专利名称：用于磁共振诊断的肿瘤靶向顺磁性脂质体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种肿瘤靶向的磁共振成像诊断用顺磁性造影剂的脂质体及其制备 方法。技术背景
肿瘤严重威胁着人类的健康与生命，全世界每年因恶性肿瘤死亡约600万人，确 诊约1000万人。肿瘤治疗面临的关键问题是如何早期发现，诊断和治疗。目前影像学已有 多种肿瘤诊断技术，如磁共振成像，X-射线成像，超声波成像和核医学成像等。
其中磁共振成像技术中造影剂被用来增强影像的强度，通过改变组织局部磁场强 度或弛豫时间，或通过造影剂生理、生化特性来增强成像因素的差异，达到造影目的。
磁共振造影剂用的最广泛的就是顺磁性金属钆离子Gd3+的螯合物，常用的螯合剂 主要为多氨多羧化合物，如二乙三胺五乙酸(DTPA)、1，4，7，10-四氮杂环十二烷_1，4，7， 10-四乙酸(DOTA)和乙二胺四乙酸(EDTA)以及它们的衍生物。这些Gd3+的亲水性螯合物， 如Gd-DTPA，Gd-DOTA, Gd-D03A_HP和Gd-DTPA-BMA分布于胞外，且被肾脏消除。游离的钆离 子具有高毒性，在体内分布于骨骼和肝脏，并可迅速导致肝脏坏死。所有的含钆造影剂都是 螯合物，螯合后能改变体内的分布以提高图像对比度，同时改善其毒副作用(参见西北大 学学报(自然科学网络版)，2004年11月第2卷第11期，罗丽等人，磁共振成像造影剂的 研究进展)。
脂质体作为一种定向药物载体，可以将药物粉末或溶液包埋在类细胞结构的微粒 中改变药物的体内分布，减少药物的治疗剂量和降低药物的毒副作用，并且可作为药物储 库，产生持久的治疗作用。脂质体注入体内后，会被网状内皮系统摄取而从血流中快速清 除，而纳米脂质体由于其的小尺寸效应、表面效应可使其逃避网状内皮系统的摄取而延长 药物在体内的停留时间，进而达到病变部位。
目前，国内外已有许多将顺磁性金属离子及其螯合物包被于脂质体中的报 道，已有技术主要可分两类第一类是利用脂质体将所需要的诊断剂包裹在中心水性 腔内，因这些螯合物均是亲水性的，极易从脂质膜中渗漏，包封率较低(参见hter J Pharm，2006，312 :105-112.Uyen M Le, Zhengrong Cui, et α 1.Long-circulating gadolinium-encapsulated liposomes for potential application in tumor neutron capture therapy)，而一些采取适合脂质体包裹水溶性药物的方法如复乳法制备的多室 脂质体(参见 Acad J Sec Mil Med Univ. 2007,28(1) :87-90. ZHANG Wei, GENG Fang, et α 1. Preparation and characterization of pulmonary targeting DepoFoam loaded MR contrast media :gadopentetate dimeglumine),虽然包封率提高，但其粒径较大，在 微米级范围；第二类是将所需要的螯合物与疏水性“锚”基结合，使螯合物限定在脂质体 膜上，这类结合物已报道的有Hnatowich等人的DTPA-二硬脂酰胺(参见J Nucl Med, 1981,22 :810-814. Hnatowich D J, Friedman B, Clancy B, and Novak Μ. Labeling of Preformed Liposomes with Gd_67and Tc_99m by Chelation), Kabalka 等人的 DTPA- 二硬脂酰酯(参见 Magn Reson Med 1991，19 :406-415. Kabalka G W, Davis M A. et α 1.Gadolinium-labeled liposomes