专利名称：：用cd1d配体进行免疫的组合物和方法
技术领域：
：本发明涉及疫苗组合物和利用疫苗组合物的免疫方法的领域。
背景技术：
：第一次给予含有病原体抗原的疫苗组合物能诱导活化细胞和记忆细胞对该抗原发生初次应答。再次接触抗原(如接触该病原体)则能诱导记忆细胞扩增和比初次应答更快和更强的再次应答，保护机体抵抗该病原体。虽然在初次接触该病原体后记忆细胞可持续存在数月或数年，但通常需要提供加强剂量的抗原来保证维持长期免疫记忆。因此，疫苗接种方案常常包括数次初免注射以提供初始记忆细胞库，以及后续间隔时间递增的加强注射以维持免疫记忆。数次初免注射的需求和加强注射所需频率取决于疫苗和接受者年龄。能够在免疫记忆维持不减退的情况下减少初免剂量的次数以及加强剂量的频率和次数是有利的。理想的是，优选完全消除对额外初免剂量和加强剂量的需求，只通过一次剂量给予疫苗。因此，本发明目的是提供在不给予加强剂量和/或没有多次初免剂量(primingdose)的情况下诱导长期免疫记忆的免疫原性组合物。本发明的另--个目的是提供含有流感病毒、B型链球菌和脑膜炎球菌B血清组的抗原的免疫原性组合物。
发明内容疫苗常常包含能刺激免疫活性的佐剂。已知佐剂的例子包括铝盐、水包油乳剂、皂苷、细胞因子、脂质和CpG寡核苷酸。目前，仅批准将铝盐、3-脱-0-酰化单磷酰脂质A('3dMPL')和MF59用于人。已知具有佐剂特性的另一种分子是a-半乳糖苷神经酰胺(a-GalCer或a-GC)，它是一种糖脂，更具体说是一种糖基神经酰胺，最初分离自海绵[l]。a-GalCer是MHCI类分子CDld的配体，由CDld分子提呈给非变异自然杀伤T(NKT)细胞。最初研究a-GalCer诱导NKT细胞对肿瘤细胞应答的能力[2]。非变异NKT细胞也能诱导B细胞激活，促进B细胞增殖和抗体产生[3,4]。a-GalCer能用作各种共同给予的蛋白质抗原的佐剂[5]。共同给予a-GalCer与表达疟疾抗原的辐射孢子体或重组病毒能够提高小鼠的保护性抗疟疾免疫力水平[6]。a-GalCer也能用作编码HIV-Igag和env基因的DNA疫苗的佐剂[7]，鼻内给予时诱导对流感病毒HA的体液和细胞免疫应答。令人惊讶的是，已经发现使用CDld配体如a-GalCer作为疫苗佐剂不仅能显著提高对疫苗中抗原的抗体应答，而且能诱导针对这些抗原的特异性B细胞记忆库增加。具体说，已发现给予一次剂量的含有a-GalCer和抗原的组合物足以促进特异性B记忆库增加，这能提高一年后用该抗原刺激时的抗体免疫应答。CDld配体促进特异性B细胞记忆库增加的能力表明使用CDld配体作为疫苗佐剂可减少获得长期免疫记忆所需的初免和加强免疫的次数和频率。也发现，CDld配体是衍生自B型链球菌、脑膜炎球菌血清组B的抗原和某些流感病毒抗原的惊人有效佐剂。诱导长期免疫记忆的方法
技术领域：
：本发明提供在需要的患者中诱导对抗原的长期免疫记忆的方法，所述方法包括给予所述患者组合物，所述组合物含有a)所述抗原；和b)CDld配体，以便与不给予CDld配体的情况下给予所述抗原时相比，降低为使所述患者能够在后续接触所述抗原时产生免疫应答所必需的所述组合物的给药次数和/或频率。优选地，与不给予CDld配体的情况下给予所述抗原时相比，本发明方法能降低使所述患者在后续接触所述抗原时产生保护性免疫应答所必需的所述组合物的给药次数和/或频率。"保护性免疫应答"指对后续抗原接触产生的免疫应答足以防止该患者患上与该抗原有关的疾病。可通过本领域已知的标准方法确定对抗原产生保护性免疫应答所需的组合物给药次数和/或频率的降低。本发明方法可降低诱导对后续抗原接触的保护性免疫应答所必需的含该抗原的组合物给药次数。一些免疫目前需要三次或四次初免抗原剂量才能对后续抗原接触产生保护性免疫应答。优选地，本发明方法将诱导针对抗原的保护性免疫应答所需的给药次数降低至一次初免给药。目前的免疫方法也常常需要间隔递增的加强免疫来维持对后续抗原接触的保护性免疫应答。例如，在婴儿期给予的免疫一般保护在给予初次剂量后数月或数年给予的加强剂量。优选地，本发明方法降低维持对后续抗原接触产生保护性免疫应答所必需的加强给予含抗原组合物的频率。优选地，本发明方法允许以一年以上，优选两年以上，优选5年以上、优选10年以上的间隔给予加强剂量。按照本发明的优选实施方式，完全消除对加强剂量的需求，单次给予该抗原足以诱导对后续抗原接触的保护性免疫应答。按照本发明的一个方面，提供了在患者中诱导对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括给予所述患者a)所述抗原；和b)CDld配体，所述抗原和CDld配体在超过一年以前也给予过所述患者。本发明也提供抗原和CDld配体在制备诱导患者免疫应答的药物中的应用，其中所述抗原和CDId配体在超过一年以前也给予过所述患者。免疫应答优选为保护性免疫应答。优选地，所述抗原和CDld配体在超过18个月，优选超过2年、5年或10年以前给予过所述患者。按照本发明这个方面给予患者抗原和CDld配体时，可以含有抗原和CDld配体的混合物，即单一组合物的形式给药。或者，可以任意顺序将抗原和CDld配体依次给予患者的同一部位。也可将抗原和CDld配体分别给予患者的不同部位，例如不同的肢体。超过l年前给予患者的CDld配体和抗原的初始剂量也可以CDld配体和抗原的单一组合物的形式给予，或者CDld配体和抗原可依次或分开给予。给予患者以诱导免疫应答的CDld配体量取决于给予该组合物的患者的年龄和体重，但一般含有1-100pg/kg患者体重。令人惊讶的是，已发现低剂量CDld配体足以提高对共同给予抗原的免疫应答，并提高对该抗原的长期免疫记忆。因此，本发明组合物中CDld配体的含量可小于5(Hig/kg患者体重、小于20(ig/kg、小于10吗/kg、小于5[ig/kg、小于4(ig/kg或小于3(ig/kg。按照本发明另一方面，提供在患者中诱导对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括给予所述患者a)所述抗原；和b)CDld配体，其中所述组合物中CDld配体含量小于10吗/kg患者体重，优选小于5吗/kg、小于4叱/kg或小于3吗/kg。本发明也提供抗原和CDld配体在制备诱导患者免疫应答的药物中的应用，其中CDld配体含量小于10吗/kg患者体重，优选小于5pg/kg、小于4吗/kg或小于3^g/kg。按照本发明这个方面给予患者的抗原和CDld配体可以混合物的形式给药；依次给予患者的同一部位(给予抗原或CDld配体的顺序任意)；或分别给予患者的不同部位，如不同的肢体。CDld配体本发明组合物中所含的CDld配体可以是结合CDld分子的任何分子。CDld分子位于非变异NKT(iNKT)细胞、B细胞、树突细胞、单核细胞和常规T细胞上，本发明CDld配体可结合位于这些细胞上的CDld分子。本发明CDld配体与CDld分子的结合可激活iNKT细胞、B细胞、树突细胞、单核细胞、和/或常规T细胞。CDld配体与CDld分子的结合优选激活iNKT细胞。可通过本领域已知的标准方法确定某分子结合CDld分子的能力。可通过测定与不存在CDld配体时释放的细胞因子水平相比，在CDld配体存在下细胞释放的细胞因子水平来确定CDld配体激活细胞，具体是非变异NKT细胞的能力。优选地，与不存在CDld配体时非变异NKT细胞的细胞因子分泌水平相比，本发明组合物中所含的CDld配体能提高非变异NKT细胞的细胞因子分泌水平。本发明CDld配体可促进Thl细胞因子或Th2细胞因子的释放。优选地，与不存在CDld配体时非变异NKT细胞分泌IFN-y、IL-4和IL-13的水平相比，本发明CDld配体能提高非变异NKT细胞分泌IFN-y、IL-4和IL-13的水平。可测试用作激活非变异NKT细胞的CDld配体的能力的候选分子包括肽和糖。优选地，本发明CDld配体是糖脂。已知用作可包含在本发明组合物中的CDld配体的糖脂抗原的综述参见参考文献9。适用于本发明组合物的CDld配体的例子包括a-糖基神经酰胺。用于本发明组合物的a-糖基神经酰胺优选为式(I)化合物式中-A代表O、CH2、-CH2CH=CH、-CH=CHCH2，Q代表(CH2)n，其中n代表0或1的整数，RM戈表H或OH，X代表l-30的整数，W代表选自以下(a)-(e)的取代基(其中Y代表5-17的整数)；(a)(b)-CH(OH)(CHCH3(c)-CH(OH)(CH2)YCH(CH3)2(d)-CH=CH(CH2)YCH3(e)-CH(OH)(CH2)YCH(CH3)CH2CH3，R3代表H、OH、NH2、NHCOCH3或单糖，R4代表OH或单糖，R5代表H、OH或单糖，R6代表H、OH或单糖，和R7代表H、CH3、CH20H或-CHr单糖。X优选为7-27，更优选为9-24，更优选为13-20。Y优选为7-15，更优选为9-13。术语"单糖"指含有3-10个碳原子链的醛(醛醣)或酮(酮糖)形式的糖分子。适用于本发明的单糖包括天然产生和合成的单糖.单糖的例子包括丙糖，如甘油糖和二羟基丙酮；丁糖，如赤藓糖(erythanose)和赤鲜酮糖；戊糖，如木糖、阿拉伯糖、核糖、木酮糖、核酮糖；甲基戊糖(6-脱氧已糖)，如鼠李糖和果糖；已糖，如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖和山梨糖；庚糖，如葡庚糖、半乳甘露庚糖、景天庚酮糖和甘露庚酮糖。优选的单糖是己糖。单糖基团可连接于结构的r3、r4、r5、rS或R"位置，以形成糖基键。单糖一般通过连接于单糖c-1碳的氧连接于r3、r4、r5、rS或W位置，形成配糖键。R3是单糖时，优选选自a-D-吡喃半乳糖、(3-D-吡喃半乳糖、a-D-吡喃葡萄糖或卩-D-吡喃葡萄糖。W是单糖时，优选选自(3-D-呋喃半乳糖或N-乙酰基a-D-吡喃半乳糖。RS是单糖时，优选选自a-D-吡喃半乳糖、(3-D-吡喃半乳糖、a-D-吡喃葡萄糖或卩-D-吡喃葡萄糖。R6是单糖时，优选选自a-D-吡喃半乳糖、P-D-吡喃半乳糖、a-D-吡喃葡萄糖或卩-D-吡喃葡萄糖。W是单糖时，优选选自甲基a-D-吡喃半乳糖苷、甲基(3-D-吡喃半乳糖苷、甲基a-D-吡喃葡糖苷或甲基P-D-吡喃葡糖苷。115和116优选不同。115和116之一优选是11。参考文献2提供了适合包含在本发明组合物中的a-糖基神经酰胺的其它例子。a-糖基神经酰胺优选是具有下式的a-半乳糖基神经酰胺(a-GalCer)或其类似物OH本发明组合物中所含的a-GalCer和其类似物可直接分离自海绵，或者可以是化学合成的产品。参考文献10和11提供适用于本发明组合物的a-GalCer类似物的例子和合成这些产品的方法。优选的a-GalCer类似物是KRN7000，其结构式如下(2S,3S,4R)-l-0-(a-D-吡喃半乳糖基)-2-(N-二十六垸酰氨基)-l,3,4-十八垸三醇。参考文献12描述了KRN7000的合成。其它优选的a-GalCer类似物是a-GalCer的C-连接类似物如参考文献13、14和15所述。优选的a-GalCer的C连接类似物是CRONY-101，其合成参见参考文献13。与ot-GalCer相比脂肪酰基链和/或鞘氨醇链被截短的a-GalCer的截短类似物也可用于本发明。参考文献16提供a-GalCer的截短类似物的例子。优选的a-GalCer截短类似物是'OCH'，与优选的a-GaICer相比其中脂肪酰基链被截短两个烃基，鞘氨醇链被截短九个烃基(即R^H，X=21，R2=CH(OH)(CH2)4CH3，R3=OH，R4=OH，R5=OH，R6=H，R7=CH2OH)。其它优选的a-GalCer截短类似物包括与a-GalCer相比脂肪酰基链被截短两个烃基和鞘氨醇链被截短七个或三个烃基的类似物(即R1=H，X=21，R3=OH，R4=OH，R5=OH,R6=H，R7=CH2OH，R2是CH(OH)(CH2)6CH3或CH(OH)(CH2)10CH3)oa-GalCer、KRN7000和OCH都是含植物鞘氨醇的a-糖基神经酰胺。然而，本发明也包括使用KRN700,OCH和其它上述a-糖基神经酰胺的含二氢鞘氨醇的类似物。KRN7000和OCH的含二氢鞘氨醇类似物的合成参见参考文献17。用于本发明组合物的CDld配体也可包含硫苷脂类似物，如参考文献18所述。a-GalCer的优选类似物3"-0-硫代-半乳糖基神经酰胺。虽然a-GalCer最初分离自海绵，但近年来从革兰阴性菌中分离到与a-GalCer结构相似的CDld配体。因此，本发明组合物中可包含的其它CDld配体是细菌来源的糖脂，具体是分离自鞘氨醇单胞菌C^/z/"gomo"w)和埃里希体CE/^/ZcWa)外膜的细菌糖基神经酰胺。这类糖基神经酰胺的例子包括来自鞘氨醇单胞菌的a-葡糖醛酸基神经酰胺(a-glucuronosylceramide)和a-半乳糖醛酸基神经酰胺(a-galacturonsylceramide)，其生产参见参考文献19。来自鞘氨醇单胞菌和埃里希体的其它CDld配体的产生参见参考文献18。本发明也包括使用不属于鞘糖脂家族的CDld配体。具体说，本发明提供使用属于糖甘油脂的CDld配体。可用于本发明的糖甘油脂包括二酰甘油，具体是单半乳糖基二酰甘油。适用于本发明的单半乳糖基二酰甘油参见参考文献20。