人参皂苷Rg的制作方法

专利名称：人参皂苷Rg的制作方法
技术领域：
本发明涉及人参皂苷Rg2制备方法，以该化合物为活性成分的药物组合物，以及它们在预防或治疗痴呆、抑郁症及外周微循环障碍等相关疾病的药物中的应用。
背景技术：
人参中含有许多种人参皂苷，目前已清楚的成分有30多种，其中人参皂苷Rg2(Ginsengnoside Rg2)属早年被分离和命名的原人参三醇苷。研究表明，在红参的加工过程中，人参皂苷C-20位结构不稳定，糖易被水解，由羟基取代，形成人参皂苷C-20(S)或C-20(R)异构体。红参中人参皂苷Rg2C-20(RS)含量明显高于生晒参，但因价格昂贵不作为提取人参皂苷Rg2的原料和制备其他单体化合物原料。
此前，由于人参皂苷Rg2的医疗用途没有确定，因此人参皂苷Rg2提取分离方法仍停留在实验室的硅胶柱层析法和制备型高效液相法。硅胶柱层析工艺是将人参总皂苷粗品，上硅胶层析柱，使人参总皂苷粗品吸附后，用不同比例的有机溶剂(氯仿∶甲醇∶乙酸乙酯∶水)作为洗脱剂，分离人参皂苷Rg2。
硅胶柱层析法的主要缺点是每次上柱分离量少，分离速度慢，而且使用了大量有毒的有机溶剂，导致成本高、收率低、不安全，不适于大规模生产。制备型高效液相法虽能分离出高纯度人参皂苷Rg2，但设备昂贵、耗资大、甲醇或乙腈用量也过大，因此成本随之增大。总之，现有的人参皂苷Rg2制备方法不适于大规模生产。
适合于企业化生产的先进工艺，必须具备简便、易行、收率高、纯度高、成本低、对人体无害、安全等特点。
关于人参皂苷Rg2的医疗用途方面的研究颇少，本申请人在已申请的“人参皂苷Rg2在制备心、脑血管疾病药物中的应用”(中国专利ZL01102117.9)仅限于人参皂苷Rg2在治疗心脑血管疾病方面的应用，所说的心脑血管疾病包括心肌缺血、脑缺血和休克性疾病。因此，有必要对人参皂苷Rg2的新用途进行进一步研究。

