专利名称：左旋多巴纳米制剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于医用制剂，涉及一种以左旋多巴为有效成份，以高分子聚合物为载体，治疗帕金森病及帕金森综合症的纳米制剂。
背景技术：
帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是以震颤、肌强直、运动减少和姿势异常为特征的慢性神经系统变性疾病，是中老年人常见病。目前其公认的发病机理是脑黑质细胞变性，致密斑部不能合成多巴胺(DA)而致DA严重缺失；左旋多巴(LD)迄今仍是帕金森病的金标准治疗药物，但因其副作用较明显，因而限制了在临床上的应用。由于绝大部分LD在外周即被脱羧生成多巴胺。而多巴胺又不易透过血脑屏障，因此进入中枢神经系统的LD不到用量的1％。临床使用美多巴，利用外周脱羧酶抑制剂(卡比多巴)可减少不良反应。但是，随着帕金森病病情的缓慢进展，美多巴服用剂量逐渐增加，其不良反应的发生率也随之升高。如能避免LD在外周脱羧，提高其血脑屏障通透性，制备LD长效缓释制剂，将能有效避免长期应用大剂量LD，减少或推迟LD所引起的不良反应。
载药纳米微粒是纳米技术与现代医药学结合的产物，是一种药物控释和缓释的新剂型。它包括纳米粒子(nanopart icales)和纳米胶囊(nanocap su les)，是直径在10～500nm之间的固状胶态粒子，活性部分(药物、生物活性材料等)通过溶解、包裹作用位于粒子内部，或者通过吸附、附着作用位于粒子表面。
自1976年Birrenbach首次报道载药纳米微粒以来，纳米微粒作为药物缓释和靶向载体已被广泛地运用于医学领域中，但利用用缓释纳米微粒治疗帕金森病，国内外还未见报道。
目前用来制备载药纳米微粒的材料主要分为天然高分子和合成高分子两大类。其中脂质体作为药物载体已经运用于临床，但其稳定性差，药物释放不易控制，包封率很低，限定了其适用范围。
最近，双亲性嵌段共聚物制备纳米胶束作为脂溶性药物和基因的投递和释放载体系统受到了极大的重视。这种壳—核状纳米胶束已试用于阿霉素的包载，并首次到达了＞60％的包封率。但由于聚合物疏水段的疏水性使之合成与制备受到诸多限制，对溶剂及药物结构要求甚高，不利于大规模生产，也不利于纳米载药产业化。
发明内容
本发明的目的是首次利用载左旋多巴(LD)纳米粒子缓释及被动靶向技术解决目前LD治疗帕金森病血脑屏障通透性差、副作用大、半衰期短的问题。采用适宜的制备及提纯方法，使载左旋多巴纳粒子具有适当的粒径与粒形，具有＞30％的载药量，具有＞80％的包封率，延长在人体内的循环时间，而且没有毒性。
本发明的技术方案是首先采用一步法(ARPT法)以PEO-Br为大分子引发剂合成双亲水性嵌段共聚物PEO-b-PAA，按以下路线进行 CH3(OCH2CH2)nOCOCH(Br)CH3
a)大分子引发剂PEO-Br的制备称取10gPEO(Mn＝5000)，真空干燥5小时，溶于150ml甲苯中，加入0.42ml三乙胺(0.003mol)，0℃冰水浴；半小时内滴加CH3CH(Br)COBr0.003ml，室温下搅拌反应过夜；经过滤，沉淀，萃取，干燥，反应过夜，得到白色的固体粉末大分子引发剂PEO-Br。
b)双亲水性嵌段聚合物PEO-b-PtBA的合成取大分子引发剂2.064g，CuBr58.9mg于反应器中，充入氮气，加入重蒸过的tBA单体8ml放入液氮冷冻，抽真空，通氮，水中溶解，重复三次；加入催化剂PMDETA0.42ml，80℃油浴中反应半小时，液氮速冻终止反应；选取80℃，反应0.5小时为反应条件，可得到PAA端长度大约为25个重复单元的二嵌段聚合物。已经试验证实该长度的PEO-b-PAA具有最佳的自组装性能。
c)提纯产物首先用去离子水洗涤，接着以200～300目的中性三氧化铝为固定相装填层析柱进行四次层析，然后蒸馏产物、真空干燥，得到白色固体粉末PEO-b-PtBA。
d)水解称取PEO-b-PtBA1.2g，用15ml二氯甲烷溶解，鼓泡通氮半个小时，注入三甲基碘硅烷1.4ml，26℃油浴中反应3个小时，反应结束后，减压抽干，2-3mlTHF溶解，滴入PH＝1的偏重亚硫酸钠溶液至黄色消去，并搅拌约一小时；透析48小时后冷冻抽干，得到PEO-b-PAA固体。
然后进行载LD纳米粒子的制备将10mgPEO-b-PAA持续低温(0℃)下超声溶解于6ml去离子水中，32.5mgLD溶解于10ml去离子水中，低温超声下滴加入PEO-b-PAA溶液中，定溶至10ml，通过分子组装技术得到LD∶AA＝1.0的载左旋多巴(LD)的纳米粒子(1‰)制剂。
用上述方法制备的左旋多巴纳米制剂，其特征在于以PEO113-b-PAA25为载体，其分子结构式为 包载于其核内的左旋多巴结构式为 本发明的优点和积极效果充分表现为1)生物相容性好。由于该聚合物两个嵌段均为亲水性的，水溶性好。此外PEO和PAA具有高度生物相容性，均已经过ADSL认证，得到FDA批准可运用于人体。