组合物的抗原性组分诱导上述长期免疫记忆的组合物中包含的抗原可以是已知用于诱导免疫应答的任何抗原。该抗原可包括蛋白质抗原或糖抗原。糖抗原该抗原是糖抗原时，优选偶联于载体蛋白。糖抗原优选为细菌糖，具体是细菌荚膜糖。可包含在本发明组合物中的细菌荚膜糖的例子包括膜炎奈瑟球菌(A^wen'ame"/"g/"fife)(血清组A、B、C、W135或Y)、肺炎链球菌(&re;^ococcM/7"e"mom'ae)(血清组4、6B、9V、14、18C、19F或23F)、无乳链球菌(Sfre;^ococc^rflga/ac"ae)(Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII或VIII型)、流感嗜血杆菌(i/aemo;W/w/My/wwzae)(可分型菌株a、b、c、d、e或f)、绿脓假单胞菌(尸w油mo顧"erwg/"OM)、金黄色葡萄球菌(&^/z;;/ococcwawww)等的荚膜糖。本发明组合物可包含的其它糖包括葡聚糖(如真菌葡聚糖，如白色念珠菌(Ow&^fl/Wcfl"力的葡聚糖)和真菌荚膜糖，如新型隐球菌(Co^ococcwsweo/onwam)荚膜的荚膜糖。脑膜炎奈瑟球菌血清组A(MenA)荚膜是(a1—6)-连接的N-乙酰基-D-甘露糖胺-l-磷酸的均聚物，在C3和C4位部分O-乙酰化。脑膜炎奈瑟球菌血清组B(MenB)荚膜是(a2—8)-连接的唾液酸的均聚物。脑膜炎奈瑟球菌血清组C(MenC)荚膜糖是(a2—9)-连接的唾液酸的均聚物，在位置7和/或8含有可变的O-乙酰化。脑膜炎奈瑟球菌血清组W135糖是由唾液酸-半乳糖二糖单元[—4)-D-Neu;5Ac(7/90Ac)-a-(2—6)-D-Gal-a-(1—]组成的聚合物。它在唾液酸的7位和9位上含有可变的0-乙酰化[21]。脑膜炎奈瑟球菌血清组Y糖类似于血清组W135糖，除了二糖重复单元用葡萄糖代替了半乳糖[—4)-D-Neu/5Ac(7/90Ac)-a-(2—6)-D-Glc-a-(1—]。它也在唾液酸的7位和9位含有可变的O-乙酰化。B型流感嗜血感觉荚膜(Hib)糖是核糖、核醣醇和磷酸的聚合物['PRP'，(聚-3-(3-0-核糖-(1，1)-0-核醣醇-5-磷酸)]。本发明组合物可含有糖抗原偶联物的混合物。本发明组合物优选包含一种以上脑膜炎奈瑟球菌血清组的糖抗原，例如该组合物可包含血清组A+C、A+W135、A+Y、C+W135、C+Y、W135+Y、A+C+W135、A+C+Y、C+W135+Y、A+C+W135+Y等的糖偶联物。优选组合物包含血清组C和Y的糖偶联物。其它优选组合物包含血清组C、W135和Y的糖偶联物。当混合物包含血清组A脑膜炎球菌的糖和至少一种其它血清组的糖时，MenA糖与其它血清组糖的比例(w/w)可以大于l(如2:1、3:1、4:1、5:1、10:1或更高)。血清组A:C:W135:Y的糖的优选比例(w/w)为1:1:1:1;1:1:1:2;2:1:1:1;4:2:1:1;8:4:2:1;4:2:1:2;8:4:1:2;4:2:2:1;2:2:1:1;4:4:2:1;2:2:1:2;4:4:1:2;和2:2:2:1。本发明的其它优选组合物包含Hib糖偶联物和至少一种脑膜炎奈瑟球菌血清组，优选一种以上脑膜炎奈瑟球菌血清组的糖偶联物。例如，本发明组合物可包含Hib偶联物和来自脑膜炎奈瑟球菌血清组A、C、W135和Y的偶联物。本发明还包括含有肺炎链球菌糖偶联物的组合物。该组合物优选包含来自一种以上肺炎链球菌血清组的糖偶联物。优选组合物包含肺炎链球菌血清组4、6B、9V、14、18C、19F和23F(7-价)的糖偶联物。组合物还可包含肺炎链球菌血清组4、6B、9V、14、18C、19F23F、1和5(9价)的糖偶联物，或者可包含肺炎链球菌血清组4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、3和7F(11价)的糖偶联物。本发明其它优选的组合物包含肺炎球菌糖偶联物和来自Hib和/或脑膜炎奈瑟球菌的糖偶联物。优选地，本发明组合物可包含来自肺炎链球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的糖偶联物和Hib糖偶联物。优选地，本发明组合物可包含来自肺炎链球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的糖偶联物和来自脑膜炎奈瑟球菌血清组A、C、W135和Y的糖偶联物。本发明组合物可包含来自肺炎链球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的糖偶联物、Hib糖偶联物和来自脑膜炎奈瑟球菌血清组A、C、W135和Y的糖偶联物。优选的是，单个糖抗原偶联物的保护效力不会因合并而消除，但实际免疫原性(如ELISA效价)可能降低。荚膜糖抗原的制备制备荚膜糖抗原的方法是熟知的。例如，参考文献22描述了脑膜炎奈瑟球菌糖抗原的制备。参考文献86第14章描述了流感嗜血杆菌糖抗原的制备。现有技术描述了肺炎链球菌糖抗原和偶联物的制备。例如，PrevenarTM是一种7-价肺炎球菌偶联疫苗。参考文献23和24中详细描述了无乳链球菌糖抗原的制备方法。糖抗原可以经化学修饰。例如，可修饰它们，用封闭基团取代一个或多个羟基。这种方法对脑膜炎球菌血清组A特别有用，其中用封闭基团取代乙酰基可防止水解[25]。这种修饰的糖仍然是本发明意义上的血清组A糖。所用的荚膜糖可以是寡糖形式。通过纯化荚膜多糖的片段化(如通过水解)方便地形成寡糖，片段化后通常要纯化所需大小的片段。优选进行多糖的片段化，以使寡糖的平均聚合程度(DP)最终小于30。可通过离子交换色谱或比色测定方便地测定DP[26]。如果进行水解，通常对水解产物进行筛分，以去除短链寡糖[27]。可用各种方法，如超滤后离子交换色谱实现此目的。对于血清组A，优选去除聚合程度小于或等于约6的寡糖；对于血清组W135和Y，优选去除聚合程度小于4左右的寡糖。载体载体优选蛋白质。本发明组合物中偶联糖抗原的载体蛋白优选是细菌毒素，如白喉类毒素或破伤风类毒素。合适的载体蛋白包括白喉毒素CRM197突变体[28-30]、白喉类毒素、脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[31]、合成肽[32,33]、热激蛋白[34,35]、百日咳蛋白[36,37]、细胞因子[38]、淋巴因子[38]、激素[38]、生长因子[38]、含有不同病原体衍生抗原的多种人004+T细胞表位的人工蛋白[39]如N19蛋白[40]、流感嗜血杆菌蛋白D[41,42]、肺炎球菌表面蛋白PspA[43]、肺炎链球菌溶血素[44、摄铁蛋白[45]、来自艰难梭菌C."骄c〃e)的毒素A和B[46]、人血清白蛋白(优选重组蛋白)等。优选通过-NH2基团，例如载体蛋白中赖氨酸残基侧链或精氨酸残基侧链中的-NH2基团连接糖抗原与载体。当糖具有游离醛基时，醛基可与载体中的氨基反应，通过还原胺化形成偶联物。也可通过-SH基团，如半胱氨酸侧链中的-SH基团连接。该组合物含有一种以上糖抗原时，可能使用一种以上载体来降低载体抑制的风险。因此，可将不同载体用于不同糖抗原，例如脑膜炎奈瑟球菌血清组糖可偶联于CRM197，而C型糖可偶联于破伤风类毒素。也可能将一种以上载体用于一种具体的糖抗原。糖可以分成两组，一些偶联于CRM197而另一些偶联于破伤风类毒素。然而，通常优选所有糖使用同一种载体。一种载体蛋白可携带一种以上糖抗原[47,48]。例如，一种载体蛋白可偶联于不同病原体或同一病原体的不同血清组的糖。为了实现这一目的，可以在偶联反应之前混合不同糖。然而，通常优选单独得到各血清组的偶联物，偶联后混合不同糖。单独的偶联物可基于同一载体。优选糖:蛋白质之比(w/w)为l:5(即蛋白质过量)-5:l(即糖过量)的偶联物。优选1:2-5:1的比例，以及1:1.25-1:2.5之间的比例。偶联物可与游离载体联用[49]。当本发明组合物中给定载体蛋白存在游离和偶联形式时，未偶联形式优选不多于组合物中载体蛋白总量的5%，更优选少于2%重量。可采用任何合适的偶联反应，必要时采用任何合适的接头。一般在偶联前活化或官能化糖。活化可包括例如用氰化试剂如CDAP(如1-氰基-4-二甲基氨基四氟硼酸吡啶[50，51等])。其它合适技术采用碳二亚胺、酰肼、活性酯、降冰片烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU(也参见参考文献52的引言)可用任何已知方法，如参考文献53和54所述的方法通过接头基团进行连接。一种连接类型包括多糖的还原性胺化，将得到的氨基与己二酸接头基团的一端偶联，然后将蛋白质偶联于该己二酸接头基团的另一端[55，56]。其它接头包括B-丙酰胺基[57]、硝基苯基-乙基胺[58]、卤代酰基卤化物[59]、配糖键[60]、6-氨基己酸[61]、ADH[62]、C4-C12部分[63]等。作为采用接头的替代方法，可以采用直接连接。直接连接蛋白质可包括氧化多糖，然后与蛋白质进行还原性胺化，如参考文献64和65所述。优选包括以下步骤的方法将氨基引入糖(如用-NH2取代末端K)基团)，然后用己二酸二酯(如己二酸N-羟基琥珀酰亚胺基二酯)衍生后，与载体蛋白反应。偶联后，可分离游离和偶联的糖。有许多合适的分离方法，包括疏水色谱、切向超滤、透析等。[也参见参考文献66和67等]。当本发明组合物包含解聚的糖时，优选在偶联之前进行解聚。适合包含在本发明组合物中的糖偶联物抗原的制备参见参考文献68。蛋白质抗原本发明组合物中包含的抗原是蛋白质抗原时，该抗原可选自脑膜炎奈瑟球菌血清组B的蛋白质抗原，如参考文献69-75所述的抗原。使用参考文献73的标准命名法时，NMB2132、NMB1870和NMB0992是可用作合适抗原基础的三种优选蛋白。-肺炎链球菌(如PhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Spl25、Spl01、Spl28、Spl30和Sp133，如参考文献76所述)的蛋白质抗原。-甲型肝炎病毒，如灭活病毒的抗原[如77，78;参考文献86的第15章]。-乙型肝炎病毒的抗原，如表面和/或核心抗原[如78，79;参考文献86的第16章〗。-丙型肝炎病毒的抗原[如80]。可以使用的丙型肝炎病毒抗原可包括以下一种或多种抗原HCVE1和/或E2蛋白，El/E2异源二聚体复合物、核心蛋白和非结构蛋白，这些抗原的片段，其中可任选地修饰所述非结构蛋白，以便在保持免疫原性的同时消除酶活性(如81、82和83)。-百日咳博德特菌(5oWefe〃apeWws^)的抗原，如百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，也可任选与百日咳杆菌黏附素(pertactin)和/或凝集原2和3组合使用[例如，参考文献84和85;参考文献86的第21章]。-白喉抗原，如白喉类毒素[例如，参考文献86的第13章]。-破伤风抗原，如破伤风类毒素[例如，参考文献86的第27章]。陽淋病奈瑟球菌(N.gonorrhoeae)抗原[例如，69、70、71]。-肺炎衣原体((^/0附>^/0^朋"附0"/^)抗原[例如，87、88、89、90、91、92、93]。-沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)抗原[例如，94]。-牙龈卟啉单胞菌(尸0/7^>^0附0"05g/wg/va/Z力抗原[例如，95]。-脊髓灰质炎抗原例如，96、97;参考文献86的第24章]如IPV。-狂犬病抗原[如98]如冻干的失活病毒[如99，RabAvert]。-麻疹、腮腺炎和/或风疹抗原[如参考文献86的第19、20和26章]。幽门螺杆菌(//6/^0^"";;;/on')抗原如CagA[100-103]、VacA[104、105]、NAP[106、107、108]、HopX[如109]、HopY[如109]和/或脲酶。-流感抗原[如参考文献86的第17和18章]，如血细胞凝集素和/或神经氨酸酶表面蛋白。-粘膜炎莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)抗原[如110]。-无乳链球菌(B型链球菌)的蛋白抗原[如111、112]。-酿脓链球菌057";^70"^;7"^"")(八型链球菌)的抗原[如112、113、114]。-金黄色葡萄球菌抗原[如U5]。-副粘病毒如呼吸道合胞病毒(1^￥[116、U7])和/或副流感病毒(PIV3[118])的抗原。-炭疽杆菌0^"7/^""^^(^)抗原[如119、120、121]。-黄病毒属病毒(黄病毒种)，如黄热病病毒、日本脑炎病毒、登革热病毒的四种血清型、蜱媒脑炎病毒、西尼罗河病毒的抗原。-瘟病毒抗原，如经典的猪热病毒、牛病毒性腹泻病毒和/或边界病病毒的抗原。-细小病毒，如细小病毒B19的抗原。-单纯疱疹病毒(HSV)抗原。用于本发明的优选HSV抗原是膜糖蛋白gD。优选使用HSV-2毒株的gD('gD2'抗原)。该组合物可使用C-末端膜锚定区缺失的gD形式[122]，如包含天然蛋白的氨基酸1-306且C-末端加入天冬酰胺和谷胺酰胺的截短的gD。