发明内容
本发明的目的之一是提供适合于工业化生产的人参皂苷Rg2制备新工艺。
本发明的另一目的是提供一种预防或治疗痴呆、抑郁症及外周微循环障碍的药物组合物。
本发明的进一步目的是提供人参皂苷Rg2在制备预防或治疗痴呆、抑郁症、外周微循环障碍等相关疾病的药物方面的用途。
已知人参皂苷Rg2特征如下分子式C42H72O13分子量784结构式 本发明制备人参皂苷Rg2方法主要包括，在现有的制备人参皂苷Rg2方法中进行了以下改进①用梯度盐析法代替了传统的硅胶层析，使得操作简便，适合于人参皂苷Rg2的大量制备。所用盐析物可以选自氯化钠，硫酸钠，亚硫酸钠，硫酸铵等，也可选择无毒的其它无机盐。这些盐析物低毒、廉价、易得、也可回收使用。②用不同浓度低级烷醇替代了价格昂贵的混合有机溶剂，同样获得高纯度人参皂苷Rg2。在梯度盐析中，非人参皂苷Rg2集中部分也可获得人参总皂苷。
该方法主要步骤包括取原料，水煎，浓缩，用低级烷醇沉淀杂质，弃去沉渣，回收低级烷醇，进行梯度盐析。用脱盐剂(阴阳离子交换树脂，吸附树脂或填料)脱盐、脱色，浓缩，再用不同浓度低级烷醇精制，然后进行重结晶。本方法获得C-20(SR)人参皂苷Rg2成品，也可获得少量的C-20(S)人参皂苷Rg2单一构型或C-20(R)人参皂苷Rg2单一构型，同时在残留物中回收人参总皂苷。
在本发明的方法中，人参皂苷Rg2可以从五加科人参属原料中提取而得到，该方法优选包括以下步骤a、将五加科人参属原料与沸水一起加热，五加科人参属原料可以包括例如植物人参叶、西洋参叶、人参果；b、浓缩水提取液，向其中加入低级烷醇，所述低级烷醇可以包括例如甲醇、乙醇、异丙醇、戊醇的一种或多种；c、上清液脱色处理后，加入乙醇回收；d、醇提取物用盐析物梯度盐析，所述盐析物可以包括例如氯化钠、硫酸钠、亚硫酸钠、硫酸铵、其它无毒无机盐的一种或多种；e、薄层层析跟踪下，得到人参皂苷Rg2集中部分；f、人参皂苷Rg2集中部分通过脱盐剂脱盐，脱色，浓缩，所述脱盐剂可以包括例如阴阳离子交换树脂或吸附树脂或填料；g、用不同浓度乙醇精制，得到所需产物，所述不同浓度乙醇，可以是例如50％、70％、80％、90％以上乙醇；本方法制备得到的产物组成为C-20(S)人参皂苷Rg2单一构型和/或C-20(R)人参皂苷Rg2单一构型和/或C-20(RS)人参皂苷Rg2混合构型。
人参叶、果或西洋参叶中提取分离的人参皂苷Rg2，按重量法计算，人参皂苷Rg2收率分别为0.3％、0.15％、0.25％左右。按HPLC法测定，纯度为90％以上。
本制备方法的优点是不需要特殊设备、操作简便、易行，收率高，成本低，对人体无害、安全，适合于大规模工业化生产。此外，本方法不影响回收剩余的其他皂苷。
本发明的含人参皂苷Rg2的药物组合物是指任何一种构型或混合构型的人参皂苷Rg2与一种或多种医药上可接受的载体/敷料制成的或者与任何一种或多种中药或西药制成的注射剂、胶囊、片剂、气雾剂、口服液、贴剂、栓剂，微囊和微球等。
其中优选含有50％以上人参皂苷Rg2为活性成分的药物组合物。
相关载体/敷料是指淀粉，滑石粉，糖，矫味剂，可溶性淀粉，糊精类，乙醇，聚乙二醇，丙二醇，植物油，明胶，以及吐温等其它表面活性剂。还包括例如稀释剂、赋形剂如水等；填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂，如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
人参皂苷Rg2可与相应药物载体结合制成各种制剂来进行应用，例如注射剂，如粉针剂和溶液注射剂等；片剂，如糖衣片和薄膜衣片等；胶囊剂，如普通和微型胶囊等；气雾剂；栓剂，如肛门和阴道栓等；口粘膜贴剂；口嚼片；糖浆剂及其它口服液等。
经大量研究发现，本发明制备得到的药物组合物对痴呆具有治疗作用，并具有抗抑郁和兴奋中枢及改善微循环的作用。
医学上，痴呆属于精神神经功能性障碍范畴，也称之为由脑部器质性疾病所致的智能(知觉、记忆、思维、推理和判断、情感等)障碍，其病因在于神经细胞的变性或死亡。已知抗痴呆药物仅增强神经递质即乙酰胆碱的作用，减轻一些症状，但不能抑制神经细胞的变性、死亡。痴呆初期不仅乙酰胆碱相关神经细胞受损，而且谷氨酸相关神经细胞也受损。因此，增强乙酰胆碱活性，在痴呆初期仅有一过性效果。谷氨酸是脑内含量较多的神经递质，在一定的程度上，若应用谷氨酸活性剂，其效果比乙酰胆碱活性剂更好一些，但谷氨酸活性剂不能阻抑神经细胞的受损，仅能增强剩余正常细胞功能，若过量，导致神经细胞的损伤。近来研究表明，不溶性淀粉样蛋白可损伤脑神经细胞，也是引起智能障碍的根本原因之一。因此，防止神经细胞的变性、死亡是治疗痴呆的一个关键环节。
抑郁症是临床上常见的精神失常性疾病，也是精神障碍性情感综合征，其病因与脑内单胺类神经递质排空增多或合成减少有关，已知抗抑郁药-丙米嗪使突触间隙去甲肾上腺素(NA)和5-羟色胺(5-HT)浓度增高，一些单胺氧化酶抑制剂也可使脑内单胺类递质增加。目前，抑郁症动物模型是在单胺递质学说的基础上建立起来的。因此，调节脑内单胺类神经递质是治疗精神失常性疾病或者精神障碍的重要环节。
研究发现，单一构型C-20(S)人参皂苷Rg2和单一构型C-20(R)人参皂苷Rg2均有同样的药理作用，因此二者不必再分离，在临床应用上直接应用混合态C-20(SR)人参皂苷Rg2即可。
本发明得到的人参皂苷Rg2在动物试验中显示了良好的治疗痴呆的作用，对不溶性β淀粉样蛋白或多发性脑梗塞所致记忆障碍都有明显的改善作用，并能调节脑神经细胞凋亡，抗凋亡相关基因蛋白表达，防止神经元的丢失及死亡，同时，它还可以抑制谷氨酸等兴奋性氨基酸引起的相关神经细胞受损。此外，动物实验表明它可明显增加明显增加脑内单胺类神经递质，具有明显的抗抑郁作用；明显缩短戊巴比妥钠所致睡眠时间，具有兴奋大脑皮层作用。