containing amphiphilic Gd-DTPAderivatives of varying chain lengthtargeted MRI contrast enhancement agents for the liver) 和 Volkmar 等人的 DTPA-PLL-NGPE 多螯合聚合物(参见 Colloids and Surfaces B Biointerfaces,2000,18,293-299. Weissig V, Babich J, Torchilin V. Long-circulating gadolinium-loaded liposomes -potential use for magnetic resonance imaging of the blood pool)，此类方法制备的脂质体稳定性较好，钆螯合物或络合物不易从脂质膜渗 漏出来，但其制备步骤比较复杂，一些成分也较昂贵，并且一些水不溶性物质无法从肝脏中 消除，而永久保留其中。
实体瘤生长与转移离不开血管生成，是所有实体瘤的共同特征。若无血管生长，实体瘤不能长到1 2mm3以上大小。为此，血管生成成为当今肿瘤诊治的可靠靶点。血管内 皮细胞属于可暂时被血管生成因子活化的正常组织，在缺氧或血管生成促进因子存在下， 可能通过发芽生长新的毛细血管。
肿瘤新生血管内皮细胞可以特异地表达许多受体，从而将他们与静止期血管内 皮细胞区别开来。研究资料证实，血管内皮细胞生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)和新生血管内皮细胞表达整合素受体ανβ3;这些受 体特异性高，在全身其它组织几不表达(整合素受体ανβ3在部分器官中有较高的表 达)。有人应用噬菌体展示技术，发现整合素参与放射引起的肿瘤血管生成，其中含有 R⑶片段是整合素的主要配体。R⑶三肽能特异性地与整合素受体中的β3亚单位结合， 从而有效地抑制肿瘤血管生成，最终达到延缓或抑制肿瘤生长的疗效。血管内皮细胞生 长因子VEGF是VEGFR的配体，在许多实体瘤表达明显上调；它具有与VEGFR特异性地结 合，诱导内皮细胞增殖和促进血管生长样作用，是目前作用最强、特异最高的血管生成因 子。Soker 等(Inhibition of Vascular Endothelial Growth Factor(VEGF)-induced Endothelial Cell Proliferation by a Peptide Corresponding to the Exon 7-Encoded Domain of VEGF165. J BC 1997，272，31582-31588)发现 VEGF 存在多个外显子；其中，外 显子7编码44个氨基酸的多肽，与VEGF竞争结合到VEGFR上，抑制血管生长。Roselyna Binetruy-Tournaire^ (Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis. EMBO J. 2000 Apr 3,19(7) :1525-33)采 用噬菌体库技术，筛选到一个多肽分子，ATWLPPR，它能特异性地与VEGF竞争地结合到细胞 表面的VEGFR KDR上，从而在体内与体外抑制内皮细胞增殖与血管生成。周彩存等人(肿 瘤，2008年6月第观卷第6期第495页，靶向肿瘤新生血管的顺磁性纳米脂质体在MRI 诊断肺癌中的研究，)将RGDlO多肽分子(序列GARYCRGDCFDG，靶点为整合素ανβ3，亲和 常数 9. 41 X IO7)、F56 多肽(序列 WHSDMEWWYLLG，靶点为 VEGFR-I，亲和常数为 3. 87 X IO7)、 K237多肽分子(序列HTMYYHHYQHHL，靶点为VEGFR-2，亲和常数为5. 98 X IO7)分别与棕榈酸 (Pal)和α -氨基己酸(C6)的连接物用于肿瘤靶向脂质体中，磁共振成像对比结果表明，整 合素α V β 3和VEGFR-I配体靶向脂质体在MRITl加权像上肿瘤信号强度明显增强，达到对 照的1. 8 2. 8倍，清晰显示直径2 5毫米微小肿瘤病灶。其中含I3aI-Ce-RDGlO的脂质 体的成像有效时间达到1. 5小时。中国专利文献CN101301479A公开了一种用于磁共振成 像诊断的肿瘤靶向显影组合物及其制备方法，但其载钆浓度偏低，释放速度也较快，因此在动物试验中表现为有效的显影时间较短，而且信号的比对度尚难以满足临床应用要求。发明内容
