烷基包括苄基，芳氧基烷基例如苯氧基甲基，芳基包括苯基，可选地被卤素(例如F，Cl，Br或I)，C1到C4烷基或者C1到C4烷氧基，磺酸酯例如烷基或者芳烷基磺酰基包括甲烷磺酰基，单、二或三磷酸盐酯，三苯甲基或单甲氧基三苯甲基，取代的苯甲基，三烷基甲硅烷基(例如二甲基-t-丁硅烷基)取代。
活性的核苷或者其它含羟基的化合物也可以作为醚酯提供(特别是核苷的5′-醚酯或者5′-磷醚酯)，如以下参考所公开的，具体可以参考Kucera，L.S.，N.Iyer，et al.AIDS Res.Hum.Retro Viruses.6491-501；Piantadosi，C.，J.Marasco C.J.，et al.J.Med.Chenu.341408.1414；Hosteller，K.Y.，D.D.Richman，et al.Antimicrob.AgentsChenzotlaer. 362025.2029；Hostetler，K.Y.，L.M.Stuhmiller，et al.J.Biol.Chem.26561127。
美国专利公开的合适的可以共价的引入含有核苷或者其它羟基或者氨基的化合物的亲脂性取代基的非限制性例子，优选核苷或亲脂性制剂的5’-OH位点，包括美国专利号5,149,794(Sep.22，1992，Yatvin etal.)；5,194,654(Mar.16，1993，Hostetler et al.，5,223,263(June29，1993，Hostetler et al.)；5,256,641(Oct.26，1993，Yatvin et al.)；5,411,947(May 2，1995，Hostetler et al.)；5,463,092(Oct.31，1995，Hostetler et al.)；5,543,389(Aug.6，1996，Yatvin et al.)；5,543,390(Aug.6，1996，Yatvin et al.)；5,543,391(Aug.6，1996，Yatvin et al.)；and 5,554,728(Sep.10，1996；Basava et al.)，所有以上专利在此引入作为参考。公开了可以连接到当前发明的核苷上的亲脂性取代基，或者亲脂性制剂的外国专利应用，包括WO 89/02733，WO 90/00555，WO91/16920，WO 91/18914，WO 93/00910，WO 94/26273，WO 96/15132，EP 0 350 287，EP 93917054.4，和WO 91/19721。
核苷药物前体的非限制性例子在以下参考中描述Ho，D.H.W.(1973) Cancer Res.33，2816-2820；Holy，A.(1993)Isopolarphosphorous-modified nucleotide analogues，″InDe Clercq(Ed.)，Advances in Antiviral Drug Design，Vol.I，JAI Press，pp.179-231；Hong，C.I.，Nechaev，A.，and West，C.R.(1979a)Biochein.Biopliys.Rs.Comniun.88，1223-1229；Hong，C.I.，Nechaev，A.，etal.(1980)J.Med.Cliein.28，171-177；Hosteller，K.Y.，Stuhmiller，L.M.et al.J.Biol.Chem.265，6112-6117；Hosteller，K.Y.，Carson，D.A.andRichman，D.D.(1991)J.Biol Claem.266，11714-11717；Hosteller，K.Y.，Korba，B.et al.(1994a)Antiviral Res.24，59-67；Hosteller，K.Y.，Richman，D.D.，et al.(1994b)Antimicrobial Agents Chemother.38，2792-2797；Hunston，R.N.，Jones，A.A.et al.(1984)J.Med.Chez.27，440-444；Ji，Y.H.，et al.(1990)；J.Med.Chem.33 2264-2270；Jones，A.S.，McGuigan，C.，et al.(1984)J.Chem.Soc.Pef-kin Trafzs.1，1471-1474；Juodka，B.A.and Smrt，J.(1974)Coll.Czecla.Chem.Conafn.39，363-968；Kataoka，S.，Imai，J.，et al.(1989)Nucleic AcidsRes.Sym.Ser.21，1-2；Kataoka，S.，Uchida，Heterocycles 32，1351-1356；Kinchington，D.，Harvey，J.J.，et al.(1992)Antiviral Chez.Chemother.3，107-112；Kodama，K.，Morozumi，M.，et al.(1989)Jpn.J.Cancer Res.80，679-685；Korty，M.and Engels，J.(1979)Naunyn-Schmiedeberg′s Arch.P7zarmacol.310，103-111；Kumar，A.，Goe，P.L.，et al.(1990)J.Med.Chenu，33，2368-2375；LeBec，C.，and Huynh-Dinh，T.(1991)Tetrahedron Lett.32，6553-6556；Lichtenstein，J.，Barner，H.D.and Cohen，S.S.(1960)J.Biol.Chem.235，457-465；Lucthy，J.，Von Daeniken，A.，et al.(1981)Mitt.Geg.Lebensmittelunters.Hyg.72，131-133(Chem.Abstr.95，127093)；McGigan，C.Tollerfield，S.M.and Riley，P.a.(1989)Nucleic Acids Res.17，6065-6075；McGuigan，C.，Devine，K.G.，et al.(1990a)Antiviral Chem.Chemother.1 107-113；McGuigan，C.，O’Connor，et al.(1990b)Antiviral Chem.Chemother.1，355-360；McGuigan，C.，Nicholls，S.R.，et al.(1990c)Antiviral Chem.Chemother.1，25-33；McGuigan，C.，Devin，K.G.，et al.(1991)“Antiviral Res.15，255-263；McGuigan，C.，Pathirana，R.N.，Balzarini，J.and DeClercq，E.(1993b)J.Med Chem.36，1048-1052.Antiviral Chem.Chemother.5，271-277；Meyer，R.B.，Jr.，Shuman，D.A.and Robins，R.K.(1973)Tetrahedron Lett.269-272；Nagyvary，J.Gohil，R.N.，Kirchner，C.R.and Stevens，J.D.(1973)BioChem.Biophys.Res.Commun.55，1072-1077；Namane，A.Gouyette，C.，etal.(1992)J.Med.Chem.35，3039-3044；Nargeot，J.Nerbonne，et al.(1983)Natl.Acad.Sci.U.S.A.80，2395-2399；Nelson，K.A.，Bentrude，W.G.et al.(1987)J.Am.Chem.Soc.109，4058-4064；Nerbonne，J.M.，Richard，S.，Nargeot，J.and Lester，H.A.(1984)Nature301，74-76；Neumann，J.M.，Herv，M.，et al.(1989)J.Am.Chem.Soc.111，4270-4277；Ohno，R.，Tatsumi，N.，et al.(1991)Oncology 48，451-455.Palomino，E.，Kessle，D.andHorwitz，J.P.(1989)J.Med.Chem.32，22-625；Perkins，R.M.，Barney，S.et al.(1993)Antiviral Res.20(Suppl.I).84；Piantadosi，C.，Marasco，C.J.，Jr.，et al.(1991)J.Med.Chem.34，1408-1414；Pompon，A.，Lefebvre，I.，Imbach，J.L.，Kahn，S.and Farquhar，D.(1994).Antiviral Chem Chemother.5，91-98；Postemark，T.(1974)Annu.Rev.Pharmacol.14，23-33；Prisbe，E.J.，Martin，J.C.M.，et al.(1986)J.Med.Chem.29，671-675；Pucch，F.，Gosselin，G.，et al.(1993)Antiviral Res.22，155-174；Pugaeva，V.P.，Klochkeva，S.I.，Mashbits，F.D.and Eizengart，R.S.(1969)Gig.Trf.Prof.Zabol.14，47-48(Chem.Abstr.72，212)；Robins，R.K.(1984)Pharm.Res.11-18；Rosowsky，A.，Kim.S.H.，Ross and J.Wick，M.M.(1982)J.Med.Chem.25，171-178；Ross，W.(1961)BioChem.Pharm.8，235-240；Ryu，E.K.，Ross，R.J.Matsushita，T.，et al.(1982).J.Med.Chem.25，1322-1329；Saffhill，R.and Hume，W.J.(1986)Chem.Biol.Interact.57，347-355；Saneyoshi，M.，Morozumi，M.，et al.(1980)Chem Pharm.Bull.28，2915-2923；Sastry，J.K.，Nehete，P.N.，et al.(1992)Mol.Pharmacol.41，441-445；Shaw，J.P.，Jones，R.J.et al.(1994)“Oral bioavailability of PMEA from PMEA prodrugs in male Sprague-Dawley rats.”9th Annual AAPS Meeting.San Diego，CA(Abstract).Shuto，S.，Ueda，S.，Imamura，S.，Fukukawa，K.Matsuda，A.and Ueda，T.(1987)Tetrahedron Lett.28，199-202；Shuto，S.Itoh，H.，et al..(1988)Pharm.Bull.36，209-217.一个有用的磷酸药物前体基团的例子是S-酰基-2-硫代乙基，也可称为“SATE”。