这种蛋白质形式包括信号肽，信号肽被切割后产生成熟的283个氨基酸的蛋白质。缺失锚定物，以便将该蛋白制备成可溶形式。-人乳头瘤病毒(HPV)抗原。用于本发明的优选HPV抗原是L1衣壳蛋白，该蛋白可组装形成称为病毒-样颗粒(VLP)的结构。可通过在酵母细胞(例如酿酒酵母(S.cerev&'ae))或昆虫细胞(例如夜蛾(印odo;7fera)细胞，如草地贪夜蛾(S./n^peWa)，或果蝇(ZVosopMa)细胞)中重组表达Ll产生VLP。在酵母细胞中，质粒载体可携带L1基因；在昆虫细胞中，杆状病毒载体可携带L1基因。更优选地，该组合物包含来自HPV-16和HPV-18毒株的L1VLP。已证明这种二价组合非常有效[123]。除了HPV-16和HPV-18毒株外，也可能包含来自HPV-6和HPV-11毒株的L1VLP。也可能采用致癌性HPV毒株。疫苗可包含20-60Hg/ml(如约40(ig/ml)的L1/HPV毒株。该组合物可包含一种或多种这些抗原，需要时可使其脱毒(例如，通过化学和/或遗传学手段使百日咳毒素脱毒)。当混合物中包含白喉抗原时，也优选包含破伤风抗原和百日咳抗原。相似地，当包含破伤风抗原时，也优选包含白喉和百日咳抗原。相似地，当包含百日咳抗原时，也优选包含白喉和破伤风抗原。混合物中各抗原的浓度一般是至少1ng/ml。通常，任何给定抗原的浓度将足以引发针对该抗原的免疫应答。作为混合物中使用蛋白质抗原的另一种替代方式，可使用编码该抗原的核酸。因此，混合物的蛋白质组分可被编码该蛋白的核酸(优选DNA，如质粒形式的DNA)取代。相似地，本发明组合物可包含模拟抗原的蛋白质，如模拟表位[124]或抗独特型抗体。或者或除上述抗原外，该组合物可包含来自脑膜炎奈瑟球菌血清组B的外膜泡(OMV)制剂，如参考文献125、126、127、128等所述。其它组合物本发明的另一个目的是提供针对B型链球菌、脑膜炎奈瑟球菌血清组B和/或流感病毒产生保护作用的疫苗组合物。已发现，对病原体抗原而言，CDld配体是令人惊讶的有效佐剂。下述组合物包含来自B型链球菌、脑膜炎奈瑟球菌血清组B或流感病毒的至少一种抗原。这些组合物可包含其它抗原。例如，这些组合物也可包含一种或多种偶联于一种或多种载体的糖抗原，所述载体例如上述包含在组合物中用于诱导长期免疫记忆的载体。或者或此外，这些组合物可包含一种或多种上述蛋白质抗原。B型链球菌因此，本发明提供含有以下组分的组合物a)CDld配体；和b)B型链球菌抗原。包含在组合物中的B型链球菌(无乳链球菌)抗原的例子参见参考文献111和112。因此，该组合物可包含含有以下一种或多种序列的蛋白质(i)参考文献112中的无乳链球菌氨基酸序列(参考文献112的SEQIDNO:2-10960中偶数编号的序列)；(ii)与(i)的无乳链球菌氨基酸序列序列相同性为至少80%的氨基酸序列；含有(i)的无乳链球菌氨基酸序列的表位的氨基酸序列。优选地，该组合物包含参考文献112中所述的GBS1-GBS689蛋白中一种或多种蛋白(参见其中的表IV)。更优选地，该组合物包含GBS80蛋白抗原。脑膜炎球菌本发明也提供包含以下组分的组合物a)CDld配体；和b)脑膜炎奈瑟球菌抗原。该组合物中所含的脑膜炎奈瑟球菌抗原可以是蛋白质抗原或外膜泡(OMV)制剂。可包含在该组合物中的OMV制剂的例子包括来自脑膜炎奈瑟球菌血清组A、B、C、W135或Y的OMV制剂。上文中也提供了可包含在该组合物中的脑膜炎奈瑟球菌的蛋白质抗原的例子。蛋白质抗原优选衍生自脑膜炎奈瑟球菌血清组B，给予患者时能引发与脑膜炎奈瑟球菌血清组B细胞发生交叉反应的免疫应答。能引发与脑膜炎奈瑟球菌血清组B细胞发生交叉反应的免疫应答的优选蛋白质抗原包括'AG287nz-953'、'936-741'和'961c'蛋白质抗原[129]。优选地，该组合物包含一种以上脑膜炎奈瑟球菌抗原。优选地，该组合物包含所有三种'AG287nz-953'、'936-741邻'961c'蛋白质抗原。其它有用的蛋白质抗原基于NMB2132、NMB1870和NMB0992。流感病毒本发明也提供包含以下组分的组合物a)CDld配体；和b)流感病毒抗原。流感病毒抗原一般由流感病毒颗粒制备，但作为另一种方式，可以在重组宿主中表达(例如在昆虫细胞系中用杆状病毒载体表达)抗原如血细胞凝集素，并以纯化形式使用[130,131]。然而，抗原通常来自病毒颗粒。抗原可以采取活病毒的形式，或者更优选地，采取灭活病毒的形式。采用灭活病毒时，该疫苗可包含完整的病毒颗粒、分裂病毒颗粒或纯化的表面抗原(包括血凝素，通常也包括神经氨酸酶)。流感抗原也可以病毒体形式出现[132]。流感病毒可被减毒。流感病毒可以是温度敏感型。流感病毒可以是冷适应性病毒。这三种可能性特别适用于活病毒。用于疫苗的流感病毒毒株随季节而变。在目前的大流行间期，疫苗一般包括两种A型流感毒株(H1N1和H3N2)和一种B型流感毒株，一般是三价疫苗。本发明也可采用大流行毒株(即疫苗接受者和普通人群没有与其发生过免疫接触的毒株)的病毒，如H2、H5、H7或H9亚型毒株(聚体是A型流感病毒)，大流行毒株的流感疫苗可以是单价疫苗，或者可以基于补充有大流行毒株的正常三价疫苗。然而，根据季节和疫苗中包含的抗原特性，本发明可保护免受一种或多种HA亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12、H13、H14、H15或H16的感染。可有用地包含在本发明组合物中的其它毒株是对抗病毒治疗有抗性(例如对奥塞米韦[133]和/或扎那米韦有抗性)的毒株，包括抗性大流行毒株[134]。本发明佐剂组合物特别可用于获得对大流行毒株的免疫。可能引起大流行爆发的流感毒株的特征是(a)与目前流通的人毒株中的血凝素相比，它含有新的血凝素，即有数十年在人群中没有发现的血凝素(如H2)，或者从未在人群中发现的血凝素(如通常只出现在鸟群体中的H5、H6或H9)，以至于人群未曾免疫接触过该毒株的血凝素；(b)它能够在人群中水平传播；和(c)它能使人致病。含有H5血凝素类型的病毒优选用于获得对大流行流感，如H5N1毒株的免疫。其它可能的毒株包括H5N3、H9N2、H2N2、H7N1和H7N7，以及任何其它可能出现的大流行毒株。本发明组合物可包含一种或多种(如1、2、3、4或更多种)流感病毒毒株，包括流感A病毒和/或流感B病毒的抗原。疫苗包含一种以上流感毒株时，一般单独培养不同毒株，收获病毒后将它们混合在一起，然后制备抗原。因此，本发明方法可包括混合一种以上流感毒株的抗原的步骤。因此，本发明方法可包括混合一种以上流感毒株的抗原的步骤。流感病毒可以是再分类毒株，并可通过逆向遗传学技术获得。逆向遗传学技术[如135-139]能够用质粒在体外制备含有所需基因组节段的流感病毒。该技术一般包括表达(a)例如，由poll启动子编码所需病毒RNA分子的DNA分子，和(b)例如，由polII启动子编码病毒蛋白的DNA分子，以便在细胞中表达两种类型的DNA，导致组装成完整的感染性病毒颗粒。DNA优选提供所有病毒RNA和蛋白质，但也可能用辅助病毒提供一些RNA和蛋白质。优选采用不同质粒产生各病毒RNA的质粒方法[140-142]，这些方法也包括使用质粒表达所有或一些(例如仅PB1、PB2、PA和NP蛋白)病毒蛋白，一些方法中至多使用12种质粒。为了降低所需的质粒数量，近期方法[143]将多个RNA聚合酶I转录盒(用于合成病毒RNA)合并到同一质粒(如编码1、2、3、4、5、6、7或所有8种流感AvRNA节段的序列)上，并且将多个蛋白编码区与RNA聚合酶II启动子合并到另一个质粒(如编码1、2、3、4、5、6、7或所有8种流感AmRNA转录物的序列)上。参考文献143方法的优选方面包括(a)PB1、PB2和PAmRNA编码区在同一质粒上；和(b)所有8个vRNA编码节段在同一质粒上。可能使用poll和polll双启动子由一个模板同时编码病毒RNA和可表达的mRNA[144,145]。因此，病毒可包含来自A/PR/8/34病毒(一般是来自A/PR/8/34的6个节段，HA和N节段来自疫苗毒株，即6:2再造毒株)的一个或多个RNA节段。也可包含来自A/WSN/33病毒，或用于产生疫苗制剂的再造病毒的任何其它毒株的一个或多个RNA节段。本发明一般保护免受能够在人之间传播的毒株的感染，因此该毒株的基因组通常包含在哺乳动物(如人)流感病毒中起源的至少一个RNA节段。可以在鸡蛋或细胞培养物上培养用作抗原来源的病毒。目前培养流感病毒的标准方法采用含胚的鸡蛋，由鸡蛋内容物(尿囊液)纯化病毒。然而，更近一段时间以来，已经在动物细胞培养物上培养病毒，出于速度和患者变态反应的原因，优选这种培养方法。细胞底物一般是哺乳动物细胞系，如MDCK;CHO;293T;BHK;Vero;MR.C-5;PER.C6;WI-38;等。用于培养流感病毒的哺乳动物细胞系优选包括衍生自MadinDarby犬肾的MDCK细胞[146-149];衍生自非洲绿猴肾(Cerco;油ea^aeAZo;w)的Vero细胞[150-152];或衍生自人胚视网膜母细胞的PER.C6细胞i;i53]。这些细胞系可由各种来源获得，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)[154]、Coriell细胞库[155]或欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)。例如，ATCC提供各种不同Vero细胞，目录号为CCL-81、CCL-81.2、CRL-1586和CRL-1587;并提供MDCK细胞，目录号为CCL-34。PER.C6可获自ECACC，保藏号为96022940。哺乳动物细胞系的一个较不优选的替代方式是，可以在禽细胞系上培养[例如参考文献156-158],包括衍生自鸭(如鸭视网膜)或鸡如鸡胚胎成纤维细胞(CEF)等的细胞系。在哺乳动物细胞系上培养病毒时，该组合物不含鸡蛋蛋白质(如卵清蛋白和卵类粘蛋白)和鸡DNA，从而降低变应原性。为了在细胞系，如MDCK细胞上生长，可以在悬浮[146]或贴壁培养的细胞上培养病毒。一种适合悬浮培养的MDCK细胞系是MDCK33016(保藏号为DSMACfc2219)。或者，可采用微载体培养。在细胞系上培养病毒时，生长培养物优选不含(即经污染检测且得到阴性污染结果)单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒3、SARS冠状病毒、腺病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、多瘤病毒、双RNA病毒、环病毒和/或细小病毒。特别优选不存在单纯疱疹病毒。在细胞系上培养病毒时，本发明组合物优选含有小于10ng(优选小于1ng，更优选小于100pg)残留的宿主细胞DNA/剂量，但可能存在痕量宿主细胞DNA。通常，需要从本发明组合物中排除长于100bp的宿主细胞DNA。现在，残留宿主细胞DNA的测定是生物制品的常规管理要求，它在技术人员的普通能力范围内。用于测定DNA的实验一般是已验证的实验[159,160]。可通过数学和可以量化的条件来描述验证实验的性能特征，并鉴定可能的误差来源。通常测试该实验的某些特征，如精确性、准确性、特异性。一旦校正(例如用已知标准量的宿主细胞DNA校正)并检测了某个实验，则可按常规进行定量DNA测定。可采用三种DNA定量的基本技术杂交方法，如Southern印迹或狭线印迹[161];免疫测定方法，如ThresholdTM系统[162];和定量PCR[163]。本领域技术人员熟悉这些方法，但各方法的准确特征，例如杂交探针的选择、引物的选择和/或用于扩增的引物等可能取决于所研究的宿主细胞。来自分子设备公司(MolecularDevices)的ThreshokFM系统是皮克水平总DNA的定量实验，己用于监测生物药品中污染DNA的水平[162]。典型实验包括生物素化ssDNA结合蛋白、脲酶偶联的抗ssDNA抗体和DNA之间以非序列特异性方式形成反应复合物。购自生产商的总DNA测定试剂盒(TotalDNAAssayKit)中包含所有实验组分。多个商业生产商均提供用以检测残留宿主细胞DNA的定量PCR实验，例如AppTec实验室服务公司(AppTecLaboratoryServices)、BioRdianceTM公司奧西科技公司(AltheaTechnologies)等。对测定人病毒疫苗的宿主细胞DNA污染的化学发光杂交实验和总DNAThresholdTM系统的比较参见参考文献164。在疫苗制备过程中可采用标准纯化方法，如层析法等去除污染的DNA。可通过核酸酶处理，例如DNA酶处理来改进对残留宿主细胞DNA的清除效果。参考文献165和166公开了一种减少宿主细胞DNA污染的方便方法，该方法包括两步处理，先使用DNA酶(如Benzonase)处理，然后使用阳离子去污剂(如CTAB)处理。优选每15吗血凝素中宿主细胞DNA含量〈10ng(如^ng、〈100pg)的疫苗，以及每0.25ml体积中宿主细胞DNA含量〈10ng(如〈lng、〈100pg)的疫苗。更优选每50吗血凝素中宿主细胞DNA含量〈10ng(如〈lng、〈100pg)的疫苗，以及每0.5ml体积中宿主细胞DNA含量<10ng(如〈1ng、〈100pg)的疫苗。