本发明的目的是公开一种用于磁共振诊断的肿瘤靶向顺磁性脂质体及其制备方 法，以克服现有技术存在的上述缺陷。
所述用于磁共振诊断的肿瘤靶向顺磁性脂质体，由如下重量百分比的组分组成
以金属钆的重量计的Gd3+螯合物8 30份卵磷脂脂质体稳定剂 脂质体修饰剂多肽分子连接物20-80 份5-20 份2 10份0.1-2.5 份缓冲液800 1000份
进一步的，优选的，所述用于磁共振诊断的肿瘤靶向顺磁性脂质体，由如下重量百 分比的组分组成
以金属钆的重量计的Gd3+螯合物10~20份
卵磷脂脂质体稳定剂 脂质体修饰剂 多肽分子连接物 缓冲液40-60 份 10-20 份 5~8份 0.5-1.5 份 800-1000 份
上述的Gd3+螯合物为金属钆的三价离子与螯合剂的螯合物，其用量是以金属钆的 重量为计算基准的，下同；所述螯合剂选白DTPA、DTPA-BMA、DOTA、D03A-HP或D03A-butrol， 优选 DTPA 或 DTPA-BMA ；
所述Gd3+螯合物可采用市售产品，如德国Bayer Schering Wiarma公司的钆喷 酸葡胺注射液或Amersham Health公司的钆双胺产品，或者采用李铁福等人(“MRI顺 磁性造影剂Gd-DTPA的合成”，化学试剂，2004，26 (3)，ppl90_191)或Tatjana, N等人 ("Paramagnetic liposomes containing amphiphilic bisamide derivatives of Gd-DTPA with aromatic side chain groups as possible contrast agents for magnetic resonance imaging”，Eur Biophys J (2006) 35 :136-144)文献报道的方法进行制备；
所述的卵磷脂选自蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂或氢化蛋黄卵磷脂；
所述脂质体稳定剂选自胆固醇、硬脂胺、磷脂酸或维生素E，优选胆固醇或维生素 E
所述脂质体修饰剂选自聚乙二醇磷脂化衍生物，优选如聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺 PEG-PE、聚乙二醇-磷脂酰胆脂PEG-PC或聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺PEG-DSPE ；最 优选聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺PEG-DSPE ；其中，聚乙二醇的分子量选用2000 5000 ；
所述多肽分子连接物选自RDGlO多肽与棕榈酸的连接物、F56多肽与棕榈酸的连 接物或K237多肽与棕榈酸的连接物、RDGlO多肽与棕榈酸和α -氨基己酸的连接物、F56 多肽与棕榈酸和α-氨基己酸的连接物或Κ237多肽与棕榈酸和α-氨基己酸的连接物，其 中，α-氨基己酸作为所述多肽和棕榈酸的连接臂；
所说多肽与棕榈酸的连接物中，多肽分子的末端氨基与棕榈酸的羧基形成酰胺键 共价结合；所说多肽与棕榈酸和α-氨基己酸的连接物中，α-氨基己酸的羧基与多肽分子 的末端氨基以及α-氨基己酸的氨基与棕榈酸的羧基分别形成酰胺键共价结合；