III.药用组合物宿主，特别是，遭受HBV带来的痛苦或者暴露在B型肝炎病毒下的人们，可以给予有效剂量的L-FMAU和β-L-FTC治疗，与某种免疫调节剂，例如TH1细胞因子，包括任何一种在此描述的干扰素，或者药用可接受的盐或其酯，联合和/或者交替治疗，任何一种可以单独或者与药用载体或稀释剂联合使用。活性物质可以采用任何合适的途径给药，例如，经口、肠外、肠内、静脉内、皮内、皮下、局部、经鼻、经直肠，用液相或固相。
活性化合物被包含在药用可接受载体或者稀释剂内以治疗有效剂量给予病人，治疗学有效剂量的化合物抑制病毒在体内复制，特别是HBV复制，而不会在接受治疗的病人引起严重的毒性效果。使用“抑制剂量”指的是活性成分足以产生在此描述的抑制效果的量，例如，这里描述的剂量。
对于所有以上提到的条件，化合物的一个优选的剂量都将在约1至50mg/kg的范围内，优选的为1至20mg/kg体重每天，更常用0.1mg至约100mg/kg接受者体重每天。药用可接受的衍生物的有效剂量范围可以基于目前需给予核苷的质量计算出来。如果衍生物本身产生功效，有效剂量可以根据上述使用衍生物的质量估计，或者根据本领域的技术人员的其他方法确定。
化合物可以方便的根据任何合适的剂量形式为单位给药，包括但不限于一个单位包含7到3000mg，优选70到1400mg有效成分每单位剂量形式。口服剂量为50到1000mg通常比较方便。
理想地，至少一种有效成分，尽管优选使用活性成分联合治疗，应该给予可以取得大约0.2到70mM的活性化合物峰值血浆浓度的量，大约1.0到10mM为优选。这可以通过，例如，通过静脉注射0.1到10％活性成分的溶液，任选的生理盐水取得，或者以活性药物的药丸给药。
此药物组合物中的活性化合物的浓度将依赖于药物的吸收、分布、代谢和排泄率以及本领域的技术人员所了解的其它因素。应当指出剂量值也将根据需要医治的情况的严重程度而变动。另外应当指出的是出于任何特殊的目的，特殊的剂量计划应当根据个体需要和管理或者监督组合物给药者的职业判断随时调整，此处提出的浓度范围仅为典型的并且不建议限制所述组合物的范围或者使用。活性成分可以一次给药，或者可以分为更小剂量在不同时间间隔给药。
一种FTC和L-FMAU的优选的给药方式为口服。口服组合物一般包括惰性稀释剂和可食用的载体。它们可以被封闭在明胶胶囊中或者压缩为片剂。为了达到口服治疗性给药的目的，活性化合物可以与赋形剂合并并以片剂、锭剂、或者胶囊的形式使用。药用相容性结合药剂，和/或佐剂材料可以作为组合物的一部分包括在内。
片剂、药丸、胶囊、锭剂和类似物可以包含任何以下成分，或者近似天然的化合物结合剂例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂例如淀粉或者乳糖，裂解剂例如藻酸、Primogel、或者谷物淀粉；润滑剂例如硬脂酸镁或者Sterotes；助流剂例如二氧化硅胶体；甜味剂例如蔗糖或者糖精；或者调味剂例如胡椒粉、甲基水杨酸、或者桔味香料。当剂量单位形式为胶囊时，它可以包含，作为上述类型材料的补充，液相载体例如脂肪油。另外，剂量单位形式可以包含不同其它可以塑造剂量单位物理形状的材料，例如，糖衣、虫胶、或者其它肠剂。
化合物可以用酏剂、悬液、糖浆、包药干糊片、口香糖或者类似方式给药。糖浆可能包含，作为活性化合物的补充，蔗糖作为甜味剂和某种防腐剂、染料和色素和香味剂。
化合物或者它们的药用可接受的衍生物或者其盐也可以与其它不会破坏预定活性的活性材料混合，或者与补充预定活性的材料合用，例如抗生素、抗真菌药、抗炎症药、蛋白酶抑制剂，或者其它核苷或者非-核苷抗病毒剂，如上更详细描述的。用于胃肠外的、皮内的、皮下的、或者局部应用的溶液或者悬液可以包括以下成分无菌稀释剂例如注射用水、生理盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙烯二醇或者其它合成溶剂；抗菌剂例如苯甲醇或者甲基苯甲酸酯类；抗氧化剂例如抗坏血酸或者硫酸氢钠；螯合剂例如乙烯基二氨基四乙酸；缓冲剂例如醋酸盐、柠檬酸盐或者磷酸盐和调节张性的试剂例如氯化钠或者葡萄糖。胃肠外制剂可以装入安瓿、一次性注射器或者多种剂量的玻璃或塑料小瓶中。如果静脉内给药，优选的载体为生理盐水或者磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
如果使用鼻腔气雾剂或吸入给药，这些组合物根据制药学制剂领域中熟知的技术准备并可以通过以下形式准备盐水溶液、溶于苯甲醇或者其它合适的防腐剂，使用吸收增强剂以提高生物利用度，碳氟化合物、和/或其它本领域中已知的溶解剂或分散剂。
如果以栓剂形式直肠给药，这些组合物可以与合适的非起始赋形剂混合而制备，例如可可油、常温下为固体但是在直肠腔内放置会液化和/或溶解的聚乙二醇的合成甘油酯。
在一种实施方案中，一种或多种活性化合物可以用可保护这些组合物防止其从体内迅速清除的载体制备，例如控释配方，包括植入和微胶囊输送系统。可以使用生物可降解的、生物相容性多聚物，例如乙烯乙酸乙烯酯、多酐、聚乙二醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这些配方的方法为本领域的技术人员所熟知。材料也可以通过商业途径从Alza Corporation取得。
脂质体悬液(包括具有抗病毒病毒抗原单克隆抗体、靶向感染细胞的脂质体)作为药用可接受的载体亦为优选。这些可以根据本领域技术人员所了解的方法制备，例如，美国专利号4,522,811所描述的(在此全部引入作为参考)。例如，脂质体制剂可以用以下方法制备在无机溶剂中溶解合适的脂类(例如硬脂酰磷脂酰乙醇胺、硬脂酰磷脂酰胆碱、arachadoyl卵磷脂、和胆固醇)的方法，溶剂蒸发后在容器表面留下一层干脂薄膜。然后在容器中加入活性化合物或者其单磷酸盐、二磷酸盐、和/或三磷酸盐衍生物的水溶液。然后手工旋转容器以使脂质从容器壁上脱落并使聚集的脂粒分散，由此形成脂质体悬液。
本发明的组合物可以与一种或更多以下物质联合和/或交替使用其它抗病毒、抗HIV、抗HBV、抗HCV或者抗疱疹试剂或干扰素、抗癌、抗增生或抗细菌剂，包括本发明的其它化合物。本发明的某些化合物可能会通过降低代谢作用、分解代谢或者其它化合物的失活增强本发明的某些化合物的活性，因此照此用药以取得更好疗效。
通常，在交替治疗中，每种药物按照有效剂量顺次给药，然而在联合治疗中，两种或更多药物按有效剂量一起给药。这些药物的剂量将根据每种药物吸收、生物-分布、代谢和排泄率等情况以及其它本领域技术人员所了解的因素确定。应当指出剂量值也要根据需要缓解的情况的严重程度而调整。更应当指出对于每种特殊情况，药物特定的剂量和计划将根据个体的需要和管理或监督组合物使用者的专业判断而被随时调整。合适的剂量范围的例子可以在科学文献和医师案头参考中找到。在这里提及的很多其它化合物的合适剂量范围的例子也可以在公共文献中找到或可以使用已知的程序鉴定。这些剂量范围可以根据需要取得的结果做调整。
IV.基因治疗该项发明的另一个方面是应用体内基因治疗方法以导入免疫调节剂与两种或更多的抗HBV药物联合和/或交替作用，以不同的作用方式和/或协同效应来治疗HBV。基因治疗方法涉及将核酸(DNA，RNA和反义DNA或RNA)序列可操作地连接于启动子和/或某个能使靶组织表达该序列的基因成分上并导入宿主，如某个动物，尤其是人体内，以增加免疫调节剂的表达。这样的基因治疗和导入技术和方法在本领域中是较为普遍的，参见例子，WO 90/11092，WO 98/11779；U.S.Pat.No.5,693,622，5,705,151，5,580,859；Tabata H.et al.(1997)Cardiovasc.Res.35(3)470-479，Chao J et al.(1997)Pharmacol.Res.35(6)517-522，Wolff J.A.(1997)Neuromuscul.Disord.7(5)314-318，Schwartz B.et al.(1996)Gene Ther.3(5)405-411，Tsurumi Y.et al.(1996)Circulation 94(12)3281-3290。
用于基因治疗方法的多肽载体构建体优选不会整合入宿主的基因组，也不包括可复制序列。任何本领域的技术人员熟悉的强启动子都可用于启动DNA的表达。
多肽构建体可通过任何可将可注射物质导入动物细胞的方法导入，如注入组织间隙(心脏、肌肉、皮肤、肺、肝脏、肠道等)。多肽结构载体可通过药用可接受的液体或液相载体递送。
