专利名称：人工培养蛹虫草中的核苷类活性物质及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及人工培养蛹虫草(Cordyceps militaris(L.)Link)中的核苷类活性物质，及其制备方法和用途。
背景技术：
蛹虫草[Cordyceps militaris(L.)Link]，别名北冬虫夏草、北虫草，属真菌门(Eumycota)子囊菌亚门(Ascomycotina)核菌纲(Pyrenomycetes)球壳菌目(Sphaeriales)麦角菌科(Clavicipitaceae)虫草属(Cordyceps)，国内外学者认为蛹虫草的无性阶段是头孢菌(Cephalosporium)或拟青霉(Paecilomyces)。蛹虫草为广布种，主要分布在中国、美国、日本、前苏联、西德、加拿大、意大利等国。我国主要生长在吉林、辽宁、河北、陕西、广西、广东、云南、四川、贵州、湖北、湖南等省区。
冬虫夏草一般生长在海拔3800米雪线以上的高寒地区，对生长环境的海拔高度、气候条件等有特殊的要求，自然资源匮乏。冬虫夏草的生物学研究表明，冬虫夏草及其寄生的蛹都存在世代交替现象，并且可供营寄生的蛹的品种单一，对寄生蛹的生长周期要求也非常严格，故给人工模拟其生长条件带来了困难。研究人员曾在多种培养基上及某些虫体上接种培养，除在不同培养基及有的虫体上能形成棒状孢梗束外，目前尚未观察到有子囊壳及子囊孢子的有性阶段的子座(宋振玉，中草药现代研究，北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1995.100-110)。
由于冬虫夏草的人工培养不能获得子座，国内外学者将注意力集中到寻求代用品方面及应用生物技术的发酵工程开展了冬虫夏草的液体深层发酵，相继研制成功了一些发酵菌丝产品并投放医疗市场，例如金水宝胶囊、宁心宝胶囊、至灵胶囊等。
蛹虫草多生长在次生林带，地表环境以针叶林、阔叶林或混合林中，环境的要求没有冬虫夏草严格，生长的海拔高度一般在150-500米之间，生活在土中或树叶、草丛及地表的树皮缝里，其寄主多为鳞翅目昆虫的蛹或幼虫(徐锦堂，中国药用真菌学，人民卫生出版社，1995.354-395)。目前，有报道显示蛹虫草的人工培育可以将从天然蛹虫草中分离、纯化得到的菌种接种在固体培养基上长出子座，与天然的蛹虫草子座颜色和形状完全相同(冉翠香，人工培植蛹虫草子实体的诱发形成，食用菌，2001.23(4)9-10)。对蛹虫草的液体培养可达到无性阶段，形成菌丝体，并对其发酵工艺进行了初步的探索(王青牡、孙姝媛，我国液体培养药用虫草菌丝体的研究进展，食用菌，1997.16(3)2-4)。
虫草属真菌中化学成分众多，包括核苷类化合物、虫草多糖、甾醇类、氨基酸、肽类、有机酸、维生素和微量元素等。其中核苷类化合物包括虫草素、腺苷、鸟苷、尿苷、腺嘌呤、尿嘧啶、次黄嘌呤、次黄嘌呤核苷等。