术语“RDG10 多肽”，在“Novel RGD Iipop印tides for the targeting of liposomes to integrin-expressing endothelial and melanoma cells，，，Protein Engineering, Design &Selection vol. 17no. 5pp. 433-441,2004, Peter H0lig等人的文献 中有详细的报道；
术语“F56多肽”，SUPPRESSION OF TUMOR GROWTH AND METASTASIS BY A VEGFR-I ANTAGONIZING PEPTIDE IDENTIFIED FROM A PHAGE DISPLAY LIBRARY,Int. J. Cancer :111, 165-173(2004)，Ping An等人的在文献中有详细的报道；
术语“K237 多肽”，在“A Novel Peptide Isolated from a Phage Display Library Inhibits Tumor Growth and Metastasis by Blocking the Binding of Vascular Endothelial Growth Factor to Its Kinase Domain Receptor，，，THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY,Vol. 277,No. 45,Issue of November 8，pp. 43137-43142，2002， Lei Hetian等人的文献中有详细的报道；
所述多肽分子连接物，可采用9-芴甲氧羰基(fluorenylmethoxy carbony，Fmoc) 固相合成法进行制备，然后采用高效液相色谱柱提纯；所说Fmoc固相合成法可以采用熊瑛 等人(Eptifibatide的固相合成及分离纯化，厦门大学学报(自然科学版)2007年1月第 46卷第1期第100 103页)文献报道的方法，所说多肽与棕榈酸和α-氨基己酸的连接 物的固相法肽键的合成次序可以采用首先合成多肽-α-氨基己酸连接肽键，再合成α-氨 基己酸-棕榈酸之间的肽键，或者先合成α -氨基己酸-棕榈酸之间的肽键，然后合成多 肽-α-氨基己酸之间的肽键；
所述的缓冲液选自ρΗ为6. 8 7. 4的磷酸盐缓冲溶液或生理盐水；
本发明的用于磁共振诊断的肿瘤靶向顺磁性脂质体的制备方法，包括如下步骤
(1)将卵磷脂、脂质体稳定剂和脂质体修饰剂溶解于乙醇，获得溶液I，将多肽分 子溶于二甲基亚砜，获得溶液II，然后将两种溶液混合，减压蒸干溶剂，获得脂类薄膜；
溶液I中，卵磷脂的含量为10 50mg/ml，脂质体稳定剂的含量为2. 5 16. 5mg/ ml，脂质体修饰剂的含量为1 6. 7mg/ml ；
脂质体修饰剂脂质体稳定剂卵磷脂=1 2 2. 5 8 10，重量比；
溶液II中，多肽分子的含量为50 200mg/ml ；
溶液I 溶液 II = 1 0. 0012 0. 0065，体积比；
(2)将脂类薄膜与含有Gd3+螯合物的缓冲溶液进行水合反应，反应温度为30 50°C，反应时间为2 4小时，获得脂质体悬浮液；
所述含有Gd3+螯合物的缓冲溶液中，Gd3+螯合物的浓度为0. 05 0. 4mmol/ml ；
脂类薄膜的用量为20 110mg/ml含有Gd3+螯合物的缓冲溶液；
(3)将所得脂质体悬浮液高压均质，压力为40 90MPa，循环次数为5 15次，控 制粒径在20 200nn ；
(5)用0. 22微米滤膜过滤除菌，获得产品。
本发明提供的于磁共振诊断的肿瘤靶向顺磁性脂质体，由顺磁性造影剂、卵磷脂、 脂质体稳定剂、脂质体修饰剂、多肽分子作为组分制备而成，本发明将大量钆造影剂包入脂 质体中，获得了高的药/脂比值，通过钆造影剂的纳米脂质体化和靶向多肽修饰，达到肿瘤 识别和造影剂延缓(延长造影剂肿瘤部位的有效时间)，提高磁共振造影成像诊断早期肿 瘤的效能。
