人源化的抗-cd40抗体及其使用方法

专利名称：：人源化的抗-cd40抗体及其使用方法人源化的抗-CD40抗体及其4吏用方法连续性本申请要求享有2005年5月26日提交的美国临时申请号60/684,853的优先权，其内容在这里整体引作参考。背景本发明概括地涉及用于诊断和治疗用途的人源化的抗-CD40抗体。症的人源化的抗-CD40抗体和使用方法。也公开了药物组合物和制品，例如包含人源化的抗-CD40抗体的试剂盒。CD40是I型完整膜糖蛋白和肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的成员。CD40在许多细胞类型上表达，包括正常和胂瘤B细胞，交错突细胞，基底上皮细胞和癌。它也存在于单核细胞、巨噬细胞、有些内皮细胞、和滤泡树突状细胞上。CD40在B细胞个体发育的早期表达，在出现CD10和CD19之后，但是在表达CD21、CD23、CD24和出现表面免疫球蛋白M(slgM)之前，出现在B细胞前体上(Uckun等，1990,15:2449)。尽管以前的报道指出，CD40会在B细胞终末分化成浆细胞后丧失，已经在扁桃体和骨髓-衍生的浆细胞上4全测到CD40(Pellat-Decounynck等，1994，B/ood84:2597)。CD40与它的配体和反受体CD40L(也称作CD154,gp39,和TRAP)的相互作用，会诱导体液和细胞-介导的免疫应答。CD40L是主要在激活的淋巴细胞、CD4+T细胞上表达的跨膜蛋白。象TNF家族的其它蛋白一样，CD40L的结构是非共价三聚体的结构。CD40-介导的信号传递似乎是T细胞-依赖性抗原引起的B细胞增殖、免疫球蛋白(Ig)同种型转换、生发中心组成、和记忆B细胞定型所必需的。CD40L与CD40的结合，会导致CD40多聚化、抗原呈递细胞(例如树突细胞，单核细胞,和B细胞)的活化信号的产生、和细胞因子-激活的成纤维细胞和上皮细胞的生长和分化信号的发生。尽管还没有完全阐明CD40分子在细胞分化中起作用的信号传递途径，CD40信号通过招募一系列TNF受体相关因子('TRAFs"),从多聚化的受体转导(Kehry,1996,/wwwwo/.156:2345-2348)。TRAFs的亚型有差别地与TNF受体家族成员(包括CD40)相互作用，提供对许多种下游途径的刺激。TRAF1和TRAF2会参与细胞凋亡的调控(Speiser等，1997，J.五平Mc/.185:1777-1783;Yeh等，1997,/附ww"外7:715-725)。TRAFs2,5,和6会参与增殖和活化事件。在正常的B细胞中，CD40与CD40L的结合，会募集TRAF2和TRAF3到受体复合物，并诱导其它TRAF的向下调节(Kuhne等，1997,乂Ex/.Mt/.186:337-342)。在B细胞发育和分化过程中，细胞凋亡和CD40-介导的信号传递密切相关。B细胞中细胞凋亡的主要功能是未成熟的B细胞的克隆排除，认为这源自未成熟的B细胞中表面Ig的广泛交联。成熟B细胞的命运也受信号传递(通过表面Ig)和源自激活的T细胞的信号(推测是由CD40L分子介导)的组合的调控。来自表面Ig的信号和CD40的组合，可以克月l细胞凋亡途径，并维持生发中心B细l包存活。生发中心中这样的从细胞凋亡的复苏，对于生产亲和抗体的记忆B细胞的发育是关键的。在T和B细胞恶性肿瘤中，当恶性细胞暴露于导致正常淋巴细胞激活的剌激时，经常发生抗肿瘤作用(生长停止，有或没有细胞凋亡)。通过抗原受体或辅助刺激受体，已经用信号观察到该活化-诱导的生长停止(Ashwell等，1987,S"ewce237:61;Bridges等，1987,丄/wwwmo/.139:4242;Page和Defranco,1988J./附w丽o/.140:3717;和Beckwith等，1990,丄A^".Owcer82:501)。抗画CD40抗体或可溶性CD40L的CD40刺激，会直接抑制B细胞淋巴瘤生长(Funakoshi等，1994,说ooJ83:2787-2784)。已经描述了针对CD40的几种鼠单克隆抗体(mAbs)(Katira等1995,"CD40WorkshopPanelReport";见丄ewAoc,I7,Schlossmanetal.,(eds)1995,1:547-550)。例如，证实了两种mAbCD40.7(M2)和CD40.8(M3)会抑制CD40向CD40L的结合(Fanslow等，1995,见丄ewAoc,Schlossman等，(eds)1995，1:555-556)。mAbsM2和M3的CD40刺激，会抑制几种人B-细胞淋巴瘤的生长，并体内诱导建立的胂瘤的消退(Funakoshi等，1994,B/ooJ83:2787-2794;Funakoshi等，1996，丄/mww"o/.19:93-101)。美国专利号5,182,368公开了抗-CD40鼠mAb,G28-5，其可以增进B细胞增殖。基于G28-5的单链Fv区的单链免疫毒素，会在体外选择性地杀死表达人CD40的血液学恶性细胞系(Francisco等，1997,J说o/.C/2e肌39:24165-24169)。但是，G28-5在没有CD40L的情况下不能增强B细胞的激活，也不会实现CD40和CD40L的结合。美国专利号6,838,261(和相关的美国专利号6,946,129和6,843,989)描述了抗-CD40鼠mAb的一类变体形式S2C6,和它在治疗多种病症中的应用，包^l舌癌症和免疫性和炎性疾病。除了增强CD40L-介导的刺激以外，在美国专利号6,838，261中描述的抗-CD40抗体表现出CD40和CD40L之间相互作用的增强和体内抗-肿瘤活性。尽管S2C6自身会以类似于G28-5的方式刺激B细胞增殖，S2C6与G28-5的区别在于它的增强CD40L结合的能力和CD40L-介导的活化信号的随后放大。其它鼠抗-CD40mAbs,例如，在国际公开号WO95/17202中描述的那些，会结合CD40,并表现出在治疗和预防特征在于表达CD40的肿瘤细胞的疾病中的效能。尽管鼠抗-CD40抗体具有作为治疗人类CD40相关疾病的治疗剂的潜在用途，它们的免疫原性提出了中和抗体应答的可能性，例如,会限制它们的价值的人抗-小鼠抗体(HAMA)应答。因而，需要人源化的抗-CD40抗体，其能特异性地结合定义的CD40表位，并表现出抗原结合特异性、亲和力和类似的非人抗-CD40抗体的其它希望的功能特征。发明简述本发明包括人源化的抗-CD40抗体和抗原结合片段，以及使用这样的人源化的抗-CD40抗体和片段治疗特征在于表达CD40表面抗原的细胞的疾病和病症的方法。也包括包含人源化的抗-CD40抗体的试剂盒和制品。在有些实施方案中，提供了特异性结合人CD40的分离的抗体或抗原结合片段。抗体或抗原结合片段包括重链可变域和/或轻链可变域。重链可变域可以包括具有与SEQIDN0:2的人可变域重链亚型III共有氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列的构架区、和至少一个具有与SEQIDNO:3的对应重链CDR至少90。/。同一的氨基酸序列的CDR。轻链可变域可以包括具有与SEQIDNO:13的人可变区轻纟连亚型kI共有氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列的构架区、和至少一个具有与SEQIDNO:14的对应轻链CDR至少90%同一的氨基酸序列的CDR。在有些实施方案中，每个重链CDR与SEQIDNO:3的对应重链CDR具有至少90%同一性。在有些实施方案中，重链CDR包括SEQIDNO:3的重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。在有些实施方案中，每个轻链CDR与SEQIDNO:14的对应轻链CDR具有至少90%同一性。在有些实施方案中，轻链CDR包括SEQIDNO:14的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。在有些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括具有SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:IO或SEQIDNO:ll的氨基酸序列的重4连可变域。在有些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括具有SEQIDNO:14、SEQIDNO:15或SEQIDNO:16的氨基酸序列的轻链可变域。在有些实施方案中，抗体或抗原结合片段具有SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:IO或SEQIDNO:ll的重链可变域氨基酸序列，和SEQIDNO:14、SEQIDNO:15或SEQIDNO:16的轻链可变;成氨基酸序列。在有些实施方案中，重链可变域和轻链可变域分别包括下述氨基酸序列SEQIDNO:3和SEQIDNO:14;SEQIDNO:4和SEQIDNO:14;SEQIDNO:5和SEQIDNO:14;SEQIDNO:6和SEQIE)NO:14;SEQIDNO:7和SEQIDNO:14;SEQIDNO:8和SEQIDNO:14;SEQIDNO:9和SEQIDNO:14;SEQIDNO:6和SEQIDNO:15;SEQIDNO:6和SEQIDNO:16;SEQIDNO:7和SEQIDNO:16;SEQIDNO:IO和SEQIDNO:14;SEQIDNO:l1和SEQIDNO:14;SEQIDNO:IO和SEQIDNO:16;或SEQIDNO:11和SEQIDNO:16。抗体或抗原结合片段可以包括人IgG恒定区,例如，同种型IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的IgG恒定区。抗体或抗原结合片段可以包括轻链恒定域,例如，k恒定域。在有些实施方案中，抗体是husgn-0,husgn-1,husgn-2,husgn-4,husgn-14,husgn-15,husgn-16,husgn-17,husgn-18,husgn-19,husgn-22,husgn-23,husgn-26或husgn-27。在有些实施方案中，抗体或抗原结合片段与ATCC保藏号PTA-110杂交瘤分泌的单克隆抗体S2C6竟争结合。抗体也可以是抗原结合片段,例如Fab，Fab，，F(ab，)2,Fv片段，双特异抗体(diabody),单链抗体，scFv片段或scFv-Fc。抗体或抗原结合片段可以任选地被标记，或缀合到化疗剂上，例如auristatm(例如，MMAE或MMAF).也提供了试剂盒，其包含置于容器中的抗-CD40抗体或抗原结合片段。试剂盒可以任选地包含其它组分，例如关于使用所述抗体检测生物样品中的CD40蛋白的说明书。也提供了药物组合物，其包含抗-CD40抗体或其抗原结合片段和药学可接受的赋形剂。在有些实施方案中，提供了编码人源化的重链可变区和/或人源化的轻链可变区的分离的多核苷酸。多核苷酸可以，例如，编码SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:IO或SEQIDNO:ll的重《连可变域氨基酸序列。多核苷酸也可以，例如，编码SEQIDNO:14、SEQIDNO:15或SEQIDNO:16的轻链可变域氨基酸序列。在有些实施方案中，分离的多核苷酸分别编码下述重链可变域氨基酸序列和轻《连可变域氨基酸序列SEQIDNO:3和SEQIDNO:14;SEQIDNO:4和SEQIDNO:14;SEQIDNO:5和SEQIDNO:14;SEQIDNO:6和SEQIDNO:14;SEQIDNO:7和SEQIDNO:14;SEQIDNO:8和SEQIDNO:14;SEQIDNO:9和SEQIDNO:14;SEQIDNO:6和SEQIDNO:15;SEQIDNO:6和SEQIDNO:16;SEQIDNO:7和SEQIDNO:16;SEQIDNO:IO和SEQIDNO:14;SEQIDNO:ll和SEQIDNO:14;SEQIDNO:IO和SEQIDNO:16;或SEQIDNO:ll和SEQIDNO:16。在有些实施方案中，提供了抑制表达人CD40抗原的细胞的生长的方法。该方法包括，给细胞施用抗-CD40抗体或抗原结合片l爻，且所述抗体或抗原结合片段结合人细胞表面CD40抗原。抗体或抗原结合片段与CD40抗原的结合抑制细胞的生长或分化。在有些实施方案中，提供了治疗具有CD40相关病症的受试者的方法。该方法包括，给受试者施用抗-CD40抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段结合人CD40。抗体或抗原结合片段与CD40的结合抑制CD40相关病症的细胞的生长或分化。CD40相关病症可以是,例如，慢性淋巴细胞白血病，伯基特淋巴瘤，多发性骨髓瘤，T细胞淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金病，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症或卡波西肉瘤。在有些实施方案中，提供了诱导外周B细胞的缺失的方法。该方法包括，给细胞施用抗-CD40抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段会结合人细胞表面CD40抗原。抗体或抗原结合片段与CD40抗原的结合，会诱导细胞的缺失。外周B细胞可以,例如，在受试者中表现出自身免疫反应性。参考下面的详述，包括优选实施方案，以及附图和序列表，可以最好地理解本发明。下面的讨论是描述性的、解释性的和示例性的，不应当用于限制所附权利要求书定义的范围。附图简述图1A和1B显示了人源化的抗-CD40抗体重链的多肽(SEQIDNO:18)和编码(SEQIDNO:17)和互补DNA序列。多肽序列的注解指示了先导序列、可变区、和人IgG!恒定区的位置。图1C显示了人源化的抗-CD40抗体轻链的多肽(SEQIDNO:21)和编码(SEQIDNO:20)和互补DNA序列。多肽序列的注解指示了先导序列、可变区、和人k恒定区的位置。图2显示了在肿瘤移植后13天开始治疗，在2周后测量的对照抗体、鼠抗-CD40抗体、和人源化的抗-CD40抗体治疗对胂瘤体积的影响。图3显示了对照抗体、鼠抗-CD40抗体、和人源化的抗-CD40抗体治疗对携带肿瘤的小鼠的存活率的影响。发明详述为了公开清楚，且不作为限制，本发明的详述分成下面的小节。当在本文中使用商品名称时，商品名称也指商品名称产物制剂、仿制药物、和商品名称产物的活性药物成分，除非上下文另有说明。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与所述方法和组合物所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。定乂术语"CD40"和"CD40表面抗原"指在正常和肺瘤B细胞的表面上表达的50kD糖蛋白，其起参与细胞增殖和分化的信号的受体的作用，有时称作Bp50(Ledbetter等，1987,,/./附w朋/.138:788-785)。已经从伯基特淋巴瘤细胞系Raji分离出编码CD40的cDNA分子(Stamenkovic等,1989，五MB(9乂8:1403)。表达CD40的细胞是特征在于CD40的表面表达的任意细胞，包括、但不限于，正常和肿瘤B细胞，交错突细胞，基底上皮细胞，癌细胞，巨噬细胞，内皮细胞，滤泡树突状细胞，扁桃体细胞和骨髓-衍生的浆细胞。在有些实施方案中，CD40分子是人CD40分子。本文使用的术语"CD40抗原表位"和"CD40表位"指，能与抗-CD40抗体发生免疫反应的分子(例如，肽)或分子片段，例如，包括由S2C6单克隆抗体识别的CD40抗原决定子。CD40抗原表位可以包含在蛋白、蛋白片段、肽等内。表位是最常见的蛋白、短寡肽、寡肽模仿物(即，模仿CD40抗原的抗体结合性质的有机化合物)或其组合。如本文所述，"特异性结合"和"特异性地结合"指结合预定抗原的抗体。通常，抗体以至少约lx107M"的亲和力结合，并以比对除了预定抗原或密切相关抗原以外的非特异性抗原(例如，BSA,酪蛋白)的结合亲和力大至少2倍的亲和力结合预定抗原。"天然抗体"和"天然免疫球蛋白"在本文中定义为，由2个相同轻(L)链和2个相同重(H)链组成的异源四聚体糖蛋白，通常约150,000道尔顿。每个轻链通过一个二硫键共价连接到重链上，形成异源二聚体。通过这样的异源二聚体的2个相同重链之间的共价二硫键，形成异源四聚体。尽管轻链和重链通过一个二硫键连接到一起，2个重链之间的二硫键的数目随免疫球蛋白同种型而异。每个重链和轻链也具有规则分布的链内二硫键。每个重链在氨基端具有一个可变域(vh),随后是3或4个恒定域(ChI,Ch2,Ch3,和Ch4),以及在CH1和CH2之间的铰链区。每个轻链具有2个结构域，即1个氨基端可变域(VO和1个羧基端恒定域(cl)。vl结构域与vh结构域非共价地结合，而cl结构域通常通过二硫键共价连接到CH1结构域上。认为特定氨基酸残基会在轻链和重链可变域之间形成界面(Chothm等，1985,,/.杨/.肠/.186:651-663)。术语"超变的"指下述事实，即可变域内的某些序列与抗体中的序列有很大不同，且含有直接参与每个特定抗体对它的特定抗原决定子的结合和特异性的残基。轻链和重链可变域内的超变性，集中在称作互补性决定区(CDR)或超变环(HVL)的3个区段内。在Kabat等，1991，见.'5"egwewc'e,st)/'/Vo/^/w/附7"wwo/ogzc"//w,eres/1,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.中，通过序列对比定义了CDR,而HVL则才艮据可变域的三维结构在结构上定义，如Chothm和Lesk,1987，《/.A^/.说o/.196:901-917所述。当这2种方法导致田各有不同的CDR鉴别时，结构定义是优选的。如Kabat所定义的，CDR-L1位于轻链可变域的残基24-34附近，CDR-L2位于残基50-56附近，且CDR-L3位于残基89-97附近；CDR-H1位于重链可变域的残基31-35附近，CDR-H2位于残基50-65附近，且CDR-H3位于残基95-102附近。每个重链和轻链内的3个CDR由构架区(FR)隔开，该构架区含有倾向于更低可变性的序列。从重链和轻链可变域的氨基端至羧基端，FR和CDR的排列次序是FR1，CDR1，FR2,CDR2,FR3，CDR3,和FR4。FR的大量P-折叠构型，使得每个链内的CDR彼此接近，也使每个链内的CDR接近其它链的CDR。得到的构象促成抗原结合位点(参见Kabat等,1991,NIHPub1.No.91-3242,Vol.I,第647-669页)，尽管并非所有CDR残基都一定直接参与抗原结合。FR残基和Ig恒定域不直接参与抗原结合，但是有助于抗原结合和/或介导抗体效应功能。有些FR残基可以以至少3种方式对抗原结合起显著作用通过非共价地直接结合表位，通过与一个或多个CDR残基相互作用，或通过影响重链和轻链之间的界面。恒定域不直接参与抗原结合，但是介导多种Ig效应功能,例如抗体在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)中的参与。基于恒定域的氨基酸序列，可以将脊推动物免疫球蛋白的轻链归为2种明显不同的类型之一k(k)和X(X)。根据恒定域的序列，通过对比，可以将哺乳动物免疫球蛋白的重链归为5种主要类型之一IgA、IgD、IgE、IgG,和IgM。IgG和IgA进一步分成亚型(同种型),例如，IgG]、IgG2、IgG3、IgG4、IgA^和IgA2。与不同类型的免疫球蛋白相对应的重链恒定域分别称作a,S，e,y,和P。天然免疫球蛋白的类型的亚基结构和三维构型是众所周知的。术语"抗体"、"抗-CD40抗体"、"人源化的抗-CD40抗体"、和"变体人源化的抗-CD40抗体"在本文中以最广义4吏用，具体地包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)，多克隆抗体，多特异性抗体(例如，双特异性抗体),和抗体片段，例如可变域和表现出希望的生物活性的(例如，CD40结合)其它抗体部分。术语"单克隆抗体"(mAb)指从基本上同源的抗体的群体得到的抗体;也就是说，构成该群体的单个抗体是相同的，例外是，可能存在微量的天然存在的突变。单克隆抗体是高度特异性的，其针对单个抗原决定子(也称作表位)。修饰词"单克隆的"表示针对相同表位的基本上同源的抗体的群体，不应理解为需要通过任何特殊方法生产抗体。单克隆抗体可以通过本领域已知的任意4支术或方法来制备;例如，K6hler等，1975,A^i/"256:495首次描述的杂交瘤方法，或本领域已知的重组DNA方法(参见，例如，美国专利号4,816,567)。