2)采用一步法制备出结构固定的浓度高达20％的聚合物胶束溶液；由该溶液出发可容易获得聚合物胶束的固体粉末，为载LD纳米粒子的大规模工业化生产奠定了基础。
3)昆明小鼠(20±2g)48只，随机分为两组，每组24只，分别以20mg/kg的剂量腹腔注射LD水溶液及同等剂量的载LD纳米粒，右心室取血，高效液相法测定多巴胺浓度。发现在给药PEO-PAA-LD后即出现“突释现象”。但其突释现象所导致的血DA浓度增高并没有超出LD组的峰值浓度(P＞0.05)。较某些枝接状纳米载体50％～60％的突释量而言，本实验组设计的载LD纳米粒子LD突释少，影响小，并不会造成血DA浓度的大幅变化，是十分理想的纳米载体，如图1。
4)昆明小鼠(20±2g)48只，随机分为两组，每组24只，分别以20mg/kg的剂量腹腔注射LD水溶液及同等剂量的载LD纳米粒，断头取脑，取双测纹状体高效液相法测定多巴胺浓度。实验显示，纳米组给药后血DA含量较LD组峰值有明显降低(P＜0.05)如图1，而脑纹状体DA含量明显增高，峰值浓度为LD组的500～600倍，在给药后28天，脑纹状体DA含量仍高于LD组100倍以上，见图2。表现出明显的富集现象及较长的体内循环时间(至少超过28天)。由于本实验组设计的载LD纳米粒子粒径为100nm左右，不易进入骨髓及肾脏排泄，在加之PEG外壳的保护作用，不易被单核细胞系统吞噬，肝脾等器官分布低，因此在血液中长循环，流经血脑屏障时经胞饮作用进入中枢神经系统，分解或扩散释放LD。从而实现脑部被动靶向及血脑屏障高通透率。
5)纳米组在给药5天后，在血DA含量已回复正常水平的情况下，纹状体DA含量仍高于LD组200～300倍，见图1、图2。这一结果充分显示载LD纳米粒子在减少外周LD脱羧，降低外周DA含量，减少不良反应方面效果显著。同时也为减少LD的用量提供了较大的空间。
图1两组小鼠给药后血DA含量比较图2各组小鼠纹状体DA(多胺)含量
权利要求
1.一种制备左旋多巴纳米制剂的方法，其特征在于首先采用一步法以PEO-Br为大分子引发剂合成双亲水性嵌段共聚物PEO-b-PAA，按以下路线进行a)大分子引发剂PEO-Br的制备称取10gPEO(Mn＝5000)，真空干燥5小时，溶于150ml甲苯中，加入0.42ml三乙胺(0.003mol)，0℃冰水浴；半小时内滴加CH3CH(Br)COBr0.003ml。室温下搅拌反应过夜；经过滤，沉淀，萃取，干燥，反应过夜，得到白色的固体粉末大分子引发剂PEO-Br；b)双亲水性嵌段聚合物PEO-b-PtBA的合成取大分子引发剂2.064g，CuBr58.9mg于反应器中，充入氮气，加入重蒸过的tBA单体8ml放入液氮冷冻，抽真空，通氮。水中溶解，重复三次；加入催化剂PMDETA0.42ml，80℃油浴中反应半小时，液氮速冻终止反应；选取80℃，反应0.5小时为反应条件，得到PAA端长度大约为25个重复单元的二嵌段聚合物；c)提纯产物首先用去离子水洗涤，接着以200～300目的中性三氧化铝为固定相装填层析柱进行四次层析，然后蒸馏产物、真空干燥，得到白色固体粉末PEO-b-PtBA；d)水解称取PEO-b-PtBA1.2g，用15ml二氯甲烷溶解，鼓泡通氮半个小时，注入三甲基碘硅烷1.4ml，26℃油浴中反应3个小时，反应结束后，减压抽干，2-3mlTHF溶解，滴入PH＝1的偏重亚硫酸钠溶液至黄色消去并搅拌约一小时；透析48小时后冷冻抽干，得到PEO-b-PAA固体粉末；然后进行载LD纳米粒子的制备将10mgPEO-b-PAA持续低温(0℃)下超声溶解于6ml去离子水中，32.5mgLD溶解于10ml去离子水中，低温超声下滴加入PEO-b-PAA溶液中，定溶至10ml，通过分子自组装技术得到LDAA＝1.0的载左旋多巴(LD)的纳米粒子(1‰)制剂。
2.用上述方法制备的左旋多巴纳米制剂，其特征在于以PEO113-b-PAA25为载体，其分子结构式为 包载于其核内的左旋多巴结构式为
全文摘要
本发明属于医用制剂，涉及一种以左旋多巴为有效成分，以高分子聚合物为载体，治疗帕金森病及帕金森综合症的纳米制剂，首先采用一步法合成双亲水性嵌段共聚物PEO－b－PAA，然后进行载LD纳米粒子的制备；得到左旋多巴纳米制剂。PEO和PAA均已经过ADSL认证，得到FDA批准可运用于人体；动物试验证实使用该制剂后，血多巴胺浓度峰值有明显下降，而脑内的状体多巴胺峰值可达普通制剂的500～600倍，时间长达28天以上；且一步法制备出结构固定、浓度高达20％的聚合物胶束溶液；为载LD纳米粒子的大规模工业化生产奠定了基础。
文档编号A61K31/192GK1682704SQ200410030559
公开日2005年10月19日 申请日期2004年4月14日 优先权日2004年4月14日
发明者周文斌, 刘晓英 申请人:中南大学