多肽结构载体可导入动物体内的组织间隙，包括肌肉、皮肤、脑、肺、肝脏、脾脏、骨髓、胸腺、心脏、淋巴、血液、骨、软骨、胰腺、肾脏、胆囊、胃、肠道、睾丸、卵巢、子宫、直肠、神经系统、眼、腺体和结缔组织。组织间隙包括细胞间液，组织器官网状纤维间的粘多糖基质，血管或小室壁的弹性纤维，纤维组织的胶原纤维，或与包裹肌细胞的结缔组织或骨陷窝中相同的基质。类似的，该间隙充满循环中的血浆和淋巴管中的淋巴液。它们可以很方便的注入包含这些细胞的组织中。它们优先被导入并表达于持久的、不分裂的、已经分化的细胞中，虽然在未分化和分化较不完全的细胞中也可导入并表达，如血液中的干细胞或皮肤中的纤维母细胞。
在该发明的进一步实施方案中，将基因改造表达免疫调节剂的细胞注入人体内。这样的细胞可来自患者或MHC相容的供者，可包括但又不限于纤维母细胞、骨髓细胞、血细胞(如淋巴细胞)、脂肪细胞、肌细胞、内皮细胞等。这些细胞在体外通过重组DNA技术改造以产生免疫调节多肽的编码序列，或者通过转导(使用病毒载体，并且优先使用可将转导基因整合入基因组的载体)或转染操作，包括但不仅限于使用质粒、粘粒、YACs、裸露DNA、电穿孔、脂质体等。免疫调节剂的编码序列受控于一个强的组成性或诱导性表达的启动子或启动/增强子，以实现免疫调节剂的表达及优先实现其分泌。经过改造的表达并优先分泌免疫调节剂的细胞可导入患者全身，如经过循环系统或腹腔内注射。
另外也可将细胞植入基质埋于人体内，如基因改造的内皮细胞可作为淋巴或血管移植物的一部分植入。(参见，例如，Anderson et al.U.S.Pat.No.5,399,349；and Mulligan & Wilson，U.S.Pat.No.5,460,959)。
当注入细胞为非自体或MHC不相容的细胞时，可通过使用熟知的技术避免宿主产生针对导入细胞的免疫反应。例如，可以胶囊的形式导入细胞，这样既使得其内容物可以和周围的细胞外环境发生交换，又避免了导入细胞被宿主的免疫系统所识别。
可通过包含核酸、基因或基因片段的感染性病毒颗粒转导表达免疫调节剂的真核细胞包括，但不仅限于原始细胞，如原始有核血细胞，如白细胞、粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞(包括T淋巴细胞和B淋巴细胞)、全能干细胞和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL细胞)；骨髓细胞；内皮细胞；上皮细胞；角质形成细胞；干细胞；肝细胞，包括肝细胞前体细胞；纤维母细胞；间充质细胞；间皮细胞；和实质细胞。
在一个实施方案中，细胞被导入一个特定的部位，由此细胞在这样的部位发挥治疗作用。或者不将细胞导入特定部位，而令其发挥全身性的治疗作用。
转导细胞可用于，例如，通过导入宿主细胞治疗HBV，如从患者取出的血细胞在体外培养扩增，与本发明一致的包含编码免疫调节剂基因的感染性病毒颗粒。细胞可以在含有目的基因的感染性病毒颗粒转导前或后进行数量上的扩增。这样，该操作方式在向患者体内注入转化细胞时，这些细胞会在患者体内产生免疫调节剂。
转导细胞携带的基因或核酸特异性的包含编码免疫调节剂的序列，但还可能包含任何直接或间接增强细胞的治疗作用的序列。转导细胞携带的基因还可以包括使转导细胞产生它一般情况下不可能具有的治疗作用的序列，如编码对于治疗血友病有益的凝集因子的基因。该基因可编码一个或多个有治疗作用的产物。适宜基因或核酸的例子包括那些编码细胞因子如TNF、白介素(白介素1-14)、干扰素(α、β、γ-干扰素)、T细胞受体蛋白和抗体的抗原结合区Fc受体，如免疫球蛋白。其他的适宜基因的例子还包括改造细胞将其导入一般情况下该细胞不会进入的部位的基因，由此使在该部位利用细胞的治疗性质成为可能。例如，血细胞如TIL细胞可加以改造，例如，通过向细胞内引入一个单克隆抗体的Fab部分，使细胞能够识别特定的抗原。
通常使用载体将核酸导入细胞，但这并不是必需的。基因治疗中最常用的载体类型为病毒。科学家利用病毒作为载体因为它们具有进入细胞DNA的独特能力。基因治疗中用作载体的病毒是基因灭活的，它们不能进行自我复制。绝大多数基因治疗临床研究依赖鼠逆转录病毒导入目的基因。其他作为载体的病毒包括腺病毒、腺相关病毒、痘病毒和疱疹病毒。
例如，从患者取出细胞并在实验室中培养。将细胞暴露于携带目的基因的病毒。病毒进入细胞，目的基因成为细胞DNA的一部分。继续在实验室中培养细胞，然后将其转回患者体内。这一类的基因治疗叫做体外基因治疗，即“在身体外进行”。基因被转入患者的细胞而该细胞却在患者的体外。在其他一些研究中，载体或脂质体(脂肪颗粒)被用于在患者体内将目的基因导入细胞。这一类的基因治疗叫做体内基因治疗，因为基因在患者体内被转入细胞。
当使用病毒载体携带基因导入体内时，它们可能影响比预期更多的细胞。另一个危险是新的基因可能插入DNA中错误的位置，可能导致癌症或其他的危险。另外，当直接注入DNA时，或当使用脂质体导入系统时，DNA可能被导入生殖细胞中，产生可遗传性的改变。
其他需要关注的方面包括转入基因“过表达”的可能性，产生过多的缺失蛋白以致于产生危害；病毒载体可能引起炎症或免疫反应；以及病毒可能从患者传播到其他个体或环境中。
本领域中已知有许多种载体。任何已知载体都可用于本发明。在本发明的优选实施方案中，载体可携带特异的基因进入特定类型的细胞。
腺病毒载体任何腺病毒载体可被用于转染细胞和/或细胞系以表达和/或分泌免疫调节剂。腺病毒为无包膜病毒，基因组为线性双链DNA。虽然腺病毒的血清型超过40种，其中绝大多数引起人类良性呼吸道感染，但C亚群血清型2或5主要被用作载体。生命周期一般不涉及整合入宿主基因组，而是它们作为附加成分在宿主细胞核中复制，因此没有产生插入突变的危险。野生型腺病毒基因组大约35kb长，其中约30kb可为外来DNA代替(Smith，1995，Verma and Somia，1997)。有四个早期转录单位(E1、E2、E3和E4)具有调节功能，还有一个晚期转录单位编码结构蛋白。原始载体的E1或E3基因失活，缺失基因以反式由辅助病毒、质粒或整合入辅助细胞基因组提供(人类胚胎肾细胞，293细胞系，Graham，F.L.，Smiley，J.，Russell，W.L.and Nairn，R.(1997).General Virology 3659-72.)。第二代载体另外还利用了E2a温度敏感变异株(Engelhardt，J.F.，Litsky，L.，and Wilson，J.M.(1994).Human Gene Therapy 51217-1229.)或E4缺失变异株(Armentano，D.，Zabner，J.，et al.(1997).Journal of Virology 712408-2416.)。最近的“无腺病毒”载体只包含反向末端重复序列(ITRs)和围绕转基因的组装序列，所有必需的病毒基因都以反式由辅助病毒提供(Chen，H.，Mack，L.M.，Kelly，R.，et al.(1997).Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the U.S.A.941645-1650.)。
腺病毒载体对于在体内和体外转导靶细胞非常有效，并能以高滴度产生(＞1011/mL).除了Geddes，B.J.，Harding，T.C.，Lightman，S.L.and Uney，J.B.(1997).Nature Medicine 31402-1404以外.)，他报道了利用E1缺失载体使大鼠脑内转基因表达时间延长，原始载体体外表达转基因倾向于是瞬时的(Verma，I.M.and Somia，N.(1997).Gene therapy-promises，problems and prospects.Nature 389239-242.)。静脉内注射后，注入载体中90％通过非免疫调节方式在肝内降解(Worgall，S.，Wolff，G.，FalckPedersen，E.and Crystal R.G.(1997).Human Gene Therapy 837-44.)。此后，产生MHC I类分子限制性免疫反应，利用CD8+CTLs消除病毒感染细胞，CD4+细胞分泌α-干扰素，导致抗腺病毒抗体的产生(Yang，Y.and Wilson，J.M.(1995).Journal of Immunology 1552564-2569.)。腺病毒载体的改变可消除一些CTL表位，但识别的表位与宿主MHC单体型不同(Sparer，T.E.，Wynn，S.G.，Clarket al.(1997).Journal of Virology 712277-2284.Jooss，K.，Ertl，H.C.J.and Wilson，J.M.(1998).Journal of Virology 722945-2954.)。在那些未被破坏的细胞中的其余的载体，其启动子失活(Armentano，D.，Zabner，J.，et al.(1997).Journal of Virology 712408-2416.)并且持续存在的抗体阻止了接下来载体的注入。