图1是人参叶中分离的人参皂苷Rg2粗品HPLC纯度图；图2是人参叶中分离的人参皂苷Rg2HPLC纯度图；图3是人参叶中分离的S型人参皂苷Rg2HPLC纯度图；图4是人参叶中分离的R型人参皂苷Rg2HPLC纯度图；图5是西洋参叶中分离的混合构型人参皂苷Rg2HPLC纯度图；图6是人参果中分离的人参皂苷Rg2HPLC纯度图。
具体实施例方式
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实验实施例1人参皂苷Rg2提取分离方法取100kg人参叶粗粉，水煎三次，每次3小时，合并煎液，过滤，滤液浓缩，加入3倍量95％乙醇，沉淀杂质，弃去沉渣，用活性炭脱色，回收乙醇。乙醇提取物在10倍水中溶解后，加入硫酸铵(农用化肥)或氯化钠(食用盐)，使溶液浓度达到饱和，静止沉淀8小时。取沉淀物，再溶解于水中，用氯化钠或硫酸胺分别进行梯度(5％、10％、15％、20％、30％浓度)盐析，分别收集沉淀物。因溶液中溶质量不同，梯度盐析浓度有所差异。因此，在薄层层析跟踪下，获取人参皂苷Rg2集中部分和非人参皂苷Rg2部分，人参皂苷Rg2集中部分用离子交换树脂或吸附树脂脱盐、浓缩至1000ml，加入95％的乙醇，使溶液中的乙醇浓度达到50％以上，开始析出粗结晶，纯度为75.81％，结果见表1.1及图1。取粗结晶，再用不同浓度(50％、70％、80％、90％以上)乙醇依次精制，获得混合态构型C-20(SR)人参皂苷Rg2238g；单一构型C-20(S)型人参皂苷Rg220g；和单一构型C-20(R)型人参皂苷Rg230g。在非人参皂苷Rg2部分中获得了人参总皂苷2100g。
表1.1人参叶中分离的人参皂苷Rg2粗品HPLC纯度结果(检测器A，203nm)


按重量法和HPLC法测定，获得C-20(SR)人参皂苷Rg2收率为0.24％，纯度为96.80％；C-20(S)型人参皂苷Rg2收率为0.02％，纯度为71.48％；C-20(R)型人参皂苷Rg2收率为0.03％，纯度为87.78％，结果见表1.2、图2，表1.3、图3，表1.4、图4。
表1.2人参叶中分离的人参皂苷Rg2HPLC纯度结果(检测器A，203nm)


表1.3人参叶中分离的S型人参皂苷Rg2HPLC纯度结果(检测器A，203nm)


表1.4人参叶中分离的R型人参皂苷Rg2HPLC纯度结果(检测器A，203nm)

另取西洋参叶50kg，按人参叶提取分离方法，同样获得C-20(SR)人参皂苷Rg275g，收率为0.15％，纯度为97.41％，结果见表1.5及图5。表1.5西洋参叶中分离的混合构型人参皂苷Rg2HPLC纯度结果(检测器A，203nm)