采用本发明的方法，可以制备小粒径、性能稳定的高载钆量的脂质体制剂，并通过 提高磷脂浓度提高其包封率，且脂质体修饰剂的加入延缓了其释放时间，提高了稳定性。
本发明采用了无水乙醇作为磷脂类的有机溶剂，因为高纯度的卵磷脂可完全溶于 乙醇，其他稳定剂和修饰剂也可溶于乙醇，这样既排除了文献常用的毒性较大的有机溶剂 氯仿或甲醇的残留，又减少了环境污染，降低了生产成本，且保护了操作人员的安全，更适 合于工业化生产。
图1为肿瘤靶向顺磁性脂质体制剂的透射电镜照片。
具体实施方式
通过下面实施例说明本发明的具体实施方式
，但本发明的保护范围，不局限于此。
超滤离心法测定脂质体的包封率精密量取脂质体0. 3ml置于超滤管中超速离心 13000rpm离心lOmin，定量取离心下液，消解后采用等离子体电感耦合发射光谱法测定清 液中钆的含量为游离药物量Wis。另精密量取同脂质体0. 3ml直接消解后采用等离子体电感 耦合发射光谱法检测钆含量为总药物量W^按下式计算脂质体对钆螯合剂的包封率QW% =(W总-W游)/W总 X100% ；
其中Qw代表重量包封率，％，W总代表药物的总投入量，mg/ml, W游代表未包入脂 质体的药物量，mg/ml。
实施例1
称取大豆卵磷脂4g、胆固醇lg、维生素EO. 4g、PEG_DSPE2000(德国Lipod公 司)0. 4g溶于IOOml无水乙醇，0. 02g多肽分子(Pal_C6_RDG10，上海市肺科医院)溶 于0. 2ml 二甲基亚砜，两者混勻，45°C恒温减压下旋转蒸发去除溶剂形成脂质薄膜；加入 Gd-DTPA螯合物浓度为0. lmmol/ml的pH7. 4磷酸盐缓冲溶液100ml，进行水合洗脱薄膜2h，制得脂质体悬浮液；将脂质体悬浮液进行高压均质，50MI^下均质15次，0. 22微米微孔滤膜 过滤除菌，获得产品。
用动态光散射激光粒度分析仪测定其体积平均粒径为121nm，超滤离心法测定钆 螯合剂的包封率为56. 4%，其透射电镜照片如图1所示。
实施例2
称取蛋黄磷脂6g、胆固醇2g、维生素E0. 6g、PEG-DSPE2000 (德国Lipod公司)Ig 溶于IOOml无水乙醇，0. 025g多肽分子(RDG10多肽与棕榈酸的连接物，上海市肺科医院) 溶于0. 2ml 二甲基亚砜，两者混勻，40°C恒温减压下旋转蒸发去除溶剂形成脂质薄膜；加入 Gd-DTPA-BMA螯合物浓度为0. 2mmol/ml的生理盐水100ml，进行水合洗脱薄膜3h，制得脂 质体悬浮液；将脂质体悬浮液进行高压均质，60MI^下均质10次，0. 22微米微孔滤膜过滤除 菌，获得产品。
实施例3
称取氢化大豆磷脂10g、胆固醇5g、维生素E0. 5g、PEG-DSPE2000 (德国Lipod 公司)2g溶于IOOml无水乙醇，0.04g多肽分子(Pal_C6_RDG10，上海市肺科医院)溶 于0.二甲基亚砜，两者混勻，35°C恒温减压下旋转蒸发去除溶剂形成脂质薄膜；加入 Gd-DTPA-BMA螯合物浓度为0. 25mmol/ml的pH6. 8，磷酸盐缓冲溶液100ml，进行水合洗脱薄 膜4h，制得脂质体悬浮液；将脂质体悬浮液进行高压均质，SOMPa下均质8次，0. 22微米微 孔滤膜过滤除菌，获得产品。
权利要求
1.用于磁共振诊断的肿瘤靶向顺磁性脂质体，其特征在于，是由如下重量百分比的组 分制备的以金属钆的重量计的Gd3+螯合物8-30 份卵磷脂20-80 份脂质体稳定剂5-20 份脂质体修饰剂2 10份多肽分子连接物0.1-2.5 份缓冲液800-1000 份所述的Gd3+螯合物为金属钆的三价离子与螯合剂的螯合物，其用量是以金属钆的重量 为计算基准的。
