专利名称：纳米砒霜磁性脂质体的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种作为治疗癌症药物的纳米砒霜磁性脂质体的制备方法。
背景技术：
本发明所涉及的是新型纳米中药制剂及其制备方法，将纳米技术引入到中药砒霜(As2O3、三氧化二砷)的制备，通过纳米技术制备纳米磁性微球(锰锌铁氧体纳米粒子)作为载体，将As2O3与其结合制成纳米砒霜磁性脂质体，从而使其具有双重抗肿瘤效能，即砒霜的“毒杀”和磁性载体的磁感应升温“热杀”肿瘤细胞作用。纳米技术是指0.1-100纳米材料尺度上的研究与应用，纳米药物是指药物粒径在1000纳米范围的药物，但一般不超过500纳米。
中药砒霜作为抗肿瘤药物在我国已有百年历史，尤其近年来，其对肿瘤的治疗已成为研究的热点。近年来，As2O3在治疗急性早幼粒细胞白血病上临床效果显著，引起人们对它的重新认识。大量研究发现用As2O3作用于急性早幼粒细胞白血病(acutepromyelocytic leukaemia，APL)细胞株NB4有剂量依赖双重效应，低浓度As2O3(0.1μmol/l～0.5μmol/l)长时间(10d～14d)可诱导其分化，高浓度(0.5μmol/l～2.0μmol/l)As2O3可以诱导凋亡，并且这种凋亡作用是通过维甲酸受体信号通路(即诱导PML/RAR α融合蛋白降解)而实现的。后来，有研究发现[9]对维甲酸耐药的PML/RARα融合蛋白缺乏小鼠白血病细胞对As2O3诱导的凋亡也表现出明显的敏感性，而且另有文献[10-12]报道，As2O3对细胞凋亡的诱导作用并无APL特异性，它不但可以导致NB4细胞发生凋亡，也可以诱导急性髓细胞样白血病(acute myloid leukemia，AML)细胞株HL-60及慢性髓细胞样白血病(chronic myloid leukemia，CML)细胞株K562等细胞凋亡。所以该药有可能通过多种途径或凋亡相关蛋白[13-15]等诱导肿瘤细胞凋亡，是一种潜在的广谱抗癌药。鉴于此，一些学者开始了As2O3用于实体瘤治疗方面的研究，结果表明As2O3可以通过阻滞细胞周期(如G2/M期等)、调节线粒体(如改变膜通透性和透膜电位等)及某些凋亡相关基因或蛋白[20-24](C-myc、Bcl-2/bax及Caspases酶底物PARP等)等途径来诱导实体瘤细胞的凋亡。在诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡时，可同时发现As2O3几乎可以完全抑制HPV18病毒E6或E7基因的表达，而且其他基因无明显改变。因HPV DNA中E6、E7基因是子宫颈上皮细胞恶性转化所必需的，所以可认为As2O3抑制病毒致癌基因E6、E7的表达是导致HeLa细胞凋亡的关键[25-26]。目前，As2O3诱导实体癌细胞凋亡已应用于临床[27-29]，治疗效果令人鼓舞。另外，As2O3在临床治疗白血病时，不但效果显著，而且没有化疗药物引起的骨髓抑制等毒副作用，无全反式维甲酸治疗引起的易复发、易耐药等缺点。但是我们同时也要看到，由于全身用药，血浆砷浓度很快升高并迅速弥散周围组织，所以仍有少部分病人出现消化道症状、末梢神经炎、皮肤干燥、色素沉着，甚至出现肾功能损害或胸腹水等副作用；尤其是流行病学调查发现[32]某些肿瘤的发生与砷的累积量有关。所以，我们在看到As2O3的临床应用价值的同时，也还必须认识到为进一步减少药量，提高疗效，积极深入开展对As2O3新剂型、靶向定位等的研究是非常迫切和必要的。