另取人参果50kg，加少量水，搓取果肉，去种子的果浆。水浓缩，用乙醇回流提取，弃去沉渣，取提取物，用活性炭脱色，回收乙醇，按人参叶分离方法，盐析，脱盐、脱色、除杂质。用乙醇精制，获得C-20(SR)人参皂苷Rg2成品125重量法为计，其收率为0.25％，用HPLC法测的纯度为98.65％，结果见表1.6及图6。
表1.6人参果中分离的人参皂苷Rg2HPLC纯度结果(检测器A，203nm)


实验实施例2人参皂苷Rg2的抗痴呆作用(1)人参皂苷Rg2对大鼠海马CA1区内注射淀粉样蛋白(Aβ1-40)引起的记忆障碍影响实验采用阿尔茨海默氏痴呆(AD)模型。取大鼠70只，均分7组，用水合氯醛麻醉，除假手术组外，其余各组于海马CA1区内注射Aβ1-40(4μg)与鹅膏蕈氨酸(1μg)共1μL。造模型后，按表1.1所示剂量ip受试药物，模型组ip等体积生理盐水，每日1次，共7日。所用受试药物为单一构型C-20(S)型人参皂苷Rg2、单一构型C-20(R)型人参皂苷Rg2和混合态C-20(SR)人参皂苷Rg2(以下实验均简称为S、R、SR)。于给药第6天，进行Y型电迷宫检测，观察大鼠的学习记忆能力。计算大鼠连续9/10次正确时所需要的刺激次数作为学习能力。记忆检测后24小时，取海马CA1区注射针尖位置处前后连续切片，取部分切片分别进行尼氏染色，HE染色，免疫组化和原位细胞凋亡检测。观察海马神经元细胞带变形、坏死、细胞丢失的程度，细胞凋亡数，BAX/Bcl-2和C-fos表达程度。
HE染色结果可见假手术组海马损伤小，仅仅在针道周围造成轻微损伤，少量胶质细胞浸润，锥体细胞带完整，无缺失。模型组有大量的胶质细胞浸润，有显著的神经元的丢失，丢失部位从注射点附近的CA1延伸到远程地区，可见很长的锥体颗粒细胞带消失，高倍镜下见到神经元胞膜破裂、细胞萎缩、胞核变小，凋亡小体明显。各构型人参皂苷Rg2组局部胶质细胞浸润不明显，锥体细胞带和颗粒细胞带紊乱、变稀、细胞带消失不明显，高倍镜下细胞膜完整，偶见凋亡小体，但距CA1较远处很少有或仅有很轻的病理改变。
行为学检测结果显示，各构型人参皂苷Rg2均能明显改善，脑内注射Aβ1-40与鹅膏蕈氨酸(IBA)大鼠的学习记忆障碍(P＜0.01)。见表2.1。
尼氏染色结果显示，脑内注射Aβ1-40与IBA可以造成大范围的神经元的丢失，各构型人参皂苷Rg2均可以不同程度的减轻神经元丢失(假手术组未测)，见表2.2。
TUNEL检测结果显示，海马内注射Aβ1-40与IBA可明显诱发神经细胞凋亡，各构型人参皂苷Rg均可减轻诱发的细胞凋亡(假手术组未测)，结果见表2.3。
Bax、Bcl-2表达结果显示，模型组bax的表达提高，bcl-2的表达降低，而各构型人参皂苷Rg2组和尼莫地平组Bax的表达降低，Bcl-2的表达升高。说明各构型人参皂苷Rg2对异常Bax和Bcl-2的基因表达有调节作用。见表2.4、2.5。
总之，Aβ1-40与IBA混合液给大鼠脑内海马区内注射时，均可出现AD行为和病理改变。各构型人参皂苷Rg2能够明显改善AD大鼠的学习和记忆能力，防止神经元的丢失，增加脑内C-fos和bax的表达，抑制bcl-2的表达。从而保护神经元，防止神经细胞的凋亡。
表2.1人参皂苷Rg2对Aβ1-40与IBA海马内注射引起大鼠学习记忆障碍的影响(x±S，n＝10)

与假手术组比较ΔΔP＜0.01；与模型组比较**P＜0.01表2.2人参皂苷Rg2对Aβ1-40与IBA海马内注射引起神经元丢失的影响(x±S，n＝10)

注与模型组比较**P＜0.01表2.3人参皂苷Rg2对Aβ1-40与IBA海马内注射引起神经元凋亡的影响(x±S，n＝10)