优选在无血清培养基和/或无蛋白培养基中培养支持流感病毒复制的细胞系。在本发明中，如果培养基中没有人或动物来源的血清的添加剂，则称为无血清培养基。无蛋白应理解为在不含蛋白质、生长因子、其它蛋白添加剂和非血清蛋白质的情况下发生细胞增殖的培养物，但可任选包含诸如胰蛋白酶和其它蛋白酶等可能是病毒生长所必需的蛋白质。在这类培养物中培养的细胞在天然情况下本身含有蛋白质。支持流感病毒复制的细胞系优选在37。C[167](如30-36"C)培养。血细胞凝集素(HA)是灭活流感疫苗中的主要免疫原，参考一般通过单径向免疫扩散(SRID)试验测定的HA水平使疫苗标准化。疫苗一般含有约15吗HA/毒株，但(例如)儿童使用时，或者在大流行情况下，也可采用较低剂量。釆用了分数剂量如1/2(即7.5吗HA/毒株)、1/4和1/8[168、169]，以及较高剂量(如3x或9x剂量[170、171])。因此，疫苗可包含0.1-150昭HA/流感毒株，优选0.1-50ng，例如0.1-20吗、0.1-15吗、O.l-lO吗、0.1-7.5吗、0.5-5吗等。具体剂量包括例如，约15、约IO、约7.5、约5、约3.8、约1.9、约1.5吗等/毒株。因此，疫苗可包含0.1-20吗HA/流感毒株，优选0.1-15)ig，例如0.1-10吗、0.1-7.5吗、0.5-5吗等。具体剂量包括例如，约15、约10、约7.5、约5、约3.8、约1.9吗等。在本发明疫苗中存在佐剂时这些较低剂量最有用。本发明所用HA可以是天然HA，如病毒中发现的天然HA，或者可以是经修饰的HA。例如，己知修饰HA以去除能使病毒在禽类动物中具有高度致病性的决定簇(超碱性区域(hyper-basicregion)),因为这些决定簇可防止病毒在鸡蛋中生长。灭活但非完整的细胞疫苗(如分裂病毒疫苗或纯化的表面抗原疫苗)可包括基质蛋白，以获益于位于此抗原内部的其它T细胞表位。因此，包含血细胞凝集素和神经氨酸酶的非完整细胞疫苗(特别是分裂疫苗)还可包含Ml和/或M2基质蛋白。存在基质蛋白时，优选包含可检测水平的M2基质蛋白。也可存在核蛋白。药物组合物的制剂上述抗原和CDld配体特别适合包含在免疫原性组合物和疫苗中。因此，本发明方法可包括将抗原和CDld配体配制成免疫原性组合物或疫苗的步骤。本发明提供可以此方式获得的组合物或疫苗。除抗原和CDld配体外，本发明免疫原性组合物和疫苗一般包含'药学上可接受的载体'，其包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的运载体一般是代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物、海藻糖[172]、脂质聚集体(如油滴或脂质体)，和灭活的病毒颗粒。本领域技术人员熟知这类载体。疫苗也可含有稀释剂，如水、盐水、甘油等。此外，也可存在辅助剂，如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂等。药学上可接受的赋形剂的充分讨论参见参考文献173。用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫有效量的抗原，以及需要的任何其它上述组分。'免疫有效量'指以一次剂量或一系列剂量的一部分，将某剂量给予个体能有效治疗或预防。此量取决于所治疗个体的健康和身体状况、年龄、所治疗个体的分类组(如非人灵长动物、灵长动物等)、个体的免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗配方、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素。预计该量将落入可通过常规试验测定的相对较宽的范围内。该疫苗可与其它免疫调节剂联合给药。CDld配体用作本发明免疫原性组合物中的佐剂。该疫苗可包含其它佐剂。这类佐剂包括但不限于可用于本发明的佐剂包括但不限于，包含钙盐和铝盐(或其混合物)的含矿物质组合物。钙盐包括磷酸钙(如参考文献174公开的"CAP"颗粒)。铝盐包括氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等，所述盐取任何合适形式(如凝胶、晶体、无定形态等)。优选吸附于这些盐。也可将含有矿物质的组合物制成金属盐的颗粒[175]。下面开始更详细地描述铝盐佐剂。，水包油乳剂，如下文所详述。，免疫刺激性寡核苷酸，例如含有CpG基序的寡核苷酸(含有通过磷酸键连接于鸟嘌呤的未甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)、TpG基序[176]、或双链RNA、或含有回文序列的寡核苷酸、或含有聚(dG)序列的寡核苷酸。免疫刺激性寡核苷酸可包含核苷酸修饰/类似物，如硫代磷酸酯修饰，可以是双链或(除RNA外)单链。参考文献177-179公开了可能的类似取代，例如用2，-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献180-185中进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂作用。CpG序列可能导向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[186]。CpG序列可特异性诱导Thl免疫应答，例如CpG-AODN(寡脱氧核糖核苷酸)，或更特异地诱导B细胞应答，例如CpG-BODN。参考文献187-189中讨论了CpG-A和CpG-BODN。CpG优选CpG-AODN。优选构建CpG寡核苷酸时使其5'端可为受体所识别。任选将两个CpG寡核苷酸序列的3，端相连接形成"免疫聚体"。参见例如，参考文献190-192。有用的CpG佐剂是CpG7909，也称为ProMune(科雷制药集团公司(ColeyPharmaceuticalGroup,Inc.))。免疫刺激性寡核苷酸一般含有至少20个核苷酸。它们可含有少于100个核苷酸。，3-0-脱酰化单磷酰脂质A('3dMPL'，也称为'MPIJM')[193-196]。3dMPL可由明尼苏达沙门菌0^/歸加//"m/朋Moto)的无庚糖突变体制备，在化学上类似于脂质A，但缺少酸-不稳定性磷酰基和碱-不稳定性酰基。参考文献197最先描述了3dMPL的制备。3dMPL可以取酰基化不同的相关分子(如具有3、4、5或6个酰基链，它们的长度可以不同)的混合物的形式。两个葡糖胺(也称为2-脱氧-2-氨基-葡萄糖)单糖在其2-位(即2和2'位)碳上N-酰基化，3'位上也有O-酰基化。咪唑并喹啉化合物，如咪喹莫特("R-837")[198,199]、瑞喹莫德("R-848")[200]和其类似物；及其盐(如盐酸盐)。有关免疫刺激性咪唑喹啉的其它细节可参见参考文献201-205。縮氨基硫脲化合物，如参考文献206所述的化合物。参考文献206中也描述了配制、制备和筛选活性化合物的方法。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核细胞产生细胞因子如TNF-a方面特别有效。色胺酮化合物，如参考文献207所述的化合物。参考文献207中也描述了配制、制备和筛选活性化合物的方法。縮氨基硫脲在刺激人外周血单核细胞产生细胞因子如TNF-a方面特别有效。核苷类似物，如(a)埃索他宾(Isatorabine)(ANA-245;7-硫杂-8-氧代鸟苷)及其前药<formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>(b)ANA975;(c)ANA-025-l;(d)ANA380;(e)参考文献208-210所述的化合物；(f)具有下式的化合物其中式中R,和R2各自独立地是氢、卤素、-NRaRb、-OH、Cu6烷氧基、取代的CL6烷氧基、杂环基、取代的杂环基、Cw()芳基、取代的Q.k)芳基、d-6烷基或取代的Cl6焼基；R3不存在，或者是H、CM烷基、取代的Cl6焼基、Q.k)芳基、取代的(36.1()芳基、杂环基或取代的杂环基；R4和Rs各自独立地是氢、卤素、杂环基、取代的杂环基、-C(O)-Rd、d-6烷基、取代的Cl6焼基，或结合在一起形成5元环，如R4—5:X2R冬5在所示的化学键处实现结合，X,和X2各自独立地是N、C、O或S;Rs是氢、卤素、-OH、Q-6垸基、C2-6烯基、<:2.6炔基、-OH、-NRaRb、-(CH2)n-0-Rc、-0-((^.6垸基)、-S(O)pRe或-C(O)-Rd;Rg是氢、C^垸基、取代的Cl6院基、杂环基、取代的杂环基或R9a，其中R9a是:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>在^所示的化学键处实现结合，RK)禾QRu各自独立地是氢、卤素、CL6烷氧基、取代的CL6烷氧基、-NRaRb或-OH;Ra和Rb各自独立地是氢、Cu6烷基、取代的Cl6院基、-C(O)Rd、(36.10芳基；Rc各自独立地是氢、磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、C,-6烷基或取代的Rd各自独立地是氢、卤素、Cl6院基、取代的Cl6院基、CL6烷氧基、取代的C,-6烷氧基、-NH2、-NH(C"垸基)、-NH(取代的C!-6垸基)、-N(C"垸基)2、-^取代的(31.6烷基)2、C6-k)芳基或杂环基；&各自独立地是氢、C,-6垸基、取代的Cl6院基、(:6.1()芳基、取代的<:6.10芳基、杂环基或取代的杂环基；Rf各自独立地是氢、&.6垸基、取代的Cl6院基、-C(O)Rd、磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯基；n各自独立地是O、1、2或3;p各自独立地是O、l或2;或者(g)(a)-(f)中任一项的药学上可接受的盐，(a)-(f)中任一项的互变异构体，或互变异构体的药学上可接受的盐。'Loxoribine(7-烯丙基-8-氧代鸟苷)[211]。*参考文献212所述化合物，包括酰基哌嗪化合物、吲哚二酮化合物、四氢异喹啉(THIQ)化合物、苯并环二酮化合物、氨基氮杂乙烯基化合物、氨基苯并咪唑喹啉酮(ABIQ)化合物[213,214]、水合酞酰胺(hydrapthalamide)化合物、苯并苯基酮化合物、异》i唑化合物、固醇化合物、喹唑啉酮(quinazilinone)化合物、吡咯化合物[215]、蒽醌化合物、喹喔啉化合物、三嗪化合物、吡唑嘧啶化合物和(J引哚化合物[216]。参考文献217所述的化合物，包括3,4-二(lH-吲哚-3-基)-lH-吡咯-2，5-二酮，星孢素类似物、衍生的哒嗪、色原-4-酮、吲哚满酮、喹唑啉和核苷类似物。*氨垸基氨基葡糖苷磷酸衍生物，如RC529[218,219]。*磷腈，如参考文献220和221中所述的聚[二(羧基苯氧基)磷月青](poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene]，"PCPP"。"J、分子免疫增强剂(SMIP)，例如N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-2，4-二胺；N2,N2-二甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-乙基-N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N2-丙基-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；l-(2-甲基丙基)-N2-丙基-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-2，4-二胺；^2-丁基-1-(2-甲基丙基)-旧-咪唑[4，5《]喹啉-2,4-二胺；N2-丁基-N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-甲基-1-(2-甲基丙基)^2-戊基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N2-丙-2-烯基-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；.l-(2-甲基丙基)-2-[(苯基甲基)硫]-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺；1-(2-甲基丙基)-2-(丙硫基)-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-4-胺；2-[[4-氨基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙醇；'2-[[4-氨基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙酸乙酯；'4-氨基-l-(2-甲基丙基)-l，3-二氢-2H-咪唑[4,5-c]喹啉-2-酮；'N2-丁基-l-(2-甲基丙基)-N4,N4-双(苯基甲基)-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-2，4-二胺；N2-丁基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-lH-咪唑[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N4,N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2,N2-二甲基-l-(2-甲基丙基)-N4,N4-双(苯基甲基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉隱2,4-二胺；l-(4-氨基-2-[甲基(丙基)氨基]-lH-咪唑[4，5-c]喹啉-l-基卜2-甲基丙-2-醇；l-[4-氨基-2-(丙基氨基)-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-l-基]-2-甲基丙-2-醇；N4,N4-二苄基-l-(2-甲氧基-2-甲基丙基)-N2-丙基-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-2,4-二胺。