磁性微球载体及纳米药物的研制随着纳米技术的兴起颇受重视。1979年Widder首先研制出载有抗癌药物的磁性微球，发现磁载体定位好、无毒。1987年家藤哲朗研制果丝裂霉素磁化微球并用于肾癌、膀胱癌，效果颇佳。国内对磁性微载体及所载药物(西药、中药)也进行了多方面研究，由于磁性微载体是一种独特的靶向药物运载系统，因此一直是药物新型制剂最活跃的领域之一。从文献报道看，目前研制的此类药物的磁性载体已可达纳米水平，但携载药物后的磁性药物微球多属于微米极水平，这可能与制作工艺有关。因纳米级微球(纳米粒)远远小于微米级微球，所以更有利于细胞吸收，分布也更均匀，且在物理特性上也有不同。研究表明纳米粒对肿瘤细胞具有亲合力，易吸附于瘤细胞表面，并具有淋巴系统导向性，其特点是纳米粒注入体内后，既可被淋巴毛细管吸收并带至引流区淋巴结，也可被巨噬细胞吞噬后带至淋巴器官和肝、肺、骨髓等处。因此，携载抗癌药物的纳米药物是一种极具应用前景的既可治疗原发肿瘤又可阻遏淋巴转移的药物新剂型。
近年来，人们根据磁性微球不仅可以用作药物载体，在交变磁场下还可加热升温的物理特点，对其在肿瘤热疗方面的潜在价值引起了重视。在临床上用微波等对肿瘤进行热疗是常采用的手段之一。但由于对肿瘤的升温无特异性，不易测温控温；加之定位困难、或者是由于体表或治疗路径组织温度过高等而影响了其应用。1997年德国学者Jordan采用纳米技术和热疗相结合的新疗法—磁流体热疗(magnetic fluid hyperthermia，MFH)治疗肿瘤取得了重要进展，Jordan将含磁性微粒的液体(磁流体)导入C3H大鼠乳腺癌移植瘤瘤内，经交变磁场局部照射，磁微粒吸收能量升温至47℃，结果肿瘤得到了有效控制。此方法的优点是靶向定位升温，即无磁微粒组织不受损。日本一研究小组[35-36]将纳米磁性微粒用脂质膜包裹起来，制成磁性脂质体(magnetic liposomes，MLs)，由于脂质膜和细胞膜的成份相似，这种磁性脂质体通过细胞的融合或吞噬作用就可以更快更多的进入细胞内部，从而进一步增强细胞内热疗的疗效。他们把含有磁性脂质体的T-9神经胶质瘤细胞团或移植瘤模型置于AMF(场强384Oe，频率118kHz，功率5.0kW)中央照射，磁性粒子产生的热量可以有效杀灭肿瘤细胞。所以，感应热疗的前景是十分广阔的。但MFH没有载药，其作用仍显单一，有效测温控温亦未解决。
在肿瘤热疗中，准确测定肿瘤温度及其分布很困难，这对于掌握热疗剂量和治疗效果带来很大影响，因此一直是肿瘤热疗中急须解决的问题。1996年学者们提出了一种能提高深层部位肿瘤热疗效果的新方法。基本原理是将具有良好吸收雷达电磁波能量的磁粉吸收剂注射到血管中，然后在外磁场的引导下，磁性微粉吸收剂定位于肿瘤周围和肿瘤内部的血管中，然后在电磁波的照射下，磁性微粉大量吸收电磁波能量，并将其迅速转换成热能，使肿瘤升温，达到肿瘤热疗效应。磁性物质在射频电磁场的照射下，因涡流损耗而不断产热，可在一定的时间内达到杀死肿瘤细胞的温度，由于铁磁性物质本身具有Tc的特点[41，42]，当温度升至居里点后铁磁性物质即失去磁性而不能吸收电磁波能量，使温度下降，当温度低于居里点后铁磁性物质又恢复磁性而升温，从而达到对肿瘤热疗的自动控温和恒温，这对深层部位肿瘤的热疗具有重要的意义。锰锌铁氧体(Mn1-xZnxFe2O4)是具有较低居里温度的软磁铁氧体材料，在交变磁场照射下可以强烈吸收电磁波能量而升温；当温度达到居里温度时，它转变为非磁性物质而失去吸收电磁波能量的能力，使温度下降，当温度低于居里温度时，又恢复升温锰锌铁氧体纳米微球又恢复磁性升温，如此往复，使温度始终控制在设定的居里温度处，从而实现对肿瘤加热治疗的自动升温和控温，提高治疗效果的稳定性和安全性。Mn1-xZnxFe2O4随着x的改变，其居里温度可以在很宽的温度范围内变化。所以，改变配方就可以制备出一系列适用于肿瘤热疗的低居里温度的锰锌铁氧体材料。从理论上讲，如能制备出具有抗癌温度与居里温度相一致的锰锌铁氧体是最理想的，如居里温度为43℃-46℃(有效抗癌温度)的锰锌铁氧体。但是，我们在实验中发现，在200kHz、输出加热电流300A的条件下，居里温度为92℃的纳米锰锌铁氧体材料配成液体(磁流体)后升温仅为39℃，达不到理想的治疗温度，这显然是散热超过了升温的幅度所致，因此居里温度设定为抗癌温度43℃-46℃的锰锌铁氧体配成的磁流体在上述条件下是难以达到治疗温度的。