注与模型组比较*P＜0.05表2.4人参皂苷Rg2对大鼠海马神经元中bax和bcl-2的表达强度的影响

与假手术组比较ΔΔP＜0.01；与模型组比较**P＜0.01表2.5人参皂苷Rg2对大鼠海马神经元中C-fos的表达强度的影响

与假手术组比较ΔΔP＜0.01；与模型组比较*P＜0.05**P＜0.01(2)对多发梗塞性痴呆影响实验采用用多发梗塞性痴呆(Multiple Infarct Dementia，MID)模型。取大鼠56只，按表2.1分成7组，将大鼠用10％的水合氯醛ip麻醉，将复合血栓诱导剂以0.13ml/100g注入颈内动脉，复位解剖结构，逐层缝合皮肤。假手术对照组注入等量生理盐水。于造模型后，按表2.1所示剂量iv受试药物，模型组iv等体积的溶媒，每日1次，共7天。于给药后第6天，进行Y型电迷宫检测，观察大鼠的学习和记忆能力。记录大鼠连续9/10次正确反应时所需要的刺激次数作为学习成绩，第二天再记录连续9/10次正确反应时所需要的刺激次数作为记忆成绩，结果进行组间t检验。记忆测试完毕后24小时，断头取脑，取前囟前2mm至前囟后5mm脑块入4％的多聚甲醛后固定过夜，石蜡包埋，用石蜡切片机作冠状连续切片，片厚7μm。取部分切片分别进行尼氏染色，免疫组化检测。实验结果如下学习记忆结果显示，模型组大鼠学习记忆次数明显增加，而各构型人参皂苷Rg2和尼莫地平组明显减少。表明各构型人参皂苷Rg2对多发梗塞性痴呆有明显改善作用，见表3.1。
表3.1各构型人参皂苷Rg2对大鼠在Y迷宫中的学习成绩比较(x±S)

与假手术对照组比较ΔP＜0.01；与模型组比较*P＜0.05免疫组化结果显示，各构型人参皂苷Rg2各组大鼠CPU区Glu、Bax、Caspase-3、Calpain II阳性神经元表达数目均明显减少，表明对该异常基因表达；有调节作用。见表3.2、表3.3。
表3.2各构型人参皂苷Rg2对大鼠CPU区Glu和Bax阳性神经元数目比较(x±S)

与假手术对照组比较ΔΔP＜0.01；与模型组比较*P＜0.05 **P＜0.01
表3.3各构型人参皂苷Rg2对大鼠CPU区Caspase-3和CalpainII阳性神经元数目比较(x±S)

与假手术对照组比较ΔΔP＜0.01；与模型组比较**P＜0.01总之，单侧大脑注射复合血栓诱导剂可造成大鼠的学习记忆能力降低，可部分模拟MID的行为和病理学改变。各构型人参皂苷Rg2能明显改善MID模型大鼠的学习记忆成绩，其作用与凋亡蛋白CalpainII、Caspase-3、Bax表达降低有关。
(3)人参皂苷Rg2对PC12细胞损伤后MTT代谢的影响将培养的PC12细胞以105个/ml的密度接种于96孔板中，每孔100μl，每组6孔，待细胞贴壁后，正常对照组加入无血清培养基；模型组加入含有1mmol/L谷氨酸的无血清培养基和等体积溶媒；给药组分别加入含有谷氨酸培养基和各构型人参皂苷Rg20.1mmol/L以及尼莫地平5pmol，持续孵育20h。每孔加入MTT(5g/L)20μl于37℃继续孵育4h，然后吸出原有培养基，每孔加入0.1ml二甲基亚砜，吹打溶解紫色颗粒，用酶标仪测定490nm处的光密度(OD)。结果进行组间t检验，见表4。
表4人参皂苷Rg2对谷氨酸损伤PC12细胞所致MTT变化(x±S，n＝4)