在另一个实例中，也可以-使用Clackson等，1991,胸,352:624-628,和Marks等，1991,丄M/.222:581-597所述的技术，从噬菌体抗体文库分离单克隆抗体。相反地，在多克隆抗体的制备中的抗体通常是免疫球蛋白同种型和/或类型的异质群体，且也表现出许多表位特异性。本文使用的术语"嵌合的"抗体是一种单克隆抗体类型，其中在重链和/或轻链的一个或多个区域或结构域中的一部分或全部氨基酸序列，与来自另一个物种或属于另一个免疫球蛋白类型或同种型或来自共有序列的单克隆抗体中的对应序列相同、同源，或是其变体。嵌合的抗体包括这样的抗体的片段，条件是，抗体片段会表现出它的亲本抗体的希望的生物活性，例如结合相同表位(参见，例如，美国专利号4,816,567;和Momson等，1984,TVoc.Ato/.」cac/."&481:6851-6855)。术语"抗体片段"、"抗-CD40抗体片段"、"人源化的抗-CD40抗体片段"、"变体人源化的抗-CD40抗体片段"指全长抗-CD40抗体的一部分，其中保留了可变区或功能能力,例如，特异性的CD40表位结合。抗体片段的实例包括、^f旦不限于，Fab,Fab，，F(ab，)2，Fd,Fv,scFv和scFv-Fc片段，双特异抗体，线性抗体，单链抗体，微抗体(minibody),由抗体片段形成的双特异抗体,和由抗体片段形成的多特异性抗体。通过全长抗体的酶处理，可以产生某些抗体片段类型。抗体的木瓜蛋白酶消化，会产生2个相同的抗原结合片段(称作"Fab"片段，各自含有一个抗原结合位点)和1个残余"Fc"片段(因为它易于结晶的能力而得名)。Fab片段也含有轻链的恒定域和重链的CH1结构域。胃蛋白酶处理会产生F(ab，)2片段，其具有2个抗原结合位点，且仍然能交联抗原。Fab，片段与Fab片段的不同之处在于，在CH1结构域的C-末端存在几个额外的残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸Fab-SH在本文中是Fab，的命名，其中恒定域的半胱氨酸残基携带游离的巯基。F(ab，)2抗体片段是通过铰链区中的半胱氨酸残基相连接的一对Fab，片段。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。"Fv"是最小的抗体片段，其含有由紧密、非共价结合的一个重链和一个轻链可变域的二聚体组成的完整抗原-识别和结合位点。在该构型中，每个可变域的3个CDR相互作用，定义在Vh-Vl二聚体表面上的抗原-结合位点。6个CDR共同赋予抗体抗原-结合特异性。"单链Fv"或"scFv"抗体片段是包含抗体的Vh和VL结构域的单链Fv变体，其中所述结构域存在于单个多肽链中，且能识别和结合抗原。scFv多肽任选地含有位于Vh和VL结构域之间的多肽连接物，其能使scFv形成希望的用于抗原结合的三维结构(参见，例如，Pluckthun，1994,7Te尸/2a/7w"co/ogyo/Mowoc/ewa/JwhZwc^e^,Vol.113，Rosenburg禾口Moore编，Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315)。术语"双特异抗体"指具有2个抗原结合位点的小抗体片段。每个片段含有连接到一个轻链可变域(V。上的一个重链可变域(VH)。通过使用短得足以允许同一链上的2个结构域之间配对的连接物，迫使连接的VH-VL结构域与另一条链的互补结构域配对，建立2个抗原结合位点。双特异抗体更完整地描述在，例如，EP404,097;WO93/11161;和Hollmger等，1993,尸rac.A^/.v4cadV&490:6444-6448。术语"线性抗体"指包含一对串联的Fd区段(Vh-ChI-Vh-ChI)的抗体，所述Fd区段形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的，参见,例如，Zapata等1995，尸ro&w8(10):1057-1062。体或其片段，其能结合预定抗原，且其包含一个或多个基本上具有人免疫球蛋白氨基酸序列的FR、和一个或多个基本上具有非人免疫球蛋白氨基酸序列的CDR。该非人氨基酸序列在本文中称作"输入"序列，其通常取自"输入"抗体结构域，尤其是可变域。一般而言，人源化的抗体至少包括非人抗体的CDR或HVL,其插入在人重链或轻链可变域的FR之间。在某些方面，人源化的抗-CD40抗体含有源自鼠单克隆抗体S2C6的CDR和/或HVL残基或序列，其插入在人共有序列重链和轻链可变域的FR之间。在另一个方面，人源化的抗-CD40抗体包含基本上全部的至少1个、且通常2个可变域(例如，包含在例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc、和Fv片段中)，其中全部或基本上全部的CDR对应非人免疫球蛋白的CDR，且全部或基本上全部的FR是人免疫球蛋白共有序列的FR。在另一个方面，人源化的抗-CD40抗体也包括免疫球蛋白Fc区域(通常是人免疫球蛋白的)的至少一部分。通常，所述抗体会含有轻链以及重链的至少可变域。适当时，所述抗体也可以包含一个或多个重链CH1、4交链、CH2、Ch3、和/或CH4区域。人源化的抗-CD40抗体可以选自任意类型的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE,和任意同种型，包括IgG!、IgG2、IgG3、IgG4、IgA!和IgA2。例如，恒定域可以是固定恒定域的补体，其中希望人源化的抗体表现出细胞毒性活性，且同种型通常是IgGi。当不需要这样的细胞毒性活性时，恒定域可以是另一种同种型,例如IgG2。替代性的人源化的抗-CD40抗体可以包含来自超过一种免疫球蛋白类型或同种型的序列，且选择特定恒定域来优化希望的效应功能属于本领域的普通技术。人源化的抗-CD40抗体的FR和CDR或HVL,不需要与亲本序列精确对应。例如，通过取代、插入或缺失，可以改变(例如,诱变)输入CDR或HVL或共有FR序列中的一个或多个残基，使得得到的氨基酸残基不再与任一个亲本序列中对应位置处的原始残基相同。但是，这样的改变通常不是广泛的。通常，至少75%人源化的抗体残基与亲本共有FR和输入CDR序列的抗体残基相对应，更经常至少90%,最经常大于95%或大于98%或大于99%。影响重链和轻链可变区之间的界面("VL-VH界面")的免疫球蛋白残基是影响2条链相对彼此的接近或朝向的那些残基。可能参与链间相互作用的某些残基包括VL残基34,36,38,44,46,87,89,91,96,和98和VH残基35,37,39,45,47,91,93，95,100,和103(使用Kabat等，SequencesofProtemsofImmunologicalInterest(NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.,1987)所述的编号系统)。其它残基包括如这里整体引作参考的美国专利号6,407,213所公开的VL残基43和85,和VH残基43和60。尽管这些残基仅仅为人IgG而指出，它们跨物种适用。选择合理地预期会参与链间相互作用的输入抗体残基，用于取代进共有序列。本文使用的术语"共有序列"和"共有抗体"指，在任意特定类型、同种型或亚基结构(例如，人免疫球蛋白可变域)的所有免疫球蛋白的每个位置处包含最经常出现的氨基酸残基的氨基酸序列。共有序列可以基于特定物种或许多物种的免疫球蛋白。"共有"序列、结构或抗体理解为包括在某些实施方案中描述的共有人序列，且指在任意特定类型、同种型或亚基结构的所有人免疫球蛋白的每个位置处包含最经常出现的氨基酸残基的氨基酸序列。提供了共有人结构和考虑了除人以外的其它物种的共有结构。因而，共有序列含有氨基酸序列，后者在每个位置处具有存在于一种或多种已知免疫球蛋白中的氨基酸，但是其可能不精确地复制任意单个免疫球蛋白的整个氨基酸序列。可变区共有序列不是从任意天然产生的抗体或免疫球蛋白获取。有用的共有序列包括人可变轻链kI共有序列(SEQIDNO:13)和人可变重链亚型III共有序列(SEQIDNO:2),它们源自在Kabat等，1991,S叫uencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.中提供的数据,和其变体。重链和轻链共有序列的FR、和其变体，会提供对于制备人源化的抗-CD40抗体有用的序列。参见，例如，美国专利号6,037,454和6,054,297。在某些实施方案中，用于制备人源化的抗体的FR源自人可变轻链kI共有序列和人可变重链亚型III共有序列。本文所述的"变体"、"抗-CD40变体"、"人源化的抗-CD40变体"或"变体人源化的抗-CD40，，各自指，至少具有源自鼠单克隆抗体S2C6的重链可变CDR或HVL序列和源自人共有序列的FR序列的人源化的抗-CD40抗体。变体包括在一个或2个轻链或重链可变域中具有一个或多个氨基酸变化的变体，条件是，所述氨基酸变化基本上不损害抗体与CD40的结合。人源化的抗-CD40变体通常包括，通过实现改良的抗体分子折叠，提高抗体性能的氨基酸取代。"分离的"抗体是已经从它的天然环境的组分中鉴别和分离和/或回收的抗体。抗体的天然环境的污染组分是可能分妨碍抗体的诊断或治疗用途的那些材料，且可以是酶、激素或其它蛋白性的或非蛋白性的溶质。在一个方面，将抗体纯化至a)通过Lowry方法测得，按抗体重量计，大于95%分离，在另一个方面，按重量计，超过99%分离，或b)使用旋转杯顺序分析仪，足以得到N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的分离程度，或C)使用考马斯蓝或优选的银染色剂观察到，在还原或非还原条件下，通过SDS-PAGE的同质性。分离的抗体包括在重组细胞内的#在抗体，因为抗体的天然环境中的至少一种组分不存在。但是，通常通过至少一个纯化步骤，制备分离的抗体。术语"抗体性能"指有助于抗原的抗体识別或抗体体内有效性的因素。抗体氨基酸序列的变化，可以影响抗体性质，例如折叠，且可以影响物理因素，例如抗体结合抗原的起始速率o。)，抗体与抗原的解离常数(Kd)，抗体对抗原的亲和力常数，抗体的构象，蛋白稳定性,和抗体的半衰期。在本文中使用的术语"表位标记的，，指，与"表位标记"融合的抗-CD40抗体。"表位标记"是具有足够数目的氨基酸来提供抗体生产的表位的多肽，并设计成不会妨碍希望的人源化的抗-CD40抗体的活性。表位标记通常足够独特，使得针对表位标记产生的抗体基本上不与其它表位交叉反应。合适的标记多肽通常含有至少6个氨基酸残基，且通常含有约8-50个氨基酸残基或约9-30个残基。表位标记和结合该表位的抗体的实例包括fluHA标记多肽和它的抗体12CA5(Field等，1988Mo/.0〃.肠/.8:2159-2165);c匿myc标记和它的8F9,3C7,6E10,G4，B7和9E10抗体(Evan等，1985，Mo/.Ce〃.Bw/.5(12):3610-3616);和单纯疱渗病毒糖蛋白D(gD)标记和它的抗体(Paborsky等1990,/Vo&z力3(6):547-553)。在某些实施方案中，表位标记是"补;救受体结合表位"。本文所述的术语"补救受体结合表位"指IgG分子(例如IgG!、IgG2、IgGs或IgG4)的Fc区的表位，其负责增加IgG分子的体内血清半衰期。术语"细胞毒性剂"指会抑制或阻止细胞的功能和/或造成细胞的破坏的物质。该术语意在包括放射性同位素(例如I131,1125,Y^'和Re186)，化疗剂,和毒素(例如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素)，和其片段。使用已知的标准操作，可以将这样的细胞毒性剂偶联到抗体(例如，人源化的抗-CD40抗体)上，并用于例如治疗指示用该抗体治疗的患者。"化疗剂"是用于治疗癌症的化合物。化疗剂的实例包括烷化剂，例如塞替派和环磷酰胺(CYTOXANTM);烷基磺酸酯例如白消安，英丙舒凡，和旅泊舒凡；氮丙咬例^口benzodopa,卡〉皮酉昆，meturedopa,禾口uredopa;氮丙口定和曱基氨基吖t定包4舌六曱蜜胺，三亚胺。秦，tnetylenephosphoramide,triethylenethiophosphoramide，和trimethylolomelamine;acetogenins(尤其bullatacm和bullatacinone);喜树碱(包括合成类似物托泊替康)；苔藓抑素；callystatm;CC-1065(包括它的阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；cryptophycines(尤其cryptophycin1和cryptophycin8);多^立司他汀，aunstatins(包括类似物单甲基-aunstatinE和单甲基-auristatinF);duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CBI-TMI);eleutherobm;pancratistatin;sarcodictyin;spongistatin;氮芥例如苯丁酸氮界，茶氮芥，chol叩hosphamide,雌莫司汀，异环磷酰胺，氮芥，氧氮芥盐酸盐，美法仑，新氮芥，苯乙酸氮齐胆甾醇酯，泼尼莫司汀；曲磷胺，乌拉莫司汀；硝基脲例如卡莫司汀，氯脲菌素，福莫司汀，洛莫司汀，尼莫司汀，雷莫司汀；#元生素例3口enediyne^元生素(例戈口，刺孑包霉素，尤其calichemicmyll和刺孢霉素phill,参见例如，C/ze肌/^/.￡d33:183-186;dynemicin,包括dynemicmA;二膦酸盐，例如氯膦酸盐；esperamicin;以及新制癌菌素生色团和相关的色蛋白enediyne抗生素生色团)，aclacinomysms,放线菌素，authramycm,偶氮丝氨酸，博来霉素，放线菌素C,carabicin,洋红霉素，嗜癌霉素，色霉素，更生霉素，柔红霉素，地托比星，6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸，多柔比星(多柔比星tm)(包括吗啉代-多柔比星，氰基吗啉代-多柔比星，2-吡咯啉代-多柔比星,和去氧多柔比星)，epimbucin,依索比星，伊达比星，麻西罗霉素，丝裂霉素例如丝裂霉素C,麦考酚酸，诺拉霉素，橄榄霉素，培洛霉素，potfiromycm,嘌罗霉素，三铁阿霉素，罗多比星，链黑霉素，链佐星，杀结核菌素，乌苯美司，净司他丁，佐柔比星；抗代谢物例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似物例如二曱叶酸，曱氨蝶呤，蝶罗呤，三曱曲沙；噤呤类似物例如氟达拉滨，6-巯嘌呤，石危咪。票呤，石危鸟嘌呤；嘧啶类似物例如安西他滨，氮杂胞苷，6-氮尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷，二去氧尿苷，去氧氟尿苷，依诺他滨，氮尿苷；雄激素例如卡普睾酮，屈他雄酮丙酸盐，环硫雄醇，美雄烷，睾内酪；抗肾上腺素类例如氨鲁米特，米托坦，曲洛司坦；叶酸补充剂例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧。定；安吖。定；bestrabucil;比生群；依达曲沙；defofsmme;地美可辛；地吖醌；依氟鸟氨酸；依利醋铵；epothilone;依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；maytansmoids例如美登素和柄型菌素；米托胍腙，米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼;PSK;雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；细格孢氮杂酸；三亚胺醌;2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素类(尤其T-2毒素，verracurinA,杆孢菌素A和anguidine);乌拉坦；长春地辛；达卡巴口秦；甘露莫司汀;二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosme;阿拉伯糖苷("Ara-C");环磷酰胺；塞替派；紫杉烷,例如，紫杉醇(TAXOL,Bristol-MyersSqmbbOncology,Princeton,NJ)和紫杉辟(TAXOTERE⑧，Rh6ne-PoulencRorer,Antony,France);苯丁酸氮芥；吉西他滨(Gemzar);6-硫乌嘌呤;巯噤呤；曱氨蝶呤；铂类似物例如顺铂和卡铂；长春碱；柏；依托泊苷(VP-16);异环石粦酰胺；米托蒽醌；长春新石咸；长春瑞滨(Navelbine);诺消灵；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-11;拓朴异构酶抑制剂RFS2000;二氟甲基鸟氨酸(DMFO);类视黄醇例如视黄酸；卡培他滨;和上述任一种的药学可接受的盐、酸或衍生物。该定义也包括用来调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，如抗雌激素，和选择性雌激素受体调控剂(SERMs)，包括例如他莫昔芬(包括Nolvadex),雷洛昔芬，屈洛昔芬，4-羟基他莫昔芬，曲沃昔芬,keoxifene,LY117018,奥那司酮，和托瑞米芬(Fareston);抑制芳香酶的芳香酶抑制剂，其调节肾上腺中的雌激素生产，例如，4(5)-咪唑，氨鲁米特，曱地孕酮醋酸盐(MegaceTM),依西美坦，福美坦，法倔唑，伏氯唑(Rivisor),来曲唑(FemaraTM),和阿那曲唑(ArimidexTM);和抗-雄激素例如氟他胺，尼鲁米特，比卡鲁胺，亮丙瑞林,和戈舍瑞林;和上述任一种的药学可接受的盐、酸或衍生物。本文使用的术语"前药"指药学活性物质的前体或衍生形式，与亲本药物相比，它对肿瘤细胞的细胞毒性较低，并且能被酶促激活或者转化为更有活性的形式。参见，例如，Wilman,1986,"ProdrugsinCancerChemtherapy",见i^/0c/7e脂'c"/Socz,Thms'ac"(ms"，14,pp.375-382,615thMeetingBelfast禾口Stella等，1985,"Prodrugs:AChemicalApproachtoTargetedDrugDelivery,见〃Dz>e"e<i/>wgDe/zver_y,Borchardt等，(编)，pp.247-267,HumanaPress。有用的前药包括、但不限于，含磷酸盐的前药、含^L代磷酸盐的前药、含v5克酸盐的前药、含肽的前药、D-氨基酸修饰的前药、糖基化前药、含p-内酰胺的前药、任选地取代的含苯氧基乙酰胺的前药、和任选地取代的含苯基乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前药，它们能转化为更有活性的无细胞毒性的药物。能衍生为前药的细胞毒性药物的实例包括但不限于上述化疗剂。术语"标记"指直接或间接缀合到抗体上的可检测的化合物或组合物。标记可以自身是可一全测的(例如，》文射性同位素标记或荧光标记)，变。可以制备标记的人源化的抗-CD40抗体，并用于多种用途，包括体外和体内诊断。"脂质体"是由多种类型的脂类、磷脂和/或表面活性剂组成的小嚢泡。脂质体可用于向哺乳动物输送化合物或制剂,例如此处公开的人源化的抗-CD40抗体，其任选地与一种或多种药学活性试剂相偶联或组合。脂质体的成分通常以双层结构排列，类似于生物膜的脂类排列。"分离的"核酸分子是从至少一种在抗体核酸的天然来源中通常伴随的污染核酸分子中鉴别和分离出的核酸分子。分离的核酸分子不同于在自然界发现的形式或环境。分离的核酸分子因此与在天然细胞中存在的核酸分子相区分。但是，分离的核酸分子包括细胞中包含的通常表达抗体的核酸分子，例如，其中核酸分子是在不同于天然细胞中的染色体位置。术语"控制序列"指在特定宿主生物体中表达可操作地连接的编码序列所需的多核苷酸序列。适用于原核细胞中的控制序列包括，例如，启动子，操纵基因,和核糖体结合位点序列。真核控制序列包括、但不限于，启动子，多腺普酸化信号,和增强子。这些控制序列可以用于在原核和真核宿主细胞中表达和生产人源化的抗-CD40抗体。当处于与另一个核酸序列的功能关系中时，核酸序列是"可操作地连接的"。例如，如果核酸前序列或分泌先导物表达为参与多肽分泌的前蛋白，则它是可操作地连接到编码多肽的核酸上；如果启动子或增强子会影响序列的转录，则它是可操作地连接到编码序列上；或者如果核糖体结合位点的位置有利于翻译，则它是可操作地连接到编码序列上。一般而言，"可才喿作地连接地"指，连4妻的DNA序列是邻接的，在分泌先导物的情况下，是邻接的且在读码框中。但是，增强子任选地是邻接的。通过在方便的限制位点处的连接，可以实现连接。