避免免疫反应的涉及瞬时免疫抑制疗法的方法在延长基因表达和实现次级基因转移方面已取得成功(Jooss，K.，Yang，Y.and Wilson，J.M.(1996).Human Gene Therapy 71555-1566.Kay，M.A.，Meuse，L.，et al.(1997).Proceedings of tlte National Academy of Sciences of the U.S.A.944686-4691)。另一种干涉较少的方法通过给宿主服用紫外线灭活的载体产生口服耐药性(Kagami，H.，Atkinson，J.C.，et al.(1998).Human Gene Therapy 9305-313.)。然而，人们更希望能够操纵载体而不是宿主。虽然只使用复制缺陷载体，仍有很低水平的病毒蛋白表达并被提呈给免疫系统。发展包含更少基因的载体，以至于不包含任何病毒编码序列的“无腺病毒”载体，使肝组织内转基因表达时间延长(Schiedner，G.，Morral，N.，et al.(1998).Nature Genetics 18180-183.)。最初的导入是利用腺病毒蛋白包裹大量的DNA，其中绝大部分被降解并提呈给免疫系统，从而影响了临床研究。另外，人群MHC单体型具有异质性，并且人群中的一部分已经暴露于该腺病毒株(Gahry-Sdard，H.，Molinier-Frenkel，V.，et al.(1997).Journal ofClinical Investigation 1002218-2226.)直到最近，对腺病毒选择性作用于宿主细胞的机制的认识仍然很少。因此只有通过使用细胞启动子/增强子，如肌球蛋白轻链1启动子(Shi，Q.，Wang，Y.and Worton，R.(1997).Human gene therapy 8403-410.)和平滑肌细胞SM22a启动子(Kim，S.，Lin，H.，et al.(1997).Jounzal of clinical investigation 1001006-1014)，或通过直接导入特定部位(Rome，J.J.，Shayani，V.，et al.(1994).Human Gene therapy 51249-1258)来实现组织特异性表达。已知腺病毒颗粒的摄取过程分为两步，包括最初的腺病毒内的纤维膜(coat)蛋白和某个或某些细胞受体相互作用，其中包括MHC I类分子(Hong，S.S.，Karayan，L.，et al.(1997).EMBO Journal 162294-2306.)和柯萨奇病毒-腺病毒受体(Bergelson，J.M.，Cunningham J.A.，et al.(1997).Science 2751320-1323.)。接下来，腺病毒颗粒的五聚体碱性蛋白结合整合素家族细胞表面异二聚体(Wickliam，T.J.，Mathias，P.，et al.(1993).Cell 73309-319.)，通过受体介导的内吞作用实现内化。虽然绝大多数细胞表达腺病毒纤维膜蛋白的原始受体，但内化过程是更有选择性的(Harris，J.D.and Lemoine，N.R.(1996).Trends in Genetics 12400-404.)。增加病毒摄取的方法包括刺激靶细胞表达合适的整合素(Davison，E.，Diaz，R.M.，et al.(1997)Journal of Virology 716204-6207.)及与腺病毒特异性靶细胞的抗体偶联(Wickhain，T.J.，Lee，G.M，et al.(1997b).Journal of Virology 717663-7669.Goldman，C.K.，Rogers，B.E.，et al.(1997).Cancer Research 571447-1451)。但抗体的使用增加了载体生产的困难及激活补体系统的潜在危险性。通过向纤维膜蛋白插入受体结合基序，Wickham等人(Wickham，T.J.，Tzeng，E.，et al.(1997a).Journal of Virology 718221-8229.)得以将病毒重新导向与受损内皮细胞或平滑肌细胞表达的整合素，或许多细胞类型都表达的硫酸肝素受体结合。
任何腺相关病毒载体都可被用于转染细胞和/或细胞系以表达和/或分泌免疫调节剂。腺相关病毒(AAV)为非致病性人类细小病毒，依赖于辅助病毒，通常为腺病毒，进行增殖。它们可感染分裂和不分裂细胞，无需辅助病毒即可以很高的频率整合进入宿主基因组的特定位置(19q 13-qter)(Kotin，R.M.，Siniscalco，M.，et al.(1990).Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A.872211-2215.)。野生型基因组为单链DNA分子，由两个基因构成；rep编码控制病毒复制、结构基因表达和整合入宿主基因组的蛋白质，而cap编码衣壳结构蛋白。在基因组的任一端为145bp的末端重复序列，包含了启动子。
当用作载体时，rep和cap基因由转基因及其相关调节序列代替。插入序列的总长度不能超过4.7kb很多，即野生型基因组的长度(Smith，A.E.(1995).Annual Review of Microbiology 49807-838.)。重组载体的产生要求rep和cap反式排列，同时还需有辅助病毒基因产物(腺病毒基因组的E1a、E1b、E2a、E4和VA RNA)。常规方法为共转染两个质粒，一个提供载体，另一个提供rep和cap基因，到感染了腺病毒的细胞293中(Samulski，R.J.，Chang，L.，and Shenk，T.(1989).Journal of Virology 633822-3828.)。然而这种方法非常麻烦，其产率很低(＜104病毒颗粒/ml)并易于被腺病毒和野生型AAV污染。低产率的原因之一为rep基因产物对腺病毒复制的抑制效应(Vincent，K.A，Piraino，S.T.and Wadsworth，S.C.(1997).Journal of Virology711897-1905.)。新的方法去除了所有腺病毒结构基因并使用抗rep质粒(Xiao，X.，Li，J.and Samulski，R.J.(1998)Journal of Virology 722224-2232.)或于感染前将表达rep的质粒连接于成熟病毒(Fisher，K.J.，Kelley，W.M，Burda，J.F.and Wilson，J.M.(1996)Human GeneTherapy 72079-2087.)。
一旦末端重复序列被轻度降解，无rep基因的AAV载体只能作为单一前病毒或头尾连环体发生随机整合(Rutledge，E.A.and Russell，D.W.(1997).Journal of Virology 718429-8436.)。对AAV载体的关注源自其整合入宿主基因组后使转基因的表达时间延长。已经报道当转基因来自非同种属时，基因转入血管内皮细胞(Maeda，Y.，Ikeda，U.，et al.(1997).Cardiovascular Research 35514-521.)、横纹肌细胞(Fisher，K.J.，Jooss，K.，et al.(1997).Nature Medicine 3306-316.Herzog，R.W.，et al.(1997).Proceedings of the National Academy ofSciences of the U.S.A.945804-5809.)和肝细胞(Snyder，R.O.，Miao，C.H.，et al.(1997).Nature Genetics 16270-275.)后表达时间延长。AAV衣壳的中和抗体可能可检测到，但并不阻止再次施用载体或关闭启动子活性。可能由于病毒衣壳的简单性，引发的免疫反应很弱。AAV抗体在人群中的出现需要进一步的研究。除了局部载体导入外没有其他选择性作用于特定细胞类型的尝试。
特别的，在美国专利号为5,693,531的专利中公开的腺相关病毒载体，在此引入作为参考，可被使用，包括AAVp5neo；pSV-β-半乳糖苷酶；TRF169；LZ11；pSP72；pSP72nLacZ；pAdRSV4；pAdRSVnLacZ；AAVrnLac；SV40；pBluescriptSK；pSV40 ori AAV1；和pKMT11。
逆转录病毒载体任何逆转录病毒可被用于转染细胞和/或细胞系以表达和/或分泌免疫调节剂。逆转录病毒是一类包膜病毒，含有单链RNA分子作为基因组。感染后，病毒基因组逆转录为双链DNA，并整合入宿主基因组，表达为蛋白。病毒基因组约为10kb，包括至少三个基因gag(编码核心蛋白)，pol(编码逆转录酶)和env(编码病毒包膜蛋白)。基因组的任何一端为长末端重复序列(LTRs)，其中包括启动子/增强子区和涉及整合的序列。另外还有包装病毒DNA(psi)所需序列和env基因中的RNA剪切位点。一些逆转录病毒包括原癌基因，这些基因发生突变时可导致癌症的发生，但在制备载体时，这些基因都将被去除。逆转录病毒可通过整合入细胞原癌基因附近并促进LTR的不适宜表达，或干扰抑癌基因而转化细胞。这一事件，称为插入突变，虽然非常罕见，但在使用逆转录病毒作为载体时仍有可能发生。
逆转录病毒常在莫洛尼氏白血病毒(Mo-MLV)的基础上构建，后者为两生性病毒，同时能感染小鼠细胞(使载体能在小鼠模型中发展)和人类细胞(使针对人类的治疗成为可能)。病毒基因(gag、pol和env)由人们感兴趣的转基因替代并表达于包装细胞系中的质粒。因为非必需基因缺乏包装序列(psi)，他们不包括于病毒颗粒中。为了避免重组形成具有复制能力的逆转录病毒，所有与载体骨架同源的区域都应被去除，并且非必需基因应被至少两个转录单位表达(Markowitz，D.，Goff，S.and Bank，A.(1988).A safe packaging linefor gene transferseparating viral genes on two differentplasmids.Journal of Virology 621120-1124.)。即便如此，仍有很低频率的具有复制能力的逆转录病毒产生。
必需区域包括5’和3’LTRs，包装序列位于5’LTR的下游。转基因的表达可由5’LTR内的启动子/增强子区或选择性的由病毒(如巨细胞病毒，Rous肉瘤病毒)或细胞(如β肌动蛋白，酪氨酸)启动子驱动。突变分析显示在不影响病毒包装或转基因表达的条件下，几乎整个gag编码区和邻接的上游区域都可被去除(Kim，S.H.，Yu，S.S.，et al.(1998).Journal of Virology 72994-1004.)。但转基因起始密码子的具体位置及5’LTR的小的改变都会影响转基因的表达(Rivire，I.，Brose，K.and Mulligan，R.C.(1995).Proceedings of the NationalAcade7ny of Sciences of t7ze U.S.A.926733-6737.)。为了协助发现转化细胞，筛选标记(如新霉素和β半乳糖苷酶)可被包括入并且转基因的表达可通过加入内部核糖体位点而增加(Saleh，M.(1997).Human Gene Tlterapy 8979-983.)。逆转录病毒载体可实现的携带能力约为7.5kb(Verma，I.M.and Somia，N.(1997).Nature 389239-242.)，而即使是在使用cDNA的情况下，这一携带能力对于很多基因来说仍然太小。