技术内容本发明提供一种纳米砒霜磁性脂质体的制备方法，利用本发明可获得磁响应性强，分散性较好，粒径小的纳米砒霜磁性脂质体。
本发明采用如下技术方案来解决其技术问题一种作为治疗癌症药物的纳米砒霜磁性脂质体的制备方法第一步将MnSO4、ZnSO4、FeSO4按摩尔比x∶(1-x)∶2混合，其中x＝0.4～0.6，用1mol/L的NaOH调成糊状，反应10～14h，置80℃烤箱中干燥，再置电阻炉内400℃焙烧60±20分钟，冷却后将材料研细成粉末状，热蒸馏水淋洗，静置自然沉降，过滤除去可溶性硫酸钠无机盐，用无水乙醇淋洗过滤后，将其放入60℃～80℃烤箱中干燥后，得锰锌铁磁性纳米粒子；第二步将卵磷脂、胆固醇按质量比为(1.6～1.8)∶1.0置于茄形瓶中，并加入相当于卵磷脂和胆固醇8～12倍体积的氯仿和无水乙醚的混合液，氯仿和无水乙醚按体积比为2∶1形成混合液，使卵磷脂和胆固醇溶解，用薄膜旋转蒸发器在40℃±5℃下恒温真空旋转蒸发，直到有机溶剂完全挥发，在茄形瓶内壁形成一均匀薄膜；将0.07～0.12倍卵磷脂和胆固醇总质量的明胶加入到砒霜NaOH溶液和磷酸盐缓冲液混合液，其pH为7.2±0.2，砒霜NaOH溶液和磷酸盐缓冲液混合液中的两溶液体积比为(0.5～1.0)∶9，60±5℃超声处理3～5分钟，然后加入0.35～0.70倍卵磷脂和胆固醇总质量的锰锌铁氧体磁性纳米粒子，18℃～25℃下超声处理3~5分钟，形成混悬液，将此混悬液加到上述含薄膜的茄形瓶中，40±5℃恒温震荡至薄膜脱落，0℃～4℃下超声处理3~5分钟，加上述混悬液1％～2％体积的甘油，混匀，置容器在-20℃～-80℃中冷冻2～6小时，37±0.1℃融化，超声处理40±10秒后再置于-20℃～-80℃中2～6小时，如此反复冻融及超声处理3次即得纳米砒霜磁性脂质体。
与现有技术相比，本发明取得了如下有益效果1.用化学共沉淀法成功制备出的锰锌铁氧体(Mn0.5Zn0.5Fe2O4)纳米磁性粒子呈圆形或椭圆形，约40nm(图1)，磁响应性强，分散性较好。Mn0.5Zn0.5Fe2O4为尖晶石结构复合铁氧体，在培养液及组织中化学性质稳定，不易分解。对培养细胞没有毒性，并且在较长的时间内(磁感应加热)对肝功能和肾功能等器官没有明显的毒副作用(见表1、2)，因此可以作为一种磁感应加热纳米热籽来治疗肿瘤。
表1锰锌铁氧体磁性纳米粒子浸渍液的细胞毒性评定(X±S)组别 OD值 生长增殖率毒性分级阴性对照组 0.3171±0.0375 100.00％ 025％浸渍液组 0.3031±0.0365 95.58％050％浸渍液组 0.3004±0.0189 94.73％075％浸渍液组 0.3058±0.0625 96.44％0100％浸渍液组0.3013±0.0516 95.02％0阳性对照组 0.0469±0.0127 14.79％4表2.锰锌铁氧体磁性纳米粒子AMF照射下对荷瘤裸鼠肝功和肾功的影响(X±S)组别 ALT AST Bun CrPBS对照组 28.33±3.37106.67±13.2 5.92±0.6656.83±3.00锰锌铁氧体磁性纳米粒子27.50±1.73122.00±18.425.34±0.3851.20±5.93各组裸鼠血清中的ALT、AST、Bun及Cr的平均值比较皆P＞0.05，差异无显著性。
