专利名称：人参皂甙单体Rb的制作方法
技术领域：
本发明属于生物制品在制药中的应用。
背景技术：
心脏机能受体内神经，体液等因素的影响，可能导致疾病的发生。内皮素-1是近年来新被发现的生物活性物质，在体内若过量的分泌能引起细胞内Ca2+超负载，致使细胞的损伤，导致各种疾病的发生。这表明血浆内皮素含量增高与疾病的发生有密切的关系。目前虽有内皮素合成抑制剂，内皮素生物效应拮抗剂，如钙通道阻断剂(硝苯地平、维拉帕米、尼索地平、非洛地平、氨氟地平、米贝拉地尔等)一些研究报道，但是这些都没有在心肌细胞离子通道水平用于研究对抗内皮素-1导致的钙超负载及心肌细胞损伤作用。更没有研究人参皂甙单体Rb1对抗内皮素-1引起的心肌细胞L-型钙通道紊乱致钙超负载导致心肌细胞损伤的保护作用。因此，迫切的需要开发在离子通道水平的高效、无毒的一类新药中药即新型的钙通道阻断剂。
发明内容
本发明的目的是在离子通道水平提供新型的拮抗内皮素-1的钙通道阻断剂，即提供一种新药，该药对内皮素导致心肌细胞Ca2+超负荷而破坏心肌细胞起保护作用。
将人参皂甙单体Rb1(C54H92O23·H2O)作为钙通道阻断剂的药物放置于细胞外液中即可达到上述目的，Rb1置于含有内皮素-1的心肌细胞浴液中，用于研究对抗内皮素-1所致的心肌细胞L-型钙通道电流的增加，心肌细胞钙超负载及心肌细胞的损伤的保护作用。其结果表明药效明显、稳定、无毒，剂量依赖性的阻断了L-型钙通道电流的增加及细胞内钙超负载，对心肌细胞起到了明显的改善保护作用。
下面通过实例详细说明本发明的效果。
例1 Rb1阻滞内皮素-1增加心肌全细胞L-型Ca2+通道电流设若干实验剂量组。每组15个豚鼠心肌细胞。用胶原酶分离豚鼠心室肌细胞，用连细胞膜片钳技术记录单个心室肌细胞。根据L型钙通道的电生理学特性与药理学特性；分别在电极充灌液与细胞浸浴液中加入TEA和TTX等试剂，以阻断除L型钙通道以外的其它有关类型的离子通道活动(K+通道与Na+)；根据L型钙通道的电压激活范围，将保持电压设制在-50mv，命令电压从-50mv至+60，命令电压间隔是10mv，每次命令电压持续时间400ms。首先记录正常的细胞的L-型Ca2+通道电流作为对照组，在15个心肌细胞的浴液中灌流ET-150nmol/L，在明显的增加L-型Ca2+通道电流之后，向心肌细胞内加Rb1(100μmol)。结果表明Rb1剂量依赖性的阻滞ET-1导致的心肌细胞L-型Ca2+电流增加作用，起到了钙通道阻断剂的作用。结果列于表1。
表1 Rb1阻滞内皮素-1增加心肌全细胞L-型Ca2+通道电流Rb1Rb1Rb1Rb1ET-1Rb1Rb1(100μContr (100(200 (300 (400 Washi (50 Contr(μ mol)+ET-1(50ol μ μμμ ng out nmol/ olmol) nmol/L)mol)mol) mol) mol) L)-215. -177. -132. -125. -192. -423. -273.
Ampli -302.