皂苷[参考文献249的第22章]是在许多种类植物的树皮、叶、茎干、根甚至花中发现的甾醇糖苷和三萜糖苷的异质群体。己广泛研究了作为佐剂的来自皂树(gw'〃a/arapo"an'a)Molina树皮的皂苷。皂苷也可购自丽花菝葜CSVm7axomato)(墨西哥菝葜)、满天星(G^/wop/n7/a;am'CM/ato)(婚纱花)和肥皂草(&^0朋〃》0#"'朋^^)(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂如QS21以及脂质制剂如ISCOM。QS21以商标Stimulon出售。已采用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已鉴定了用这些技术纯化的特定组分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。制备QS21的方法参见参考文献222。皂苷制剂也可包含甾醇，如胆固醇[223]。皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参考文献249的第23章]。ISCOM通常也含有磷脂如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。ISCOM中可采用任何己知的皂苷。ISCOM优选包含QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。参考文献223-225中进一步描述了ISCOM。任选地，ISCOM可不含其它去污剂[226]。开发基于皂苷的佐剂的综述可参见参考文献227和228。*细菌ADP-核糖基化毒素(如大肠杆菌(E.co/0不耐热肠毒素"LT"、霍乱毒素"CT"或百日咳毒素"PT")及其脱毒衍生物，如称为LT-K63和LT-R72的突变毒素[229]。参考文献230中描述了将脱毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐剂，参考文献231中描述了将其用作胃肠道外佐剂。生物粘附剂和粘膜粘附剂，如酯化透明质酸微球[232]或壳聚糖及其衍生物[233]。，由可生物降解和无毒材料(例如聚(a-羟酸)、聚羟基丁酸、聚正酯、聚酐、聚己酸内酯等)，优选丙交酯-乙交酯共聚物形成的微粒(即直径约lOOnm-150pm，更优选约200nm-30pm，最优选约500nm-10nm的颗粒)，任选处理以具有带负电表面(如用SDS处理)或带正电表面(例如用阳离子去污剂如CTAB处理)。脂质体(参考文献249第13和14章)。适合用作佐剂的脂质体制剂的例子见参考文献234-236所述。，聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂[237]。这种制剂还包括聚氧乙烯山梨聚糖酯表面活性剂和辛苯糖醇[238]以及聚氧乙烯垸基醚或酯表面活性剂和至少一种其它非离子表面活性剂如辛苯糖醇[239]的混合物。优选的聚氧乙烯醚选自.-聚氧乙烯-9-月桂醚(laureth9)、聚氧乙烯-9-固醇醚(steorylether)、聚氧乙烯-8-固醇醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。*胞壁酰肽，例如N-乙酰胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(去甲MDP)、N-乙酰葡萄糖胺酰-N-乙酰胞壁酰-L-A1-D-异谷氨酰-L-Ala-二棕榈酰丙酰胺("DTP-DPP"或"TheramideTM")和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。*由第一种革兰阴性菌制备的外膜蛋白蛋白质体制剂与衍生自第二种革兰阴性菌脂多糖(LPS)制剂的组合，其中外膜蛋白蛋白质体和LPS制剂形成稳定的非共价连接佐剂复合物。这类复合物包括"IVX-908"，它是由脑膜炎奈瑟球菌外膜和LPS组成的复合物。*甲基肌苷5'-单磷酸酯("MIMP")[240]。，多聚羟化吡咯双烷类化合物[241]，如下式化合物式中，R选自氢，直链或支链、未取代或取代、饱和或不饱和的酰基、垸基(如环垸基)、烯基、炔基和芳基，或其药学上可接受的盐或衍生物。例子包括但不限于木麻黄(casuarine)、木麻黄-6-D-吡喃葡萄糖、3-表-木麻黄、7-表-木麻黄、3,7-二表-木麻黄等。7菊糖[242]或其衍生物，如algammulin。式I、II或III的化合物或其盐iniii如参考文献243所述，如'ER803058'、'ER803732'、'ER804053'、'ER804058'、'ER804059'、'ER804442'、'ER804680'、'ER804764'、'ER803022'或'ER804057'，如與OH<formula>formulaseeoriginaldocumentpage32</formula>大肠杆菌C&cAen'cA/aco/Z)如OM174的脂质A的衍生物(如参考文献244和245所述)。,离子脂质与(通常为中性)共脂质(co-lipid)，如氨基丙基-二甲基-肉豆蔻烯酰氧基-溴化丙铵-二植酰基磷脂酰-乙醇胺("VaxfectinTM")或氨基丙基-二甲基-双十二烷基氧基-溴化丙铵-二油酰基磷脂酰-乙醇胺("GAP-DLRIE:DOPE")的制剂。优选含有-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-双(顺-9-四癸烯氧基)-l-丙铵盐的制剂[246]。含有连接于含磷酸无环主链的脂质的化合物，如TLR4拮抗剂E5564[247,248]:参考文献249和250中更详细地讨论了这些和其它佐剂活性物质。医学方法和应用一旦配制好后，本发明组合物可直接给予对象。治疗对象可以是动物；具体说，可治疗人类对象。该疫苗特别可用于接种儿童和青少年。已证明疫苗在目(311-/-动物模型中有效，因此认为它们可用于治疗免疫削弱的对象。可通过全身和/或粘膜途径给予它们。一般地，将该免疫原性组合物制备成溶液或悬液形式的注射剂；适合在注射前用液体载体溶解或悬浮的固体形式。也可乳化该制剂或将其包装到脂质体中以提高佐剂作用。通常通过胃肠道外(如注射，皮下、腹膜内、静脉内或肌肉内，或者递送至组织间隙)直接递送该组合物。也可将该组合物给予病灶。其它给药方式包括口服给药和肺给药、栓剂和透皮或经皮施用(参见例如参考文献251)，针注射和无针注射。给药治疗可以是单剂量方案或多剂量方案(如包括加强剂量)。本发明疫苗优选为无菌疫苗。它们优选无热原。优选用缓冲液使(例如)pH6-pH8，通常约为pH7。本发明疫苗可包含低水平(如O.01。/。)去污剂(如吐温，如吐温80)。本发明疫苗可含有(如)约15mg/ml的糖醇(如甘露醇)或海藻糖，尤其是冻干时。可凭经验评估各抗原的最佳剂量。然而通常，本发明抗原的给药剂量为每剂量各种抗原0.1-100pg，典型剂量体积为0.5ml。剂量一般为每剂每种抗原5-20吗。给予患者以诱导免疫应答的CDld配体量取决于给予该组合物的患者的年龄和体重，但一般含有1-100吗/kg患者体重。令人惊讶的是，已发现低剂量CDld配体足以提高对共同给予抗原的免疫应答，并提高对该抗原的长期免疫记忆。因此，本发明组合物中CDld配体的含量可小于50pg/kg患者体重、小于20pg/kg、小于10pg/kg、小于5pg/kg、小于4吗/kg或小于3pg/kg。本发明疫苗可以是预防性(即预防感染)或治疗性(即在感染后治疗疾病)疫苗，但一般是预防性疫苗。本发明提供医用的CDld配体和B型链球菌抗原。本发明提供医用的CDld配体和脑膜炎奈瑟球菌血清组B抗原。本发明提供医用CDld配体和流感病毒抗原，所述抗原选自能够或可能引起大流行爆发的流感毒株。本发明也提供了诱导患者产生免疫应答的方法，所述方法包括给予患者本发明疫苗。具体说，本发明提供在患者中产生免疫应答的方法，所述方法包括给予患者CDld配体和B型链球菌抗原。本发明提供在患者中产生免疫应答的方法，所述方法包括给予患者CDld配体和脑膜炎奈瑟球菌血清组B抗原。本发明提供在患者中产生免疫应答的方法，所述方法包括给予CDld配体和流感病毒抗原，所述流感病毒抗原选自能够或可能引起大流行爆发的流感毒株。所述抗原和CDld配体可以同时、依次或单独给予。例如，可以在给予该抗原之前或之后给予CDld配体以初免该哺乳动物，以提高该哺乳动物对该偶联物的免疫应答。给予一种以上抗原时，可同时将该抗原与相对该抗原混合物单独、同时或依次给予的CDld配体一起给予。产生免疫应答的方法可包括给予第一剂量的抗原和CDld配体，随后给予任选的第二无佐剂剂量的抗原。第一剂量的抗原和CDld配体可同时、依次或单独给予。免疫应答优选为保护性免疫应答，可包括体液免疫应答和/或细胞免疫应答。该患者可以是成年人或儿童。该患者的年龄可以是0-6个月、6-12个月、1-5岁、5-15岁、15-55岁或55岁以上。该患者优选为儿童。该患者可以是免疫削弱的患者。该患者可患有与免疫系统功能缺失有关的疾病，具体是与CD4T细胞应答功能缺失有关的疾病。这类疾病的例子包括但不限于AIDS、共济失调毛细血管扩张、迪格奥尔格综合征、全丙种球蛋白过少血症、威-奥二氏综合征和补体缺陷。本发明提供B型链球菌抗原在制备产生患者免疫应答的药物中的应用，该药物与CDld配体一起给药。本发明提供CDld配体原在制备产生患者免疫应答的药物中的应用，该药物与B型链球菌抗原一起给药。本发明提供B型链球菌抗原和CDld配体在制备产生患者免疫应答的药物中的应用。本发明也提供B型链球菌抗原在制备产生患者免疫应答的药物中的应用，其中用CDld配体预先治疗过该患者。本发明提供CDld配体在制备产生患者免疫应答的药物中的应用，其中用B型链球菌抗原预先治疗过该患者。本发明提供B型链球菌抗原在制备产生患者免疫应答的药物中的应用，其中用B型链球菌抗原和CDld配体预先治疗过所述患者。本发明也提供脑膜炎球菌血清组B抗原在制备产生患者免疫应答的药物中的应用，该药物与CDld配体一起给药。本发明也提供CDld配体在制备产生患者免疫应答的药物中的应用，该药物与脑膜炎球菌血清组B抗原一起给药。本发明也提供B型链球菌抗原和CDld配体在制备产生患者免疫应答的药物中的应用。本发明也提供脑膜炎球菌血清组B抗原在制备产生患者免疫应答的药物中的应用，其中用CDld配体预先治疗过该患者。本发明还提供CDld配体在制备产生患者免疫应答的药物中的应用，其中用脑膜炎球菌血清组B抗原预先治疗过该患者。本发明也提供脑膜炎球菌血清组B抗原在制备产生患者免疫应答的药物中的应用，其中用脑膜炎球菌血清组B抗原和CDld配体预先治疗过所述患者。本发明也提供流感病毒抗原(如上所述)在制备产生患者免疫应答的药物中的应用，该药物与CDld配体一起给药。本发明也提供CDld配体在制备产生患者免疫应答的药物中的应用，该药物与流感病毒抗原(如上所述)一起给药。本发明也提供流感病毒抗原(如上所述)和CDld配体在制备产生患者免疫应答的药物中的应用。本发明也提供流感病毒抗原(如上所述)在制备产生患者免疫应答的药物中的应用，其中用CDld配体预先治疗过该患者。本发明也提供CDld配体在制备产生患者免疫应答的药物中的应用，其中用流感病毒抗原(如上所述)预先治疗过该患者。本发明提供流感病毒抗原(如上所述)在制备产生患者免疫应答的药物中的应用，其中用流感病毒抗原(如上所述)和CDld配体预先治疗过所述患者。所述药物优选为免疫原性组合物(如疫苗)。该药物优选用于预防和/或治疗B型链球菌、脑膜炎奈瑟球菌(如脑膜炎、败血症等)或流感病毒引起的疾病。可用标准动物模型检测这些疫苗(例如参见参考文献252)。