如果不存在这样的位点，可以使用合成的寡核苷酸接头或连接物。如本文所述，表述"细胞"、"细胞系，，和"细胞培养物"可互换地使用，且所有这样的命名包括其后代。因而，"转化体"和"转化的细胞，，包括最初的主题细胞和从其衍生的培养物，无论传代的次数。也应当理解，由于故意的或天然存在的突变，所有后代的DNA含量可能不精确地相同。包括在原始转化的细胞中筛选出的具有相同功能或生物活性的突变后代。当使用不同的命名时，从上下文中可以知晓。用于治疗目的的术语"哺乳动物"指指被归类为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农畜、动物园动物、运动动物或宠物，如狗、马、猫、牛等。优选地，哺乳动物是人。本文使用的"病症"是能从本文所述人源化的抗-CD40抗体的治疗获益的任意状况。这包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易感所讨论的病症的那些病理学状况。本文要治疗的非限制性实例或病症包括癌症，血液恶性肺瘤，良性和恶性肺瘤，白血病和淋巴恶性肿瘤，和炎性的、生产血管的和免疫学的病症。术语"癌症"和"癌性的"是指或描述，特征通常在于失调的细胞生长的哺乳动物生理状况。癌症的实例包括、但不限于，癌，淋巴瘤，母细月包瘤，肉瘤，和白血病。如本文所述，术语"CD40相关病症"或"CD40相关疾病"指，其中指示表达CD40的细胞的改变或消除的状况。它们包括，表现出异常增殖的表达CD40的细胞，或与癌性或恶性生长相关的表达CD40的细胞。表现出CD40抗原的异常表达的癌症的更具体的实例包括，B类淋巴母细胞，伯基特淋巴瘤，多发性骨髓瘤，T细胞淋巴瘤，卡波西肉瘤，骨肉瘤，表皮和内皮肺瘤，胰腺、肺、乳腺、卵巢、结肠、前列腺、头和颈、皮肤(黑素瘤)、膀胱和肾癌。这样的病症包括、但不限于，白血病，淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，多发性骨髓瘤，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；实体瘤，包括肉瘤,例如骨肉瘤，尤因肉瘤，恶性黑素瘤，腺癌，包括卵巢腺癌，卡波西肉瘤/卡波西肿瘤和鳞状细胞癌。CD40相关病症也包括免疫系统的疾病和病症，例如自身免疫障碍和炎症。这样的病症包括、但不限于，类风湿性关节炎(RA),系统性红斑狼疮(SLE),硬皮病，舍格伦综合征，多发性硬化，炎性肠病(例如，溃疡性结肠炎和克罗恩病)，肺炎，哮喘，和特发性血小板减少性紫癫(ITP)。短语"阻止......的生长，，或"生长抑制性的"在本文中用于指抑制细胞(尤其表达CD40抗原的肿瘤细胞类型)的生长或增殖。因而，生长抑制，例如，会显著减少S期的肿瘤细胞的百分比。术语"静脉内输注"指经大于约15分钟的时间段、通常约30-90分钟，将试剂导入动物或人患者的静脉。术语"静脉内推注"或"静脉内推进"指向动物或人的静脉中施用药物，以便身体在约15分钟或更少的时间内、通常5分钟或更少的时间内4妻受药物。术语"皮下给药"指，通过从药物容器的相对緩慢的、持续的输送，将试剂导入动物或人患者的皮肤下，优选地在皮肤和基底组织之间的袋内。挤捏或拉扯在基底组织上面且远离基底组织的皮肤，可以建立袋。术语"皮下输注"指，通过从药物容器的相对緩慢的、持续的输送，经包括但不限于30分钟或更少或90分钟或更少的时间段，将药物导入动物或人患者的皮肤下，优选地在皮肤和基底组织之间的袋内。任选地，通过植在动物或人患者皮肤下的药物输送泵的皮下植入，可以进行输注，其中所述泵会输送预定量的药物预定的时间段，例如30分钟，90分钟或跨治疗方案长度的时间段。术语"皮下推注，，指在动物或人患者的皮肤下面施用药物，其中推注药物输送小于约15分钟；在另一个方面，小于5分钟,在另一个方面，小于60秒。在另一个方面，在皮肤和基底组织之间的袋内给药，其中通过挤捏或拉扯在基底组织上面且远离基底组织的皮肤，可以建立袋。术语"治疗有效量"用于指具有有益的患者结果(例如，生长停止效应或造成细胞的缺失)的活性试剂的量。在一个方面，治疗有效量具有细胞凋亡活性，或能诱导细胞死亡。在另一个方面，治疗有效量指已经证实会例如有效地减慢疾病发展的靶血清浓度。根据待治疗的病症，可以以常^见方式测量效能。例如，在特征在于表达CD40的细胞的肿瘤性疾病或病症中，通过评估达到疾病发展的时间(TTP)或确定响应速率(RR),可以测量效能。本文使用的术语"治疗"和"疗法"等意在包括，导致任何临床上希望括但不限于一种或多种症状的缓解或解除，疾病或病症发展的消退、减t曼或4亭止。因而，例如，术语治疗包括，在疾病或病症的症状发生之前或之后施用试剂，从而预防或去除疾病或病症的一种或多种迹象。作为另一个实例，该术语包括，在疾病的临床显现之后施用试剂，以战胜疾病的症状。此夕卜，在发生临床症状后和临床症状已经发展之后施用试剂，也包含本文使用的"治疗"或"疗法"，其中施用会影响疾病或病症的临床参数，例如组织损伤的程度，或转移的量或范围，无论治疗是否会导致疾病的改善。术语"包装插页"用来指治疗产物的商品包装中通常包含的说明书，其含有关于适应症、用法、施用、禁忌症的信息和/或关于使用这些治疗产物的警告。缩写"AFP"指二甲基缬氨酸-缬氨酸-dolaisoleume-dolaprome-苯丙氨酸-对苯二胺。缩写"MMAE"指单曱基auristatmE.缩写"AEB"指通过使auristatmE与对乙酰基苯甲酸反应生成的酯。缩写"AEVB"指通过使auristatmE与苯曱酰基戊酸反应生成的酯。缩写"MMAF，指dovaline隱缬氨酸-dolaisoleunine-dolaproine-苯丙氨酸。我#本文描述和公开了人源化的抗-CD40抗体，和包含人源化的抗-CD40抗体的组合物和制品。也描述了结合剂，其包含人源化的抗-CD40抗体的抗原结合片段。人源化的抗-CD40抗体和结合剂可以阻止细胞的生长，造成表达CD40的细胞的缺失，或对靶细胞诱导或造成细胞毒性的或细胞抑制的效应。人源化的抗-CD40抗体和结合剂可以用于治疗特征在于表达CD40表面抗原的细胞的增殖的多种疾病或病症。人源化的抗-CD40抗体和CD40结合剂各自至少包含特异性识别CD40表位的一部分(即，抗原结合片段)。在有些实施方案中，人源化的抗-CD40抗体或CD40结合剂包含与抗体S2C6竟争结合的抗原结合片段。在有些实施方案中，抗原结合片段可以，例如，阻断增殖或阻止细胞的生长，或造成它的耗尽、死亡或它的缺失,例如，通过结合CD40表面抗原。例如，在T和B细胞恶性肺瘤中，当恶性细胞暴露于导致正常淋巴细胞的激活的刺激时，经常产生抗-肿瘤作用(例如，生长停止，有或没有细胞缺失或细胞凋亡)。通过抗原受体或辅助刺激受体的信号，已经观察了该活化-诱导的生长停止(参见，例如，Ashwell等，1987，Scw"ce237:61;Bridges等，1987,丄/附mw"o/.139:4242;Page和Defranco，1988,丄/附附謝o/.140:3717;和Beckw池等，1990,</.淑/.C騰e〃血.82:501)。作为抗体或可溶性配体的特异性结合的结果，CD40刺激会抑制B细胞淋巴瘤生长(参见，例如，Funakoshi等，1994,B/oot/83:2787-2794)。以此方式抑制恶性细胞生长且针对CD40表面抗原的试剂，是适当试剂的实例。CD40特异性试剂包括结合CD40的人源化的抗-CD40抗体的抗原结合片段(例如，人CD40或其变体)。CD40特异性试剂和抗体可以任选地缀合或融合到细胞毒性剂或化疗剂上。在其中人源化的抗体结合CD40表面抗原并造成表达CD40的细胞类型的缺失的方面，结合通常特征在于体内寻靶CD40表面抗原细l包。合适的结合剂会以足够的亲和力和/或亲合力结合CD40抗原，从而通过特异性地靶向表达该抗原的细胞，CD40特异性试剂可以用作治疗剂。在一个方面，试剂是含有鼠单克隆抗体S2C6的CDR的人源化的^t体(S2C64元体i己载在，农'J^口，Paulie等，1984,Cawcer/附附wwo/./附mw冊^r17:165-179)。已经证实S2C6抗体会对人外周B细胞发挥激动剂活性，如通过抗体的以剂量依赖性的方式刺激初期B细胞增殖的能力(参见，例如，Paulie等，1989,J./w/m/朋/.142:590-595)、以及体内抗-肿瘤的活性(参见，例如，美国专利号6,838,261)所证实的。在有些方面，人源化的抗体会使CD40配体与CD40的结合增加至少45%、至少50%、至少60%或至少75%。测定CD40配体与CD40的结合的增加的方法，^^开在美国专利号6,838,261(其7>开内容在本文中引作参考)。在有些实施方案中，人源化的抗-CD40抗体(包括其抗原结合片段，例如重链和轻链可变域)包含源自S2C6鼠抗体的CDR或HVL的残基的氨基酸序列(参见，例如，美国专利号6,838，261)和源自人免疫球蛋白构架区的氨基酸残基。在一个方面，人构架区氨基酸源自如美国专利号6,037,454所述的重链亚型III可变域和K轻链可变域的人共有序列。人源化的抗-CD40抗体任选地包含在共有构架区内的特异性的氨基酸取代。在这些框架位置中的特异性的氨基酸取代，可以提高不同方面的抗体性能，包括结合亲和力和/或稳定性，这优于通过将CDR或HVL"直接交换"进人共有构架区内形成的人源化抗体所证实的，如下面的实施例所述。在有些实施方案中，本文公开的人源化的抗-CD40抗体至少包含具有鼠单克隆抗体S2C6的CDR或HVL的重链或轻链可变域和具有表5所述特异性取代的人共有重链和轻链可变域的FR。在表3和4中，分别显示了具有取代的可变重链氨基酸序列和具有取代的可变轻链氨基酸序列的比对。这些序列包括具有SEQIDNO:3的氨基酸序列的重链可变域和具有SEQIDNO:14的氨基酸序列的轻链可变域。在某些实施方案中，人源化的抗-CD40抗体是抗体片段。已经开发了用于生产抗体片段的不同技术。通过完整抗体的蛋白水解消化，可以书t生出片l炎(参见，例如，Morimoto等，1992,Jowt^/o/5wc/zemzc"/aw<i说，/zjwca/A/"/2O6fe2(107-117;和Brennan等，1985,229:81)。或者，片l殳可以在重组宿主细月包中直冲妻生产。例如，Fab'-SH片l殳可以/人大肠杆菌直接回收，并化学地偶联，以形成F(ab')2片段(参见，例如，Carter等，1992,说o/Tec/mo/ogy10:163-167)。通过另一个方案，F(ab')2片段可以从重组宿主细胞培养物中直接分离。用于生产抗体片段的其它技术，是熟练的从业人员显而易见的。某些实施方案包括人源化的抗-CD40抗体的F(ab')2片段，其分别包含下述序列的重链可变域氨基酸序列和轻链可变域氨基酸序列SEQIDNO:3和SEQIDNO:14;SEQIDNO:4和SEQIDNO:14;SEQIDNO:5和SEQIDNO:14;SEQIDNO:6和SEQIDNO:14;SEQIDNO:7和SEQIDNO:14;SEQIDNO:8和SEQIDNO:14;SEQIDNO:9和SEQIDNO:14;SEQIDNO:6和SEQIDNO:15;SEQIDNO:6和SEQIDNO:16;SEQIDNO:7和SEQIDNO:16;SEQIDNO:10和SEQIDNO:14;SEQIDNO:ll和SEQIDNO:14;SEQIDNO:10和SEQIDNO:16;或SEQIDNO:ll和SEQIDNO:16。这样的实施方案可以包括包含这样的F(ab')2的完整抗体。其它实施方案包括人源化的抗-CD40抗体的F(ab')2片段，其分别包含下述序列的重链可变域氨基酸序列和轻链可变域氨基酸序列SEQIDNO:7和SEQIDNO:14;SEQIDNO:6和SEQIDNO:16;SEQIDNO:7和SEQIDNO:16;SEQIDNO:10和SEQIDNO:14;SEQIDNO:11和SEQIDNO:14;SEQIDNO:10和SEQIDNO:16;和SEQIDNO:11和SEQIDNO:16。其它实施方案包括人源化的抗-CD40抗体的F(ab')2片段，其分别包含下述序列的重链可变域氨基酸序列和轻链可变域氨基酸序列SEQIDNO:7和SEQIDNO:14;SEQIDNO:6和SEQIDNO:16;SEQIDNO:IO和SEQIDNO:16;和SEQIDNO:11和SEQIDNO:16。有些实施方案包括人源化的抗-CD40抗体的F(ab')2片段，其含有具有SEQIDNO:10的氨基酸序列的重链可变域和具有SEQIDNO:16的氨基酸序列的轻链可变域。在有些实施方案中，抗体或抗体片段包括介导效应物功能的恒定区。恒定区可以针对表达CD40的靶细胞提供抗体-依赖性的细胞毒性(ADCC)、抗体-依赖性的细胞吞噬作用(ADCP)和/或补体-依赖性的细胞毒性(CDC)应答。效应结构域可以是，例如，Ig分子的Fc区域。通常，CD40结合剂会募集和/或活化细胞毒性的白细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞，吞噬作用细胞(例如，巨噬细胞),和/或血清补体成分)。抗体的效应结构域可以来自任意合适的脊推动物物种和同种型。来自不同动物物种的同种型的介导效应功能的能力不同。例如，人免疫球蛋白的介导CDC和ADCC/ADCP的能力的次序通常分别是IgM^IgG^IgG3〉IgG2〉IgG4和IgG^IgG3〉IgG2/IgM/IgG4。鼠免疫J求蛋白通常会分别以下述次序介导CDC和ADCC/ADCP:鼠IgM-IgG^MgGA^gGs^MgGi和IgG2b〉IgG2a>IgGi〉〉IgG3。在另一个实施例中，鼠IgGh介导ADCC,而鼠IgGh和IgM介导CDC。机,人源化的抗-CD40抗体和试剂可以包括人源化的抗-CD40抗体或其抗原结合片段的修饰。例如，可能希望修饰抗体的效应功能，以便例如增强抗体在治疗癌症中的有效性。一种这样的修饰是，将半胱氨酸残基导入Fc区域，从而在该区域形成链间二石危键。这样产生的同型二聚体抗体可以具有提高的内化能力和/或增强的补体-介导的细胞杀伤和/或抗体-依赖性的细胞毒性(ADCC)。参见，例如，Caron等，1992,J.￡孕A/ec/.176:1191-1195;和Shopes,1992,././ww丽o/.148:2918-2922。使用Wolff等，1993,Omcw^^an:/253:2560-2565所述的异双功能交联剂，也可以制备具有增强的抗-肺瘤活性的同型二聚体抗体。或者，可以构建含有双Fc区域的抗体，增强补体裂解和抗体的ADCC能力。参见Stevenson等,1989,爿"fz-C騰erDrwgZ)ewgw3:219-230。通过修饰它们的Fc区域的糖基化模式，已经制备了具有提高的支持ADCC的能力的抗体。这是可行的，因为CH2结构域中天冬酰胺残基N297处的抗体糖基化会参与ADCC所必需的IgG和Fc受体之间的相互作用。已经构建了宿主细胞系来表达具有改变的糖基化的抗体，例如增加的二等分N-乙酰基葡糖胺或还原的岩藻糖。岩藻糖还原会提供比增加存在的二等分N-乙酰基葡糖胺更大的对ADCC活性的增强。此外，低岩藻糖抗体对ADCC的增强，独立于FcRIIIaV/F多态性。修饰抗体Fc区域的氨基酸序列，是增强ADCC的糖基化工程的替代方案。通过广泛的突变分析，已经测定了人IgG!上的Fc受体的结合位点。这导致具有Fc突变的人源化的IgGi抗体的产生，所述Fc突变会增加对FcRIIIa的结合亲和力，并体外增强ADCC。另外，用结合性质的许多不同排列，例如，提高的对特定FcR受体的结合、且对其它FcR受体的结合保持不变或减少，已经得到了Fc变体。在有些实施方案中，可以如其公开内容在这里引作参考的美国专利申请公开号2006-0003412和2006-0008883所述，修饰Fc区域。另一个方面包括免疫缀合物，其包含人源化的抗体或其片段，后者缀合到细胞毒性剂(例如化疗剂)、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素(即，放射性缀合物)上。上面已经描述了用于制备这样的免疫缀合物的化疗剂。可以用于形成有用的免疫缀合物的酶活性毒素和其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、a-八叠球菌、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(尸/2yto/acaawenca肪)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒素、巴豆毒素、Sa/Mow^7'ac^9cw"/w抑制剂、白初于毒素、米托洁林、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯(tncothecene)等。许多种放射性核素可用于生产放射性缀合的人源化的抗-CD40抗体。实例包括21^,I31I,131l0186Re。人源化的抗-CD40抗体和细胞毒性剂或化疗剂的缀合物，可以通过已知方法，使用下述试剂制备双功能蛋白偶联剂例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)-丙酸酯(SPDP)、immothiolane(IT)、亚氨酯的双功能衍生物(如二甲基己二酰二胺HCL)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对叠氮苯曱酰)己二胺)、双重氮衍生物(如双(重氮对苯曱酰)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯-2，6-二异氰酸酉旨)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒素免疫毒素能如Vitetta等，1987,5We"ce238:1098所述制备。碳-14-标记的l-异硫氰酸根合苄基-3-曱基二乙烯三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苦酸缀合到抗体上的一种示例性螫合剂。参见，例如，国际公开WO94/11026。也可以用可切割的连接物形成缀合物，例如在7>开的欧洲专利申请0624377中公开的那些；其公开内容在本文中引作参考。在另一个实施方案中，抗体可以缀合到用于肿瘤预导向的"受体"(如抗生物素蛋白链菌素)上。在该方法中，对患者施用抗体-受体缀合物，随后利用清除剂从循环中除去未结合的缀合物，然后施用选择性地结合受体(例如，抗生物素蛋白)的"配体"，所述配体缀合在细胞毒性剂(如放射性核素)上。本文公开的人源化的抗-CD40抗体也可以配制成免疫脂质体。含有抗体的脂质体可以通过本领域已知的方法制备，例如在Epstein等，1985,iVoc.AAa/7.Jcat/.t/&482:3688;Hwang等，1980,尸roc.A^/.」cadV&477:4030;和美国专利号4,485,045和4，544,545中描述的方法。具有增强的循环时间的脂质体，〃>开在例如美国专利号5,013,556中。特别有用的脂质体可以用反相蒸发法产生，其中使用含有磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂类组合物。脂质体通过规定孔径的滤器喷出，产生具有希望的直径的脂质体。本文公开的抗体的Fab，片l殳可以通过二石危化物交换反应，与如Martin等，1982,丄Ao/.C/zew.257:286-288所述的脂质体缀合。脂质体中任选地含有化疗剂(例如多柔比星)。参见，例如，Gabizon等，1989,丄Atow腦/C朋cw81(19):1484。本文描述和7〉开的抗体也可以用于ADEPT(抗体-导向的酶前药治疗)方法中，其中将抗体缀合到前药-激活酶上，后者可以将前药(例如，肽基化疗剂)转化成有活性的抗癌药物。参见，例如，WO81/01145,WO88/07378,和美国专利号4,975,278。用于ADEPT的免疫缀合物的酶组分，是能以将它转化成更有活性的、细胞毒性形式的方式作用于前药的酶。用于ADEPT的具体酶包括、但不限于，可用于将含磷酸盐的前药转化为游离药物的碱性磷酸酶；可用于将含硫酸盐的前药转化为游离药物的芳基硫酸酯酶；可用于将无毒5-氟胞嘧啶转化为抗癌药5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨基酶；可用于将含肽前药转化为游离药物的蛋白酶，如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(如组织蛋白酶B和L);可用于转化含D-氨基酸取代基的前药的D-丙氨酰羧肽酶；可用于将糖基化前药转化为游离药物的碳水化合物裂解酶，如oc-半乳糖苦酶和神经氨酸酶；可用于将a-内酰胺书f生的药物转化为游离药物的cc-内酰胺酶；和可用于将在它们的胺氮处分别用苯氧乙酰基或苯乙酰基衍化的药物转化为游离药物的青霉素酰胺酶，如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，具有酶活性的抗体("抗体酶")可以用于将前药转化为游离活性药物(参见，例如，Massey,1987，Atowe328:457-458)。