与正常对照组比较ΔP＜0.05；与模型组比较*P＜0.05结果，模型组明显降低MTT代谢，表明，谷氨酸损伤了部分PC12细胞。各构型人参皂苷Rg2及尼莫地平，均明显增加PC12细胞对MTT代谢，且各构型人参皂苷Rg之间无明显差异。说明，各构型人参皂苷Rg2均可抑制谷氨酸对PC12细胞的损伤。
实验实施例3抗抑郁及中枢兴奋作用(1)对大鼠脑组织NE、DA、5-HT含量的影响抑郁症常用模型采用药物或应激性刺激法，使脑组织NE、DA、5-HT含量降低，引起中枢抑制症。本实验采用脑缺血再灌法，使脑组织NE、DA、5-HT含量降低。
取大鼠56只，均分7组，麻醉，除假手术组外，各鼠自左侧颈外动脉导入栓线(4-0号聚乙烯线)到颈内动脉，阻塞大脑中动脉(MCA)。从阻断血流开始计时，0.5小时后，提拉栓线再灌。各组动物均于手术日、术后第1天、第2天、第3天、第4天，按表4.1所示剂量ip受试药物，模型组ip等体积溶媒，每日1次，连续5天。术后2天，进行Y型电迷宫检测，记录大鼠连续9/10次正确反应时所需要的刺激次数作为学习成绩，第二天再记录连续9/10次正确反应时所需要的刺激次数作为记忆成绩。第6天，断头取脑，匀浆，测定脑组织NE、DA、5-HT含量。结果进行组间t检验，见表5.1、表5.2。
表5.1人参皂苷Rg2对大鼠学习记忆差别的比较(x±S，n＝8)

与假手术组比较ΔΔP＜0.01；与模型组比较**P＜0.01表5.2人参皂苷Rg2对大鼠脑组织NE、DA、5-HT含量的影响(x±S，n＝8)


与假手术组比较ΔΔP＜0.01；与模型组比较*P＜0.05**P＜0.01结果显示，模型组学习记忆能力和脑内NE、DA、含量明显降低，而各构型人参皂苷Rg2及尼莫地平组均明显提高学习记忆能力和增加NE、DA和5-HT含量。
根据单胺类理论，各构型人参皂苷Rg2对抑郁症或中枢神经兴奋/抑制紊乱性疾病有明显的改善作用。
(2)对戊巴比妥钠睡眠时间的影响取雄性小鼠38只，按表5所示分组及iv人参皂苷Rg2，对照组iv等体积溶媒，各组同时ip 50mg·kg-1戊巴比妥钠，以翻正反射消失为指标，记录各组小鼠睡眠时间，结果进行组间t检验，见表6。
表6人参皂苷Rg2对小鼠戊巴比妥钠睡眠时间的影响(x±S)

与对照组比较，*P＜0.05由表6显示，混合态人参皂苷Rg2均明显缩短戊巴比妥钠睡眠时间，说明人参皂苷Rg2对中枢神经系统有兴奋作用。
根据以上实验结果，人参皂苷Rg2对痴呆，抑郁症，记忆减退，均有治疗作用。
实验实施例4改善微循环作用(1)人参皂苷Rg2对小鼠耳廓微循环的影响取雄性小鼠68只，按表6.1所示分6组，用乌拉坦ip麻醉，将耳廓置于显微镜下，找一条微静脉(V)和微动脉(A)，分别测定其管径，观察并记录其流态，按表6.1所示剂量iv各受试药物(对照组iv等体积的生理盐水)后5分钟，再iv肾上腺素0.01mg·kg-1，测定iv肾上腺素后不同时间管径、流态、网交点数。计算iv肾上腺素前-后变化百分率。结果进行组间t检验，见表7.1、表7.2、表7.3。
表7.1人参皂苷Rg2对小鼠耳廓微循环(v)的影响(x±S)

与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001表7.2人参皂苷Rg2对小鼠耳廓微循环(A)的影响(x±S)

与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001表7.3人参皂苷Rg2对小鼠耳廓微循环网交点的影响(x±S)


与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001结果显示，各构型人参皂苷Rg2明显抑制由肾上腺素引起的小鼠耳廓微动脉、微静脉管径缩小及网交点数减少。其中，抑制微静脉管径缩小的作用强于微动脉。
(2)人参皂苷Rg2对离体兔耳灌流量的影响取大耳白兔33只，按表7分4组，用戊巴比妥钠麻醉，剥离耳根动脉，插管，用Locke溶液冲洗残留血液，剪断兔耳，进行灌流。稳定后记录给药前后3min内灌流滴数，按表7所示剂量侧管给药，对照组侧管给予体积溶媒，以给药前后灌流滴数变化值来表示末梢血管扩张程度。结果进行组间t检验，见表8。
表8人参皂苷Rg2对离体兔耳灌流量的影响(x±S)