逆转录病毒包膜与特定的细胞蛋白反应来确定靶细胞的范围。已经证实改变env基因或其产物可成功操控这一范围。具体方法包括对包膜蛋白和细胞受体结合部位的直接修饰，但这些步骤似乎会影响接下来的病毒颗粒内化(Harris，J.D.and Lemoine，N.R.(1996).Trendsin Genetics 12400-404.)。通过以红细胞生成素蛋白(EPO)的150个密码子替代env基因的一部分，Kasahara等人(Kasahara，N.，Dozy，A.M.and Kan，Y.W.(1994).Science 2661374-1376.)构建的病毒颗粒能以很高的亲和力作用于具有EPO受体的细胞。连接抗体于病毒颗粒，抗体通过链亲和素桥对第二个细胞特异性抗体产生亲和力，增加了病毒的摄取，但内化倾向于导致病毒降解(Roux，P.，Jeanteur，P.，and Piechaczyk，M.(1989).Proceedings of the National Academy ofSciences USA 869079-9083.)。Neda等人(Neda，H.，Wu，C.H.，andWu.G.Y.(1991)The Journal of Biological Chenaistry 26614143-14146.)以乳糖处理病毒颗粒导致表达唾液酸糖蛋白受体的细胞摄取病毒颗粒，主要为肝细胞。接下来病毒转基因高效表达，可能由于内涵体的酸化使病毒包膜与内涵体膜得以相互融合。
病毒根据其趋化性不同而不同，因此在一种叫做假型的技术中以另一种病毒的env基因取代一种病毒的env基因将扩展其宿主范围。疱疹性口炎病毒G蛋白被包括入Mo-MLV衍生载体(Burns，J.C.，Matsubara，T.，et al.(1994).Developmental Biology 165285-289.)，该载体同样在以超离心方法纯化更为稳定。最近，Qing(Qing，K.，Bachelot，T.，Mukherjee，P.，et al.(1997).Journal of Virology 715663-5667.)通过首先以表达逆转录病毒包膜蛋白的细胞受体的腺相关病毒载体(讨论如下)处理受体细胞改良了向许多细胞系转导的方法。
逆转录病毒整合和表达病毒基因需要靶细胞进行分裂。这就将基因治疗限制于体内或体外的增殖细胞，由此细胞从体内移出，处理以刺激复制，然后用逆转录病毒载体转导，最后转回患者体内。由于暴露于高滴度的病毒和生长因子，细胞在体外能够更为有效的被转导(Glimm，H.，Kiem，H.P.，et al.(1997).Human Gene T7zerapy 82079-2086.)。此外，体外处理的肿瘤细胞会与肿瘤结合并发挥肿瘤杀伤效应(Oldfield，E.H.and Ram，Z.(1995).Human Gene Therapy655-85.；Abdel-Wahab，Z.，Weltz，C.，et al.(1997).Cancer 80401-412.)。
慢病毒为逆转录病毒的一个亚类，可感染增殖和非增殖细胞。它们较简单逆转录病毒更为复杂，还包含其他6个蛋白，tat、rev、vpr、vpu、nef和vif。目前包装细胞系已将质粒分离为假分型env基因、转基因构建体和以反式提供结构和调节基因的包装构建体(Naldini，L.，Blmer，U.，et al.(1996).Scienee 272263-267)。利用标记基因的早期结果很有价值，显示在体内肌肉、肝脏和神经组织中的表达时间延长(Blmer，U.，Naldini，L.，et al.(1997).Journal of Virology 716641-6649.；Miyoshi，H.，Takahashi，M.，Gage，F.H.and Verma，1.M.(1997).Proceedingsof the National Academy of Sciences of the U.S.A.9410319-10323.；Kafri，T.，Blmer，U.，et al.(1997).Nature Genetics17314-317)。有趣的是，转基因由内部设计的巨细胞病毒启动子驱动，而不像在MoMLV载体中，是未经灭活的。这可能是由于对载体注入的有限的炎症反应，炎症反应的强度与盐水对照组相同(Blmer，U.，Naldini，L.，Kafri，T.，Trono，D.，Verma，1.M.and Gage，F.H.(1997).Journal of Virology 716641-6649)。
使用的慢病毒载体来自人类免疫缺陷病毒(HIV)并已经过安全性评测，去掉了其中一些非必需调节基因。Vpr和vif突变株可以较低的效率感染神经元细胞，但不能感染肌肉或肝细胞(Blmer，U.，Naldini，L.，Kafri，T.，Trono，D.，Verma，I.M.and Gage，F.H.(1997).Journal of Virology 716641-6649；Kafri，T.，Blmer，U.，et al.(1997).Nature Genetics 17314-317.)。
在一个具体的实施方案中，使用了逆转录病毒载体pLXIN、pSIR、pLXSH、pLNCX、pLAPSN、pFB和pFB-Neo。
单纯疱疹病毒载体任何单纯疱疹病毒载体可被用于转染细胞和/或细胞系以表达和/或分泌免疫调节剂。单纯疱疹病毒1型(HSV-1)为人类嗜神经性病毒，因此人们主要关注如何将HSV-1作为载体向神经系统导入基因。野生型HSV-1病毒能感染神经元细胞并进入溶细胞生命周期或持续作为核内附加体存在进入潜伏状态。潜伏感染的神经元细胞可正常行使功能并不被免疫系统所排斥。虽然潜伏的病毒在转录水平几乎是静止的，它却具有神经元特异性启动子，可在潜伏期内启动。针对HSV-1的抗体在人群中很常见，然而疱疹感染的并发症，如脑炎，非常罕见。
病毒基因组为152kb的线性双链DNA分子。它有两个独特的区域，长区域和短区域(叫做UL和US)，二者由内部重复序列(IRL和IRS)以任何方向连接。在独特区域的无连接端为末端重复序列(TRL和TRS)。有将近81个基因(Marconi，P.，Krisky，D.，et al.(1996).Proceedings of the National Academy of Sciences USA 9311319-11320.)，其中约半数对于在细胞培养中生长是非必需的。一旦去掉这些非必需基因，该病毒可插入40-50kb的外源性DNA(Glorioso，J.C.，DeLuca，N.A.and Fink，D.J(1995).Annual Review of Microbiology49675-710.)。已经发现三种主要类型的HSV-1基因，叫做即刻早期基因(IE或α)基因、早期(E或β)基因和晚期(L或γ)基因。
易感细胞感染后，溶解性复制由基因转录暂时性调整序列调节。Vmw65(被膜结构蛋白)激活即刻早期基因(IP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP477)，后者为反式激活因子，允许早期基因的产生。早期基因为核苷代谢和DNA复制编码基因。晚期基因被早期基因激活并编码结构蛋白。整个周期耗时小于10小时并不可避免的导致细胞死亡。
导致潜伏状态的分子事件还未完全确定。潜伏期内的基因表达由基因组IRL区的潜伏相关转录子(LATs)驱动。两个LATs(2.0kb和1.5kb)以IE基因ICP0相反的方向转录。LATs在HSV-1从潜伏期内再次活化(Steiner，I.，Spivack，J.G.，et al.(1989).EMBO Journal 8505-511.)和进入潜伏状态中起作用(Sawtell，N.M.and Thompson，R.L.(1992).Journal of Virology 662157-2169.).已经发现两个驱动LATs表达的潜伏活化启动子(Marconi，P.，Krisky，D.，et al.，(1996).Proceedings of the National Acadenzy of Sciences USA 9311319-11320.)并可能对于载体转基因表达有作用。
两种基本方法被用于产生HSV-1载体，即扩增子和重组HSV-1病毒。扩增子为从细菌中产生的质粒，含有col E1 ori(大肠杆菌来源的复制)，OriS(HSV-1来源的复制)，HSV-1包装序列，转基因受控于即刻早期启动子和一个可选择性标记(Federoff，H.J.，Geschwind，M.D.，Geller，A.I.and Kessle r，J.A.(1992).Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 891636-1640.)。扩增子转染入含有辅助病毒(温度敏感变异株)的细胞系，辅助病毒以反式提供所有缺失的结构和调节基因。将辅助病毒和包含病毒颗粒的扩增子导入受体。最近的扩增子包括来源于EB病毒的序列以维持质粒基因的游离状态(Wang，S.and Vos，J.(1996).Journal ofVirology 708422-8430.)。
重组病毒通过去掉一个即刻早期基因如ICP4，以反式提供，而失去复制能力。虽然它们的致病性减弱并可实现转基因在脑组织中的表达，但在细胞培养中它们对神经元是有毒性的(Marconi，P.，Krisky，D.，et al..(1996).Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 9311319-11320.)。去掉数个即刻早期基因可相当大的降低细胞毒性，并使得在野生型潜伏病毒中静止的启动子驱动的表达成为可能。这些启动子也许对于介导长期基因表达是有用的。