抗体-抗体酶缀合物可以通过已知方法制备，用于对肺瘤细胞群输送抗体酶，例如，通过使酶共〗介结合上面讨论的人源4^的抗-CD40抗体/异双功能交联剂。或者，也可以使用重组DNA技术构建融合蛋白，其至少包含本文公开的抗体的抗原结合区，后者至少与上述酶的功能活性部分相连接(参见，例如，Neuberger等，1984,Atowe312:604-608)。在某些实施方案中，可能希望使用人源化的抗-CD40抗体片段(而不是完整抗体)来例如增强肿瘤穿透。可能希望修饰抗体片段，以便增加它的血清半衰期。这可以通过例如将补救受体结合表位掺入抗体片段中来实现。在一种方法中，可以改变(例如，突变)抗体片段的适当区域，或者可以将表位掺入肽标记中，然后将后者与抗体片段在任一端或在中间融合，例如，通过DNA或肽合成。参见，例如，WO96/32478。在其它实施方案中，也包括人源化的抗-CD40抗体的共价修饰。在适当时，它们可以通过化学合成或通过抗体的酶或化学切割来制备。通过使抗体的耙向氨基酸残基与有机衍生剂反应(其能与选择的侧链或氨基-或羧基-端残基反应)，可以将其它类型的抗体共价修饰导入分子中。共价修饰包括下述基团的修饰半胱氨酰残基，组氨酰残基，赖氨酰和氨基端残基，精氨酰残基，酪氨酰残基，羧基侧基(天冬氨酰基或谷氨酰基)，谷氨酰基和天冬酰胺酰残基,或丝氨酰基或苏氨酰基残基。另一类共价修饰包含糖苷与抗体的化学或酶促偶联。可以化学地或酶促地实现抗体上存在的任意石友水化合物部分的去除。化学去糖基化描述在Hakimuddin等，1987,Jrc/z.^o;/z，.259:52和Edge等，1981，^憩/.Bzoc/^肌，118:131。通过使用Thotakura等1987,A:fe仇五"zymo/.138:350所述的许多种内-和夕卜糖苷酶，可以实现抗体上碳水化合物部分的酶促切割。另一类有用的共价修饰包含，以美国专利号4,640,835、美国专利号4，496，689、美国专利号4，301，144、美国专利号4，670,417、美国专利号4,791,192和美国专利号4,179,337中的一个或多个所述的方式，将抗体连接到许多种非蛋白聚合物之一上，例如，聚乙二醇，聚丙二醇或聚氧烯烃。人源化和氨基酸序列变体下面的实施例1描述了人源化抗-CD40抗体的方法，实施例2描述了变体。在某些实施方案中，可能希望产生这些人源化的抗体的氨基酸学性质。b;、、、；、^通过将适当核苷酸变化导入抗-CD40抗体DNA,或通过肽合成,可以制备抗-CD40抗体的氨基酸序列变体。这样的变体包括，例如，本文实施例的抗-CD40抗体的氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或取代。进行缺失、插入和取代的任意组合，以获得最终构建体，只要最终构建体具有希望的特性。氨基酸改变也可改变人源化的或变体抗-CD40抗体的翻译后加工，例如改变糖基化位点的数量或位置。或区域，它称作"丙氨酸扫描诱变法"，如Cunningham和Wells(S"e"ce，244:1081-1085(1989))所述。在此确定了一个残基或一组耙残基(例如，带电残基，如arg、asp、his、lys和glu),并替换为中性或带负电的氨基酸(通常丙氨酸)，以影响氨基酸与CD40抗原的相互作用。然后通过在取代位点引入其它变异，确定证实对取代功能敏感的氨基酸位置。因此，预先确定用于引入氨基酸序列变异的位点，而不需预先确定突变本身的性质。例如，为了分析特定位点突变的表现，在耙密码子或区域处进行丙氨酸扫描或随机诱变，并筛选表达的抗-CD40抗体变体的希望的活性。氨基酸序列插入包括氨基端和/或羧基端融合，其长度从一个残基到含有一百个或以上残基的多肽，以及一个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括，与表位标记融合的抗-CD40抗体。抗-CD40抗体分子的其它插入变体包括与酶的抗-CD40抗体的N端或C端的融合体，或延长抗体的血清半衰期的多肽。另一类变体是氨基酸取代变体。这些变体在抗-CD40抗体分子中的至少一个氨基酸残基被去除，并在该位置插入不同的残基。最感兴趣的用于取代诱变的位点包括超变区，但是也包括FR改变。表l在"优选取代"标题下列出了保守取代。如果这些取代导致生物活性改变，可引入更多实质改变，在表1中被命名为"示例性取代"，或者如以下关于氨基酸类别所进一步描述，并且筛选产物。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>Lys(K)arg;gin;asnargMet(M)leu;phe;ileleuPhe(F)leu;val;ile;ala;tyrtyrPro(P)alaalaSer(S)thrthrThr(T)ssrserTrp(W)tyr;phetyrTyr(Y)trp;phe;thr;serpheVal(V)ile;leu;met;phe;leuala;正亮氨酸抗体生物学性质的本质改变通过选择取代实现，这些取代的下述作用显著不同保持(a)取代区域中多肽主链的结构，如片层或螺旋构象，(b)耙部位处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的大小。自然存在的残基根据共同的侧链性质分为以下几类(1)疏水正亮氨酸，met,ala,val,leu,ile;(2)中性亲水cys,set,thr;(3)酸性asp,glu;(4)减性asn，gin,his，lys，arg;(5)影响《连方向的残基gly,pro;和(6)芳族trp，tyr,phe。非保守性取代需要将这些类别之一的成员换为另一类别。不参与保持人源化的或变体抗-CD40抗体的适当构象的任何半胱氨酸残基一般也可以取代为丝氨酸，以提高分子的氧化稳定性，并防止异常交联，或提供与细胞毒性的或细胞抑制的化合物缀合的建立点。反之，也可以向抗体中加入半胱氨酸键，以提高其稳定性(特别是在抗体是抗体片段如Fv片段时)。一类取代变体包含，取代亲本抗体(例如，人源化的或人抗体)的一个或多个超变区残基。通常，产生的为进一步发展选择的变体具有比产生它们的亲本抗体提高的生物学性质。生产这些取代变体的一种适宜方法是利用噬菌体展示的亲和成熟法。简言之，突变几个超变区位点(例如6-7个位点)，以产生每个位点的所有可能的氨基取代。这样产生的抗体变体由丝状噬菌体颗粒以单价方式展示，作为与包装于每个颗粒中的Mi3的基因ni产物的融合体。然后筛选噬菌体展示的变体的生物活性(例如结合亲和力)。为了确定用于修饰的候选超变区位点，可以进行丙氨酸扫描诱变，以鉴别明显有助于抗原结合的超变区残基。或者或另外，为了鉴别抗体与人CD40之间的接触点，分析抗原-抗体复合物的晶体结构也是有利的。这些接触残基和邻近残基是按照此处详述的技术取代的候选残基。产生这些变体后，对全部变体进行此处所述的筛选，可以选择在一次或多次相关试验中具有优越性质的抗体，用于进一步发展。抗体的另一类氨基酸变体会改变抗体的原始糖基化模式。"改变"是指，删除抗体中的一个或多个碳水化合物部分，和/或添加一个或多个抗体中没有的糖基化位点。抗体的糖基化一般是N-连接的或O-连接的。N-连接的是指，碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸之外的任一氨基酸)是碳水化合物部分与天冬酰胺侧链的酶促连接的识别序列。因此，这些三肽序列中的任一种在多肽中的存在，都会产生可能的糖基化位点。O-连接的糖基化是指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一与羟氨基酸(最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸)的连接。通过改变氨基酸序列，使其含有一种或多种上述三肽序列(用于N-连接的糖基化位点)，可以方便地向抗体中添加糖基化位点。也可以通过向原始抗体序列中添加或取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基，进行这种改变(对于O-连接的糖基化位点)。通过本领域周知的多种方法，可以制备编码抗-CD40抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括但不限于从天然来源分离(对于天然存在的氨基酸序列变体)，或通过以前制备的变体或非变体形式的抗-CD40抗体的寡核苷酸介导的(或定点的)诱变、PCR诱变和盒诱变来制备。人抗体作为人源化的替代方案，可以制备人抗体。例如，可以使用转基因动物(辨如，小鼠)，其在免疫接种后，能在没有生成内源免疫球蛋白的情况下，生产人抗体的所有组分。例如，已经描述，嵌合的和种系突变的小鼠中抗体重链连接区域(Jh)基因的纯合子缺失，会导致内源抗体生产的完全抑制。这样的种系突变的小鼠中人种系免疫球蛋白基因阵列的转移，会导致抗原挑战后人抗体的生产。作为人源化的替代方案，可以制备人抗体。例如，可以使用转基因动物(辨如，小鼠)，其在免疫接种后，能在没有生成内源免疫球蛋白的情况下，生产人抗体的所有组分。例如，已经描述，嵌合的和种系突变的小鼠中抗体重链连接区域(JH)基因的纯合子缺失，会导致内源抗体生产的完全抑制。这样的种系突变的小鼠中人种系免疫球蛋白基因阵列的转移，会导致抗原挑战后人抗体的生产。参见，例如，Jakobovits等，1993,尸roc.Ato/.爿c^/.90:2551;Jakobovits等，1993,A^we362:255-258;Bmggermann等，1993,yearz力/w附朋o.7:33;和美国专利号5,591,669;5,589,369;5,545,807;6,075,181;6,150，584;6,657,103;和6,713,610。或者，噬菌体展示技术(参见，例如，McCafferty等，1990,Atowe348:552-553)可以用于从来自未免疫的供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因库，体外生产人抗体和抗体片段。根据该技术，将抗体V结构域基因在框架内克隆进丝状噬菌体例如M13或fd的主要或次要壳蛋白基因中，并作为功能抗体片段显示在噬菌体颗粒的表面上。因为丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，基于抗体的功能性质的选择，也会导致编码表现出这些性质的抗体的基因的选择。因而，噬菌体会模仿B-细胞的有些性质。噬菌体展示可以以多种形式进行；它们的综述参见，例J(口，Johnson牙口Chiswell,1993,Cwrre77/0/z'm'cwz力5Vri/"wra/3:564-571。V-基因区段的几种来源可以用于噬菌体展示。Clackson等，1991，淑脏352:624-628从源自免疫小鼠的脾的V基因的小随机组合文库中，分离了抗-"恶唑酮抗体的不同阵列。可以构建来自未免疫的人供体的V基因的所有组分，且可以基本上3安照Marks等，1991,,/.A/o/.S,o/.222:581-597或Griffith等，1993,￡A^BO,/.12:725-734所述的技术，分离抗原(包括自身抗原)的不同阵列的抗体。也参见美国专利号5,565,332和5,573,905。如上面所讨论的，也可以用体外激活的B细胞产生人抗体(参见美国专利号5,567,610和5,229,275)。多核苷酸，载体，宿主细月包,和重组方法多核苷酸，载体,和包含该多核苷酸的宿主细胞,和用于生产人源化的抗体的重组技术。分离的多核苷酸可以编码任意希望形式的抗-CD40抗体，包括，例如，全长单克隆抗体，Fab,Fab',F(ab')2,和Fv片段，双特异抗体，线性抗体，单链抗体分子,和从抗体片段形成的多特异性抗体。有些实施方案包括分离的多核苷酸，后者包含编码具有SEQIDN0:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10或SEQIDNO:ll的重链可变区氨基酸序列的抗体或抗体片段的序列。有些实施方案包括分离的多核苷酸，后者包含编码具有SEQIDNO:14、SEQIDNO:15或SEQIDNO:16的轻链可变域氨基酸序列的抗体或抗体片段的序列。在一个方面，所述分离的多核苷酸序列编码具有重链可变域和轻链可变域的抗体或抗体片段，所述重链可变域和轻链可变域分别包含下述氨基酸序列SEQIDNO:3和SEQIDNO:14;SEQIDNO:4和SEQIDNO:14;SEQIDNO:5和SEQIDNO:14;SEQIDNO:6和SEQIDNO:14;SEQIDNO:7和SEQIDNO:14;SEQIDNO:8和SEQIDNO:14;SEQIDNO:9和SEQIDNO:14;SEQIDNO:6和SEQIDNO:15;SEQIDNO:6和SEQIDNO:16;SEQIDNO:7和SEQIDNO:16;SEQIDNO:10和SEQIDNO:14;SEQIDNO:ll和SEQIDNO:14;SEQIDNO:10和SEQIDNO:16;或SEQIDNO:ll和SEQIDNO:16。在另一个方面，所述分离的多核苷酸序列编码具有重链可变域和轻链可变域的抗体或抗体片段，所述重链可变域和轻链可变域分别包含下述氨基酸序列SEQIDNO:7和SEQIDNO:14;SEQIDNO:6和SEQIDNO:16;SEQIDNO:7和SEQIDNO:16;SEQIDNO:10和SEQIDNO:14;SEQIDNO:l1和SEQIDNO:14;SEQIDNO:10和SEQIDNO:16;和SEQIDNO:11和SEQIDNO:16。在另一个方面，所述分离的多核苷酸序列编码具有重链可变域和轻链可变域的抗体或抗体片段，所述重链可变域和轻链可变域分別包含下述氨基酸序列SEQIDNO:7和SEQIDNO:14;SEQIDNO:6和SEQIDNO:16;SEQIDNO:10和SEQIDNO:16;和SEQIDNO:11和SEQIDNO:16。在另一个方面，所述分离的多核苷酸序列编码具有重链可变域和轻链可变域的抗体或抗体片段，所述重链可变域包含SEQIDNO:IO的氨基酸序列，所述轻链可变域包含SEQIDNO:16的氨基酸序列。包含人源化的抗-CD40抗体或其一个片段或链的编码序列的多核苷酸可以融合到一个或多个本领域已知的调节或控制序列上，且可以包含在本领域已知的适当表达载体或宿主细胞中。编码重《连或轻链可变域的每一个多核苷酸分子可以独立地融合到编码恒定域(例如人恒定域)的多核苷酸序列上，以便生产完整抗体。或者，可以将多核苷酸或其一部分融合到一起，提供生产单链抗体的模板。为了重组生产，将编码抗体的多核苷酸插入用于克隆(DNA的扩增)或表达的复制载体中。可以得到许多适用于表达重组抗体的载体。载体组分通常包括、但不限于，下述的一种或多种信号序列，复制起点，一个或多个标记基因，增强子元件，启动子，和转录终止序列。人源化的抗-CD40抗体也可以生产为融合多肽，其中抗体与异源多肽(例如信号序列或在成熟蛋白或多肽的氨基末端具有特异性切割位点的其它多肽)相融合。选择的异源信号序列通常是能被宿主细胞识別和加工(即，被信号肽酶切割)的序列。对于不能识别和加工人源化的抗-CD40抗体信号序列的原核宿主细胞，信号序列可以取代为原核信号序列。信号序列可以是，例如，碱性磷酸酶，青霉素酶，脂蛋白，热稳定的肠毒素n先导物，等。对于酵母分泌，天然信号序列可以取代为,例如，从酵母转化酶a-因子(包括酵母和克鲁维氏酵母-因子先导物)、酸性磷酸酶、白色卩叚丝酵母葡萄糖淀粉酶得到的先导序列，或WO90/13646所述的信号。在哺乳动物细胞中，可以4吏用哺乳动物信号序列以及病毒分泌先导物，例如，单纯疱疹gD信号。将这样的前体区域的DNA在读码框内连接到编码人源化的抗-CD40抗体的DNA上。表达和克隆载体含有能使该载体在一种或多种选定的宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，该序列是能使载体独立于宿主染色体DNA复制的序列，且包括复制起点或自主复制序列。对于许多种细菌、酵母和病毒，这样的序列是众所周知的。来自质粒pBR322的复制起点适用于大多数革兰氏阴性细菌，2质粒起点适用于酵母，多种病毒起点(SV40,多瘤，腺病毒，VSV,和BPV)适用于哺乳动物细胞中的克隆载体。通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点组分(通常只可以使用SV40起点，因为它含有早期启动子)。表达和选择载体可以含有选择基因，也称作选择标记。典型的选择基因编码的蛋白会(a)赋予对抗生素或其它毒素(例如，氨千西林，新霉素，甲氨蝶呤或四环素)的抗性，(b)弥补营养缺陷型缺陷，或(c)供应从复合培养基不能得到的关键营养素，例如，编码芽孢杆菌的D-丙氨酸消旋酶的基因。选择方案的一个实例采用药物来阻止宿主细胞的生长。用异源基因成功转化的那些细胞，会生产赋予药物抗性的蛋白，从而在选择方案中存活。这样的显性选择的实例使用药物新霉素，霉酚酸,和潮霉素。适用于哺乳动物细胞的选择标记的另一个实例是，能鉴别摄入编码人源化的抗-CD40抗体的核酸的感受态细胞的那些，例如DHFR(二氲叶酸还原酶)、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和-II(例如灵长类动物金属硫蛋白基因)、腺普脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。例如，通过在含有甲氨蝶呤(Mtx)(DHFR的一种竟争拮抗剂)的培养基中培养全部转化体，首先鉴别出用DHFR选择基因转化的细胞。当使用野生型DHFR时，适当的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如，DG44)。或者，通过在含有选择标记的选择剂(例如氨基糖苷抗生素，例如,卡那霉素，新霉素，或G418)的培养基中培养细胞，可以选择用编码抗-CD40抗体、野生型DHFR蛋白的DNA序列和另一种选择标记(例如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH))转化或共转化的宿主细胞(更具体地，含有内源DHFR的野生型宿主)。参见，例如，美国专利号4,965,199。适用于酵母的选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的7TeF/基因(Stmchcomb等，1979,M^wre282:39)。77^/基因会提供缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变^M々选择标记，例如，ATCCNo.44076或PEP4-1(Jones,1977,85:12)。损伤在酵母宿主细胞基因组中的存在，又会提供通过在没有色氨酸的情况下的生长检测转化的有效环境。类似地，携带丄五L/2基因的已知质粒，会弥补Leu2p-缺陷型酵母抹(例如ATCC20,622和38,626)。另外，源自1.6ym环状质粒pKDl的载体可以用于转化^鲁攀^,爭属酵母。或者，为〖/&报道了用于大规模生产重组牛凝乳酶的表达系统(VandenBerg,1990,说o/Tec/wo/ogy8:135)。还已经公开了^^举《,母的工业菌抹的分泌成熟重组人血清白蛋白的稳定多拷贝表达载体(Fleer等，1991,说o/Tec/z"o/ogy9:968-975)。表达和克隆载体通常含有能被宿主生物体识别、且可操作地连接到编码抗-CD40抗体或其多肽链的核酸分子上的启动子。适合用于原核宿主的启动子包括phoA启动子，oc-内酰胺酶和乳糖启动子系统，碱性磷酸酶，色氨酸(trp)启动子系统，和杂种启动子例如tac启动子。其它已知的细菌启动子也是适用的。用于细菌系统的启动子也含有可操作地连接到编码人源化的抗-CD40抗体的DNA上的Shine-Dalgamo(S.D.)序列。许多真核启动子序列是已知的。实际上，所有真核基因都具有富含AT的区域，其位于转录起始位点上游约25-30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70-80个碱基处发现的另一个序列是CNCAAT区域，其中N可以是任意核苷酸。在大多数真核基因的3'末端是AATAAA序列，其可以是向编码序列的3'末端添加聚腺苷酸尾的信号。所有这些序列都适合插入真核表达载体。适合用于酵母宿主的启动序列的实例包括下述酶的启动子3-磷酸甘油酸酯激酶或其它糖酵解酶,例如烯醇酶，甘油醛-3」畴酸脱氪酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6-磷酸异构酶，3-磷酸甘油酸酯变位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖异构酶，磷酸葡萄糖异构酶,和葡萄糖激酶。