2.在频率为200kHz、功率为4kW，输出加热电流为150A～300A的交变磁场照射下，居里温度为110.7℃的Mn0.5Zn0.5Fe2O4磁流体温度升高情况与磁流体浓度有关随浓度升高(1mg/ml～16mg/ml)，磁流体温度升高的速度和幅度依次增加，各浓度磁流体的温度上升到某一定点后即保持恒定(恒温)，并且最终可达肿瘤治疗温度范围(42℃～45℃)(见图2)。
3.在频率为200kHz、功率为4kW的交变磁场照射下，一定浓度的Mn0.5Zn0.5Fe2O4磁流体的温度升高情况与输出加热电流(即磁场强度)有关随输出加热电流依次增高(150A～300A)，浓度为8mg/ml的Mn0.5Zn0.5Fe2O4磁流体的温度升高速度和幅度也依次增加，温度升高到某一定点后也能保持恒定(恒温)，最终温度可达42℃～45℃肿瘤治疗温度范围。(图3)4.本发明增加反复冻融和超声处理两道程序，并加明胶增强磁性纳米粒子的分散性，制备出纳米As2O3磁性脂质体，其粒径为190±80nm，呈球形或卵形，平面圆度为1.10±0.13，其中可见电子密度高的磁性纳米粒子核心，外有脂质膜包绕，分散性好(图4)，以上性能和特征均优于用现有制备方法制备的磁性脂质体。
5.一定量的纳米As2O3磁性脂质体局部注射到移植瘤内，在频率为200kHz、功率为4kW、输出加热电流为300A的交变磁场照射下，可以在15min内使肿瘤区温度迅速升温43℃±1℃，并在以后的时间里保持恒温，而周围正常组织温度基本不变，表明该方法具有靶向定位加热和恒温的治疗作用。
6.一定量的纳米As2O3磁性脂质体局部注射到移植瘤内，不但可以通过磁感应靶向加热、还可以通过释放As2O3来共同抑制裸鼠人宫颈癌抑制瘤的生长(P＜0.001)，它与单一的纳米磁性脂质体磁感应热疗或单一的纳米As2O3脂质体治疗相比，效果更加显著(P＜0.05)(表3，图6、7、8、9、10)。
表3.三种复合型纳米脂质体在AMF照射下对裸鼠人宫颈癌移植瘤的质量抑制率组别裸鼠只数平均体重(g，X±S) 肿瘤质量 抑瘤率前后前后 (g，X±S)PBS对照组6624.07±1.62 24.43±3.353.28±1.13纳米As2O3脂质体组 6624.45±0.72 24.4±0.58 1.41±0.65 57.06％1)纳米磁性脂质体组 5523.98±1.05 24.62±1.311.66±0.80 49.44％1)纳米As2O3磁性脂质体组 7723.80±0.86 23.83±1.630.63±0.53 80.84％2)其中，与对照组相比，1)代表P＜0.05；2)则代表P＜0.001。
7.治疗实验表明纳米As2O3磁性脂质体是一种对肿瘤既有“毒杀”又有“热杀”治疗作用的多功能靶向新型中药制剂。
图1是锰锌铁氧体磁性纳米粒子照片。
图2是体外加热试验磁场强度一定时，不同浓度的Mn0.5Zn0.5Fe2O4磁流体磁感应产热情况曲线图。
图3是体外加热试验不同输出加热电流(磁场强度)下，8mg/ml的Mn0.5Zn0.5Fe2O4磁流体磁感应产热情况曲线图。
图4是纳米As2O3磁性脂质体的显微照片。
图5是实验结束时对照组裸鼠移植瘤照片。
图6是实验结束时纳米As2O3脂质体组裸鼠移植瘤照片。
图7是实验结束时纳米磁性脂质体感应加热组裸鼠移植瘤照片。
图8是实验结束时纳米As2O3磁性脂质体感应加热组裸鼠移植瘤照片。
图9是治疗实验结束后，对照组(1)、纳米As2O3脂质体组(2)、纳米磁性脂质体组(3)及纳米As2O3磁性脂质体组(4)移植瘤的大体情况照片。
