专利名称：一种用于治疗神经退行性病变的胚胎干细胞及其培养基和制备方法
技术领域：
本发明涉及胚胎干细胞技术领域，特指一种用于治疗神经退行性病变的胚胎干细胞及其培养基和制备方法。
背景技术：
中风、帕金氏病等是由神经脑细胞退行性病变所引起的神经中枢系统疾病；中风是一种心血管疾病，当运输血液到脑部的血管阻塞或破裂，其相关的大脑区域在几分钟内可能坏死；既使病人进行适当的治疗，受损部位能够重新获得的血液供应；但由于神经细胞的损伤具有不可恢复性，病人可能出现半身不遂、口眼歪斜，严重的可能危机生命；对于急性中风病人，即使抢救及时，很多人丧失了生活自理能力；而大脑皮层、下丘脑、海马、纹状体区域是中风多发部位，据世界卫生组织统计，每年大约有一千七百万人死于中风。
另外一种比较常见的神经退行性病变是帕金氏病，其病变为大脑黑质中的多巴胺神经细胞退行性死亡，其临床表现为肢体僵硬、静止性颤抖，病人生活不能自理；其主要的治疗手段是服用L-多巴，但不能从根本上根除疾病；随着服用时间的延长，病人表现对药物的耐受性。
神经退行性病变不仅仅局限于这两种，视病灶发生的部位可能表现为不同的症状，根据其病理机制等，神经退行性病变可以为重症肌无力肌萎缩(ALS)、多发性硬化(multiple sclerosis)等；其根本的病因是行使其功能的神经细胞死亡，其缺损的组织为胶质细胞所代替；理论上其缺失部位的神经递质合成，传递损伤，随后伴随着上下信息传递受阻；尽管有文献报道，在一定的环境下神经细胞可以自我繁殖，但其自我增生繁殖的能力非常有限，受损的功能很难用一两种神经递质药物来代替。
干细胞具有无限繁殖、多极分化的能力，他能分化成神经、肌肉、心脏等细胞；其典型的代表是精卵结合后的胚胎细胞，他能分化成全身各种类型的细胞；随着身体的发育，大多数胚胎细胞失去其全能性，成为分化完全的细胞；但仍然有一些细胞保留着全身分化的能力；这些细胞散布在全身各处，包括骨髓、脐带血、肝脏，甚至以前认为已经高度分化的大脑，也发现了干细胞。
在适当的环境刺激下，干细胞能够定向分化成所需要的细胞，Sanchez-Romans(美国，Exp.Neurol，171109-115；2001)等报道，在神经生长因子和叶酸的刺激下，骨髓细胞能形体发生改变，伸出很多辏突，成为神经样细胞；这些细胞呈现神经胶质细胞因子(GFAP)，脑纳素(BNP)抗原阳性；Alison(美国、Stem Cells.2005 Nov-Dec；23(10)1560-70)等的研究表明即使在通常的细胞培养条件下，脐带血细胞也能够分化成神经样细胞；并且，能与抗GFAP、Tuj1(轴突特异性蛋白)、NeuN(成熟神经元特异性蛋白)抗体相结合，组织化学染色现阳性；当这些细胞移植到动物体内，他们分化为神经样细胞，促使大脑损伤的康复；因此，干细胞能够用来治疗神经退行性病变。
发明内容
本发明解决的技术问题在于提供一种用于治疗神经退行性病变的胚胎干细胞及其培养基和制备方法；可有效地治疗神经退行性病变引起的各种疾病。
本发明解决的技术问题是通过如下技术方案实现的从胚胎组织中分离肝脏、脾脏制成的细胞悬液的细胞总数为5-200×106/ml，其成分主要有a、颗粒/巨噬细胞克隆，为20-200×106个/1ml；b、颗粒细胞、红细胞、单核细胞/巨噬细胞、巨核细胞，为0.5-30×106个/1ml；c、干细胞(CD34)，为1-20×106个/1ml。
还包括有如下细胞成分，祖红细胞和巨核细胞系列，包括74.5±5.8％的成红细胞、噬碱性细胞、中幼红细胞和巨母红血球细胞、巨噬细胞；淋巴细胞系列，包括淋巴细胞，3.5±1.7％的淋巴母细胞、没分化母细胞；髓系细胞系列，包括髓性芽细胞、2.0±1.6％的中幼颗粒细胞、颗粒细胞、原单核细胞、单核细胞；肝细胞，16.5±4.2％；其他细胞，包括megacariocytes、成纤维细胞、3.0±0.7％上皮细胞、脂肪细胞、核等。
制备所述的胚胎干细胞的方法，主要包括有如下几个步骤，a、将胎盘置于组织培养液中；b、将取得的组织切成小块，置于均浆器，研磨成组织均浆；c、将组织均浆用组织培养液洗下来，转移到梯度离心管；d、用血液过滤器进行过滤，并进一步用小针头试管吹打，使之分离成单个细胞；e、将安全性检测合格的组织细胞悬液保存到液氮中。
所述的用于组织分离的胚胎其发育阶段为5-12周。