本发明还提供了一种药盒，其装有B型链球菌抗原和CDld配体。本发明还提供装有脑膜炎奈瑟球菌血清组B抗原和CDld配体的药盒。本发明还提供装有流感病毒抗原和CDld配体的药盒。优选以药盒单独组分的形式提供抗原和配体，以使其适应单独给予(例如)不同的肢体。定义术语"含有"包括"包含"以及"由…组成"，例如"含有"X的组合物可仅由X组成或可包含其它物质，例如X+Y。与数值x相关的术语"约"表示，例如x士l(Fo。术语"基本上"不排除"完全"，如"基本上不含"Y的组合物可能完全不含Y。必要时，可从本发明定义中删去术语"基本上"。附图简要说明图l显示Ig效价图。A)用a-GC和细菌(破伤风类毒素TT或白喉类毒素DT)或病毒蛋白质(流感毒株A的血凝素-神经氨酸酶亚基H3N2)肌肉内免疫的C57/BL6小鼠中蛋白质特异性抗体的血清效价。用蛋白质和a-GC(实心框)免疫的小鼠中抗体效价高于只用蛋白质免疫的小鼠(空心框)。X轴表示以天计算的时间。B)甩H3N2和a-GC(实心框)免疫的携带iNKT细胞(Jal8+/+)的小鼠的H3N2-特异性抗体血清效价高于只用H3N2免疫的携带iNKT细胞的小鼠。用H3N2和a-GC(实心框)免疫的缺乏iNKT细胞(Jal8-/-)的小鼠的H3N2-特异性抗体血清效价并未高于只用H3N2免疫的缺乏iNKT细胞的小鼠。所有免疫均为皮下免疫。图2显示平均IgG效价图。A)在产生IgGl和IgG2a抗体方面，与CFA、CpG、MF59和Alum相比oc-GC同样强效。抗原是TT。B)用H3N2皮下免疫的固。11-/-小鼠产生可检测的抗体(^0)效价，而只用H3N2或者以明砜为佐剂的H3N2皮下免疫MHC-IW-小鼠时则不产生可检测的抗体(IgG)效价。图3:a-GC和MF59在流感病毒感染的小鼠模型中的比较。所有免疫均为肌肉内免疫。A)HlNl-特异性IgG效价(几何平均值)。用H1N1和a-GC免疫的小鼠的抗体效价与用H1N1和MF59免疫的小鼠相当，并且明显高于只用蛋白质疫苗免疫的小鼠的效价。B)存活百分数与刺激后天数。用流感病毒刺激后，80%用H1N1和a-GC免疫的小鼠和100%用H1N1和MF59免疫的小鼠存活。图4显示H3N2Ig效价(几何平均值)。白色框是无佐剂，阴影框为a-GC佐剂A)WT、IL-4-A和IFN-yR-A小鼠对用H3N2和a-GC皮下免疫(存在时用黑色表示)或单用H3N2皮下免疫(存在时用白色表示)的IgGl和IgG2a应答。单用H3N2免疫野生型小鼠能诱导IgGl应答(Th2)，而用H3N2和a-GC免疫能诱导IgGl和lgG2a应答(ThO)。单用H3N2免疫IL4-A小鼠不会诱导IgG应答，而用H3N2和a-GC免疫能诱导IgGl和IgG2a应答(ThO)。单用H3N2免疫IFN-YRV-小鼠能诱导IgGl应答(Th2)，用H3N2和a-GC免疫诱导的IgGl应答(Th2)明显较高。虚线显示测试血清的最低稀释度。B)用H3N2和a-GC皮下免疫之前或期间用抗CD40L单克隆抗体治疗的小鼠显示的H3N2抗体效价明显低于用对照IgG治疗小鼠的观察值。图5:A)单用H3N2或用H3N2和a-GC在第0周和第2周初免小鼠。初次免疫30周后，单用H3N2蛋白加强免疫这两组小鼠。该图显示H3N2-Ig效价(几何平均数)与时间(周)。箭头显示免疫时间。用两个剂量的H3N2和a-GC初免，随后单用蛋白质加强免疫的小鼠(实心框)的抗体效价显著高于单用H3N2初免和加强免疫的小鼠(空心框)。免疫是皮下免疫。B)按照图5A初免的小鼠中H3N2-抗体分泌细胞前体的频率(H3N2-IgGASC前体/一百万个B细胞)。第30周时，用H3N2和a-GC免疫两次的小鼠(阴影)中H3N2-抗体分泌细胞前体的频率明显高于单用H3N2免疫两次的小鼠(白色)。图6:H3N2-Ig效价(几何平均值)与时间(周)。单用H3N2皮下免疫两次的缺乏iNKT细胞的小鼠(Jaa18-/-)和携带iNKT细胞的小鼠(Jaa18+/+)中H3N2-特异性抗体的降解(decay)。与携带iNKT细胞的小鼠(圆形)相比，缺乏iNKT细胞的小鼠(三角形)中抗原-特异性抗体降解得较快。图7显示用破伤风类毒素+A佐剂最后一次(共两次)免疫6周后C57BL/6小鼠的ASC前体(即记忆B细胞)频率，表示为每一百万个B细胞中的数量。在第0天和第14天用不含佐剂、a-GC或明矾的破伤风类毒素肌肉内免疫C57BL/6小鼠。用破伤风类毒素和a-GC免疫的小鼠的TT-特异性记忆B细胞频率明显高于单用破伤风类毒素免疫的小鼠，用明矾为佐剂的破伤风类毒素免疫的小鼠则不。4表明相对于无抗原给药p0.05，"表明p〈0.01。***表明相对于TTw/o佐剂p〈0.05。图8:用于评价初免所用的所有疫苗剂量中是否需要存在a-GC的免疫方案。将20只6-8周龄C57BL/6雌性小鼠分成4组，每组5只小鼠。在第0周用PBS配制的H3N2免疫第1组，用H3N2+a-GC在2周后免疫。在第0周用H3N2+a-GC免疫第2组，用PBS配制的H3N2在2周后免疫。用PBS配制的H3N2在第0周和第2周免疫第3组。用H3N2和a-GC在第0周和2周后免疫第4组)。初次免疫后56周，用PBS配制的3吗H3N2刺激所有组的小鼠，在第58周评估回忆应答。所有免疫均为肌肉内免疫。图9:将图8第3组的小鼠的H3N2-抗体应答(用PBS配制的H3N2免疫两次)与以下应答作比较A)图8第4组小鼠的应答(用a-GC配制的H3N2免疫两次)；B)图8第1组小鼠的应答(用PBS配制的H3N2免疫，然后用a-GC配制的H3N2免疫)；和C)图8第2组小鼠的应答(a-GC配制的H3N2和用PBS配制的H3N2免疫)。抗体半衰期没有差异。图10:比较H3N2-抗体应答观察到A)用a-GC免疫两次(第4组)与a-GC仅用于第二次免疫(第1组)；B)用a-GC免疫两次(第4组)与a-GC仅用于第一次免疫(第2组)的小鼠；和C)a-GC仅用于第一次免疫(第2组)与a-GC仅用于第二次免疫(第1组)。图ll:如图8所述免疫小鼠的回忆应答。单用H3N2加强免疫2周后(第56周时给予)，用一个或两个剂量的a-GC初免的小鼠的回忆应答高于单用两个剂量的H3N2初免的小鼠。数据是第56和58周的H3N2Ig效价(几何平均值)。图12:测定如图13所述免疫小鼠的脾脏中MenB-特异性记忆B细胞的频率。与明矶相比，用a-GC或MF59免疫小鼠的脾脏中MenB特异性记忆B细胞的频率较高。该图显示每一百万B淋巴细胞中的MenB-特异性IgG记忆B细胞。*和**:相对于无佐剂时p0.05和pO.Ol。图13:用与0.1叱a-GC、0.6mg明矾、100piMF59混合或无佐剂的3种MenB抗原AG287nz-953、936-741和961c(各自为20吗/剂量、5吗/剂量或2.5吗/剂量)的混合物免疫小鼠。在第0天、第21天和第35天给予一系列三次免疫，每次免疫后评估各抗原的IgG效价，一直到第105天。a-GC和MF59诱导的杀菌抗体效价均高于明矾。图14:将第0天和第21天肌肉内免疫的小鼠对重组MenB抗原的CD4T细胞应答与下述应答作比较a)含有3种MenB抗原和a-GC的组合疫苗；b)含有3种MenB抗原和明矾的组合疫苗；或c)只含有3种MenB抗原的组合疫苗。第二次免疫两周后，通过将总脾细胞与所示量的MenB重组蛋白培育16小时(最后14小时在布雷菲德菌素A存在下)评价CD4T细胞应答。通过胞内染色和FACS分析产生TNFa的CD4T细胞数量。与含有明矾或无佐剂的MenB抗原组合免疫的小鼠相比，用三种MenB抗原和a-GC的组合免疫的小鼠一致地显示出较高的CD4应答。作为阳性对照，检测了所有三组小鼠对多克隆刺激的应答。所有三组小鼠对抗-CD3抗体(IaCD3)多克隆刺激的应答相同，如该图的插图所示。Y轴显示产生TNFa的CD4T细胞占所有CD4+T细胞的百分数。图15:效价(几何平均数)。比较用GBS抗原免疫的小鼠的IgG、IgGl和IgG2a效价。用1吗GBS80和a-GC免疫的小鼠的IgGl和IgG2a效价明显高于只用1吗GBS80免疫的小鼠，而用明矾配制的GBS80免疫的小鼠则不。用20吗GBS80和a-GC免疫的小鼠的IgGl效价与用20吗GBS80和明矾免疫的小鼠相同，而lgG2a效价较高。*，**相对于GBS80w/o佐剂p0.05，pO.Ol。图16:在第0天和第21天联合使用三种MenB抗原(DG287nz-953、936-741或961c)之一或所有三种抗原的混合物与下述物质免疫小鼠a)a-GC;b)明矾；或c)无佐剂。在第二次免疫两周后和第三次免疫两周后评估对MenB菌株MC58、2996、H44/76和NZ98/254的杀菌抗体的水平。与明砜相比，组合疫苗与佐剂ot-GC—起给药时杀菌抗体明显较高。所有免疫均为肌肉内免疫。图17:用GBS80免疫的母鼠脾脏中记忆B细胞的频率。用GBS80和a-GC免疫的母鼠脾脏中产生GBS80-特异性抗体的浆细胞频率明显高于只用GBS80或用GBS80和明矾免疫的母鼠脾脏。该图显示每一百万B淋巴细胞中GBS80IgG浆细胞的数量。图18:比较用GBS80和a-GC免疫的母鼠和用GBS80和明砜免疫的母鼠中的浆细胞频率。用GBS80和a-GC免疫的母鼠中浆细胞频率明显较高。该图显示每一百万B淋巴细胞中GBS80IgG浆细胞的数量。图19:单用3种MenB抗原AG287nz-953、936-741和961c(各20昭/剂量)的混合物，用上述混合物和O.lpga-GC，或者用上述混合物和0.6mg明矾免疫小鼠。在第O天、第21天和第35天给予一系列三次免疫，每次免疫后评估各抗原的IgG效价。在提高对组合疫苗中所有三种MenB抗原的抗体应答方面，a-GC和明矾同样有效。所有免疫均为肌肉内免疫。实施本发明的方式有关实施本发明的方式的其它信息可参见参考文献253。实施例i:求变,Mrr欲應祭励产主沐/^疾^性贫体应芬，并麥励遂存丑潘應记忆概述CDld-限制性非变异自然杀伤T(iNKT)细胞是识别糖脂抗原如a-半乳糖基神经酰胺(cx-GC)的先天性淋巴细胞。为了研究先天免疫系统对体内适应性免疫应答的作用，我们评价iNKT细胞能否影响抗体应答的重要特征，例如保护免受感染和B细胞记忆。我们用细菌或病毒蛋白与a-GC的组合免疫小鼠，发现用蛋白质和a-GC免疫的小鼠的抗体效价比单用蛋白质诱导的效价高一至两个对数，最重要的是，它们防止感染如流感的保护力更高。用蛋白质和常规佐剂刺激时，缺少MHCII类分子的小鼠不产生抗体，然而，用蛋白质和a-GC免疫这些小鼠时能引发可检测的蛋白质特异性IgG，表明iNKT细胞可通过II类限制性CD4+T细胞部分替代对B细胞的辅助。最后，我们发现用蛋白质和a-GC免疫的小鼠产生的蛋白质特异性记忆B细胞的频率高于单用蛋白质免疫的小鼠的频率。而且，缺少iNKT细胞的小鼠的循环抗体效价降低得比野生型小鼠快，这表明iNKT细胞对奖细胞寿命产生了出于预料的影响。总之，这些发现指出iNKT细胞在体内调节抗体应答和B细胞记忆维持中的重要作用。结果iNKT细胞的激活提高体内对蛋白质抗原的抗体应答。近年来，我们证明人iNKT细胞可帮助B淋巴细胞在体外增殖和产生免疫球蛋白。为了测定此发现的体内相关性，我们用含有或不含NKT特异性糖脂a-GC的细菌(破伤风类毒素TT或白喉类毒素DT)或病毒蛋白质(流感毒株A的血凝素-神经氨酸酶亚基H3N2)免疫C57/BL6小鼠，并评价不同时间点上蛋白质特异性抗体的血清效价。图1A显示使用所有抗原时，用蛋白质和a-GC免疫的小鼠(实心框)的抗体效价比单用蛋白质免疫的小鼠(空心框)高一至两个对数。在BALB/c、CDl和C3H/HeJ小鼠中获得相似结果(数据未显示)。为了证明a-GC佐剂活性是由于激活iNKT细胞而产生，我们用含有或不含a-GC的Flu蛋白H3N2免疫携带(Jal8+/+和Jal8+A)或缺少(Jal8-/-)iNKT细胞的小鼠。用含有或不含a-GC的Flu蛋白H3N2如图1B所示，无论是否存在iNKT细胞，单用H3N2免疫的所有小鼠(空心框)产生的抗体应答相当。然而，图1B显示用H3N2和a-GC免疫时(实心框)，携带iNKT细胞的小鼠的H3N2-特异性抗体血清效价明显提高，而缺乏iNKT的小鼠则未见明显提高。以下发现(数据未显示)进一步证明这些结果在缺少CDld的小鼠(CDW-)中a-GC不显示佐剂活性，CDld是将a-GC递呈给iNKT细胞T细胞受体的限制元件。为了比较a-GC活性与更常用佐剂的活性，用单独给予的递增剂量的TT，以及包含a-GC或最优剂量的以下佐剂之一的抗原免疫小鼠CFA(用于小鼠的最强佐剂之一[254])，CpG(目前进行人类试验的强效Th0/Thl免疫刺激剂[255])，MF59和明矾(批准用于人类的两种佐剂[256，257]，被认为是ThO/Th2诱导物)。如图2A所示，在帮助产生IgGl和IgG2a抗体方面，a-GC总体效力与上述基准佐剂相当。最后，我们评价了对蛋白质抗原的抗体应答是否伴随iNKT淋巴细胞的帮助而不需要常规CD4+T细胞的帮助，这种情况是常规佐剂无法提供帮助的情况。因此，用单独的H3N2或含有a-GC或明矾的H3N2免疫两组缺少MHCn类分子的C57BL/6小鼠(MHC-II-/-)两次。不出所料，单用H3N2或以明矾为佐剂的H3N2免疫的目。