Cunningham和Frederiksen(Cunningham K G等，J Chem Soc，1951，2299-2307；Frederiksen，Matting等，Biochem Bio Acta，1965，95189-193)等于50年代首次报道了从蛹虫草的培养液中分离出核苷类抗菌素—虫草素并发现其显著的抗癌活性，引起了人们对虫草属真菌中核苷类化合物的广泛重视，新的核苷类物质不断被发现。徐文豪(徐文豪等，冬虫夏草的水溶性成分—核苷类化合物的研究，中药通报，1988，13(4)226～228)等利用强酸性离子交换树脂、大孔吸附树脂和硅胶柱层析从西藏产冬虫夏草的子座中分得次黄嘌呤核苷、胸腺嘧啶、尿嘧啶和杂有鸟嘌呤的次黄嘌呤；从虫体中得到微量次黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和腺苷。刘静明(刘静明等，蛹虫草化学成分研究，中国中药杂志，1989，14(10)32-33)等利用Dowex-I[氯型]树脂柱从蛹虫草菌丝中分离得到腺嘌呤、腺苷及虫草素。刘柯(姜泓等，人工蛹虫草子实体化学成分，药学学报2000，35(9)663-668)等利用硅胶柱色谱、制备液相、制备薄层等方法从人工培养的蛹虫草子实体的乙醇提取物中分离得到虫草素、腺苷、N6-甲基腺苷、O5′-乙酰基虫草素、N6-[β-(乙酰胺甲酰)氧乙基]腺苷等5个核苷类化合物。
本发明人的对比研究显示虽然蛹虫草与冬虫夏草的营养成分分析国内报道较多，但蛹虫草核苷类多种成分的含量分析未见详细报道。本研究组经过HPCE法测定发现，人工栽培蛹虫草子座中虫草素的含量可达天然蛹虫草子座5.04倍，液体培养蛹虫草发酵菌丝中虫草素、腺苷、鸟苷含量可分别达天然蛹虫草子座的10.85、2.58、3.99倍。由此可见，在天然冬虫夏草、蛹虫草资源不断减少的情况下，可以利用人工培养的蛹虫草子座和液体培养的菌丝作为替代品。
人工培养的虫草菌丝及子座中核苷类化合物的含量多数接近、有的甚至超过了天然虫草。尤其是人工培养的蛹虫草菌丝及子座中虫草素的含量明显高于天然虫草，这就为把人工培养虫草作为天然虫草的代用品提供了理论依据。
20世纪70年代，国外科学家曾对虫草素的抗癌活性进行了大量研究，但由于其细胞毒性过大而放弃。本发明主要依据中医药用药中各组分/成分“相辅相成”之原则，意外地发现人工培养蛹虫草中的核苷类活性物质具有良好的体内和体外抑制肿瘤的作用，同时细胞毒性降低，成本也降低。
本发明人在文献检索过程中并未发现关于人工培养蛹虫草中的核苷类活性物质及其制备方法和用途的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种来源于人工培养蛹虫草中的核苷类活性物质及其制备方法和用途，通过本发明的制备方法提取得到的人工培养蛹虫草中的核苷类活性物质可以直接用于肝癌的治疗中。
本发明是通过如下的技术方案来实现的。在无菌条件下，将野生蛹虫草的子座和蛹体用75％乙醇消毒20-30秒，用无菌水反复冲洗，无菌纱布吸干水分，再用0.1％升汞溶液浸泡30秒，用无菌水反复冲洗干净。用无菌手术刀按子座头、子座柄、蛹体分别切成小块，接种于PDA平板培养基上，23℃恒温暗培养8天。长出白色菌落后，接种于斜面培养基上，23℃恒温箱暗培养8天。再继代一次，斜面上长满白色菌丝体，菌落呈白色绒毛状，质地紧密，边沿整齐，继1-2代后，作为母种保存备用。
将蛹虫草母种接入固体培养基中，接种量为5ml/瓶，25℃暗培养，菌丝刚刚覆盖培养基后，取出在自然光照下培养，室温控制在20-22℃，相对湿度80％，当子座长高至4-5cm，子座头上出现粒刺，表明已成熟，用镊子夹出子座，自然风干，即得。
本发明的人工培养蛹虫草干品也可以采用教科书中常规的或者文献中报道的人工培养蛹虫草的方法培养得到。