复制条件变异株只能在特定的细胞系中复制。这些细胞系都处于增殖状态中并且可提供一种细胞酶来补足病毒缺陷。变异株包括胸苷激酶(During，M.J.，Naegele，J.R.，OMalley，K.L.and Geller，A.1.(1994).Science 2661399-1403.)、核糖核酸酶还原酶(Kramm，C.M.，Chase，M.，et al.(1997).Hiiniaii Gene Therapy 82057-2068.)、UTPase或神经毒性因子g34.5(Kesari，S.，Randazzo，B.P.，et al.(1995).Laboratory Investigation 73636-648.)。
非病毒载体病毒载体都将引起某种程度的免疫反应并且可能有安全性方面的危险(如插入突变和毒性问题)。此外，它们的容量有限并且很难实现大规模生产。因此，在本发明的一个实施方案中，使用了基因转移的非病毒方法，该方法只要求很少数的蛋白，其实际容量是无限的，无感染或基因突变能力，并且通过使用药物学技术可实现大规模生产。有三种非病毒DNA转移方法，即裸DNA、脂质体和分子耦联体。
裸核酸裸DNA或核酸可被用于向宿主导入免疫调节剂。例如，它可以可直接注入肌细胞的质粒形式导入(Wolff，J.A.，Malone，R.W.，Williams，P.，Chong，W.，Acsadi，G.，Jani，A.and Felgner P.L.(1990).Science 2471465-1468.)或粘附于轰击入组织中的金颗粒上(Cheng，L.，Ziegelhoffer，P.R.and Yang，N.S.(1993).Proceedings of theNational Academy of Sciences of the U.S.A.904455-4459.)。“裸”核酸，DNA或RNA这一术语指游离于任何具有辅助、增强或辅助进入细胞功能的输送载具的序列，包括病毒序列、病毒颗粒、脂质体制剂、阳离子脂质体或沉淀剂等。虽然不是非常有效，但可导致体内低水平表达时间延长。不像其他基因治疗技术，向靶细胞引入裸核酸序列的一个主要优点为细胞内免疫调节剂合成的瞬时特点。研究表明非复制DNA序列可导入细胞生产所需得到的免疫调节剂长达六个月。这一方法的简单性，和持续表达导致DNA疫苗的发展。与常规减毒和以蛋白质为基础的疫苗相比，它们不受既存免疫(如来源于母亲的抗体)的影响，相对便宜，并可通过单个质粒提供多个病原体抗原(Manickan，E.，Karem，K.L.，and Rouse，B.T.(1997).CriticalReviews in Immunology 17139-154.)。正在发展针对那些目前还没有疫苗的病原体，如HIV(Lekutis，C.，Shiver，J.W.，Liu，M.A.，andLetvin，L.N.(1997).The Journal of Inan uyzology 1584471-4477.)或目前的疫苗不是非常有效，如流感(Macklin，M.D.，McCabe，D.，etal.(1998).Journal of Virology 721491-1496.)的DNA疫苗.利用一个高度保守基因，Ulmer等人(Ulmer，J.B.，Donnelly，J.J.，et al.(1993).science 2541745-1749.)免疫小鼠抵抗两种不同血清型流感病毒株。然而，大多数情况下，DNA疫苗并未显示优于现有疫苗(Macklin，M.D.，McCabe，D.，et al.(1998).Journal of virology 721491-1496)。免疫反应的具体类型可通过共转化一个编码合适细胞因子的基因控制(Xiang，Z.and Ertl，H.C.(1995).Immunity 2129-135.)并且这一方法可能对改变不适宜的免疫反应有作用(Manickan，E.，Karem，K.L.，and Rouse，B.T.(1997).Critical Reviews in Immunology 17139-154.).裸DNA的其他利用包括癌症的免疫强化(讨论如下，Corr.M.，Tighe，H.，Lee.D.，Dudler，J.，et al.(1997).The Journal ofLaboratory Investigation 1594999-5004.)，修复胰腺的胰岛素功能(Goldfine.1.D.，German，M.S.，Tseng，H.，et al.(1997).NatureBiotechnology 151378-1382.)，及刺激侧支血管形成(Takeshita，S.，Tsurumi，Y.，et al.(1996).Laboratory Investigation 75487-501.)。肌肉组织内基因产物的表达可通过同时注入胶原酶、罂粟碱和创造缺血环境而增加(Budker，V.，Zhang，G.，Danko，I.，Williams，P.AndWOLFF，J.(1998).Gene therapy5272-276)。使用肌细胞特异性启动子(Skarli，M.Kiri，A.，et al.(1998)Gene Thearapy 5514-520.)和其他基因内调控序列，如多聚A和转录终止序列(Hartikka，J.，Sawdey，M.，et al.(1996).Huamn Gene Therapy 71205-1217.)也可增加转基因的表达。
对于裸多肽注射，有效DNA或RNA剂量在0.05g/kg体重到大约50mg/kg体重的范围内。优选剂量为0.005mg/kg到大约20mg/kg，更加适宜的剂量范围为0.05mg/kg到大约5mg/kg。当然，正如一般技术人员所意识到的那样，这一剂量将随着注射组织的不同而不同。适宜和有效剂量的核酸序列可很容易的由本领域的一般技术人员确定，并可能随着治疗情况和给药途径而发生改变。给药途径为胃肠外途径，将药物注入组织间隙，也可使用其他胃肠外途径，如，吸入气雾剂，尤其当需要向肺部或气管组织，咽喉或鼻粘膜给药时。另外，裸多肽结构可在血管成形术中通过术中使用的导管向血管内给药。
免疫调节剂还可以脂质体的形式输送(如Feigner P.L.et al.(1995)Ann.NY Acad.Sci.772126-139 and Abdallah B.et al.(1995)Biol.CelJ 85(1)1-7)，脂质体的制备方法在本领域的技术人员中是众所周知的。脂质体为双层脂肪夹着一部分水样液体。DNA会自动与阳离子的脂质体(根据其电荷)的外表面结合，这些脂质体会与细胞膜作用(Felgner，J.H.，Kumar，R.，et al.(1994).Journal of BiologicalChemistry 2692550-2561.)。在体外，一些特定细胞系的高达90％可被转染。通过在阳离子脂质体中加入少量阴离子脂质，DNA可被加入脂质体的内表面，从而保护其免于酶解。(Crespo et al，1996，citedin Alio，S.F.(1997).Biochemical Pharmacology 549-13.)。为了协助作为内涵体摄入细胞，目标蛋白被包入脂质体中，如抗MHC抗体(Wang，C.，and Huang，L.(1987).Proceediugs of the NationalAcademy of Sciences USA 847851-7855.)、转铁蛋白(Stavridis，J.C.，Deliconstantinos，G.，et al.(1986).Experimeiztal Cell Research164568-572.)和仙台病毒或其F蛋白(Dzau，J.V.，Mann，M.J，Morishita，R.and Kaneda，Y.(1996).Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 9311421-11425)。仙台病毒另外还允许质粒DNA逃离内涵体到胞质中，从而避免了降解。加入DNA结合蛋白(28kDa高移动性组蛋白1)通过将质粒带进核内而增强了转录()。
分子耦联体由蛋白或合成配体组成，其上连接DNA结合剂。通过使用与脂质体中类似的技术可改善向细胞内的输送过程。目标蛋白包括唾液酸糖蛋白(Wagner，E.，Cotten，M.，Foisner，R.and Birnstiel，M.L.(1991).Proceedings of the National Academy of Sciences USA 884255-4259.)、转铁蛋白(Wu，C.H.，Wilson，J.M.and Wu.，G.Y.(1989).Journal of Biological Chemistry.26416985-16987，)、多聚IgA(Ferkol，T.，Kaetzel，C.S.and Davis，P.B.(1993).Journal of ClinicalInvestigation 922394-2400.)和腺病毒(Madon，J.and Blum，H.E.(1996).Hepatology 24474-481)。转基因表达倾向于为瞬时的并受制于内涵体/溶酶体降解。
本发明的说明性和非限制性的例子提供如下。这些例子并非用于限制本发明的适用范围。
实施例此处使用的缩写意义如下Ad IFN表达土拨鼠γ干扰素的腺病毒载体Ad RFP无土拨鼠γ干扰素基因的腺病毒载体CCC DNA 共价闭环病毒形DNADNA 脱氧核糖核酸FTC 5-氟-1-(2R，5S)-1，3-氧硫杂戊环-5-基]胞嘧啶GFP 绿色荧光蛋白HBV 乙型肝炎病毒IFN 干扰素L-FMAU1-(2-氟-5-甲基-，L-阿糖呋喃基)胸腺嘧啶M1，M2开始治疗后第一个或第二个月PCNA 增殖细胞核抗原