诱导型启动子具有生长条件控制的转录的其它优点。它们包括下述酶的酵母启动子区域醇脱氢酶2,异细胞色素C,酸性磷酸酶，与氮代谢有关的衍生酶，金属硫蛋白，甘油醛-3-磷酸脱氲酶，和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。适用于酵母表达的载体和启动子进一步描述在EP73,657中。酵母增强子也可以有利地与酵母启动子一起使用。在哺乳动物宿主细胞中从载体转录人源化的抗-CD40抗体，受例如从病毒(例如多瘤病毒，鸡痘病毒，腺病毒(例如腺病毒2),牛乳头状瘤病毒，鸟类肉瘤病毒，巨细胞病毒，逆转录病毒，乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40))的基因组得到的启动子、异源哺乳动物启动子(例如，肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)或热休克启动子的控制，只要这样的启动子与宿主细胞系统相容。SV40病毒的早期和晚期启动子，可以作为也含有SV40病毒复制起点的SV40限制片段方便地得到。人巨细胞病毒的立即早期启动子可以作为HmdIIIE限制片段方便地得到。使用牛乳头状瘤病毒作为载体，在哺乳动物宿主中表达DNA的系统，公开在美国专利号4，419,446中。该系统的改进，描述在美国专利号4,601，978中。也参见Reyes等，1982,Atowre297:598-601,其中公开了在来自单纯疱渗病毒的胸苷激酶启动子的控制下，在小鼠细胞中表达人oc-干扰素cDNA。或者，劳斯肉瘤病毒长末端重复序列可以用作启动子。通过在载体中插入增强子序列，经常会增强高级真核生物对编码本文公开的人源化的抗-CD40抗体的DNA的转录。现在已知许多增强子序列来自哺乳动物基因(例如，珠蛋白，弹性蛋白酶，白蛋白，-胎儿球蛋白，和胰岛素)。但是，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括在复制起点的晚侧上的SV40增强子(bp100-270),巨细胞病毒早期启动子增强子，在复制起点的晚侧上的多瘤增强子，和腺病毒增强子。关于活4匕真核启动子的增强元件的描述，也参见Yamv,1982，Atowe297:17-18。增强子可以在人源化的抗-CD40抗体-编码序列的5'或3'位置拼接进载体，但是优选地位于启动子的5'位点。在真核宿主细胞(酵母，真菌，昆虫，植物，动物，人类，或来自其它多细胞生物体的有核细胞)中4吏用的表达载体也可以含有转录终止和稳定mRNA所需的序列。这样的序列通常来自真核或病毒DNA或cDNA的5'(和有时3')不翻译区。这些区域含有转录成编码抗-CD40抗体的mRNA的不翻译部分中的多腺苦酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止组分是牛生长激素多腺苷酸化区域。参见WO94/11026和其中公开的表达载体。在有些实施方案中，人源化的抗-CD40抗体可以使用CHEF系统来表达。(参见，例如，美国专利号5,888,809;其公开内容在本文中引作参考)。适用于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞是原核生物、酵母或上述的高级真核生物细胞。适用于该目的的原核生物包括真细菌，例如革兰氏阴性的或革兰氏阳性的生物体,例如，肠杆菌科例如埃希氏杆菌属,例如，大肠杆菌，肠杆菌属，欧文菌属，克雷伯氏菌属，变形菌属，沙门氏菌属,例如，鼠伤寒沙门氏杆菌，粘质沙雷氏菌属,例如，粘质沙雷氏杆菌,和志贺氏菌属，以及芽胞杆菌属例如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌(例如，在1989年4月12日/>开的DD266,710中4皮露的地衣芽孢杆菌41P),假单胞菌属例如铜绿假单胞菌,和链霉菌属。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC31,446)，尽管其它菌抹例如大肠杆菌B,大肠杆菌X1776(ATCC31,537),和大肠杆菌W3110(ATCC27，325)也是适用的。这些实例是解释性的，而不是限制性的。除了原核生物外，真核微生物(例如丝状真菌或酵母)是适用于人源化的抗-CD40抗体-编码载体的克隆或表达宿主。酿酒酵母或常见的面包酵母，是低级真核宿主微生物中最常用的。但是，通常在本文中可以得到并使用许多其它的属、种和菌抹，例如^源袭座^#;孝宿主例如，乳克鲁维氏酵母，脆壁克鲁维氏酵母(ATCC12,424)，保加利亚克鲁维氏酵母(ATCC16，045),威克曼氏克鲁维氏酵母(ATCC24，178),K.waltii(ATCC56,500),果蝇克鲁维氏酵母(ATCC36,906),K.thermotolerans和马克斯克鲁维氏酵母；耶氏酵母(yarrowia)(EP402,226);巴斯德毕赤氏酵母(EP183,070);假丝酵母属；Tnchodermareesia(EP244,234);粗糙链孢霉；许旺氏酵母属例如Schwanmomycesoccidentalis;和丝状真菌例如，链孢霉属，青霉属，ro/_y/7oc/at/mw和曲霉属宿主例如构巢曲霉和,必#。适用于表达糖基化的人源化抗-CD40抗体的宿主细胞源自多细胞生物体。无脊推动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞，包括，例如，许多杆状病毒菌抹和变体和对应的许可的来自宿主的昆虫宿主细胞，例如草地贪夜蛾(Spodopterafmgiperda)(毛虫)，埃及伊蚊(蚊子)，白乡丈伊蚊(蚊子)，黑腹果蝇(果蝇),和家蚕(蚕虫)。许多种用于转染的病毒抹可以公开得到，例如，苜蓿丫紋夜蛾(Autographacaliformca)NPV的L-l变体和家蚕NPV的Bm-5菌株，这样的病毒可以用于，尤其是转染草地贪夜蛾细月包。棉花、玉米、马铃薯、大豆、牵牛花、西红柿和烟草的植物细胞培养物，也可以用作宿主。在另一个方面，在脊推动物细胞中表达人源化的抗-CD40。脊推动物细胞在培养物(组织培养物)中的繁殖，已经成为可广泛得到的常规操作和技术。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCCCRL1651),人胚胎肾系(为悬浮培养生长亚克隆的293或293细胞)(Graham等，1977,./.Kzro/.36:59),幼仑鼠肾细胞(BHK，ATCCCCL10),中国仓鼠卵巢细胞ADHFR;(CHO,Urlaub等,1980,尸rac.Ato/.爿cadScz.T7&477:4216;例如，DG44),小鼠Sertoli细胞(TM4,Mather,1980,说o/.Ke/rot/.23:243-251)，浙吳肾细！包(CV1ATCCCCL70),非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCCCRL-1587),人子宫颈癌细胞(HELA,ATCCCCL2),犬肾细胞(MDCK，ATCCCCL34),布法罗大鼠肝细胞(BRL3A,ATCCCRL1442),人肺细月包(W138,ATCCCCL75),人肝细胞(HepG2，HB8065),小鼠乳腺肿瘤(MMT060562,ATCCCCL51),TRI细胞(Mather等，1982,爿朋"/siV.7:爿c^/.&z.383:44-68),MRC5细胞，FS4细胞,和人肝瘤系(HepG2)。用人源化的抗-CD40抗体生产的上述表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为诱导启动子、选择转化体或扩增编码目标序列的基因而适当改良的常规营养素培养基中培养。可以在多种培养基中培养用于生产本文所述人源化的抗-CD40抗体的宿主细胞。可商业得到的培养基例如Ham氏F10(Sigma-AldrichCo.,St.Loms,MO)、最低必需培养基((MEM)、(Sigma-AldrichCo.)、RPMI-1640(Sigma-AldrichCo.)、和Dulbecco氏改良的伊才各尔培养基((DMEM),Sigma-AldrichCo.),适用于培养宿主细胞。另外，在下述文献中的一篇或多篇中描述的任意培养基，可以用作宿主细胞的培养基Ham等，1979,她仇￡虹58:44,Barnes等，1980，^4朋/.Aoc/zew.102:255,美国专利号4,767,704,美国专利号4,657,866,美国专利号4,927,762，美国专利号4,560,655,美国专利号5,122,469,WO90/103430，和WO87/00195。这些培养基可以才艮据需要添加有激素和/或其它生长因子(例如胰岛素，转铁蛋白，或表皮生长因子)，盐(例如氯化钠，钓，镁,和磷酸盐)，緩冲剂(例如HEPES),核普酸(例如腺苦和胸苷)，抗生素(例如庆大霉素)，微量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物),和葡萄糖或等效能源。也可以包含本领域技术人员已知的适当浓度的其它添加剂。培养条件，例如温度、pH等，是以前为选择用于表达的宿主细胞使用的条件，且是普通技术人员显而易见的。当使用重组技术时，抗体可以生产在细胞内、在周质空间中，或直接分泌进培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么作为第一步，破碎细胞来释放蛋白。通过例如离心或超滤，可以清除宿主细胞或裂解片段的樣t粒碎片。Carter等，1992，Bw/Tec/mo/ogy10:163-167描述了用于分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的方法。筒单的说，在存在乙酸钠(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)下，使细胞糊在约30分钟内融化。可以通过离心除去细胞碎片。如果抗体分泌到培养基中，那么通常首先使用商品化蛋白浓缩过滤器，例如Amicon或MilliporePellicon超滤单元，浓缩来自这类表达系统的上清液。在任何上述步骤中，可以包括蛋白酶抑制剂例如PMSF来抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素来防止外来污染物的生长。许多方法可以用于从宿主细胞分离抗体。可以使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析(亲和层析是典型的纯化技术)来纯化由细胞制备的抗体组合物。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人yl、y2或Y4重链的抗体(参见，例如，Lmdmark等，1983/./附ww朋/.Me仇62:1-13)。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人(参见，例如，Guss等，1986￡A^<97.5:1567-1575)。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可以使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能够获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。对于包含CH3结构域的抗体而言，可使用BakerbondABXTM树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)进行纯化。才艮据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术，诸如离子交换柱上的分离、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSE，上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。在任何初步纯化步骤之后，可以将包含目的抗体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用层析，使用pH约2.5-4.5的洗脱緩冲液，通常在低盐浓度(如约0-0.25M盐)进行。也包括在本文定义的低等、中等和高等严谨性条件下与由SEQIDNO:17或其补体或SEQIDNO:20或其补体代表的核苷酸序列的全部或一部分(例如，编码可变区的部分)杂交的核酸。杂交核酸的杂交部分的长度通常是至少15(例如，20,25,30或50)个核苷酸。杂交核酸的杂交部分与编码抗-CD40多肽(例如,重链或轻链可变区)的核酸或其补体的一部分或全部序列的同一性是至少80%,例如，至少90%、至少95%或至少98%。本文所述类型的杂交核酸可以用作,例如，克隆探针，引物,例如,PCR引物或诊断探针。作为实例且非限制，使用低严格条件的操作如下(也参见Shilo和Weinberg,1981，/Voc.Ato/.jcm/.78:6789-6792)。在一个实施方案中，将含有DNA的滤膜在40。C的溶液中预处理6小时，所述溶液含有35%甲酰胺、5XSSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、5mMEDTA、0.1%PVP、0.1。/。聚蔗糖(Fico11)、1%BSA和500叫/ml变性鲑精DNA。杂交在相同溶液中进行，并啦文了如下变动0.02%PVP、0.02%聚蔗糖、0.2%BSA、100吗/ml变性鲑精DNA、10%(重量/体积)硫酸葡聚糖，并使用5-20X10、pm"P-标记的探针。滤膜在杂交混合液中40。C孵育18-20小时，然后在55。C在含有2XSSC、25mMTris-HCl(pH7.4)、5mMEDTA和0.1%SDS的溶液中洗涤1.5小时。用新的溶液更换洗液，在6(TC再孵育1.5小时。滤膜被吸干后进行放射自显影。如必要，滤膜在65-68。C第三次洗涤，然后重新暴露于滤膜。在另一个实施方案中，低严格条件的实例包括，在含有35%甲酰胺、5XSSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、5mMEDTA、0.02%PVP、0.02%聚蔗糖、0.2%BSA、100pg/ml变性鲑精DNA和10%(重量/体积)硫酸葡聚糖的緩冲液中，在40°C杂交18-20小时，在由2XSSC、25mMTris画HCl(pH7.4)、5mMEDTA,和0.1%SDS组成的緩冲液中，在55。C洗涤1.5小时，和在由2XSSC、25mMTris-HCl(pH7.4)、5mMEDTA,和0.1%SDS组成的緩冲液中，在60。C洗涤1.5小时。可以使用的其它低严格条件是本领域众所周知的(例如，用于跨物种杂交)。作为实例且非限制，使用高严格条件的操作如下。将含有DNA的滤膜在65°C的緩冲液中预杂交8小时至过夜，所述緩冲液由6XSSC、50mMTris画HCl(pH7.5)、1mMEDTA、0.02%PVP、0.02%聚蔗糖、0.02%BSA、和500貼/ml变性鲑精DNA组成。在含有100貼/ml变性鲑精DNA和5-20X106cpm的3￥-标记的探针的预杂交混合物中，在65。C杂交滤膜48h。在含有2XSSC、0.01%PVP、0.01%聚蔗糖和0.01%BSA的溶液中，在37。C洗涤滤膜1h。然后在0.1XSSC中在50°C洗涤45mm，随后放射自显影。可以使用的其它高严格条件是本领域众所周知的。作为实例且非限制，使用中等严格条件的操作如下将含有DNA的滤膜在55°C的溶液中预杂交6小时，所述溶液含有6XSSC、5XDenhardt氏溶液、0.5%SDS和100pg/ml变性鲑4青DNA。用5-20x106cpm"P-标记的探针，在相同溶液中进行杂交。在55°C，在杂交混合物中温育滤膜18-20小时，然后在含有1XSSC和0.P/。SDS的溶液中，在60。C洗涤2次，各30分钟。滤膜被吸干后进行放射自显影。在含有2XSSC、0.1。/。SDS的溶液中，在37°C洗涤滤膜1小时。可以使用的其它中等严格条件是本领域众所周知的(参见，例如，Sambrook等，1989,M/ecw/"rC7om力g，爿A/朋認/,2dEd.,ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor,NewYork;Sambrook等，2001;MolecularCloning,ALaboratoryManual,3rded.,ColdSpringHarborPublish.,ColdSpringHarbor，N.Y.;也参见Ausubel等，编，inCwr固/1尸rafoco/sMo/ecw/arSz'o/ogyseriesoflaboratorytechniquemanuals,1987-1999,电流Protocols,1994-199JohnWiley和Sons,Inc.)。有些实施方案包括分离的多核苦酸，其包含编码具有重链可变区氨基酸序列的抗体或抗体片段的序列，所述重链可变区氨基酸序列与SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10或SEQIDNO:ll的氨基酸序列的同一性是至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%。有些实施方案包括分离的多核苦酸，其包含编码具有轻链可变域氨基酸序列的抗体或抗体片段的序列，所述轻链可变域氨基酸序列与SEQIDNO:14、SEQIDNO:15或SEQIDNO:16的氨基酸序列的同一性是至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%。在一个方面，分离的多核苷酸序列编码具有重《连可变域和轻链可变区的抗体或抗体片段，所述重链可变域和轻链可变区各自包含分别与下述氨基酸序列具有至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的氨基酸序列:SEQIDNO:3和SEQIDNO:14;SEQIDNO:4和SEQIDNO:14;SEQIDNO:5和SEQIDNO:14;SEQIDNO:6和SEQIDNO:14;SEQIDNO:7和SEQIDNO:14;SEQIDNO:8和SEQIDNO:14;SEQIDNO:9和SEQIDNO:14;SEQIDNO:6和SEQIDNO:15;SEQIDNO:6和SEQIDNO:16;SEQIDNO:7和SEQIDNO:16;SEQIDNO:10和SEQIDNO:14;SEQIDNO:ll和SEQIDNO:14;SEQIDNO:10和SEQIDNO:16;或SEQIDNO:11和SEQIDNO:16。在一个方面，分离的多核苷酸序列编码具有重链可变域和轻4连可变域的抗体或抗体片段，所述重链可变域和轻链可变域各自包含分別与下述氨基酸序列具有至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的氨基酸序列:SEQIDNO:7和SEQIDNO:14;SEQIDNO:6和SEQIDNO:16;SEQIDNO:7和SEQIDNO:16;SEQIDNO:10和SEQIDNO:14;SEQIDNO:ll和SEQIDNO:14;SEQIDNO:10和SEQIDNO:16;和SEQIDNO:11和SEQIDNO:16。在一个方面，分离的多核苦酸序列编码具有重链可变区和轻链可变区的抗体或抗体片段，所述重链可变区和轻链可变区各自包含分別与下述氨基酸序列具有至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的氨基酸序列SEQIDNO:7和SEQIDNO:14;SEQIDNO:6和SEQIDNO:16;SEQIDNO:10和SEQIDNO:16;和SEQIDNO:11和SEQIDNO:16。在另一个方面，分离的多核苷酸序列编码具有重链可变区和轻链可变区的抗体或抗体片段，所述重链可变区和轻链可变区各自包含分别与SEQIDNO:10和SEQIDNO:16的氨基酸序列具有至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的氨基酸序列。在2个或多个核酸或多肽序列的上下文中，本文所述的术语"同一"或"同一性百分比"指，2个或多个序列或子序列在对比和比较最大同一性时，它们是相同的，或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基。为了确定同一性百分比，为了最佳对比的目的，比对序列(例如，可以将空位导入第一个氨基酸或核酸序列的序列中，用于与第二个氨基酸或核酸序列最佳比对)。