2.根据权利要求1所述的用于磁共振诊断的肿瘤靶向顺磁性脂质体，其特征在于，是 由如下重量百分比的组分制备的以金属钆的重量计的Gd3+螯合物10-20 份卵磷脂40-60 份脂质体稳定剂10-20 份脂质体修饰剂5-8份多肽分子连接物0.5-1.5 份缓冲液800 1000 份。
3.根据权利要求1或2所述的用于磁共振诊断的肿瘤靶向顺磁性脂质体，其特征在于， 所述螯合剂选自 DTPA、DTPA-BMA、DOTA、D03A-HP 或 D03A_butrol。
4.根据权利要求3所述的用于磁共振诊断的肿瘤靶向顺磁性脂质体，其特征在于，所 述螯合剂选自DTPA或DTPA-BMA。
5.根据权利要求1所述的用于磁共振诊断的肿瘤靶向顺磁性脂质体，其特征在于，所 述的卵磷脂选自蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂或氢化蛋黄卵磷脂。
6.根据权利要求1所述的用于磁共振诊断的肿瘤靶向顺磁性脂质体，其特征在于，所 述脂质体稳定剂选自胆固醇、硬脂胺、磷脂酸或维生素E。
7.根据权利要求1所述的用于磁共振诊断的肿瘤靶向顺磁性脂质体，其特征在于，所 述脂质体修饰剂选自聚乙二醇磷脂化衍生物。
8.根据权利要求1所述的用于磁共振诊断的肿瘤靶向顺磁性脂质体，其特征在于，所 述多肽分子连接物选自RDGlO多肽与棕榈酸的连接物、F56多肽与棕榈酸的连接物或K237 多肽与棕榈酸的连接物、RDGlO多肽与棕榈酸和α -氨基己酸的连接物、F56多肽与棕榈酸 和α-氨基己酸的连接物或Κ237多肽与棕榈酸和α-氨基己酸的连接物，其中，α -氨基己酸作为所述多肽和棕榈酸的连接臂。
9.根据权利要求1所述的用于磁共振诊断的肿瘤靶向顺磁性脂质体，其特征在于，所 述的缓冲液选自pH为6. 8 7. 4的磷酸盐缓冲溶液或生理盐水。
10.根据权利要求1 9任一项所述的用于磁共振诊断的肿瘤靶向顺磁性脂质体的制 备方法，其特征在于，包括如下步骤(1)将卵磷脂、脂质体稳定剂和脂质体修饰剂溶解于乙醇，获得溶液I，将多肽分子溶 于二甲基亚砜，获得溶液II，然后将两种溶液混合，减压蒸干溶剂，获得脂类薄膜；溶液I中，卵磷脂的含量为10 50mg/ml，脂质体稳定剂的含量为2. 5 16. 5mg/ml, 脂质体修饰剂的含量为1 6. 7mg/ml ；脂质体修饰剂脂质体稳定剂卵磷脂=1 2 2. 5 8 10，重量比；溶液II中，多肽分子的含量为50 200mg/ml ；溶液I 溶液II = I 0. 0012 0. 0065，体积比；(2)将脂类薄膜与含有Gd3+螯合物的缓冲溶液进行水合反应，反应温度为30 50°C， 反应时间为2 4小时，获得脂质体悬浮液；所述含有Gd3+螯合物的缓冲溶液中，Gd3+螯合物的浓度为0. 05 0. 4mmol/ml ；脂类薄膜的用量为20 110mg/ml含有Gd3+螯合物的缓冲溶液；(3)将所得脂质体悬浮液高压均质，压力为40 90MPa，循环次数为5 15次，控制粒 径在20 200nm ；(5)用0. 22微米滤膜过滤除菌，获得产品。
全文摘要
本发明提供了一种用于磁共振诊断的肿瘤靶向顺磁性脂质体及其制备方法，所述脂质体是由如下重量百分比的组分制备的以金属钆的重量计的Gd3+螯合物8～30份，卵磷脂20～80份，脂质体稳定剂5～20份，脂质体修饰剂2～10份，多肽分子连接物0.1～2.5份，缓冲液800～1000份，本发明将大量钆造影剂包入脂质体中，获得了高的药/脂比值，通过钆造影剂的纳米脂质体化和靶向多肽修饰，达到肿瘤识别和造影剂延缓，提高磁共振造影成像诊断早期肿瘤的效能，既排除了文献常用的毒性较大的有机溶剂氯仿或甲醇的残留，又减少了环境污染，降低了生产成本，且保护了操作人员的安全，更适合于工业化生产。
文档编号A61K49/18GK102028959SQ20091019647
公开日2011年4月27日 申请日期2009年9月25日 优先权日2009年9月25日
发明者余蓉蓉, 吴秋芳, 徐云龙, 戎丽娜, 杨景辉, 钱秀珍 申请人:上海华明高技术(集团)有限公司