将人工培养蛹虫草干品粉碎，加入5-12重量倍数的蒸馏水温浸提取1-4次，过滤，合并滤液，减压浓缩滤液得浸膏；将此浸膏用酸溶解，过滤得酸液，酸液用二氯甲烷萃取；萃取后的酸液用NaOH碱化至pH10，再用正丁醇萃取1-5次，合并正丁醇萃取液，经减压浓缩得核苷类活性物质。本发明的核苷类活性物质的主要化学成分及其含量见下表1。
表1毛细管电泳法测定人工培养的蛹虫草干品中核苷类化合物的含量(μg/g)
将该核苷类活性物质，制成粉末剂、片剂、胶囊等剂型，可用于抑制肝部肿瘤。
用本发明的核苷类活性物质制成的抗肿瘤药物，可有64.3％的抑瘤率，同时因为是天然生物提取物质，具有低毒的特点。本发明的人工培养蛹虫草中的核苷类活性物质的提取方法，直接将人工培养蛹虫草干品粉碎后进行水提，经简单去杂后，再用正丁醇萃取，经减压浓缩即得核苷类活性物质。可达到将核苷类物质提取物在分离提取的同时得到纯化的效果，更好地适用于医药用途。
最佳实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
人工培养蛹虫草干品240g，粉碎，按1∶8的比例(w/w)加入蒸馏水，60℃水浴温浸提取二次，每次2小时，过滤，合并滤液，减压浓缩滤液得浸膏I。
浸膏I用2％稀盐酸溶解，过滤得酸液，酸液用二氯甲烷萃取五次；萃取后的酸液用稀NaOH碱化至pH10，再用正丁醇萃取三次，合并正丁醇萃取液，经减压浓缩得到人工培养蛹虫草核苷类活性物质，它的纯度有了很大的提高。
实施例2抑癌率考察体外抑癌率实验1、分别吸取小鼠肝癌H22的细胞悬液(肝癌H22瘤源鼠腹水与10％小牛血清1640培养液按1∶4制成)；2、取细胞悬液2ml加入48孔培养板中，对照组用培养液代替，实验组加入蛹虫草核苷类活性物质的溶解悬液200μl，每种受试药物设5个平行孔。放入5％CO2、37℃细胞培养箱中，培养48小时。
4、用0.4％胎盼蓝溶液对上述实验组和对照组进行染色，活细胞不着色，死细胞着色，显微镜下计数活细胞数，计算体外抑瘤率。
体内抑癌实验选8-10周龄昆明种小鼠2只，进行肿瘤细胞移植，取接种7天生长良好的H22小鼠，无菌条件下抽取腹水，用生理盐水以1∶3稀释(v/v)。
选8-10周龄昆明种小鼠40只，雌雄各半，于小鼠腹股沟接种H22细胞悬液0.2ml，接种次日，称重，随机分为4组，实验组每鼠用蛹虫草提取液灌胃1ml，对照组在同样条件下，用生理盐水灌胃1ml，连续10天，接种第11天停药，次日处死动物，剥瘤称重，按公式计算抑瘤率，重复3次实验。
生存天数和生命延长率选8-10周龄昆明种小鼠2只，进行肿瘤细胞移植，取接种7天生长良好的H22小鼠，无菌条件下抽取腹水，用生理盐水以1∶3稀释(v/v)。
选8-10周龄昆明种小鼠40只，雌雄各半，于小鼠腹腔接种H22细胞悬液0.2ml，接种次日，称重，随机分组，分组、给药方法与抑癌率考察实验中相同，每天观察小鼠的存活变化。计算生命延长率。
实验结果体外抑瘤作用表2.人工培养蛹虫草中核苷类活性物质对体外培养的肝癌H22细胞的影响
体外抑瘤实验结果表明，人工培养蛹虫草中总核苷对肝癌H22细胞有一定的杀伤作用，提示其具有直接的细胞毒作用。
体内抑瘤作用
表3蛹虫草提取液对小鼠移植性肝癌H22的抑制作用
与对照组比较，***P＜0.001；体内抑瘤实验结果表明，试验组与对照组相比有显著差异(P＜0.001)。说明本发明的人工培养蛹虫草中核苷类活性物质具有显著的体内抑瘤作用。