然后对比在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一个序列中的位置被与第二个序列中的对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在该位置是同一的。2个序列之间的同一性百分比，随序列共有的同一位置的数目而变化(即，％同一性=同一位置的数目/位置的总数(例如，重叠位置)x100)。在有些实施方案中，在根据需要向序列内导入空位后，对比的2个序列是相同的长度(例如。不对比超出序列的额外序列)。例如，当对比可变区序列时，不考虑先导物和/或恒定域序列。对比2个序列之间的序列对比，"对应的"CDR指在2个序列中的相同位置处的CDR(例如，每个序列的CDR-H1)。使用数学算法，可以确定2个序列之间的同一性百分比或相似性百分比。用于对比2个序列的数学算法的优选的、非限制性实例是Karlm和Altschul,1990,AW/.Jem/.87:2264-2268的算法，如Karlm和Altschul,1993,尸toc.Ww/.^cadOSL490:5873-5877所述进行改进。这样的算法整合在Altschul等，1990,./.M/.Bzo/.215:403-410的NBLAST和XBLAST程序中。可以用NBLAST程序进行BLAST核苷酸搜索，评分=100,字长=12,以得到与编码目标蛋白的核酸同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序进行BLAST蛋白搜索，评分==50,字长=3,以得到与目标蛋白同源的氨基酸序列。为了得到用于对比目的的空位比对，可以使用如Altschul等，1997,7Vwc/e,c25:3389-3402所述的空位BLAST。或者，PSI-Blast可以用于实现重复搜索，这会检测分子之间的远离关系(同上文)。当使用BLAST,空位BLAST:和PSI-Blast程序时，可以使用各程序(例如，XBLAST和NBLAST)的缺省参数。用于序列对比的数学算法的另一个优选的、非限制性实例是Myers和Miller,C4^/OS1(1989)的算法。这样的算法整合在ALIGN程序(2.0版)中，后者是GCG序列比对软件包的一部分。当使用ALIGN程序来对比氨基酸序列时，可以使用PAM120加权残基表，空位长度罚分为12,空位罚分为4。用于序列分析的其它算法是本领域已知的，包括如Torellis和Robotti,1994，Cow/z^.J///.10:3-5所述的ADVANCE和ADAM;和在Pearson和Lipman，1988,尸roc.JcadS",85:2444-8中所述的FASTA。在FASTA内，ktup是设定搜索的敏感性和速度的控制选项。如果ktup二2,通过寻找比对的残基对，可以发现对比的2个序列中的类似区域；如果ktup=l,则检查单个比对的氨基酸。ktup可以设定为2或1(对于蛋白序列)，或1-6(对于DNA序列)。如果没有指定ktup,缺省值是2(对于蛋白)和6(对于DNA)。或者，可以使用Higgins等，1996，A^AoA￡"z>wo/.266:383-402所述的CLUSTALW算法，进行蛋白序列比对。本文所述的抗体可以用作亲和纯化剂。在这种方法中，使用本领域众所周知的方法，将抗体固定在固相诸如Sephadex树脂或滤纸上。使固定化的抗体接触含有待纯化的CD40蛋白(其片段)的样品，并在此后用合适的溶剂洗涤支持物，所述溶剂将基本上去掉样品中除CD40蛋白(其结合在固定化的抗体上)以外的所有物质。最后，用另一种合适的溶剂洗涤支持物，诸如甘氨酸緩沖液pH5.0,其将使CD40蛋白从抗体中释放。人源化的抗-CD40抗体还可以用于诊断测定中，以检测和/或定量CD40蛋白，例如特定细胞、组织或血清中的CD40蛋白表达。就诊断应用而言，一般用可检测部分标记抗体。可利用的许多标记一般可以分成如下几类(a)放射性同位素，例如，35S,14C，1251,&,和1311。可以使用例如在Cwre//1尸rc^oco/sz力/wwwo/ogy,Volumes1禾口2,1991,Coligen等，Ed.Wiley-Interscience,NewYork,N.Y.，Pubs中描述的技术，用放射性同位素标记抗体。可以通过例如闪烁计数测定》文射性。(b)荧光标记，例如可以利用稀士元素螯合物(铕螯合物)或荧光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、丹酰、丽丝胺、藻红蛋白和德克萨斯红。通过例如上面Cw"e"/1尸ratoc。/s/mww"o/ogy中才皮露的已知4支术,可以使荧光标记与抗体偶联。可以使用荧光计对荧光进行定量。(c)可以利用各种酶-底物标记(参见，例如，美国专利号4,275,149提供了有关它们中的一些的综述)。所述酶一般催化可以使用各种技术测定的显色底物的化学改变。例如，酶可以催化可通过分光光度法测定的底物的颜色改变。或者，酶可以改变底物的荧光或化学发光。用于对荧光改变进行定量的技术如上所述。化学发光底物被化学反应电子地激发，然后可以发射可测定(例如使用化学发光计)的或给荧光受体提供能量的光。酶标记的实例包括萤光素酶诸如荧火虫安光素酶和细菌萤光素酶(美国专利号4,737,456)、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮类、苹果酸脱氢酶、尿素酶、过氧化物酶诸如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、a-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和6-磷酸葡萄糖脱氳酶)、杂环氧化酶(诸如尿酸酶和黄。票呤氧化酶)、乳酸过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于4吏酶与抗体偶联的技术，描述在例如，O'Sullivan等，1981,MethodsforthePreparationofEnzyme-AntibodyConjugatesforuseinEnzymeImmunoassay,inMef/zotfemi/72y亂(J.Langone&H.VanVunakis,编)，Academicpress,N.Y.,73:147-166。酶-底物组合的实例包括，例如(a)辣根过氧化物酶(HRPO)与作为底物的过氧化氲酶，其中所述过氧化氢酶会氧化染料前体，例如邻苯二胺(OPD)或3,3',5，5'-四曱基联苯胺盐酸盐(TMB);(b)碱性磷酸酶(AP)与作为显色底物的对硝基苯磷酸酯；和(c)cc-D-半乳糖苷酶(a-D-Gal)与显色底物(例如对硝基苯基-oc-D-半乳糖苷酶)或荧光底物4-曱基伞形基-a-D-半乳糖苷。本领域技术人员可以利用许多其它酶一底物组合。有关它们的一般性综述，参见美国专利号4,275,149和美国专利号4,318,980。4吏用许多已知的技术，可以将标记与抗体间接偶联。例如，可以将抗体与生物素偶联，并且可以将上述三大类标记中的任意种与抗生物素蛋白偶联，或反之亦然。生物素选择性地结合抗生物素蛋白，标记由此以这种间接方式与抗体偶联。或者，为了实现标记与抗体的间接偶联，将抗体与小半抗原(例如地高辛)偶联，并将上文所述不同类型的标记之一与抗半抗原抗体(例如抗地高辛抗体)偶耳关。由此，可以实现标记与抗体的间接偶联。在另一个实施方案中，人源化的抗-CD40抗体不经标记地^吏用，并使用结合人源化的抗-CD40抗体的经标记的抗体一企测它。本文所述的抗体可以用于任何已知的测定方法，诸如竟争性结合测定、直接和间接夹心测定、和免疫沉淀测定。参见，例如，Zola，A/owoc/o"a/jMw認/q/Tec/w甲es,pp.147-158(CRCPress,Inc.1987)。#资试身盆人源化的抗-CD40抗体可以用于诊断试剂盒中，即预定量的试剂与关于进行诊断测定的说明书的成套组合。如果用酶标记抗体，那么试剂盒可以包括酶所需的底物和辅因子，例如提供可检测发色团或荧光团的底物前体。此外，可以包括其它添加剂，诸如稳定剂、緩冲剂(例如封闭緩冲剂或裂解缓冲剂)等。各种试剂的相对量可以广泛改变，以便提供实质性优化测定灵敏度的试剂在溶液中的浓度。可以将这些试剂作为干粉提供，通常为冻干的，它们包括在溶解后会提供具有合适浓度的试剂溶液的赋形剂。在另一个实施方案中，本文公开的人源化的抗-CD40抗体可以用于治疗与本文所述的CD40表达有关的多种病症。人源化的抗-CD40抗体或试剂通过任意合适的方式给药，包括根据需要用于局部免疫抑制性治疗的肠胃外的、皮下的、腹膜内的、肺内的、和鼻内的给药，病灶内给药(包括在移植前灌注或使移植物接触抗体)。人源化的抗-CD40抗体或试剂可以作为例如输注或推注来给药。肠胃外输注包括肌肉内的、静脉内的、动脉内的、腹膜内的或皮下的给药。另外，人源化的抗-CD40抗体适合通过脉沖输注给药，尤其使用递减剂量的抗体。在一个方面，给药是通过注射进行，最优选静脉内的或皮下的注射，这部分地取决于给药是短暂的还是长期的。为了预防或治疗疾病，合适的抗体剂量取决于多种因素，例如如上所述的待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和过程、施用抗体是为了预防还是为了治疗的目的、先前的疗法、患者的临床病史和对抗体的反应、以及主治医师的判断。合适地对患者一次性或在一系列治疗中施用抗体。根据疾病的类型和严重程度，约1jug/kgto20mg/kg(例如，0.1-15mg/kg)的抗体是对患者施药的起始候选剂量，无论例如一次或多次分开的施药，还是连续输注。典型的日剂量可以在约ljug/kg—100mg/kg或更高的范围内，这取决于上述因素。根据状况，为了在几天或更长时间内反复施药，治疗可以持续至发生所希望的疾病症状抑制。但是，其它给药方案可能是有用的。通过常规技术和测定，可以容易地监视该治疗的进展。一种示例性的给药方案7>开在WO94/04188中。可以以符合良好医疗实践的方式，配制、定量和施用抗体组合物。在该背景下，考虑的因素包括包括待治疗的具体病症、待治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的原因、输送试剂的位点、给药方法、给药计划、和医学从业人员已知的其它因素。要施用的抗体的"治疗有效量"由这些考虑因素的决定，且是预防、改善或治疗与CD40表达有关的病症所需的最小量。抗体不需要、<旦是<壬选地与目前用于预防或治疗目标病症的一种和多种试剂一起配制。这样的其它试剂的有效量取决于制剂中存在的人源化的抗-CD40抗体的量、病症和治疗的类型、和上面讨论的其它因素。它们通常以与前文相同的剂量和给药途径使用，或是此前使用剂量的约1陽99%。抗-CD40抗体或试剂可以用于治疗或预防表达CD40的癌症或特征在于CD40表达的免疫障碍，例如,特征在于免疫细胞(例如，淋巴细胞或树突细胞)的不适当激活。这样的CD40表达可以是由于，例如，细胞表面上的高CD40蛋白水平和/或表达的CD40的改变的抗原性。根据本文所述方法对免疫障碍的治疗或预防，可以通过给需要这样的治疗和预防的对象施用有效量的抗-CD40抗体或试剂来实现，其中所述抗体(i)会结合表达CD40且与疾病状态有关的激活的免疫细胞，和(ii)对激活的免疫细胞产生细胞毒性的、细胞抑制性的或免疫抑制性的作用。特征在于免疫细胞的不适当激活且可以通过本文所述方法治疗或预防的免疫疾病，可以根据例如作为病症基础的超敏反应的类型进行分类。这些反应通常分成4类过敏性反应，细胞毒性的(细胞溶解的)反应，免疫复合物反应，或细胞-介导的免疫(CMI)反应(也称作迟发型超敏(DTH)反应)。(参见,"f列^r，Fww(iame77fa///wmwwo/ogy(WilliamE.Pauled.,RavenPress,N.Y.,3rded.1993))这样的免疫疾病的具体实例包括下述的类风湿性关节炎，自身免疫脱髓鞘疾病(例如，多发性硬化，变应性脑脊髓炎)，内分泌眼病，葡萄膜视网膜炎，系统性红斑狼疮，重症肌无力，格雷夫斯病，肾小球肾炎,自身免疫性肝病，炎性肠病(例如，克罗恩病或溃疡性结肠炎)，过敏反应，变应性反应，舍才各伦综合征，I型糖尿病，原发性胆汁性肝硬变，韦格纳氏肉芽肺病，纤维肌痛，多肌炎，皮肌炎，炎性肌炎，多内分泌故障:施密特综合征，自身免疫葡萄膜炎，艾迪生病，肾上腺炎，曱状腺炎，桥本甲状腺炎，自身免疫甲状腺疾病，恶性贫血，胃萎缩，慢性肝炎，类狼疮肝炎，动脉粥样硬化，亚急性皮肤红斑狼疮，曱状旁腺功能减退，心肌梗死后综合征，自身免疫血小板减少症，原发性血小板减少性紫癜，溶血性贫血，寻常型天疱瘙，天疱疮，疱渗样皮炎，斑先(alopeciaareata),类天疱痴，硬皮病，渐进性全身硬化，CREST综合征(钓质沉着症，雷诺现象，食道运动功能障碍，指端硬化,和毛细管扩张)，男性和女性自身免疫性不孕，强直性脊推炎，溃疡性结肠炎，混合结締组织病,结节性多动脉炎，系统性坏死性血管炎，特应性皮炎，特应性鼻炎,Goodpasture氏综合征，查加斯病，结节病，风湿热，哮喘，习惯性流产,抗磷脂综合征，农民肺，多形红斑，心切开术后综合征，柯兴综合征，自身免疫慢性活动性肝炎，养乌人肺，中毒性表皮坏死松解症，Alport氏综合征，肺泡炎，变应性肺泡炎，纤维化肺泡炎，间质性肺病，结节性红斑坏疽性脓皮症，输血反应，大动脉炎，风湿性多肌痛，颞动脉炎，血吸虫病，巨细胞动脉炎，蛔虫病，曲霉病，Sampter氏综合征，湿渗，淋巴瘤样肉芽肿病，眼-口-生殖器三联综合征，Caplan氏综合征，川崎病，登革脑脊髓炎，心内膜炎，心肌心内膜纤维化，眼内炎，持久隆起性红斑(erythemaelevatumetdiutmum),4艮屑病，月台儿溶血症，嗜酸细i包性筋膜炎，Shulman氏综合征，Felty氏综合征，丝虫病，睫状体炎，慢性睫状体炎，异时性睫状体炎，Fuch氏睫状体炎、IgA肾病，亨-舍二氏紫癜，移植物抗宿主病，移植排斥，心肌病，Eaton-Lambert综合征，复发性多软骨炎，冷球蛋白血症，华氏巨球蛋白血症，Evan氏综合征，急性呼吸窘迫综合征，肺炎，骨质疏松症，迟发型超敏反应和自身免疫性腺生成障碍。因此，本文所述方法包括下述病症的治疗B'淋巴细l包(例如，系统性红斑狼痴，Goodpasture氏综合征，类风湿性关节炎,和I型糖尿病)，Th广淋巴细胞(例如，类风湿性关节炎，多发性硬化，银屑病，Sjorgren氏综合征，桥本曱状腺炎，格雷夫斯病，原发性胆汁性肝硬变，韦格纳氏肉芽肿病，结核病，或移植物抗宿主病)，或Th2-淋巴细胞(例如，特应性皮炎，系统性红斑狼疮，特应性哮喘，鼻结膜炎，变应性鼻炎,Omenn氏综合征，全身硬化或慢性移植物抗宿主病)。通常涉及树突细胞的病症包含Th!-淋巴细胞或Th2-淋巴细胞的病症。在有些实施方案中，免疫障碍是T细胞-介导的免疫障碍，例如其中激活的T细胞与表达CD40的障碍有关的T细胞障碍。可以施用抗-CD40抗体或试剂，以排除这样的表达CD40的激活的T细胞。在一个具体的实施方案中，抗-CD40抗体或试剂的施用，可以排除表达CD40的激活的T细胞，同时抗-CD40或试剂基本上不排除休眠T细胞。在该上下文中，"基本上不排除"是指，小于约60%或小于约70%或小于约80%的休眠T细胞未排除。本文所述的抗-CD40抗体和试剂也可以用于治疗或预防表达CD40的癌症。根据本文所述方法对表达CD40的癌症的治疗或预防，可以通过给需要这样的治疗或预防的对象施用有效量的抗-CD40抗体或试剂来实现，其中所述抗体或试剂(i)会结合表达CD40的癌细胞，和(ii)对表达CD40的癌细胞产生排除或抑制其增殖的细胞毒性的或细胞抑制性的作用。白血病，例如急性白血病，急性淋巴细胞白血病，急性髓细胞性白血病(例如，成髓细胞性白血病，前髓细胞性白血病，髓单核细胞性白血病，单核细胞性白血病,或红白血病)，慢性白血病，慢性髓细胞性(粒细胞)白血病，或慢性淋巴细胞白血病；真性红细胞增多症；淋巴瘤(例如，霍奇金病或非霍奇金病)；多发性骨髓瘤，特发性巨球蛋白血症;重链病；实体瘤如肉瘤和癌(例如，纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，專欠骨肉瘤，骨源性肉瘤，骨肉瘤，脊索瘤，血管肉瘤，内皮肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管内皮肉瘤，滑膜瘤，间皮瘤，尤因瘤，平滑肌肉瘤，横紋肌肉瘤，结肠癌，结肠直肠癌，胰腺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，嚢腺癌，髓样癌，支气管癌，肾细胞癌，肝癌，胆管癌，绒毛膜癌，精原细胞瘤，胚胎性癌，维尔姆斯氏肿瘤，子宫颈癌，子宫癌，睾丸肿瘤，肺癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，膀胱癌，上皮癌，胶质瘤，星形细胞瘤，髓母细胞瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体瘤，成血管细胞瘤，听神经瘤，少突神经胶质瘤，menangioma,黑素瘤，神经母细月包瘤，视网膜母细胞瘤，鼻咽癌，或食管癌)。秀參邀合參及岸滋^包含CD40结合剂(例如，抗-CD40抗体)的组合物，可以施用给具有免疫障碍或表达CD40的癌症或处于该危险中的受试者。本发明还提供了CD40结合剂(例如，抗-CD40抗体)在药剂生产中的应用，所述药剂用于预防或治疗表达CD40的癌症或免疫障碍。本文使用的术语"受试者"是指可以施用CD40-结合剂的任意哺乳动物患者，包括，例如，人和非人哺乳动物，例如灵长类动物，啮齿类动物,和狗。特别适合用本文所述方法治疗的受试者包括人。在免疫障碍或表达CD40的癌症的预防或治多种递送系统是已知的，且可以用于施用CD40结合剂。导入方法包括、但不限于真皮内的、肌肉内的、腹膜内的、静脉内的、皮下的、鼻内的、硬膜外的和经口的途径。CD40结合剂可以通过例如输注、推注或注射施用，且可以与其它生物活性剂例如化疗剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。在具体实施方案中，CD40结合剂组合物通过注射、借助于导管、栓剂或植入物来施用，所述植入物是多孔的、无孔的或胶状的材料，包括膜,例如唾液酸膜或纤维。通常，当施用组合物时，4吏用抗-CD40抗体或试剂不会粘附的材料。在其它实施方案中，在控释系统中递送抗-CD40抗体或试剂。在一个实施方案中，可以使用泵(参见，例如，Langer,1990,Scze"ce249:1527-1533;Sefton,1989,CACCr".7e/5wwed14:201;Buchwald等，1980,Swrgery88:507;Saudek等，1989,W丄A/W.321:574)。在另一个实施方案中，可以使用聚合材料。(参见，例如，Me&ca/^4//"ca"'orao/Co欣o〃edi^e/ewe(Langer禾口Wise编，CRCPress,BocaRaton,Florida,1974);Ccw,ra〃e<iZ)rwg5z6>m^//"Z^7z'(y'Z>wg尸/Ww"Z)ew'gw尸er/ormawce(SmolenandBalleds.,Wiley,NewYork,1984);RangerandPeppas,1983,Mkt謂o/.Wev.MacTwwc*/.CTz謹.23:61。也参见Levy等，1985,228:190;During等，1989,^肌25:351;Howard等，1989,#，歸化.71:105.)。在例如上面的Langer中，讨论了其它控释系统。CD40结合剂(例如，抗-CD40抗体)可以作为包含治疗有效量的结合剂和一种或多种药学相容成分的药物组合物施用。例如，药物组合物通常包括一种或多种药物载体(例如，无菌液体,例如水和油，包括石油、动物、4直物或合成来源的油，例如花生油，大豆油，矿物油，芝麻油等)。当静脉内施用药物组合物时，水是更典型的载体。盐水溶液和含水右旋糖和甘油溶液也可以用作液体载体，尤其对于注射溶液。合适的药物赋形剂包括,例如，淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，明胶，麦芽，大米，面粉，白垩，硅胶，硬脂酸钠，单硬脂酸甘油酯，滑石，氯化钠，脱脂奶粉，甘油，丙烯，乙二醇，水，乙醇等。其它合适的药物赋形剂包括氨基酸(例如，精氨酸，组氨酸，甘氨酸)，表面活性剂(例如，聚山梨酯)和糖和糖醇(例如，蔗糖或山梨醇和其它多元醇(例如，海藻糖))。如果需要，组合物也可以含有小量润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物的形式可以是溶液,悬浮液，乳剂，片剂，丸剂，胶嚢，散剂，持续释放制剂等。组合物可以用常规粘合剂和载体例如甘油三酯配制成栓剂。经口制剂可以包括标准的载体，例如药用级的甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素,碳酸镁，等。