2±8± 5± 1± 5± 6± -222.3±8±tude 7±22.42 20.35 18.14 17.56 20.13 48.56 23.25** 24.65(pA) 28.16** * * **** ** *n＝15，X±S，*p＜0.05，**p＜0.01，例2 Rb1对抗内皮素-1导致心肌细胞L-型单Ca2+通道开放概率增加的效果设若干个实验剂量组。实验的方法与实施例1相同。记录正常细胞L-型单Ca2+通道开放概率，在15个稳定的心肌细胞溶液中灌流ET-1 50nmol，在明显的增加L-型单Ca2+通道开放概率之后，向心肌细胞内再加入Rb1(100μmol)。结果表明Rb1明显的拮抗ET-1，导致的心肌细胞L-单Ca2+通道开放概率增加的作用。结果列于表2。
表2Rb1对抗内皮素-1导致心肌细胞L-型单Ca2+通道开放概率增加的效果Open-stateDrugOpen time(mS) Close time(mS)probabilityControl 0.718±0.018.344±0.04 0.105±0.0161.044±ET 5.247±0.9** 0.179±0.015**0.0042**Et-1+Rb10.403±0.007** 7.57±0.02** 0.137±0.013**
n＝15，X±S，*p＜0.05 **p＜0.01(compared with control group).
例3 Rb1对抗ET-1导致心肌细胞延迟外向K+电流设若干个实验剂量组。为获得Ik电流，实验记录前分别将TTX(10μmol/L)和CdCl(0.1mmol/L)加入细胞浸浴液，以阻断Na+电流与Ca2+电流。根据Ik电流的激活电压范围，将保持电压设制于-40mv，命令电压从-40mv至+50，命令电压间隔是10mv，每次命令电压持续时间是800ms。记录15个细胞外向Ik电流作为对照组，15个心肌在细胞溶液中灌流ET-150nmol，可增加Ik电流，记录15个心肌之后，向心肌细胞内加Rb1(100μmol)。观察记录Rb1对抗ET-1，导致的心肌Ik电流增加作用。结果列于表-3。
表-3Rb1对抗ET-1导致心肌细胞延迟外向K+电流MedicationAmplitude(pA)Control 1000.35±81.83ET 5nM2000.56±85.90**Rb1300μM+ET 5nM828.42±81.34**n＝15，X±S，**P＜0.01例4 Rb1对抗内皮素-1导致的心肌细胞内钙超负载设若干个实验剂量组。将成年健康豚鼠用胶原酶分离成单个心肌细胞，实验采用Fura-2/AM测定心肌细胞内[Ca2+]i。FA-2/AM进入细胞后，经酶水解成Fura-2并与Ca2+结合，则峰值从380nm降至340nm，此时固定激发光和发射之波长，分别测定加入各种药及对照的荧光强级F，根据公式计算出[Ca2+]i。结果列于表4表4Rb1对抗内皮素-1导致的心肌细胞内钙超负载药物 Original value(对照)N mol/L 5minControl对照 172.4±5.0 172.4±5.0ET-1 60nmol/L170.2±5.5 485.3±14.5**Rb1100+ET-1228±4.8169.5±5.9**Rb1200+ET-1216±5.9108.6±8.7**
Rb1300+ET-1205.6±7.6104.6±5.8**n＝15，X±S，**p＜0.01例5 Rb1改善内皮素-1导致的心肌细胞损伤作用设若干个实验剂量组。取10只正常的健康的成年大白鼠心脏作为对照组，经戊二醛、饿酸固定后，epon812环氧树脂常规包埋，70μm超薄切片机切片，醋酸双氧铀、柠檬酸铅染色，透射电镜照相观察正常心肌细胞的超微结构。取10只正常成年健康的大白鼠用内皮素-1(10μg/kg)静脉注入，制备心肌缺血模型，取心脏，通过电镜对比观察内皮素-1对心肌细胞超微结构的损伤。另取10只正常健康成年大白鼠用内皮素-1(10μg/kg)静脉注入，五分钟之后再从静脉注入Rb1(40mg/kg)，通过电镜观察Rb1改善内皮素-1对心肌细胞超微结构损伤的作用。结果列于表-5。
表5Rb1改善内皮素-1对大鼠心肌细胞超微结构损伤的作用
药效明显、稳定、无毒，对心肌细胞起到了明显的改善保护作用。
权利要求
1.人参皂甙单体Rb1在制备治疗由内皮素-1导致的心细胞损伤的药物中的应用。
全文摘要
人参皂甙单体Rb
文档编号A61K31/7028GK1569014SQ20041001083
公开日2005年1月26日 申请日期2004年4月30日 优先权日2004年4月30日
发明者曾庆华, 马越 申请人:东北师范大学