PCR多聚酶链式反应Pfu空斑形成单位RFP红色荧光蛋白RI 复制中间产物RT 逆转录TUNEL 末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记分析WHV土拨鼠乙型肝炎病毒实施例1L-FMAU和β-L-FTC给药总体上，β-L-FTC按照Cullen等人之前描述的模型给药(Cullen etal.Antimicrob.Agents Chemother.1997，41，2076-2082)。具体的，β-L-FTC以30mg/kg腹腔给药。
在使用L-FMAU的试验中，该化合物通过腹腔给药，药物浓度如Peek等人的描述(Peek et al.Hepatology 2001，33，254-66)and Zhuet al.(Zhu et al.J.Virol.2001，75，311-22)(10mg/kg)。
动物土拨鼠乙型肝炎病毒感染模型代表了一个评价抗病毒药物的有用模型，因为它模拟了慢性乙型肝炎感染患者中观察到的病毒感染过程。几项研究显示这一动物模型用于研究新的核苷类似物是可靠的，尤其是抗病毒效力和毒性。
捕获的土拨鼠繁殖的12头约1岁的土拨鼠(Marmotta donax)慢性感染WHV被用于体内试验。治疗从2000年6月开始持续到12月。
当注入腺病毒后，在腺病毒注入后的10天内每天收集血样，此后每周两次。这些血样将如下述进一步接受病毒标记物检测。干扰素基因输送系统(Dr.Nassal，Freiburg，Germany)腺病毒载体按照He等人介绍的方法获得(He，T.C.，et al.ProcNatl Acad Sci U.S.A.1998，95，2509-14)。腺病毒载体因为去掉了E1和E3区而发生复制缺陷。重组盒，其前-γ干扰素基因的编码盒(aa1-143)受控于CMV启动子，与受控于SV40启动子的eCFP报告基因一起，插入最初的E1区(454-3500)(图1)。活性土拨鼠γ干扰素产生效率通过其保护土拨鼠细胞系WCH17免于感染VSV的能力评价。
只含有pSV40-eCFP盒的相同腺病毒载体作为对照。腺病毒载体通过静脉注射方式给药并作用于肝脏。注入载体浓度为3×107到3×1011pfu/动物，以磷酸盐缓冲液(PBS)稀释。
实施例2评价L-FMAU+β-L-FTC+Ad IFN从Northeastern Wildlife(南普利茅斯，纽约)购进18头试验性感染WHV的土拨鼠(Marmota monax)。土拨鼠为慢性感染，并被用于体内试验。
β-L-FTC(30mg/kg)和L-FMAU(10mg/kg)腹腔给药。第一周内每天注射，接下来7周，隔日注射。
土拨鼠γ干扰素(IFN)基因的一个新的重组盒受控于CMV启动子，与受控于SV40启动子的eRFPnuc基因一起，插入最初的腺病毒载体E1区(Ad IFN)。只含有pSV40控制的eGFPnuc的相同腺病毒载体作为对照(AdGFP)(由Dr.Michael Nassal，University ofFreiburg，Germany提供)。
对于这些试验，以3×1010pfu/动物的浓度静脉注射表达土拨鼠γ干扰素的重组腺病毒载体两次(在第4周和第8周时)。病毒接种在之前2001年8月美国麻省Amherst举行的HBV大会公布的研究中被证实(见图2)。
在治疗过程中，每两天留取血样，注射Ad IFN后的5天每天一次留取血样。停药后，每两天收集血样直到病毒负荷量开始上升，然后每周一次，然后每月两次。
实施例3肝脏活检手术肝脏活检于治疗前(TO)在全身麻醉下，行腹腔镜后进行，治疗中进行两次(M1、M2)和停药后4个月(M3)一次。治疗中活检在每次注射腺病毒4天后进行。每份样本的一部分贮存于-80℃以备进行病毒DNA分析。另一部分以福尔马林固定并包埋于石蜡中行肝脏组织学和免疫染色。最后一部分以1％的四氧化锇固定行电镜分析(TO和M2)。在手术时还需进行大体肝脏检查。
肝内病毒DNA合成分析来自感染的土拨鼠的肝内病毒DNA在行肝脏活检时提出。在10mM Tris-HCl(pH7.5)，10mMEDTA中匀浆化后，肝脏标本被分为两部分，一部分用于分离总病毒DNA(在蛋白激酶K消化后，酚-氯仿抽提后乙醇沉淀)，另一部分用于分离非蛋白结合共价闭环(CCC)病毒DNA(在SDS-KCl沉淀蛋白结合DNA后，酚-氯仿抽提，然后乙醇沉淀)。为了使每一用作Southern印迹分析的标本中的DNA含量标准化，DNA浓度由紫外分光光度计确定并与之前琼脂糖凝胶电泳分析后的定量DNA比较。5微克的相当于总DNA或CCCDNA的核酸标本用于在1.2％的琼脂糖凝胶上进行电泳分析，碱转移印迹到尼龙膜上，病毒DNA通过上述特异性杂交方法检测。
肝脏组织学分析福尔马林固定的肝脏活检组织切片以苏木精-伊红-番红(HES)染色并以光学显微镜检查。利用Metavir评分半定量评价肝细胞坏死程度(嗜酸性小体)，门管及小叶内部炎症程度和纤维化分期(Hepatology.1994；20(1 Pt1)15-20)。肝脏活检切片还用于评价脂肪变性、小管增生、肝细胞异型增生和肝细胞癌。
肝脏组织学检查显示在接受Ad IFN或Ad GFP载体的两组动物中类似的肝炎急性恶化，而在未经治疗动物中观察到轻度炎症反应。
多克隆抗WHV抗体注射前和注射后第5天的肝脏活检切片免疫染色研究显示在土拨鼠A37和A36中，感染肝细胞数量明显减少。
实施例4病毒血症分析斑点杂交分析病毒血症通过定量检测土拨鼠乙型肝炎病毒(WHV)DNA评价。利用HighPure PCR模板DNA抽提试剂盒(Roche Daignostics)从血清中提出WHV DNA，以WHV DNA标准的系列稀释液将相当于50μL血清的样本点于膜上(Biodyne B，0.45uM，Merek Eurolab)。在经过固定后，滤器与32P标记的全长WHV DNA探针杂交。利用ImageQuant软件进行磷光影像(phosphoImager)扫描仪(AmershamPharmacia Biotech)的比较分析。该试验的检测阈值为6.107拷贝/mL(200pg/mL)。
内源性聚合酶分析(EPA)利用WHV颗粒以内源性聚合酶分析方法(EPA)确定Ad IFN对于病毒正链DNA合成的作用。为了比较，DNA依赖性DNA聚合酶抑制剂、膦甲酸(PFA)作为对照。内源性聚合酶活性与含有松环DNA的成熟颗粒中病毒正链DNA的完成相关。WHV相关DNA聚合酶活性通过混合50μL部分纯化的病毒颗粒和25μL含有(i)dATP，dCTP，dGTP(每种100μL)and3H-dTTP(0.17uM)的反应缓冲液((Tris-HCl50mM pH7.6，MgCl240mM，NH4Cl 60mM，NP40 0.5％，β-巯基乙醇10mM)测定。酶检测按照Hantz等人介绍的方法进行(HantzO，et al.1992 Virology.Sep；190(1)193-200)。简要的说，酶反应在37℃孵育3小时并点于GF/C纤维玻璃滤膜(Whatman)上，以5％的三氯醋酸充分洗涤。掺入3H-dTTP的量以Beckman LS 6000SC闪烁计数器测定。该试验的检测阈值为1,000cpm/mL。
实时PCR分新(Light Cycler)对于病毒滴度太低不易以斑点杂交方法检测的病例，可使用实时PCR技术(参见例如Dandri等人，Hepatology 2000，32，139-46)。已知实时PCR技术可以检测少到10个拷贝的人类HBV DNA。因此，为了完成病毒血症的分析，实时PCR用于检测6×107拷贝/ml(200pg/ml)以下的WHV DNA。相同的WHV DNA标准被用于斑点杂交分析和实时PCR分析。对斑点杂交阳性的标本行PCR检测获得相似的数值。该方法检测的下限为25WHV拷贝/μl。
3只土拨鼠病毒清除和反跳动力学实时PCR研究的初步结果在图10中给出。病毒滴度显示达到低值0.320pg/ml，代表平均为9×104拷贝/ml。该技术还可进一步用于动物标本，确定β-L-FTC单独或与免疫调节剂，如Ad IFN，联合使用的疗效。
实施例5确定接种物滴度为了确定抗病毒疗效及对腺病毒载体接种物的耐受性，4只动物接受静脉内注射Ad-IFN，浓度分别为3.107(A33)、3×109(A30)和3×1011pfu(A32和A34)。
最高接种物滴度(3.1011pfu)引起病毒载量的显著下降，然而，全部2只动物分别于注射后第2天和第5天死亡(WHV DNA在0天到死亡之日间下降分别为147ng/ml到70ng/ml及1067ng/ml到265ng/ml)。3×109pfu接种物引起持续6天的瞬时下降，从70ng/ml降至约30ng/ml。最低接种物浓度未引起病毒血症的明显下降(图3)。
实施例6疗效研究评价Ad IFN载体的抗病毒效果五只土拨鼠(A35，A36，A37，A38，A42)接受3×109pfu完全Ad IFN载体。对照组有2只土拨鼠(A39，A40)接受3×109pfu Ad GFP载体，1只土拨鼠(A41)未接受任何治疗(图4和5)。
在Ad IFN治疗组中，在接种腺病毒后，在5只动物中的3只中观察到瞬时WHV DNA下降(A35从46ng/ml到20ng/ml；A37从76到20ng/ml；A42从20到5ng/ml)。WHV DNA结果还以EPA评价(图4和5)。肝内WHV DNA Southern印迹杂交显示病毒DNA(从16到76％，除了A42)及CCC DNA水平(从2到76％)明显下降(图6)。
实施例7评价L-FMAU和β-L-FTC结果显示病毒血症显著受抑，降低约4到5个对数单位，在所有接受β-L-FTC、L-FMAU和Ad IFN治疗的动物中降至斑点杂交分析的检测阈值(6.107拷贝/ml)(图7)。然而，对照组(未经治疗，Ad GFP)或单独以Ad IFN治疗的土拨鼠显示病毒血症无显著变化(图8和9)。
治疗引起的病毒载量的下降非常快。病毒血症在治疗开始的一到两周内降至检测不出的水平(＜6.107/ml)。
接受β-L-FTC、L-FMAU和Ad IFN治疗的动物的病毒血症在治疗停止后持续抑制不同长度的一段时间。此外，治疗动物的病毒载量不会恢复到治疗前水平。两只接受L-FTC、L-FMAU和Ad IFN治疗的土拨鼠(A52和A49)的病毒血症水平在第28周时仍然检测不到(药物治疗停止后6个月)。