合适的药物载体的实例，由E.W.Martm描述在"Remmgton，sPharmaceuticalSciences"。这样的组合物含有治疗有效量的核酸或蛋白，通常是纯化形式，以及适当量的载体，以便提供适合给患者施用的形式。制剂与给药模式相对应。在典型的实施方案中，根据常规操作，将药物组合物配制成适合静脉内施用给人类的药物组合物。通常，静脉内给药的组合物是在无菌等渗含水緩冲液中的溶液。当需要时，药物也可以包含增溶剂和局部麻醉剂(例如利多卡因)，以緩解注射位点的疼痛。通常，所述成分在单位剂型中分开地或混合在一起地提供，例如，作为在标明活性剂的量的熔封容器(例如安瓿或香嚢)内的干燥冻干粉末或无水浓缩物。当通过输注施用药物时，可以用含有无菌药用级水或盐水的输注瓶来分散。当通过注射施用药物时，可以提供一安瓿无菌注射用水或盐水，以便在给药前混合成分。此外，药物组合物可以作为药物试剂盒来提供，所述药物试剂盒包含(a)—个容器，其含有冻干形式的CD40结合剂(例如，抗-CD40抗体)，和(b)第二个容器，其含有药学可接受的注射用稀释剂(例如，无菌水)。药学可接受的稀释剂可以用于重配或稀释冻干的抗-CD40抗体或试剂。任选地，这样的容器可以伴有管理药物或生物制品的生产、使用或销售的政府机构规定形式的通告，该通告反映了人类施用的生产、使用或销售的机构的批准。通过标准的临床技术，可以确定能有效地治疗或预防免疫障碍或表达CD40的癌症的CD40结合剂(例如，抗-CD40抗体)的量。另外，体外测定可以任选地用于辅助鉴别最佳剂量范围。要在制剂中使用的精确剂量，也取决于给药途径、和免疫障碍或表达CD40的癌症的阶段，应当根据从业人员的判断和每位患者的情况来决定。可以从源自体外或动物模型实验系统的剂量-响应曲线，外推有效剂量。例如，通过测定LD5G(使50%群体致死的剂量)和ED5q(对50%群体治疗上有效的剂量)的标准药学规程，可以在细胞培养物或实验动物中测定抗-CD40抗体或试剂的毒性和治疗效能。毒性和治疗作用之间的剂量比是治疗指数，它可以表达为比率LD5o/ED5。。优选会表现出大治疗指数的CD40-结合剂(例如，抗-CD斗0抗体)。当CD40-结合剂表现出毒性副作用时，将CD40-结合剂导向受影响组织的位点的递送系统，可以用于使对不表达CD40的细胞的潜在损伤最小化，从而减小副作用。从细胞培养测定和动物研究得到的数据，可以用于配制一定范围的人用剂量。CD40结合剂的剂量通常在循环浓度(包括具有微小毒性或无毒性的ED5Q)的范围内。根据使用的剂型和使用的给药途径，剂量可以在该范围内变化。对于在该方法中使用的任意CD40结合剂，可以从细胞培养测定中初步估计治疗有效剂量。可以在动物才莫型中配制剂量，以达到包含在细胞培养中测定的IC5o(即，达到症状的半数最大抑制的实验化合物浓度)的循环血浆浓度范围。这样的信息可以用于更精确地测定在人类中有用的剂量。可以测量在血浆中的水平，例如，通过高效液相色谱。通常，施用给具有免疫障碍或表达CD40的癌症的患者的抗-CD40抗体或CD40结合剂的剂量，典型地是约O.lmg/kg至约100mg/kg受试者体重。施用给受试者的剂量是约0.1mg/kg至约50mg/kg,约1mg/kg至约30mg/kg,约1mg/kg至约20mg/kg,约1mg/kg至约15mg/kg或约1mg/kg至约10mg/kg受试者体重。示例性的剂量包括、但不限于，1ng/kg至100mg/kg。在有些实施方案中，剂量是约0.5mg/kg,约1mg/kg,约2mg/kg,约3mg/kg,约4mg/kg,约5mg/kg，约6mg/kg,约7mg/kg,约8mg/kg,约9mg/kg，约10mg/kg,约11mg/kg,约12mg/kg，约13mg/kg,约14mg/kg,约15mg/kg或约16mg/kg。所述剂量可以例如每天、每周1次(每周)、每周2次、每周3次、每周4次、每周5次、每周6次、每2周或每月施用。在具体实施方案中，剂量是约0.5mg/kg/周，约1mg/kg/周，约2mg/kg/周，约3mg/kg/周，约4mg/kg/周，约5mg/kg/周，约6mg/kg/周，约7mg/kg/周，约8mg/kg/周，约9mg/kg/周，约10mg/kg/周，约11mg/kg/周，约12mg/kg/周，约13mg/kg/周，约14mg/kg/周，约15mg/kg/周或约16mg/kg/周。在有些实施方案中，剂量范围是约1mg/kg/周至约15mg/kg/周。在有些实施方案中，包含CD40结合剂的药物组合物可以另外包含治疗剂，其缀合或未缀合到结合剂上。抗-CD40抗体或CD40结合剂可以与一种或多种治疗剂相联合地共同施用，用于治疗或预防免疫障碍或表达CD40的癌症。例如，联合治疗可以包括细胞抑制性的、细胞毒性的或免疫抑制性的试剂。联合治疗也可以包括,例如，施用靶向激活的淋巴细胞、树突细胞或表达CD40的癌细胞表面上的CD40以外的受体或受体复合物的试剂。这样的试剂的实例包括第二种非-CD40抗体，后者会结合激活的淋巴细胞、树突细胞或表达CD40的癌细胞表面上的分子。另一个实例包括輩巴向这样的受体或受体复合物的配体。通常，这样的抗体或配体会结合激活的淋巴细胞、树突细胞或表达CD40的癌细胞上的细胞表面受体，病通过向激活的淋巴细胞、树突细胞或表达CD40的癌细胞递送细胞抑制性的或细胞毒性的信号，增强抗-CD40抗体的细胞毒性的或细胞抑制性的作用。这样的组合施用可以对疾病参数(例如，症状的严重性，症状的数目，或复发的频率)具有累加或协同作用。关于组合施用的治疗方案，在一个具体的实施方案中，抗-CD40抗体或CD40结合剂与治疗剂同时施用。在另一个具体的实施方案中，在施用抗-CD40抗体或CD40结合剂之前或之后至少1小时且最高达几个月，例如在施用抗-CD40抗体或CD40结合剂之前或之后至少1小时、5小时、12小时、1天、l周、l个月或3个月，施用治疗剂。细胞毒性的或免疫抑制性的试剂的有用类型包括，例如，抗微管蛋白剂，aunstatins(例如，MMAE或MMAF),DNA小沟结合剂，DNA复制抑制剂，烷化剂(例如，铂复合物例如顺铂，单(钿)，双(鉑)和三核铂复合物和卡賴)，蒽环类抗生素，抗生素，抗叶酸剂，抗代谢物，化疗敏化剂，duocarmycms,依托泊苷，氟化嘧咬，离子载体，lexitropsms,亚硝基脲，顺氯氨铂，预先形成的化合物，噤呤抗代谢物，。票呤霉素，辐射敏化剂，甾族化合物.，紫杉烷类，拓朴异构酶抑制剂，长春花生物碱，等。单独的细胞毒性的或免疫抑制性的试剂包括，例如，雄激素，氨茴霉素(AMC),门冬酰胺酶，5-氮胞苷，硫唑噤呤，博来霉素，白消安，buthionmes函ximme,喜树碱，卡铂,卡莫司汀(BSNU),CC-1065,苯丁酸氮芥，顺柏，秋水仙素，环磷酰胺，阿糖胞苷，胞啶阿糖胞苷，细胞松弛素B,达卡巴嗪，更生霉素(以前的放线菌素)，柔红霉素，氨烯咪胺,多西他赛，多柔比星，雌激素，5-氟脱氧尿苷，5-氟尿嘧啶，短杆菌肽D,羟基脲，伊达比星，异环磷酰胺，伊立替康，洛莫司汀(CCNU),氮芥，美法仑，6-巯嘌呤，曱氨蝶呤，光辉霉素，丝裂霉素C,米托蒽醌，硝基咪唑紫杉醇，普卡霉素，丙卡巴肼，链唑霉素，替尼泊苷，6-硫鸟嘌呤，塞替派，托泊替康，长春碱，长春新碱，长春瑞滨，VP-16和VM-26。在有些典型的实施方案中，治疗剂是细胞毒性剂。合适的细胞毒性剂包括，例如，多拉司他汀(例如，aunstatmE,AFP,MMAF,MMAE,AEB或AEVB),DNA小沟结合剂(例如，enediynes和lexitropsins),duocarmycms,紫杉烷类(例如，紫杉醇和多西他赛)，噤呤霉素，长春花生物碱，CC-1065,SN-38,托泊替康，吗啉代-多柔比星，根霉素，氰基吗啉代-多柔比星，棘霉素，考布他汀，纺锤菌素，epothiloneA和B,雌莫司；丁，cryptophysins,西马多丁，maytansinoids,discodermolide:eleutherobin,或米托蒽醌。在有些实施方案中，细胞毒性剂是常规化疗剂，例如，多柔比星，紫杉醇，美法仑，长春花生物碱，曱氨蝶呤，丝裂霉素C或依托泊苷。另外，有效的试剂例如CC-1065类似物，刺孢霉素，美登素，多拉司他汀10的类似物，根霉素,和海葵毒素，可以连接到抗-CD40抗体或其试剂上。在具体实施方案中，细胞毒性的或细胞抑制性的试剂是auristatmE(在本领域也称作多拉司他汀-10)或其衍生物。通常，auristatinE衍生物是，例如，在aunstatinE和酮酸之间形成的酯。例如，aunstatmE可以分别与对乙酰基苯甲酸或苯甲酰基戊酸反应，生成AEB和AEVB。其它典型的aunstatm书t生物包括AFP,MMAF,和MMAE。auristatinE和它的衍生物的合成和结构，描述在，例如，美国专利申请公开号2004-0157782Al和2005-0238649;国际专利申请号PCT/US03/24209,国际专利申请号PCT/US02/13435,和美国专利号6,884,869;6,323,315;6,239,104;6,034,065;5,780,588;5,665,860;5，663,149;5,635,483;5,599,902;5,554,725;5,530,097;5,521,284;5,504,191;5,410,024;5，138,036;5,076,973;4,986,988;4,978,744;4,879,278;4,816,444;和4,486,414;其公开内容在这里引作参考。在具体实施方案中，细胞毒性剂是DNA小沟结合剂(参见，例如，美国专利号6，130,237.)。例如，在有些实施方案中，所述小沟结合剂是CBI化合物。在其它实施方案中，所述小沟结合剂是enediyne(例如，刺孢霉素)。抗微管蛋白剂的实例包括、但不限于，紫杉烷类(例如，Taxol(紫杉醇)，Taxotere(多西他赛))，T67(Tularik),vmcaalkyloids(例如，长春新石成，长春碱，长春地辛,和长春瑞滨),和多拉司他汀(例如，auristatmE,AFP,MMAF,MMAE,AEB,AEVB)。其它抗微管蛋白剂包括,例如，浆果赤霉素衍生物，紫杉烷类似物(例如，epothiloneA和B),诺考达唑，秋水仙素和colcimid,雌莫司汀，cryptophysins,西马多丁，maytansinoids,考布他汀，discodermolide,和eleutherobin。在有些实施方案中，细胞毒性剂是maytansmoid,即另一组抗微管蛋白剂。例如，在具体实施方案中，maytansmoid是美登素或DM-1(ImmunoGen,Inc.;也参见Chan等，1992,Omcer52:127-131)。在有些实施方案中，治疗剂不是放射性同位素。在有些实施方案中，细胞毒性的或免疫抑制性的试剂是抗代谢物。抗代谢物可以是,例如，噤呤拮抗剂(例如，^i唑嘌呤或麦考酚酸莫酯)，二氬叶酸还原酶抑制剂(例如，甲氨蝶呤)，阿昔洛韦，更昔洛韦，齐多夫定，阿糖腺苷，利巴韦林，叠氮基胸苷，胞啶阿糖胞苷，金刚烷胺，二去氧尿苷，橫苦，poscarnet,或三氟尿苦。在其它实施方案中，细胞毒性的或免疫抑制性的试剂是他克莫司，环孢霉素A或雷帕霉素。在其它实施方案中，细胞毒性剂是阿地白介素，阿仑单抗，阿利维A酸，别嘌醇，六甲蜜胺，氨磷汀，阿那曲唑，三氧化二砷，贝沙罗汀，贝沙罗汀，卡普睾酮，卡培他滨，塞来考昔，克拉屈滨，Darbepoetmalfa,地尼白介素-毒素连接物，右雷佐生，屈他雄酮丙酸盐，表柔比星，阿法依伯汀，雌莫司汀，依西美坦，非格司亭，氮尿苷,氟达拉滨，氟维司群，吉西他滨，吉姆单抗，奥佐米星，戈舍瑞林，伊达比星，异环磷酰胺，曱磺酸伊马替尼，干扰素a-2a,伊立替康，来曲唑,亚叶酸，左旋咪唑，meclorethamme或氮芥，甲地孕酮，美司钠，甲氨蝶呤，曱氧沙林，丝裂霉素C,米托坦，苯丙酸诺龙，奥普瑞白介素，奥沙利铂，氨羟二磷酸二钠，培加酶，培门冬酶，pegfilgrastim,喷司他丁，哌泊溴烷，普卡霉素，卟吩姆钠，丙卡巴肼，米帕林，拉布立酶，revlimid,沙格司亭，链佐星，他莫昔芬，替莫唑胺，替尼泊苷，睾内酪，硫鸟嘌呤,托瑞米芬，托西莫单抗，曲妥单抗，维A酸，尿嘧啶氮芥，戊柔比星，长春碱，长春新碱，长春瑞滨和唑来磷酸。在其它实施方案中，药物是人源化的抗-HER2单克隆抗体；RITUXAN(利妥昔单抗；Genentech,Inc.,SouthSanFrancisco,CA);嵌合的抗-CD20单克隆抗体)；OVAREX(AltaRexCorporation,MA);PANOREX(GlaxoWellcome,NC;鼠IgG2a抗体)；CetuximabErbitux(ImcloneSystemsInc.,NY;抗-EGFRIgG嵌合的抗体)；Vitaxm(Medlmmune,Inc.,MD);CampathI/H(Leukosite,MA;人源4匕的IgGl抗体)；SmartMI95(ProtemDesignLabs,Inc.,CA;人源化的抗-CD33IgG抗体)；LymphoCide(Immunomedics,Inc.,NJ;人源4匕的抗-CD22IgG抗体)；SmartID10(ProteinDesignLabs,Inc.,CA;人源化的抗画HLA-DR抗体)；Oncolym(Techniclone,Inc.,CA;放射标记的鼠抗-HLA-DrlO抗体)；Allomune(BioTransplant,CA;人源的#元画CD2mAb);Avastin(Genentech，Inc.,CA;抗-VEGF人源化的抗体)；依帕珠单抗(Immunomedics,Inc.，NJ和Amgen,CA;抗-CD22抗体)；禾口CEAcide(Immunomedics,NJ;人源4b的4元-CEA抗体)。其它合适的抗体包括、但不限于，针对下述抗原的抗体CA125,CA15-3,CA19-9,L6,LewisY,LewisX,a胎儿球蛋白，CA242,胎盘碱性磷酸酶，前列腺特异性抗原，前列腺酸性磷酸酶，表皮生长因子，MAGE-1,MAGE-2,MAGE-3,MAGE-4,抗转4失蛋白受体，p97,MUCl-KLH,CEA,gp100，MARTI,前列腺特异性抗原，IL-2受体，CD20,CD52,CD33,CD22,人绒毛膜促性腺激素，CD38,粘蛋白，P21，MPG,和Neu癌基因产物。在有些实施方案中，治疗剂是免疫抑制性的试剂。免疫抑制性的试剂可以是，例如，更昔洛韦，依那西普，他克莫司，环孢霉素A,雷帕霉素，环磷酰胺，硫唑噪呤，麦考酚酸莫酯或甲氨蝶呤。或者，免疫抑制性的试剂可以是，例如，糖皮质激素(例如，考的松或醛固酮)或糖皮质激素类似物(例如，泼尼松或地塞米松)。合适的环氧合酶抑制剂包括曱氯芬那酸，曱芬那酸，卡洛芬，双氯芬酸，二氟尼柳，芬布芬，非诺洛芬，布洛芬，吲哚美辛，酮洛芬，萘丁美酮，萘普生，舒林酸，替诺昔康，托美丁,和乙酰基水杨酸。合适的脂肪氧合酶抑制剂包括氧化还原抑制剂(例如，儿茶酚丁烷衍生物，去曱二氢愈创木酸(NDGA),马索罗酚，菲尼酮，Ianopalen,吲唑酮，naphazatrom，benzofuranol,烷基轻胺),和非氧化还原抑制剂(例如，羟基噻唑，甲氧基烷基噻唑，苯并吡喃和其衍生物，甲氧基四氲吡喃，乳香酸和乳香酸的乙酰基化衍生物，和被环烷基基团取代的喹啉曱氧基苯基醋酸)，和氧化还原抑制剂的前体。其它合适的脂肪氧合酶抑制剂包括抗氧化剂(例如，苯酚，没食子酸丙酯，黄酮类化合物和/或天然存在的含有黄酮类化合物的底物，黄酮的羟基化衍生物，黄酮醇，二氬槲皮素,四鞋黄酮，高良姜黄素，奥洛波尔查耳酮衍生物，4,2，，4，-三羟基查耳酮，邻氨基苯盼，N-羟基脲，benzofuranols,依布硒和增加还原性硒代酶的活性的物质)，铁螯合剂(例如，异羟肟酸和其衍生物，N-鞋基脲，2-千基-l-萘酚，儿茶酚，羟胺，鼠尾草酚troloxC,儿茶酚，萘酚，柳氮磺p比。定，zyleuton,5-羟基邻氨基苯曱酸和4-(co-芳基烷基)苯基链烷酸)，含有咪唑的化合物(例如，酮康唑和伊曲康哇)，吩噻漆,和苯并吡喃衍生物。其它合适的脂肪氧合酶抑制剂包括类花生酸(例如，十八碳四烯酸,二十石友四烯酸，二十二石友五烯酸，二十石友六烯酸和二十二碳六烯酸和其酉旨)的抑制剂，PGE1(前列地尔)，PGA2(前列腺素A2),维前列醇，15-单羟基二十碳四烯酸，15-单羟基-二十碳三烯酸和15-单羟基二十碳五烯酸，和白细胞三烯B5，C5和D5),干扰鈣流的化合物，吩噻。秦，二苯基丁基胺，维拉帕米，fuscoside,姜黄，氯原酸，咖啡酸，5,8,11,14-二十碳四烯酸(ETYA),羟基苯基维酰胺，Ionapalen,七叶灵，二乙基乙胺嗪，菲咯啉,黄茶香元，普昔罗米，硫醚，二烯丙基硫化物和二-(l-丙烯基)硫化物。白细胞三烯受体拮抗剂包括骨化三醇，昂唑司特，BayerBay-x-1005,Ciba-GeigyCGS画25019C,依布硒，LeoDenmarkETH-615,LillyLY-293111,OnoONO-4057,TerumoTMK-688,BoehringerIngleheimBI-RM-270,LillyLY213024,LillyLY264086,LillyLY292728,OnoONOLB457,Pfizer105696,PerdueFrederickPF10042,Rhone-PoulencRorerRP66153,SmithKlmeBeechamSB-201146,SmithKlineBeechamSB-201993,SmithKlmeBeechamSB-209247,SearleSC-53228,SumitamoSM15178,AmericanHomeProductsWAY121006,BayerBay-o-8276,Warner-LambertCI-987,Warner-LambertCI-987BPC-15LY223982,LillyLY233569,LillyLY-255283,MacroNexMNX-160,Merck和Co.MK-591,Merck和Co.MK-886,OnoONO-LB-448,PurdueFrederickPF-5901,Rhone-PoulencRorerRG14893,Rhone-PoulencRorerRP66364,Rhone-PoulencRorerRP69698,Shio画giS-2474,SearleSC-41930,SearleSC-50505,SearleSC-51146,SearleSC-52798,SmithKlmeBeechamSKandF-104493,LeoDenmarkSR-2566,TanabeT-757和TeijmTEI-1338。翔品在另一个方面，包括含有用于治疗上述病症的材料的制品。所述制品包含容器和标记。合适的容器包括，例如，瓶子，管形瓶，注射器,和试管。容器可以由许多种材料(例如玻璃或塑料)制成。容器装有能有效治疗病症的组合物，且可以具有无菌存取口。例如，所述容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针穿透塞子的管形瓶。组合物中的活性剂是人源化的抗-CD40抗体。在容器上或容器伴随的标记表明，组合物可以用于治疗选择的病症。制品还可以包含第二个容器，后者含有药学可接受的缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水，林格溶液,和右旋糖溶液。还可以包含从商业和用户观点看需要的其它材料，包括其它緩沖剂，稀释剂，滤膜，针，注射器,和具有使用说明的包装说明书。爿rcc^虑根据国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏布达佩斯条约的期限，在1999年5月25日进行单克隆抗体S2C6的ATCC保藏。ATCC位于10801UniversityBoulevard,Manassas,Virgma20110-2209,USA。该ATCC保藏物得到登记号PTA-llO。ATCC位于10801UniversityBoulevard,Manassas,Virgina20110-2209,USA。保藏是为了给本领域技术人员提供方便，而不是承认在35U.S.C.112部分规定下需要保藏物。本文所述的范围不限于保藏的抗体的范围，因为保藏的实施方案意在作为本发明某些方面的单纯解释，功能上等同的任意抗体是在本发明范围内。本文材料的保藏不构成对下述内容的承认本文包含的书面描述不足以实现本发明的任意方面、包括其最佳方式，也不应解释为将权利要求的范围限制为它代表的具体解释。实际上，除了本文所示和描述的那且落入所附权利要:书的范围内。,、；、在下面的实施例中，进一步解释了本发明，这些实施例无意限制本发明的范围。根据美国典型培养物中心(ATCC)或德意志微生物保藏中心(DMSZ)指定的条件，维持培养在下面实施例中描述的细胞系。从I脂trogenCorp.(Carlsbad,CA)得到细胞培养试剂。实施例#滋斧//.'乂源必#戎-0^6我^U々iy^通过将鼠抗-CD40供体抗体的CDR输入受体人抗体，构建人源化的抗-CD40抗体。