对生命延长率的影响表4蛹虫草提取液对H22腹水小鼠生存期的影响
与对照组比较，***P＜0.001人工培养的蛹虫草子座可延长肝癌H22荷瘤小鼠
的生存时间，试验组与对照组比较差异极显著(P＜0.001)。
对荷瘤小鼠生存质量的影响实验中可以观察到小鼠接种瘤细胞后第3天开始，皮下可触及肿瘤生长的结节8-9天后，全部小鼠均产生结节。给药组小鼠的存活状态明显比对照组好。对照组小鼠毛色暗淡，杂乱，行动迟缓。相比之下，给药组小鼠毛色较亮，较为活跃。
对肿瘤转移的影响对照组小鼠经病理证实有86个转移灶，给药组小鼠中低、中、高剂量组分别发现了36、30和27个转移灶。在高剂量组小鼠的病理检查中发现有15个转移灶的周围形成包被，其他实验组的癌灶周围没有此现象发生，这一结果表明人工培养蛹虫草子座总核苷对小鼠癌灶的转移有明显的抑制作用的原因之一有可能是核苷类化合物可调节小鼠机体的免疫功能，在癌灶周围形成包被而减少肿瘤转移的发生。
权利要求
1.一种人工培养蛹虫草(Cordyceps militaris(L.)Link])中的核苷类活性物质，所述核苷类活性物质通过以下方法制备，方法包括直接将人工培养蛹虫草干品粉碎，加入5-12重量倍数的蒸馏水温浸提取1-4次，过滤，合并滤液，减压浓缩滤液得浸膏；将此浸膏用酸溶解，过滤得酸液，酸液用二氯甲烷萃取；萃取后的酸液用NaOH碱化至pH10，再用正丁醇萃取1-5次，合并正丁醇萃取液，经减压浓缩得核苷类活性物质。
2.权利要求1的人工培养蛹虫草的核苷类活性物质的制备方法，该方法包括将人工培养蛹虫草干品粉碎，加入5-12重量倍数的蒸馏水温浸提取1-4次，过滤，合并滤液，减压浓缩滤液得浸膏；将此浸膏用酸溶解，过滤得酸液，酸液用二氯甲烷萃取；萃取后的酸液用NaOH碱化至pH10，再用正丁醇萃取1-5次，合并正丁醇萃取液，经减压浓缩得核苷类活性物质。
3.按照权利要求2的人工培养蛹虫草的核苷类活性物质的制备方法，该方法包括将人工培养蛹虫草干品粉碎，加入8重量倍蒸馏水，60℃水浴温浸提取2次，每次2小时，过滤，合并滤液，减压浓缩滤液得浸膏I；浸膏I用2％稀盐酸溶解，过滤得酸液，酸液用二氯甲烷萃取5次；萃取后的酸液用稀NaOH碱化至pH10，再用正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，经减压浓缩得到人工培养蛹虫草核苷类活性物。
4.一种含有权利要求1的人工培养蛹虫草中的核苷类活性物质的药物组合物。
5.权利要求1的人工培养蛹虫草中的核苷类活性物质在制备用于抑制肿瘤的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种人工培养蛹虫草(Cordycepsmilitaris(L.)Link])中的核苷类活性物质，及其制备方法和用途，所述制备方法包括直接将人工培养蛹虫草干品粉碎，加入蒸馏水温浸提取，过滤，合并滤液，减压浓缩滤液得浸膏；将此浸膏用酸溶解，过滤得酸液，酸液用二氯甲烷萃取；萃取后的酸液用NaOH碱化至pH10，再用正丁醇萃取，合并正丁醇萃取液，经减压浓缩得核苷类活性物质。药理研究表明，上述活性物质对肝癌H
文档编号A61P35/00GK1821254SQ20051000773
公开日2006年8月23日 申请日期2005年2月16日 优先权日2005年2月16日
发明者于荣敏, 汪宇 申请人:于荣敏, 汪宇