与免疫调节剂联合治疗的结果显示病毒血症水平快速、显著降低(两周内平均降低5log10)。相对于只使用β-L-FTC和L-FMAU的结果，其下降更为显著。在之前的研究中，血清中病毒滴度在相同的时间框内分别降低约56和1,000倍。这一观察结果显示当与免疫调节剂结合时，β-L-FTC和L-FMAU的抗病毒活性增强。另外，这种抗病毒效应随时间延长，病毒反跳延迟。在斑点杂交分析中(＜6.107拷贝/ml)，病毒血症在停药后6到7个月，在两只动物(A49和A52)血清中仍然测不出。这种延长的效应与CCC DNA水平的下降一致(分别为-69％和-75％)。治疗停止后病毒复制反跳的延迟反映了通过重新感染新的肝细胞和/或重新扩增感染细胞内现存细胞内CCC DNA池而重建CCC DNA池所需的时间。
肝内CCC DNA肝内病毒DNA Southern印迹分析(图11)显示肝内WHV复制中间产物水平的改变，后者与病毒血症模式相一致。β-L-FTC和L-FMAU治疗组都观察到病毒DNA合成水平显著降低，相对于治疗前水平，肝内病毒DNA中间产物水平降低了82到93％(图12和13)。虽然CCC DNA在M1和M2时在肝脏中持续存在，其他WHV DNA复制中间产物下降十分显著。
此外，在L-FMAU/β-L-FTC双药治疗中，CCC DNA也降低了24到47％。然而，L-FMAU/β-L-FTC对WHV复制的抑制并不导致肝内病毒CCC DNA的清除，如southern印迹分析所示。
然而在未经治疗的土拨鼠中，总的或CCC DNA随时间而分别增加+64％和+77％(图14)。
与Cullen等人(Cullen et al.Antimicrob.Agents Chemother.1997，41，2076-2082)、Zhu等人(Zhu et al.J.Virol.2001，75，311-22)和Peek等人(Peek et al.Hepatology 2001，33，254-66)的结果相比较，β-L-FTC与IFN和L-FMAU联合使用有显著的抗病毒效应。治疗开始一个月后，肝内复制中间产物降至无法测出的水平。相对的，肝内CCC DNA水平相对复制DNA的下降速度低许多。联合应用β-L-FTC和L-FMAU降低病毒CCC DNA 40％(DNA复制中间产物降低98％)。这一效应可能由于L-FMAU单独使用的抗病毒效应，如Peek等人说明的那样(Peek et al.Hepatology 2001，33，254-66)，who showed anaverage 10-fold decrease in CCC DNA)。然而，单药L-FMAU治疗后8到9个月，将出现WHV耐药株(Zhou，T.，et al.J.Vison.2000，74，11754-63)。L-FMAU与β-L-FTC联合使用可避免出现耐药株，以实现长期治疗消除CCC DNA残余池。
实施例8肝内WHV DNA合成与联合治疗的结果不同，Ad IFN单独不会影响肝内总病毒和CCCDNA水平(相对于Ad GFP组总DNA的+43％分别为+44％和-6％)(图15)。
实施例9评价重组腺病毒载体转导肝细胞为了确定被腺病毒感染的肝细胞的数目，以针对绿色荧光蛋白(GFP)的商用抗体进行免疫染色。然而，当与对照组比较时，观察到的荧光并不特异，这可能是因为肝细胞或胆色素产生自然荧光。
实施例10组织学检查接受β-L-FTC联合治疗的动物肝脏活检切片显示肝内炎症反应及小叶损伤。接受Ad IFN治疗组的所有土拨鼠显示炎症活动度增加(图15)。在该组的6份活检标本中观察到Metavir评分表示的最大炎症活动度。与之相比，接受L-FMAU和β-L-FTC治疗组并未显示类似的结果。该组的6只土拨鼠中只有3只显示炎症活动度增高。对照组中，甚至在单独接受Ad IFN治疗组中，Metavir评分稳定。
实施例11病毒血症分析病毒血症可以斑点杂交分析WHV DNA方法分析并在病毒血症恢复到治疗前水平前以射线影像分析仪定量分析。
如需确认病毒已被清除，在PCR条件下从血清中抽提的DNA以斑点杂交分析方法应该测不出(病毒血症在6.107拷贝/ml以下)。此外，DNA必须通过实时PCR(Light Cycler)检测。在这些例子中，对实时PCR检测方法进行了改进以利用特异性引物对WHV检测DNA。
实施例12肝内病毒DNA合成分析对治疗后5个月时的肝脏活检标本切片利用southern印记杂交进行分析，分析肝内病毒DNA合成。
实施例13WHV聚合酶基因测序可在PCR扩增PreS和RT区后对循环病毒的基因组序列进行分析，以确定抗病毒方法是否已经筛选出逃逸变异株。
在治疗末期或动物死亡前的最佳时期收集血清，通过PCR扩增WHV DNA。血清中的DNA以Taq聚合酶和特异性引物对(5′-AGATTGGTTGGTGCACTTCT-3’(核苷酸385到403)和5′-ATTGTCAGTGCCCAACA-3′(核苷酸1468到1461)扩增35个循环((94℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 1min)，引物相当于逆转录酶基因的B和C区，参考此前发表的序列。为了确认无病毒DNA存在，对第一轮扩增中阴性的标本以另一对引物对进行巢式PCR，在此处为5′-GGATGTATCTGCGGCGTTT-3′(核苷酸510到528)和5′-CCCAAATCAAGAAAAACAGAACA-3′(核苷酸953到931)。
实施例14电镜检查肝线粒体以溶于150mM二甲基胂酸钠HCI(pH7.4)的1％四氧化锇固定肝脏活检切片，在不同浓度的乙醇中脱水，包埋于甲醇乙酸双氧铀和柠檬酸铅中，以1200EX透射电镜分析，以排除β-L-FTC联合治疗的线粒体毒性。
实施例15GFP或RFP显影感染腺病毒载体的细胞数可通过使用合适滤波片的共聚焦显微镜直接观察5微米厚的脱蜡肝脏组织切片监控。
实施例16评价WHV感染的肝细胞数目WHV感染细胞数可通过表面和衣壳蛋白免疫染色进行监控。具体步骤为将5微米厚的脱蜡肝脏组织切片与含有针对WHV核心或前S蛋白的多克隆抗体的兔血清孵育过夜。之后切片与生物素标记的山羊抗兔IgG共同孵育。抗原抗体复合物以链亲和素-辣根过氧化物酶显示。表达病毒蛋白的感染肝细胞定量检测在肝脏切片有代表性的区域进行。
实施例17肝细胞更新分析发生凋亡的肝细胞数可通过TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记)法确定(Kerr，J.F.R.，Wyllie，A.H.andCurrie，A.R.1972 Br.J.Cancer 26239-257)。细胞有丝分离周期中的肝细胞数目可通过PCNA免疫染色确定。
本发明参考其优选实施方案进行了介绍。对本领域的技术人员来说，根据本发明前述的详细说明对本发明进行改变和修改是显而易见的。所有这些改变和修改都包括于本发明的范围中。
权利要求
1.一种治疗或预防人类感染乙型肝炎病毒的方法，其包括联合或交替给予独立地任选地处于药用可接受载体中的有效剂量的β-L-FTC；L-FMAU；和干扰素；或它们的药用可接受的盐或药物前体。
2.权利要求1的方法，其中β-L-FTC为基本纯的形式。
3.权利要求1的方法，其中按β-L-异构体的重量β-L-FTC至少占90％。
4.权利要求1的方法，其中按β-L-异构体的重量β-L-FTC至少占95％。
5.权利要求1的方法，其中干扰素选自干扰素α、聚乙二醇化干扰素、干扰素α-2a、干扰素α-2b、聚乙二醇化干扰素α-2a、聚乙二醇化干扰素α-2b ROFERON-A(干扰素α-2a)、PEGASYS(聚乙二醇化干扰素α-2a)、INTRONA(干扰素α-2b)、PEG-INTRON(聚乙二醇化干扰素α-2b)、干扰素β、干扰素γ、干扰素ι、干扰素ω、一致干扰素、INFERGEN(干扰素alphacon-1)、OMNIFERON(天然干扰素)、REBIF(干扰素β-1a)、ω干扰素、口服干扰素α、干扰素γ-1b、SuperFeron(天然人多亚型IFN-α)和HuFeron(人IFN-β)。
6.权利要求5的方法，其中干扰素为干扰素α。
7.权利要求5的方法，其中干扰素为干扰素γ。
8.权利要求5的方法，其中干扰素为干扰素β。
9.独立地任选地处于药用可接受载体中的β-L-FTC、L-FMAU和干扰素或它们的药用可接受的盐或前体的联合在治疗感染乙型肝炎病毒的宿主中的用途。
10.权利要求9的用途，其中β-L-FTC为基本纯的形式。
11.权利要求9的用途，其中按β-L-异构体的重量β-L-FTC至少占90％。
12.权利要求9的用途，其中按β-L-异构体的重量β-L-FTC至少占95％。
13.权利要求9的用途，其中干扰素选自干扰素α、聚乙二醇化干扰素、干扰素α-2a、干扰素α-2b、聚乙二醇化干扰素α-2a、聚乙二醇化干扰素α-2b ROFERON-A(干扰素α-2a)、PEGASYS(聚乙二醇化干扰素α-2a)、INTRONA(干扰素α-2b)、PEG-INTRON(聚乙二醇化干扰素α-2b)、干扰素β、干扰素γ、干扰素ι、干扰素ω、一致干扰素、INFERGEN(干扰素alphacon-1)、OMNIFERON(天然干扰素)、REBIF(干扰素β-1a)、ω干扰素、口服干扰素α、干扰素γ-1b、SuperFeron(天然人多亚型IFN-α)和HuFeron(人IFN-β)。
14.权利要求13的用途，其中干扰素为干扰素α。
15.权利要求13的用途，其中干扰素为干扰素γ。
16.权利要求13的用途，其中干扰素为干扰素β。
全文摘要
L－FMAU与FTC及干扰素，如干扰素α或干扰素γ联合/或轮流使用治疗乙型肝炎病毒感染疗效更优。
文档编号A61K38/21GK1681518SQ03821877
公开日2005年10月12日 申请日期2003年7月11日 优先权日2002年7月15日
发明者P·A·福尔曼 申请人:基利得科学公司