与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001结果显示，混合构型人参皂苷Rg2在所用剂量下明显增加灌流滴数，说明对末梢血管有扩张作用。
以上实施例可以进一步表明本发明的积极效果实施1表明，人参皂苷Rg2制备方法，用梯度盐析法代替了传统的硅胶层析，操作简便易行，适合于大量制备。用不同浓度乙醇替代了价格昂贵的混合有机溶剂，成本低，对人体无害、安全，适合于大规模工业化生产。此外，本方法不影响回收剩余的其它皂苷。
实施2表明，各构型人参皂苷Rg2对不溶性β淀粉样蛋白或多发性脑梗塞所致痴呆动物的记忆障碍有明显的改善作用，并能调节脑神经细胞凋亡/抗凋亡相关基因蛋白表达，防止神经元的丢失及死亡，并可抑制谷氨酸对PC12细胞的损伤。
实施3表明，各构型人参皂苷Rg2，明显增加脑缺血再灌注大鼠脑内NE，5-HT，DA等单胺类神经递质。根据单胺学说，人参皂苷Rg2具有明显的抗抑郁作用。此外，人参皂苷Rg2能明显缩短戊巴比妥钠所致睡眠时间，说明人参皂苷Rg2对大脑皮层有兴奋作用。
实施4表明，不同构型人参皂苷人参皂苷Rg2，对小鼠耳廓微循环樟碍有明显的改善作用。并能增加离体兔耳灌流量，说明对末梢血管有扩张作用。
权利要求
1.一种制备人参皂苷Rg2的方法，包括将原料水煎、滤液浓缩、用低级烷醇沉淀除渣，将提取液用梯度盐析法进行盐析，再用脱盐剂脱盐并用低级烷醇精制，然后进行重结晶。
2.根据权利要求1的方法，包括以下步骤a、将原料与沸水一起加热；b、浓缩水提取液，向其中加入低级烷醇，弃去残渣；c、上清液脱色处理后，加入乙醇回收；d、乙醇提取物用盐析物梯度盐析；e、薄层层析跟踪下，得到人参皂苷Rg2集中部分；f、人参皂苷Rg2集中部分通过脱盐剂脱盐，脱色，浓缩；g、用不同浓度乙醇精制，得到所需产物。
3.按照权利要求2的方法，其中所述的原料选自五加科人参属植物人参叶、西洋参叶、人参果之一。
4.按照权利要求2的方法，其中所述的低级烷醇选自甲醇、乙醇、异丙醇、戊醇的一种或多种。
5.按照权利要求2的方法，其中所述的盐析物选自氯化钠、硫酸钠、亚硫酸钠、硫酸铵，其他无毒无机盐的一种或多种。
6.按照权利要求2的方法，其中所述的脱盐剂选自阴阳离子交换树脂或吸附树脂或填料。
7.一种按照权利要求1～6任一项所述方法，其中制备的人参皂苷Rg2的组成为包括单一构型的C-20(S)人参皂苷Rg2和/或单一构型的C-20(R)人参皂苷Rg2和/或两者共存的混合构型即C-20(SR)人参皂苷Rg2。
8.一种用于治疗或预防痴呆，抑郁症，外周微循环障碍等疾病中一种或多种的药物组合物，其中含有治疗有效量权利要求7的人参皂苷Rg2作为活性成分并含有药学上一种或多种药用载体和/或辅料。
9.人参皂苷Rg2在治疗或预防痴呆，抑郁症，外周微循环障碍药物中的应用。
10.按照权利要求9所说的应用，其中痴呆选自早老性痴呆，血管性痴呆的一种或多种。
全文摘要
本发明涉及一种适用于工业化生产的人参皂苷Rg
文档编号A61P9/00GK1763069SQ20041008645
公开日2006年4月26日 申请日期2004年10月20日 优先权日2004年10月20日
发明者李龙云, 田建明, 金毅 申请人:吉林省中医中药研究院