11-/-小鼠不产生任何抗原特异性抗体(图2B)。相反，用H3N2和a-GC免疫的^[11(:-11-/-小鼠产生可检测的抗体(1§0)效价。总之，这些结果证明在体内通过a-GC激活的iNKT细胞能通过与常规佐剂相当的方式加强对蛋白质抗原的抗体应答。与这些佐剂不同的是，a-GC不需要MHC-II类分子限制性CD4T淋巴细胞来产生抗体应答。iNKT细胞帮助免疫证明a-GC能提高对病原体蛋白的抗体应答后，我们开始研究应答的质量和这些抗体能否提供感染的保护。为此，我们比较了小鼠流感病毒感染模型中a-GC与MF59(批准用于人的流感疫苗佐剂)的佐剂作用。在第0天和第15天单用H1N1蛋白(来自甲型人流感病毒/新喀里多尼亚/20/99)、用含有a-GC或MF59的H1N1蛋白免疫成年C57BL/6小鼠。最后一次免疫两周后，用90%致死剂量(LD)的小鼠-适应性A/WS/33流感病毒刺激小鼠，在接下来两周研究其存活情况。如图3A所示，刺激前一天，用H1N1和a-GC免疫的小鼠的抗体效价与用H1N1和MF59免疫的小鼠相当，并明显高于单用该蛋白免疫的小鼠的效价。而且，图3B显示刺激两周后，80%用H1N1和a-GC免疫的小鼠和100%用该蛋白和MF59免疫的小鼠存活，而在后续研究结束时，只有10%用单以该蛋白为基础的疫苗免疫的小鼠仍存活。总之，我们从这些结果可以得出结论，a-GC-依赖性iNKT细胞激活可提高疫苗对抗感染性疾病的功效。iNKT细胞帮助B细胞的机制下一步，我们检测了体内驱动iNKT细胞帮助B细胞的机制。首先，为了研究细胞因子的作用，我们评价a-GC在C57BL/6小鼠和缺少细胞因子IL4或IFN-Y受体(IFN-YR)的同类系小鼠中的佐剂作用。图4A(左图)显示，在野生型小鼠中，单用flu蛋白H3N2免疫(如白色所示)能诱导Th2应答(存在IgGl而不存在IgG2a)，而用该蛋白和a-GC免疫能引发平衡的ThO应答(同时存在IgGl和IgG2a)(如黑色所示)。图4A的中图显示单用蛋白质免疫时缺少IL-4的小鼠没有发生任何抗体应答，而用该蛋白和a-GC免疫时它们产生平衡的Th0应答(如黑色所示)。最后，单用该蛋白免疫时缺少IFN-y受体的小鼠(图4A，右图)显示出Th2应答(IgGl抗体)(如白色所示)。虽然用蛋白质和a-GC免疫的小鼠中IgGl效价明显提高(如黑色所示)，但IgG2a抗体水平没有提高至背景水平以上。总之，这些发现证明，就a-GC依赖性iNKT细胞辅助B淋巴细胞而言，单独IL-4不是必需的，而IFN-y是iNKT细胞的平衡(ThO)辅助效应所必需的。其次，我们想研究a-GC依赖性iNKT细胞的体内辅助作用是否需要CD40/CD40L相互作用.。因此，我们评价了用饱和量的中和性抗CD40LmAb处理的小鼠对H3N2的抗体应答。如图4B所示，用H3N2和a-GC免疫后，用抗CD40LmAb处理的小鼠的H3N2抗体效价明显低于用对照IgG处理的小鼠。a-GC能提高回忆抗体应答并帮助维持B细胞记忆。适应性免疫系统的关键特征是对之前接触的抗原较快产生"回忆"应答的能力。为了评价a-GC的佐剂作用是否影响回忆抗体应答，在第0周和第2周单用H3N2或用含a-GC的H3N2免疫小鼠两次。然后，在第30周单用H3N2第三次(回忆)免疫所有小鼠。图5A显示，与图l所示数据相一致，前两次给药后，用H3N2和a-GC免疫的小鼠的抗体效价明显高于单独接受H3N2的小鼠。两组中H3N2-特异性抗体随时间下降，约在第30周时达到背景水平，此时单用H3N2对所有小鼠进行第三次加强免疫。两周后，我们评价抗体应答并发现，前两次免疫时给予蛋白质和a-GC的小鼠在第三次免疫后的抗体效价明显高于所有三次免疫均单用蛋白质免疫的小鼠(图5A)。与这些结果相一致，在平行实验中我们发现，在第30周(恰好在第三次免疫前)在H3N2和a-GC免疫两次的小鼠脾脏中检测到的H3N2-抗体分泌细胞(ASC)前体频率明显高于单用H3N2免疫两次的小鼠脾脏的频率(图5B)。为了进一步研究iNKT细胞在调节B细胞记忆中的作用，我们评价单用蛋白质(H3N2)诱导的抗原特异性抗体在携带(Jal8+/+和Jal8+Z-)或缺乏(Jal8-/-)iNKT细胞的小鼠血清中的持续性。在所有小鼠组中，在第二次免疫两周后，抗原特异性抗体效价达到峰值，其水平相当。然而，图6显示，虽然在携带iNKT细胞的小鼠中抗原特异性抗体以相似的缓慢速率下降，但在缺乏iNKT细胞的小鼠中抗体效价下降得明显较快。由于这些小鼠均未接受a-GC，我们认为一定水平的iNKT"自发"活性可影响循环抗体的半衰期。总之，这些发现证明iNKT细胞激活导致回忆免疫的抗体应答较高，这是由于抗原特异性记忆B细胞库增加。而且，iNKT体内自发活性似乎在维持循环抗体水平中起到稳态作用。实施例2:在不进行加强免疫时用a-GalCer初免显著提高抗体应答如上所述，在第30周(恰好在第三次免疫前)在H3N2和a-GC免疫两次的小鼠脾脏中检测到的H3N2-抗体分泌细胞(ASC)前体(即记忆B细胞)频率明显高于单用H3N2免疫两次的小鼠脾脏的频率(图5B)。在破伤风类毒素免疫的小鼠中进行的实验获得相似结果(图7和18)。图7显示用不含佐剂、含a-GC佐剂或含明矾佐剂的破伤风类毒素在第0天和第14天进行两次免疫，最后一次免疫6周后，C57BL/6小鼠的ASC前体频率。与使用明矾佐剂相比，a-GC用作佐剂能显著提高ASC前体的频率。同样，图18显示与用GBS80和明矾免疫相比，用GBS80和a-GC免疫两次，最后一次免疫3个月后，CD1小鼠的ASC前体频率明显较高。作为佐剂在两次免疫中给予时，与明矾相比a-GC显著提高记忆B细胞频率的能力表明，用作单次免疫中的佐剂时a-GC可能诱导特异性记忆B细胞增多。因此，进行实验来评价单次给予a-GC和H3N2抗原对特异性B细胞记忆库的影响(图8-11)。图8显示了用于该实验的免疫方案。将20只68周龄C57BL/6雌性小鼠分成4组，每组5只小鼠。在第0周用PBS配制的H3N2免疫第1组，用H3N2+01-0<3在2周后免疫。在第0周用H3N2+a-GC免疫第2组，用PBS配制的H3N2在2周后免疫。用PBS配制的H3N2在第0周和第2周免疫第3组。用H3N2和a-GC在第0周和2周后免疫第4组。初次免疫56周后，用PBS配制的3吗H3N2刺激所有组的小鼠。所有免疫均为肌肉内免疫。图9比较了第3组小鼠(用PBS配制的H3N2免疫)的H3N2-抗体应答与两次免疫中用a-GC免疫(图A)、仅在第一次免疫中用a-GC免疫(图B)和仅在第二次免疫中用a-GC免疫(图C)的小鼠的应答。发现即使仅在第一或第二次免疫中给予，a-GC也能提高抗体应答。没有观察到四组之间的抗体半衰期差异。图10提供采用以下方案观察到的抗体应答的成对比较A诉a-GC免疫两次与a-GC仅用于第二次免疫；B)用a-GC免疫两次与a-GC仅用于第一次免疫的小鼠；和C)a-GC仅用于第一次免疫与a-GC仅用于第二次免疫。在第一次疫苗给药中给予a-GC时观察到最大功效。在第一次疫苗给药中提供a-GC产生的抗体应答高于在第二次疫苗给药中提供a-GC(图IOC)，在第一次疫苗给药中提供a-GC时的抗体应答与两次疫苗给药中均提供a-GC时的应答相似(图IOB)。图11确认用a-GC初免的小鼠对免疫接种的回忆应答高，即使a-GC仅包含在两次初免注射的第一次给药或第二次给药中。这些结果提示，疫苗组合物中包含佐剂a-GC可降低实现长期免疫记忆所需的初免免疫次数并降低加强免疫的频率和次数。实施例3:a-GC能提高无乳链球菌诱导的新生儿败血症小鼠模型中的保护性抗体应答检测a-GC提高无乳链球菌感染诱导的新生儿败血症小鼠模型中保护性抗体应答的能力。将雌小鼠分成3组。在第0天用不含佐剂的20吗GBS80初免第1组，在第21天用相同组合物加强免疫。在第23天使小鼠交配，在第43-36天采血，以评价GBS80-IgG效价，然后在第50-53天生产小鼠后代。在出生后0-48小时用90%致死剂量的无乳链球菌刺激后代。加强免疫3个月后，处死母鼠，取出脾脏，评价GBS80-IgG血浆细胞前体频率。对第2组和第3组实施相同的免疫方案，不同之处在于用GBS80和明矾初免和加强免疫第2组的小鼠，用GBS80和0.1吗a-GC初免和加强免疫第3组的小鼠。结果如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>**相对于GBS-80pO.01;§相对于明矶配制的GBS-80pO.OOl因此，a-GC用作佐剂在母鼠中诱导的GBS80-IgG应答比明矾诱导的IgG应答高8倍。母鼠中较高的抗体应答导致保护其后代免受GBS感染的保护力提高。用GBS80和a-GC免疫的母鼠后代中70。/。经无乳链球菌刺激后存活下来，相比较而言用GBS80和明矾免疫的母鼠后代中只有30%存活。用20吗或l昭GBS80免疫的小鼠重复实验。第O天初免所有小鼠，第20天加强免疫，第34天交配，第48天放血，接着在第54-58天生产后代。立即用90%致死剂量的无乳链球菌剌激后代，48小时时评价存活率。加强免疫3个月后处死母鼠，取出脾脏评价GBS80-IgG浆细胞前体频率。用含有明矾、a-GC或不含佐剂的1吗GBS80;含有明矾、a-GC或不含佐剂的20吗GBS80;或单用PBS或明矾佐剂免疫小鼠。如图15所示，用l吗GBS80和a-GC免疫的小鼠IgGl和IgG2a效价明显高于用1吗GBS80和明矾免疫的小鼠。用20吗GBS80和a-GC免疫的小鼠的IgGl效价与用20吗GBS80和明矾免疫的小鼠相同，而IgG2a效价较高。结果如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage46</formula>单尾费氏检验^目对于GBS80w/o佐剂p〈0.05因此，用GBS80和a-GC免疫的小鼠的％存活率等于用GBS80和明矾免疫的小鼠的存活率。用GBS80和a-GC免疫的母鼠脾脏也含有明显较高频率的GBS80IgG浆细胞和记忆B细胞(分别参见图17和18)，通过评价在单独的培养基中或在CpG和IL-2存在下培育的脾细胞有限稀释培养物的10-天上清液中GBS80-特异性抗体的存在来确定GBS80-特异性浆细胞和记忆b细胞的频率，如参考文献258所述。在另一个实验中，用PBS、GBS80、GBS80+明矾或GBS80+a-GC免疫怀孕CD1雌小鼠。在各组免疫的CD1雌鼠或未经免疫的CD1雌鼠分娩前1周采集血清，收集该血清，皮下注射(3W/剂，终体积为20pl)给未经免疫的CD1母鼠的出生后24小时的新生小鼠。3小时后，用1LD90的活无乳链球菌腹膜内刺激所有新生小鼠。继续观察幼鼠的存活率2天。用经GBS80免疫的母鼠血清免疫的幼鼠全部死亡(28只幼鼠死亡28只)，用经PBS免疫的母鼠血清免疫的27只幼鼠中只有1只存活。佐剂(明矾或a-GC)的存在提高存活率，在提高存活率方面用a-GC免疫比用明矾免疫更有效。用经GBS+a-GC免疫的母鼠血清免疫的幼鼠存活率比用GBS+明矾免疫的母鼠血清免疫的幼鼠存活率高165%。这些数据表明，令人惊讶地，与明矾相比，a-GC明显能更有效地诱导对无乳链球菌的保护性免疫应答。实施例4:a-GC能提高对含有脑膜炎奈瑟球菌血清组B的几种蛋白质抗原的组合疫苗的抗体应答评价a-GC用作脑膜炎奈瑟球菌血清组B(MenB)抗原组合的佐剂的能力。用3种MenB抗原AG287nz-953、936-741和961c(各20pg/剂量)的混合物，用上述混合物和O.l吗a-GC，或者用上述混合物和0.6mg明矾免疫小鼠。在第0天、第21天和第35天给予一系列三次免疫，每次免疫后评估各抗原的IgG效价。如图19所示，在提高对组合疫苗中所有三种MenB抗原的抗体应答方面，a-GC和明矾同样有效。a-GC也能提高对这些抗原的杀菌应答。图16比较了用含有明矾、a-GC或不含佐剂的3种MenB抗原AG287nz-953、936-741和961c的混合物或单个抗原免疫的小鼠血清样品中，对MenB菌株MC5S、2996、H44/76和NZ98/254的杀菌抗体应答。对MenB抗原和a-GC免疫的杀菌应答一致高于对MenB抗原和明矾免疫的应答。进行第二个实验，以评价MenB抗原的离体CD4T细胞应答。用PBS、明矾或a-GC配制的MenB抗原混合物免疫6只CD1雌小鼠的小组两次。第二次免疫10天后，每组处死3只小鼠，取出其脾脏。用MenB抗原培育来自单个小鼠的全脾细胞悬液16小时，后12小时在布雷菲德菌素A存在下培养，以便在细胞内蓄积细胞因子。固定刺激的脾细胞，通透，并用抗-CD3、抗-Cd4、抗-CD69、抗-IFNg和抗-TNFa单克隆抗体染色。通过FACS分析测定整个CD4+细胞群体中CD3+CD4+CD69+细胞因子+细胞的百分数。结果见图14。发现与明矶相比，a-GC能更有效地扩增因MenB抗原而产生TNFa的CD4T细胞，这表明a-GC能够对MenB抗原诱导至少与明矾相同的细胞介导的免疫应答。作为阳性对照，检测了所有三组小鼠对多克隆刺激的应答。所有三组小鼠对抗-CD3抗体(IaCD3)多克隆剌激的应答相同，如图14插图所示。进行另一个实验，以评价与明矾或MF59相比，a-GC用作同样三种MenB抗原的佐剂的能力。