具体实施方案一种作为治疗癌症药物的纳米砒霜磁性脂质体的制备方法第一步将MnSO4、ZnSO4、FeSO4按摩尔比x∶(1-x)∶2混合，其中x＝0.4～0.6，用1mol/L的NaOH调成糊状，反应10～14h，置80℃烤箱中干燥，再置电阻炉内400℃焙烧60±20分钟，冷却后将材料研细成粉末状，热蒸馏水淋洗，静置自然沉降，过滤除去可溶性硫酸钠无机盐，用无水乙醇淋洗过滤后，将其放入60℃～80℃烤箱中干燥后，得锰锌铁磁性纳米粒子；第二步将卵磷脂、胆固醇按质量比为(1.6～1.8)∶1.0置于茄形瓶中，并加入相当于卵磷脂和胆固醇8～12倍体积的氯仿和无水乙醚的混合液，氯仿和无水乙醚按体积比为2∶1形成混合液，使卵磷脂和胆固醇溶解，用薄膜旋转蒸发器在40℃±5℃下恒温真空旋转蒸发，直到有机溶剂完全挥发，在茄形瓶内壁形成一均匀薄膜；将0.07～0.12倍卵磷脂和胆固醇总质量的明胶加入到砒霜NaOH溶液和磷酸盐缓冲液混合液，其pH为7.2±0.2，砒霜NaOH溶液和磷酸盐缓冲液混合液中的两溶液体积比为(0.5～1.0)∶9，60±5℃超声处理3～5分钟，然后加入0.35～0.70倍卵磷脂和胆固醇总质量的锰锌铁氧体磁性纳米粒子，18℃～25℃下超声处理3～5分钟，形成混悬液，将此混悬液加到上述含薄膜的茄形瓶中，40±5℃恒温震荡至薄膜脱落，0℃～4℃下超声处理3~5分钟，加上述混悬液1％～2％体积的甘油，混匀，置容器在-20℃～-80℃中冷冻2～6小时，37±0.1℃融化，超声处理40±10秒后再置于-20℃～-80℃中2～6小时，如此反复冻融及超声处理3次即得纳米砒霜磁性脂质体，在本实施例中，将制得的锰锌铁磁性纳米粒子置于十二烷基苯磺酸钠水溶液中悬浮。
权利要求
1.一种作为治疗癌症药物的纳米砒霜磁性脂质体的制备方法，其特征在于第一步将MnSO4、ZnSO4、FeSO4按摩尔比x∶(1-x)∶2混合，其中x＝0.4～0.6，用1mol/L的NaOH调成糊状，反应10～14h，置80℃烤箱中干燥，再置电阻炉内400℃焙烧60±20分钟，冷却后将材料研细成粉末状，热蒸馏水淋洗，静置自然沉降，过滤除去可溶性硫酸钠无机盐，用无水乙醇淋洗过滤后，将其放入60℃～80℃烤箱中干燥后，得锰锌铁磁性纳米粒子；第二步将卵磷脂、胆固醇按质量比为(1.6～1.8)∶1.0置于茄形瓶中，并加入相当于卵磷脂和胆固醇8～12倍体积的氯仿和无水乙醚的混合液，氯仿和无水乙醚按体积比为2∶1形成混合液，使卵磷脂和胆固醇溶解，用薄膜旋转蒸发器在40℃±5℃下恒温真空旋转蒸发，直到有机溶剂完全挥发，在茄形瓶内壁形成一均匀薄膜；将占0.07～0.12倍卵磷脂和胆固醇总质量的明胶加入到砒霜NaOH溶液和磷酸盐缓冲液混合液，其pH为7.2±0.2，砒霜NaOH溶液和磷酸盐缓冲液混合液中的两溶液体积比为(0.5～1.0)∶9，60±5℃超声处理3～5分钟，然后加入0.35～0.70倍卵磷脂和胆固醇总质量的锰锌铁氧体磁性纳米粒子，18℃～25℃下超声处理3~5分钟，形成混悬液，将此混悬液加到上述含薄膜的茄形瓶中，40±5℃恒温震荡至薄膜脱落，0℃～4℃下超声处理3~5分钟，加上述混悬液1％～2％体积的甘油，混匀，置容器在-20℃～-80℃中冷冻2～6小时，37±0.1℃融化，超声处理40±10秒后再置于-20℃～-80℃中2～6小时，如此反复冻融及超声处理3次即得纳米砒霜磁性脂质体。
2.根据权利要求1所述的纳米砒霜磁性脂质体的制备方法，其特征在于将制得的锰锌铁磁性纳米粒子置于十二烷基苯磺酸钠水溶液中悬浮。
全文摘要
本发明是将MnSO
文档编号A61K33/36GK1559439SQ20041001429
公开日2005年1月5日 申请日期2004年3月12日 优先权日2004年3月12日
发明者张东生, 樊祥山, 郑杰, 贾秀鹏, 顾宁, 丁安伟, 金立强, 万美铃, 李群慧 申请人:东南大学