供体抗体是美国专利号6,838,261中所述的鼠单克隆抗体S2C6,且被证实会为B-淋巴细胞提供强烈的、生长促进信号。参见，例如，Paulie等，2000,丄/mw丽o/.142:590。如Carter等，1992,尸roc.A^/.爿cat/.Scz.V&489:4285;美国专利号6,037，454,和美国专利号6,054,297—般所述，得到人亚型III重链可变域(SEQIDNO:2)和人k亚型I轻链可变域(SEQIDNO:13)的共有序列，用作人受体重链和轻链结构域。在Cunningham等(1989,Scw"ce243:1330-1336)中描述的噬菌粒pEMXl,含有编码人共有K-亚型I轻链可变域和共有人亚型III重《连可变域的DNA片段，且是对于诱变以及F(ab)s在义應y^霧中的表达有用的载体。如Carter等，1992,尸roc.腐.爿cad腦89:4285所述，将编码共有可变域的DNA可操作地连接到源自基于pUC119的质粒pAK2的碱性磷酸酶启动子和Shine-dalgarno序列上。在编码F(ab)轻链和重4连可变域的多核苦酸之间，构建独特的Spel限制位点。构建pEMXl,并用于制备本文公开的人源化的抗体。通过定位诱变，将鼠抗体的CDR输入人共有序列构架区，构建第一个人源化的mAbS2C6F(ab)，它称作sgn-0。通常根据Kunkel,1985,尸rac.A^/.82:488所述的方法，进行诱变。在表2中显示了得到的人源化的F(ab)分子(sgn-0)重链和轻链可变域的氨基酸序列(分别是SEQIDNO:3和SEQIDNO:14),并与供体抗体、鼠单克隆抗体S2C6(mMAbS2C6,在本文中也称作SGN-14;分别是SEQIDNO:l和SEQIDNO:12)、和人共有序列受体抗体HuVHIII和HuVLI(分別是SEQIDNO:2和SEQIDNO:13)的序列进行对比。将质粒转化进义應^f^"4朱XL-1Blue(Strataene,SanDiego，CA),用于制备双^^和单《连DNA。4吏用双脱氧核苷酸方法(测序酶，U.S.BiochemicalCorp.),对每个轻链和重链可变域完全测序。将质粒转化进义廯Vf麥林16C9，即MM294的一种衍生物，涂布在含有5pg/ml羧千西林的LB平板上，选择单个菌落的蛋白表达。将5ml培养物加入500mlAP5-100貼/ml羧千西林，在37°C、在4L带有挡板的摇瓶中生长16小时。APS培养基包含1.5g葡萄糖、ll.OgHycaseSF、0.6g酵母提取物(合格品)、0.19gMgS04(无水)、1.07gNH4Cl、3.73gKCl、1.2gNaCl、120ml1Mtri乙醇胺、pH7.4,水调至1L，然后经0.1pmSealkeen过滤器无菌过滤。通过在3000Xg、在1L离心瓶(Nalgene)中离心，收获细胞，并去除上清液。冷冻1小时后，将沉淀重新悬浮于25ml冷10mMMES,10mMEDTA,pH5.0(緩沖液A)。加入250p10.1MPMSF(Sigma)来抑制蛋白酶解，并加入3.5ml原液10mg/ml鸡蛋清溶菌酶(Sigma)来辅助裂解细菌细胞壁。在水上轻轻摇动1小时后，在40,000Xg离心样品15分钟。用緩冲液A,将上清液调至50ml，并装载上用緩沖液A平tf的2mlDEAE柱。然后流过用缓沖液A平tf的蛋白G-琼脂糖CL-4B柱(Pharmacia)(0.5ml床体积)。用10ml緩冲液A洗涤柱，并用3ml0.3M甘氨酸、pH3.0洗脱进1.25ml1MTRIS,pHS.O。然后使用Centricon-30过滤器(Amicon),将F(ab)緩沖交换进PBS，并浓缩至终体积0.5ml。进行F(ab)的SDSPAGE凝胶，以确认纯度，并通过电雾化质谱法验证分子量。与亲本鼠抗体相比，人源化的抗体sgn-0表现出对固定化在微量滴定板上的CD40显著减小的结合亲和力。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>实施例2,人源化的抗-CD40变体抗体的制备对如实施例1所述制备的模板人源化抗体sgn-0,进行一系列突变。通过定位诱变，对编码sgn-0的轻链和重链可变域的DNA进行特异性突变，在下面的表3和4中，列出了从该模板分子生成的变体的序列。分析使用这些变体轻链和重链可变域构建的抗体的结合活性。将每种抗体稀释至等同浓度，然后系列稀释。测定稀释的抗体对固定化在微量滴定板上的CD40的结合。在下面的表5中，显示了变体抗体的亲和力结合数据。表现出接近亲本鼠抗体的结合活性的抗体是sgn-14,sgn-18,sgn-19，sgn-22，sgn-23,sgn-26,和sgn-27,其中变体sgn-14,sgn-18,sgn-26,和sgn-27更接近亲本鼠抗体的结合活性，SGN-14和变体sgn-26在这些测定中表现出最佳性能。表3重链可变域<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>表4<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>表5<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>用递增浓度(O-IOOfig/ml)的人源化的S2C6抗体处理CD40+和CD138++人多发性骨髓瘤细胞系MM.1S(它是地塞米+〉每l感的)和MM.1R(它是地塞米松抗性的)以及从2个多发性骨髓瘤患者新分离的肺瘤细胞(CD40+,CD138++)48小时。通过3[司-胸苷摄入，测量DNA合成。结果表明，人源化的S2C6抗体没有刺激MM.1S、MM.1R或来自2位患者的细胞的增殖(pX).1)。为了进一步确定人源化的S2C6抗体对这些细胞的细胞毒性作用，用人源化的S2C6抗体(10pg/ml)处理MM.1S和MM.1R的培养物6小时，然后与新合成的蛋白合成抑制剂环己酰亚胺(0.2貼/ml)共培养另外48小时。使用还原3-(4,5-二曱基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)作为指示剂，测定细胞生存力。人源化的S2C6抗体和环己酰亚胺处理在2种细胞系中触发了50-60%细胞杀伤，而单独的同种型对照Ig(有或没有环己酰亚胺)处理没有诱发细胞毒性。人源化的S2C6抗体在2种患者肿瘤细胞培养物中触发了20-30%细胞的细胞毒性，在有无毒剂量(0.2貼/ml)的环己酰亚胺存在下，这会显著提高。豸應辨(乂源化W在-CZ^0我谬^在身vf话^在SCID小鼠淋巴瘤异种嫁接冲莫型中，测定人源化的抗-CD40抗体的抗肿瘤活性。在开始药物治疗前13天，将500万Ramos肿瘤细l包皮下注射进SCID小鼠(IO只/组)。每周腹膜内施用鼠抗-CD40抗体或人源化的S2C63次(4mg/kg/次)，施用8或5次。检查小鼠的肿瘤生长，在14天研究期间，每周测量肿瘤体积。图2中的结果证实了对照小鼠中肿瘤生长增加了近9-倍，而在相同的时间段内，用鼠抗-CD40抗体或人源化的S2C6处理的小鼠中的胂瘤生长是可忽略的。数据表明，人源化的抗体能与鼠抗-CD40抗体一样有效地抑制该B淋巴瘤异种嫁接才莫型中的肿瘤生长。,滋#/5,乂源必#我-0^6我##延#存法爭在SCID小鼠淋巴瘤异种嫁接冲莫型中，测定人源化的抗-CD40抗体对携带肿瘤的小鼠的存活率的效能。在抗体治疗前3天，给SCID小鼠(10只/组)静脉内接种100万Ramos肺瘤细胞。用鼠或人源化的抗-CD40抗体或Ig对照处理小鼠，每周腹膜内施用2次(4mg/kg/次)，共5次。每天检查小鼠笼的死亡率。图3所示的结果表明，用对照抗体治疗的小鼠都没有存活至超过肺瘤接种后34天，而用鼠抗-CD40抗体治疗的10只小鼠中的8只、和用人源化的抗-CD40抗体治疗的所有10只小鼠，在肺瘤植入后甚至90天仍然存活。数据表明，人源化的抗体能与鼠抗-CD40抗体一样有效地延长SCID小鼠在该B淋巴瘤异种嫁接模型中的存活率。本文引用了各种参考文献，包括专利申请、专利和科学出版物，它们的公开内容在本文中整体引作参考。本文对任何参考文献的引用或确认，不应当解释为承认这些参考文献可以作为本发明的
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来得到。本文公开的教导的应用范围，不受本文所述具体实施方案的限制。实际上，本领域普通技术人员考虑本文包含的教导和所附实施例，能够作出多种改进。这样的改进应当属于所附权利要求书的范围内。权利要求1.特异性地结合人CD40的分离的抗体或抗原结合片段，其包含人源化的重链可变域，所述重链可变域包含具有与SEQIDNO2的人可变域重链亚型III共有氨基酸序列的构架区氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列的构架区，且包含至少一个具有与SEQIDNO3的对应重链CDR至少90％同一的氨基酸序列的CDR。2.特异性地结合人CD40的分离的抗体或抗原结合片段，其包含人源化的轻链可变域，所述轻链可变域包含具有与SEQIDNO:13的人可变域轻链亚型kI共有氨基酸序列的构架区氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列的构架区，且包含至少一个具有与SEQIDNO:14的对应轻链CDR至少卯％同一的氨基酸序列的CDR。3.权利要求1的抗体或抗原结合片段，还包含人源化的轻链可变域，所述轻链可变域包含具有与SEQIDNO:13的人可变域轻4连亚型kI共有氨基酸序列的构架区氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列的构架区，且包含至少一个具有与SEQIDNO:14的对应轻链CDR至少卯％同一的氨基酸序列的CDR。4.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其中每个重链CDR与SEQIDNO:3的对应重链CDR具有至少90%同一性。5.权利要求4的抗体或抗原结合片段，其中所述重链CDR包含SEQIDNO:3的对应重链CDR的氨基酸序列。6.权利要求2或3的抗体或抗原结合片段，其中每个轻链CDR与SEQIDNO:14的对应轻链CDR具有至少90%同一性。7.权利要求6的抗体或抗原结合片段，其中所述轻链CDR包含SEQIDNO:14的轻链CDR的氨基酸序列。8.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其包含SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10或SEQIDNO:ll的重《连可变域氨基酸序列。9.权利要求2的抗体或抗原结合片段，其包含SEQIDNO:14、SEQIDNO:15或SEQIDNO:16的轻链可变域氨基酸序列。10.4又利要求3的抗体或抗原结合片段，其包含SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:IO或SEQIDNO:ll的重4连可变域氨基酸序列，和SEQIDNO:14、SEQIDNO:15或SEQIDNO:16的轻链可变域氨基酸序列。11.权利要求1或3的抗体或抗原结合片段，还包含人IgG恒定区。12.权利要求11的抗体或抗原结合片段，其中IgG恒定区的同种型是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。13.权利要求12的抗体或抗原结合片段，其中IgG恒定区的同种型是IgGl。14.权利要求2或3的抗体或抗原结合片段，还包含轻链恒定域。15.权利要求14的抗体或抗原结合片段，其中轻链恒定域是K恒定域。16.权利要求10的抗体或抗原结合片段，其中所述重链可变域和轻链可变域分别包含下述氨基酸序列SEQIDNO:3和SEQIDNO:14;SEQIDNO:4和SEQIDNO:14;SEQIDNO:5和SEQIDNO:14;SEQIDNO:6和SEQIDNO:14;SEQIDNO:7和SEQIDNO:14;SEQIDNO:8和SEQIDNO:14;SEQIDNO:9和SEQIDNO:14;SEQIDNO:6和SEQIDNO:15;SEQIDNO:6和SEQIDNO:16;SEQIDNO:7和SEQIDNO:16;SEQIDNO:10和SEQIDNO:14;SEQIDNO:ll和SEQIDNO:14;SEQIDNO:10和SEQIDNO:16;或SEQIDNO:ll和SEQIDNO:16。17.权利要求10的抗体或抗原结合片段，其中所述重链可变域和轻链可变域分别包含下述氨基酸序列SEQIDNO:7和SEQIDNO:14;SEQIDNO:6和SEQIDNO:16;SEQIDNO:7和SEQIDNO:16;SEQIDNO:10和SEQIDNO:14;SEQIDNO:l1和SEQIDNO:14;SEQIDNO:10和SEQIDNO:16;或SEQIDNO:11和SEQIDNO:16。18.权利要求10的抗体或抗原结合片段，其中所述重链可变域和轻链可变域分别包含下述氨基酸序列SEQIDNO:7和SEQIDNO:14;SEQIDNO:6和SEQIDNO:16;SEQIDNO:10和SEQIDNO:16;或SEQIDNO:11和SEQIDNO:16。19.权利要求10的抗体或抗原结合片段，其中所述重链可变域和轻链可变域分别包含SEQIDNO:3和SEQIDNO:14的氨基酸序列。20.权利要求10的抗体或抗原结合片段，其中所述重链可变域和轻链可变域分别包含SEQIDNO:10和SEQIDNO:16的氨基酸序列。21.权利要求16-20中任一项的抗体，其中所述抗体还包含人免疫J求蛋白恒定区。22.权利要求21的抗体，其包含分别如SEQIDNO:19和SEQIDNO:22所述的重链和轻链氨基酸序列。23.^又利要求21的抗体，它是husgn-O,husgn-l,husgn-2,husgn-4，husgn-14,husgn-15,husgn-16,husgn-17,husgn-18,husgn-19,husgn-22.husgn-23,husgn-26或husgn-27。24.权利要求1-3中任一项的抗体或抗原结合片段，它是抗原结合抗体片段。25.权利要求24的抗原结合片段，其中所述抗体片段是Fab,Fab，,F(ab，)2，Fv片段，双特异抗体，单链抗体，scFv片段或scFv-Fc。26.权利要求1-3中任一项的抗体或抗原结合片段，还包含可检测标记。27.权利要求1-3中任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体缀合到化疗剂上。28.权利要求27的抗体或抗原结合片段，其中所述化疗剂是auristatin。29.权利要求28的抗体或抗原结合片段，其中所述auristatm是MMAE或MMAF。30.试剂盒，其包含置于容器中的权利要求1-3中任一项的抗体或抗原结合片段，任选包含关于使用所述抗体检测生物样品中的CD40蛋白的说明书。31.抑制表达人CD40抗原的细胞的生长的方法，其包含，给细胞施用权利要求1-3中任一项的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段特异性地结合人细胞表面CD40抗原，其中抗体或抗原结合片段与CD40抗原的结合抑制细胞的生长或分化。32.治疗具有CD40相关病症的受试者的方法，其包含，给受试者施用权利要求1-3中任一项的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段特异性地结合人CD40,其中抗体或抗原结合片段与CD40的结合抑制CD40相关病症的细胞的生长或分化。33.4又利要求32的方法，其中CD40相关病症的细胞是B类淋巴母细胞，胰腺细胞，肺细胞，乳腺细胞，卵巢细胞，结肠细胞，前列腺细胞，皮肤细胞，头和颈细胞，膀胱细胞，骨细l包或肾细胞。34.权利要求32的方法，其中所述CD40相关病症是慢性淋巴细胞白血病，伯基特淋巴瘤，多发性骨髓瘤，T细胞淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金病，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症或卡波西肉瘤。35.诱导外周B细胞的缺失的方法，其包含，给细胞施用权利要求l-3中任一项的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段特异性地结合人细胞表面CD40抗原，其中抗体或抗原结合片段与CD40抗原的结合，会诱导细胞的缺失。36.权利要求35的方法，其中将所述抗体或抗原结合片段施用给具有免疫病症的受试者。37.权利要求37的方法，其中所述免疫病症是类风湿性关节炎或系统性红斑3良痴。38.权利要求1-3中任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与具有ATCC保藏号PTA-110的杂交瘤分泌的单克隆抗体S2C6竟争结合。39.药物组合物，其包含(i)权利要求1-3中任一项的抗体或抗原结合片段；和(ii)药学可接受的赋形剂。40.分离的多核苷酸，其编码权利要求1的抗体或抗原结合片段的人源化重链可变区。41.分离的多核苷酸，其编码权利要求2的抗体或抗原结合片段的人源4t轻《连可变区。42.权利要求40的分离的多核苷酸，还包含人源化的轻链可变域，所述轻链可变域包含具有与SEQIDNO:13的人可变区轻链亚型kI共有氨基酸序列的构架区氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列的构架区，且包含至少一个具有与SEQIDNO:3的对应重链CDR至少90%同一的氨基酸序列的CDR。43.权利要求40或42的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10或SEQIDNO:ll的重链可变域氨基酸序列。44.权利要求4J或42的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码SEQIDNO:14、SEQIDNO:15或SEQIDNO:16的轻链可变域氨基酸序列。45.权利要求43的分离的多核苷酸，其中所述多核普酸分別编码下述重链可变域氨基酸序列和轻链可变域氨基酸序列SEQIDNO:3和SEQIDNO:14;SEQIDNO:4和SEQIDNO:14;SEQIDNO:5和SEQIDNO:14;SEQIDNO:6和SEQIDNO:14;SEQIDNO:7和SEQIDNO:14;SEQIDNO:8和SEQIDNO:14;SEQIDNO:9和SEQIDNO:14;SEQIDNO:6和SEQIDNO:15;SEQIDNO:6和SEQIDNO:16;SEQIDNO:7和SEQIDNO:16;SEQIDNO:10和SEQIDNO:14;SEQIDNO:11和SEQIDNO:14;SEQIDNO:10和SEQIDNO:16;或SEQIDNO:ll和SEQIDNO:16。46.权利要求43的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸分别编码下述重链可变域氨基酸序列和轻链可变域氨基酸序列SEQIDNO:7和SEQIDNO:14;SEQIDNO:6和SEQIDNO:16;SEQIDNO:7和SEQIDNO:16;SEQIDNO:10和SEQIDNO:14;SEQIDNO:11和SEQIDNO:14;SEQIDNO:10和SEQIDNO:16;或SEQIDNO:11和SEQIDNO:16。47.权利要求43的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸分别编码下述重链可变域氨基酸序列和轻链可变域氨基酸序列SEQIDNO:7和SEQIDNO:14;SEQIDNO:6和SEQIDNO:16;SEQIDNO:10和SEQIDNO:16;或SEQIDNO:11和SEQIDNO:16。48.权利要求43的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸分别编码SEQIDNO:3和SEQIDNO:14的重《连可变域氨基酸序列和轻链可变域氨基酸序列。49.权利要求43的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸分别编码SEQIDNO:10和SEQIDNO:16的重链可变域氨基酸序列和轻链可变域氨基酸序列。全文摘要提供了人源化的抗-CD40抗体和抗原结合片段，和用于治疗特征在于CD40抗原表达的疾病的方法。文档编号A61K39/395GK101237882SQ200680027117公开日2008年8月6日申请日期2006年5月26日优先权日2005年5月26日发明者L·G·普雷斯塔,L·Y·奥康奈尔,S·O·多罗尼娜申请人:西雅图基因公司;吉宁特有限公司