所述的组织细胞悬液按如下方法保存于液氮中，首先准备二甲亚砜，并将该二甲亚砜用直径为0.22μm的显微滤器过滤；然后，同样体积大小的二甲亚砜逐步加滴入到细胞组织溶液中，边滴入、边搅拌，使二甲亚砜的最终浓度为3-10％；准备好的组织溶液使之以每分钟一度的速度冷却到零下4度；然后以每分钟0.1度的速度从零下4度冷却到零下10度；最后该组织溶液以每分种7度的速度冷却到零下190度；最后放入到液氮中保存。
制备方法前述胚胎干细胞中使用的组织培养液，由以下成分构成，NaCl8.0g；KCl 0.4g；CaCl20.14g；MgCl20.1g；MgSO4.7H2O0.1g；Na2HPO40.06g；NaHCO30.07g；Glucose(葡萄糖) 1.00g；Phenol(酚) 0.02g；H2O1000g。
利用本发明的干细胞可以有效治疗神经退行性病变引起的各种疾病；如病人甲病发于2004年3月27日，表现为口齿不清，身体左侧肌体无力，次日出现头痛、呕吐，CT扫描发现患者大脑前叶出血、下脑干血肿、颅内压明显增高；患者于2004年3月29日进行右脑开颅手术，抽血块及降压治疗；随后进行9个月的康复治疗；患者仍然表现为左侧肌体无力、左侧视力不能集中等；患者于2005年9月19入住乌克兰细胞治疗研究所，次日静脉注射干细胞液，其中含有36亿干细胞；病人经5天住院观察，其左侧肢体活动明显改善、张力增大，能够自由弯曲、伸张；同时，左侧视力明显改善；一月后，患者返回到工作岗位，全职工作。
具体实施例方式
本发明用于组织分离的胚胎来源于自愿堕胎的妇女，并取得病人的同意.病人经过检验，没有HIV，乙肝，丙肝等其他传染性疾病。
用于组织分离的胚胎，其发育阶段为5-12周.取得的胎盘立即置于溶有抗生素的组织培养液中；其中的肝脾组织剥离出来，置于组织培养液中.组织培养液的组织成分包括NaCl(氯化钠)8.0g；KCl(氯化钾) 0.4g；CaCl2(氯化钙) 0.14g；MgCl2(氯化镁) 0.1g；MgSO4.7H2O(7水硫酸镁) 0.1g；Na2HPO4(磷酸氢钠) 0.06g；NaHCO3(碳酸氢钠) 0.07g；Glucose(葡萄糖) 1.00g；Phenol(酚) 0.02g；该成分溶于1升双蒸水中，调节其PH至7.2-7.4。
取得的组织切成小块，置于均浆器，研磨成组织均浆；在进行细胞筛选及分离前，该组织溶液中含有70％的细胞，30％的组织溶液，其生物活性成分包括生物大分子、有机或无机离子；其中的细胞大约为1×109；这些细胞从均浆器、研磨忤中用组织培养液洗下来，转移到梯度离心管；冲洗液进一步用血液过滤器进行过滤；该溶液进一步用小针头试管吹打，使之分离成单个细胞。
经初步分离的组织溶液主要含有以下成分在1ml中，包含8-360×106个有核细胞；其中，颗粒/巨噬细胞克隆为10-260×106个；颗粒细胞，红细胞，单核细胞/巨噬细胞，巨核细胞为0.5-30×106个；
干细胞为1-12×106个；除以上主要的细胞成分，其他细胞成分如下祖红细胞和巨核细胞系列(74.5±5.8％的成红细胞、噬碱性细胞、中幼红细胞和巨母红血球细胞、巨噬细胞)，淋巴细胞系列(淋巴细胞、3.5±1.7％的淋巴母细胞和没分化母细胞)，髓系细胞系列(髓性芽细胞、2.0±1.6％的中幼颗粒细胞、颗粒细胞、原单核细胞及单核细胞)，16.5±4.2％的肝细胞，其他细胞(megacariocytes、成纤维细胞、3.0±0.7％的上皮细胞、脂肪细胞及核等)。
同时，每个胚胎组织悬液进行样品安全性检测；样1为0.5ml细胞悬液，用来检测没冷冻细胞悬液的生物活性是否含有以上描述的细胞成分；样2，3，4为1.0-1.5ml细胞悬液，这些样品不是直接来源于以上准备的细胞悬液，而是来于胚胎的表皮组织；按同样的组织分离方法获得的组织细胞，从事病毒检测；如果样品病毒检测为阳性，该样品废弃；样品2的检测在细胞提取者的实验室中由提取者自己检测，样品3报送公共卫生机构检测，样品4保留在液氮中供以后进一步进行病毒细菌检测。
样5，6为组织提取过程中的水源，进行细菌感染性检测，其中一个样品由细胞提取者进行检测，另外一个样品由公共卫生机构进行检测。
然后，将准备好的组织细胞悬液保存到液氮中；首先准备二甲亚砜，该化学物质用直径为0.22μm的显微滤器过滤，同样体积大小的二甲亚砜逐步加滴入到细胞组织溶液中，边滴入、边搅拌，使二甲亚砜的最终浓度为3-10％；准备好的组织溶液使之以每分钟1度的速度冷却到零下4度，然后以每分钟0.1度的速度从零下4度冷却到零下10度，最后该组织溶液以每分种7度的速度冷却到零下190度；最后放入到液氮中保存。