用与O.lpga-GC、0.6mg明矾、100piMF59混合或无佐剂的3种MenB抗原AG287nz-953、936-741和961c(各自为20吗/剂量、5吗/剂量或2.5pg/剂量)的混合物免疫小鼠。在第0天、第21天和第35天给予一系列三次免疫，每次免疫后评估各抗原的IgG效价。如图13所示，a-GC和MF59诱导的杀菌抗体效价均高于明矾。也测定免疫小鼠的脾脏中MenB-特异性记忆B细胞的频率。如图12所示，与明矾相比，用a-GC或MF59免疫的小鼠脾脏中MenB特异性记忆B细胞的频率较高。这些数据表明，a-GC诱导对抗MenB抗原的杀菌免疫应答和诱导长期免疫记忆所需的Men-B特异性记忆B细胞的有效性高于明矾，与MF59相当。应理解，通过实施例只是描述了本发明，可对详细描述作一些修改但仍属于本发明的范围和构思。参考文献Natori等，Tetrahedron,1994，50:2771-2783。[2]EP-A-1018548。Galli等，Vaccine,2003，21:S2/48-S2/54。[4]Galli等，J.Exp.Med.，2003，197:1051-1057。[5]WO03/009812。Gonzalez-Aseguinolaza等，J.ExpMed，2002，5:617-624。[7]Huang等，2003，摘要396，第10届逆转录病毒和机会性感染会议(10thConferenceonretrovirusesandopportunisticinfection)。[8]Ko等，J.Immunol,2005，175:3309-3317。[9]DeLibero等，NatureReviewsImmunology，2005，5:485-496。[10]US5,936,076。WO03/I05769。Oki等，J.Clin.Investig.，113:1631-1640。US2005/0192248。Yang等，Angew.Chem.Int.Ed，2004，43:3818-3822。Goff等，J.Am.Chem.Soc，2004，126:13602-13603。Ndonye等，J.Org.Chem.，2005，70:10260-10270。Wu等，PNAS，2005，102(5):1351-1356。Mattner等，Nature,2005，434:525-529。Kinjo等，Nature,2006，7(9):978-986。WO03脂985。Wessels等(1990)JClinInvest86:1428-33。Wessels等(1989)InfectImmun57:1089-94。国际专利申请PCT/IB03/01436。Ravenscroft等(1999)Vaccine17:2802-2816。Costantino等(1999)Vaccine17:1251-1263。Anonymous(2002年1月)ResearchDisclosure,453077。Anderson(1983)InfectImmun39(l):233-238。Anderson等(1985)JClinInvest76(l):52-59。EP-A-0372501。EP-A-0378881。EP-A-0427347。W093/17712WO94/03208。W098/58668。Falugi等(2001)EurJImmunol31:3816-3824。40]Baraldo等(2004)InfectImmun.72:4884-7。41JEP-A-0594610。「42]WO00/56360。「43]WO02顾998。「44]Kuo等(1995)InfectImmun63:2706-13。「45]WO01/72337。「46]WO00/61761。「47]WO99/42130。「48]WO2004/011027。「49]WO96/40242。50]Lees等(1996)Vaccine14:190-198。51]WO95/08348。52]W098/42721。53]美国专利4,882,317。54]美国专利4,695,624。55]Mol.Immunol,1985，22，907-919。56]EP-A-0208375。57]WO00/10599。58]Gever等，Med.Microbiol.Immunol,165:171-288(1979)。59]美国专利4,057,685。60]美国专利4,673,574;4,761,283;4,808,700。61]美国专利4,459,286。62]美国专利4,965,338。63]美国专利4,663,160。「64]美国专利4,761,283。「65]美国专利4,356,170。「66〗Lei等(2000)DevBiol(巴塞尔)103:259-264。「67]WO00/38711;美国专利6,146,902。[68〗WO2006膨685。[69]W099/24578。[70]W099/36544。[71]WO99/57280。[72]WO00/22430。Tettelin等(2000)Science287:1809-1815。[74]W096/29412。Pizza等(2000)Science287:1816-1820。[76]WO02/22167。Bell(2000)PediatrInfectDisJ19:1187-1188。Iwarson(1995)APMIS103:321-326。Gerlich等(1990)Vaccine8增刊S63-68和79-80。Hsu等(1999)ClinLiverDis3:901-915。WOO1/37869WO04/005473Gustafsson等(1996)N.Engl.J.Med.334:349-355。[85]Rappuoli等(1991)TIBTECH9:232-238。Vacdnes(疫苗)(2004)，Plotkin禾C1Orenstein编，ISBN0-7216-9688-0。WO02/02606。Kalman等(1999)NatureGenetics21:385-389。Shirai等(2000)J.Infect.Dis.181(增刊3):S524隱S527。WO99/27105。WO00/27994。WO00/37494。W099/28475。Ross等(2001)Vaccine19:4135-4142。121896]Sutter等(2000)PediatrClinNorthAm47:287-308。97]Zimmerman禾卩Spann(1999)AmFamPhysician59:113-118，26。98]Dreesen(1997)Vaccine15增刊S2-6。99]MMWRMorbMortalWklyRep1998年1月16日；47(1):12，19。100101102103104105106107108109110111112113114115116117118119120121122Covacci禾口Rappuoli(2000)J.Exp.Med.19:587-592。WO93/18150。Covacci等(1993)Proc.NatlAcad.Sci.USA90:5791-5795。Tummuru等(199勺Infect,Immun.61:1799-1809。Marchetti等(1998)Vaccine16:33-37。Telford等(1994)J.Exp.Med.179:1653-1658。Evans等(1995)Gene153:123-127。WO96/01272和WO96/01273,特别是SEQIDNO:6。W097/25429。WO98/04702。McMichael(2000)Vaccine19增刊1:S101-107。Schuchat(1999)Lancet353(9146):51-6。WO02/34771。Dale(1999)InfectDisClinNorthAm13:227-43，viii。Ferretti等(2001)PNASUSA98:4658-4663。Kuroda等(2001)Lancet357(9264):1225-1240;也参见第1219页。Anderson(2000)Vaccine19增刊1:S59-65。Kahn(2000)CurrOpinPediatr12:257-262。Crowe(1995)Vaccine13:415-421。JToxicolClinToxicol(2001)39:85-100。Demicheli等(1998)Vaccine16:880-884。Stepanov等(1996)JB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所述患者一种组合物，所述组合物含有a)所述抗原；和b)CDld配体，从而与不给予CDld配体的情况下给予所述抗原时相比，降低使所述患者在随后接触所述抗原时产生免疫应答所必需的所述组合物的给药次数和/或频碎i。19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，与不给予CD]d配体的情况下给予所述抗原时相比，使所述患者在后续接触所述抗原时产生保护性免疫应答所必需的所述组合物的给药次数和/或频率降低。20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，与不给予CDld配体的情况下给予所述抗原时相比，使所述患者在后续接触所述抗原时产生保护性免疫应答所必需的所述组合物的给药次数降低。21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，诱导保护性免疫应答所需的给药次数降低至一次初免剂量。22.如权利要求19所述的方法，其特征在于，与不给予CDld配体的情况下给予所述抗原时相比，使所述患者在后续接触所述抗原时产生保护性免疫应答所必需的所述组合物的加强给药频率降低。23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，以一年以上的间隔进行加强给药。24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，完全不需要所述加强给药。25.—种在患者中诱导针对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括给予所述患者a)所述抗原；和b)CDld配体，所述抗原和CDld配体在超过一年以前也给予过所述患者。26.抗原和CDld配体在诱导患者免疫应答中的用途，其中所述抗原和CDld配体在超过一年以前也给予过所述患者。27.如权利要求25所述的方法或如权利要求26所述的用途，其特征在于，所述免疫应答是保护性免疫应答。28.如权利要求25-27中任一项所述的方法或用途，其特征在于，同时、依次或单独给予所述抗原和CDld配体。29.如权利要求18-28中任一项所述的方法或用途，其特征在于，给予所述患者的所述CDld配体给药量小于10pg/kg患者体重。30.—种在患者中诱导针对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括给予所述患者a)所述抗原；和b)CDld配体，其中所述组合物中CDld配体的含量小于10昭/kg患者体重。31.抗原和CDld配体在诱导患者免疫应答中的用途，其中所述CDld配体用量小于10pg/kg患者体重。32.如权利要求30或31所述的方法或用途，其特征在于，所述免疫应答是保护性免疫应答。33.如权利要求30-32中任一项所述的方法或用途，其特征在于，同时、依次或单独给予CDld配体和抗原。34.如前述任一项权利要求所述的方法或用途，其特征在于，所述抗原是偶联于载体蛋白的糖抗原。35.如前述任一项权利要求所述的方法或用途，其特征在于，所述抗原是蛋白质抗原。36.如前述任一项权利要求所述的方法、用途、组合物或药盒，其特征在于，所述CDld配体激活非变异NKT细胞。37.如前述任一项权利要求所述的方法、用途、组合物或药盒，其特征在于，与不存在CDld配体时非变异NKT细胞分泌IFN-y、IL-4和IL-13的水平相比，所述CDld配体提高了非变异NKT细胞分泌IFN-y、IL-4和IL-13的水平。38.如前述任一项权利要求所述的方法、用途、组合物或药盒，其特征在于，所述CDld配体是糖脂。39.如前述任一项权利要求所述的方法、用途、组合物或药盒，其特征在于，所述CDId配体是a-糖基神经酰胺。40.如前述任一项权利要求所述的方法、用途、组合物或药盒，其特征在r-，所述CDld配体是a-半乳糖苷神经酰胺或其类似物。41.如前述任一项权利要求所述的方法、用途、组合物或药盒，其特征在于，所述CDld配体是选自KRN7000、OCH或CRONY-101的a-半乳糖基神经酰胺类似物。全文摘要本发明涉及含有在不给予加强剂量和/或不给予多次初免剂量的情况下能诱导长期免疫记忆的CD1d配体的免疫原性组合物。本发明还涉及含有CD1d配体和流感病毒、B型链球菌和脑膜炎球菌血清组B抗原的免疫原性组合物。文档编号A61K39/39GK101443039SQ200780017402公开日2009年5月27日申请日期2007年3月15日优先权日2006年3月15日发明者G·盖利申请人:诺华疫苗和诊断有限公司