在治疗神经退行性病变时，其液氮保存的组织细胞用37度水浴溶解，以保持其组织细胞为冰水混合物为宜；溶解后的细胞置于室温下；但不能超过两小时。
溶解后的细胞进行活性检测，其细胞总数应该在5-200×106/ml，颗粒/巨噬细胞克隆为20-200×106/ml，颗粒细胞、红细胞、单核细胞/巨噬细胞、巨核细胞为0.5-30×106/ml，而干细胞(CD34)为1-20×106/ml。
除以上主要的细胞成分，其他细胞成分如下
祖红细胞和巨核细胞系列(78.4±4.2％的成红细胞、噬碱性细胞、中幼红细胞和巨母红血球细胞、巨噬细胞)，淋巴细胞系列(淋巴细胞、8.5±5.4％的淋巴母细胞及没分化母细胞)，髓系细胞系列(髓性芽细胞、中幼颗粒细胞、颗粒细胞、原单核细胞和单核细胞)，肝细胞3.5±2.2％，其他细胞(megacariocytes、成纤维细胞、8.5±5.9％的上皮细胞、脂肪细胞、核等)。
准备好的细胞溶液混合在100-150ml生理盐水中，然后每分钟20-40滴的速度，静脉注射到人体中。
权利要求
1.一种用于治疗神经退行性病变的胚胎干细胞，其特征在于从胚胎组织中分离肝脏、脾脏制成的细胞悬液的细胞总数为5-200×106/ml，其成分主要有a、颗粒/巨噬细胞克隆，为20-200×106个/1ml；b、颗粒细胞、红细胞、单核细胞/巨噬细胞、巨核细胞，为0.5-30×106个/1ml；c、干细胞(CD34)，为1-20×106个/1ml。
2.根据权利要求1所述的胚胎干细胞，其特征在于还包括有如下细胞成分，祖红细胞和巨核细胞系列，包括74.5±5.8％的成红细胞、噬碱性细胞、中幼红细胞和巨母红血球细胞、巨噬细胞；淋巴细胞系列，包括淋巴细胞，3.5±1.7％的淋巴母细胞、没分化母细胞；髓系细胞系列，包括髓性芽细胞、2.0±1.6％的中幼颗粒细胞、颗粒细胞、原单核细胞、单核细胞；肝细胞，16.5±4.2％；其他细胞，包括megacariocytes、成纤维细胞、3.0±0.7％上皮细胞、脂肪细胞、核等。
3.一种权利要求1所述的胚胎干细胞的制备方法，其特征在于主要包括有如下几个步骤，a、将胎盘置于组织培养液中；b、将取得的组织切成小块，置于均浆器，研磨成组织均浆；c、将组织均浆用组织培养液洗下来，转移到梯度离心管；d、用血液过滤器进行过滤，并进一步用小针头试管吹打，使之分离成单个细胞；e、将安全性检测合格的组织细胞悬液保存到液氮中。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于用于组织分离的胚胎其发育阶段为5-12周。
5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于组织细胞悬液按如下方法保存于液氮中，首先准备二甲亚砜，并将该二甲亚砜用直径为0.22μm的显微滤器过滤；然后，同样体积大小的二甲亚砜逐步加滴入到细胞组织溶液中，边滴入、边搅拌，使二甲亚砜的最终浓度为3-10％；准备好的组织溶液使之以每分钟一度的速度冷却到零下4度；然后以每分钟0.1度的速度从零下4度冷却到零下10度；最后该组织溶液以每分种7度的速度冷却到零下190度；最后放入到液氮中保存。
6.一种权利要求3所述的制备方法的组织培养液，其特征在于由以下成分构成，NaCl 8.0g；KCl 0.4g；CaCl20.14g；MgCl20.1g；MgSO4.7H2O 0.1g；Na2HPO40.06g；NaHCO30.07g；Glucose(葡萄糖) 1.00g；Phenol(酚)0.02g；H2O 1000g。
全文摘要
本发明涉及胚胎干细胞技术领域，特指一种用于治疗神经退行性病变的胚胎干细胞及其培养基和制备方法；该胚胎干细胞从胚胎组织中分离肝脏、脾脏制成，其成分主要有颗粒/巨噬细胞克隆，颗粒细胞、红细胞、单核细胞/巨噬细胞、巨核细胞，干细胞(CD34)。前述胚胎干细胞利用组织培养液经过筛选、检验冷冻而成。本发明的胚胎干细胞可以用于治疗神经退行性病变引起的各种疾病，有效促使大脑损伤的康复；可广泛应用于治疗因神经退行性病变引起的各种疾病中。
文档编号A61P25/00GK1884492SQ20061010134
公开日2006年12月27日 申请日期2006年7月7日 优先权日2006年7月7日
发明者蒋礼先, 曹·卡尔文 申请人:蒋礼先, 曹·卡尔文