专利名称：：用于生产基于酵母的疫苗的方法
技术领域：
：本发明涉及在中性pH培养酵母培养物以改善酵母培养物的产率和某些特征的方法。本发明还涉及通过这些方法产生的组合物。
背景技术：
：疫苗是卫生护理产业可利用的费效比最高的措施之一。然而对于多种疾病而言依然急需研发安全有效的疫苗和佐剂，包括由于致病因子感染、癌症、遗传缺陷所致的那些疾病及其他免疫系统紊乱。有关疫苗的出版物，例如Rabinovich等，265，1401-1404(1994)指出，仍然需要能够口服给药以及仅需少次、优选在生命早期给药的安全热稳定的疫苗。还优选能够保护个体对抗不止一种疾病的组合疫苗，以及不需要佐剂的疫苗和能够亂t粘膜免疫的疫苗。迄今为止，如果有的话，也只有极少的疫苗满足所有这些标准。亚单位疫苗的研发因为重组DNA技术而成为可能，^il今为止一直令人失望，因为它们仅呈现出有限的免疫原性。一个例子是最近几种HIV(人类免疫缺陷病毒)亚单位疫苗的临床测试已被终止，这不仅是因为这些疫苗功效有限，而且还因为在一些情况下经免疫的个体在随后接触HIV时表现出加剧的病程ii^;例如参见Cohen，Sc/ewce264:1839(1994)和Cohen，Sc/^ice264:660(1994)。亚单位疫苗以及杀死的病毒和重组活病毒疫苗的一个劣势在于虽然它们似乎刺激强体液免疫反应，但是不能M保护性细4胞免疫。1994年国际艾滋病大会(InternationalAIDSConference)的主要结论是，依然需要细胞毒性T细胞介导的反应来预防或减轻HIV感染性，而这在迄今为止的临床疫苗中是一直缺乏的。另外，迄今为止所测试的HIV疫苗不能在粘膜表面(最初HIV感染发生的位置)激发免疫。此外，在美国批准使用的唯一佐剂是铝盐，即氢氧化铝和磷酸铝，两者均不能刺激细胞介导的免疫。另外，铝盐制剂不能进行冷冻或冻干，且这样的佐剂并非对所有抗原都有效。酵母细胞已经用于亚单位蛋白疫苗的生产，包括前述HIV疫苗试验中测试的一些。还曾在动物免疫之前对其饲喂酵母，试图以非特异性方式引发免疫反应(即刺激吞噬作用以及补体和干扰素的产生)。这些结果模棱两可，且这样的方案未产生保护性细胞免疫；例如参见Fattal-German等，Z)ev.77:115-120(1992)和Bizzini等，F￡7W5Mic/y^/o/./附附mwo/.2:155-167(19卯)。除疫苗之外，许多基因和药物治疗也都需要有效的特异性递送运载体以确保最大的可能益处。缺乏足够的递送运载体是基因治疗应用的主要拦路虎，并且大幅限制了许多药物的治疗潜力。例如，最近的报道显示目前正在临床上进行基因治疗应用检测的腺病毒载体会刺激不期望的免疫和炎性反应，且似乎并不以期望的方式发生整合；例如参见Engdhardt等，i/w附""77^m/7j;5:1217-1229(1994)及其中引述的参考文献。酵母疫苗技术的另一主要障碍为生产过程。多年来已在实验室进行了酵母细胞培养，且已经确立了标准培养条件。例如参见Me幼^fe0/五wzj^o/0gv,194巻，Guthrie等编辑，冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress)(1990)。标准操作方案一般包括在以pH水平衡量为酸性的培养基中培养酵母。然而，在酸性培养基中培养酵母可能导致酵母呈现出对于^f吏用酵母作为抗原携带载体用于免疫调节或疫苗制备目的而言并非最佳的不同生物学特性。因此，需要培养酵母的方法，以便酵母呈现出使之更佳地适用于作为抗原携带载体的特性。本文公开的发明部分地基于这样的发现，即，虽然酵母能够在酸性培养基中生长，但酵母在酸性培养基中生长时所呈现出的生物学特性不如酵母在中性pH水平的培养基中生长时那样值得期望。特此将本文引述的所有专利、专利申请和出版物的公开内容整体并入作为参考用于一切目的。发明概述本发明提供了通过在培养基中培养酵母来生长酵母的方法，其中培养基在5.5-8的pH水平维持至少50%的酵母培养时间。本发明还提供通过在培养基中培养酵母来生长酵母的方法，其中培养基维持在5.5-8的pH水平，且其中酵母的密度为至少0.5酵母单位/ml。在其他方面，本发明提供通过在pH水平至少5.5的培养基中培养酵母来生长酵母的方法。本发明还提供通过在培养基中培养酵母来生长酵母的方法，其中培养基维持在5.5-8的pH水平。在本发明的一方面，酵母是酉良酒酵母(Sffcc/^w附^c^cereWs/M)。在本发明的一方面，培养基用琥珀酸盐或琥珀酸进行緩冲，或者培养基额外地含有大豆胨(soytone)。在本发明的其他方面，酵母激发免疫反应。在本发明的其他方面，酵母表达抗原，在一些情况下抗原是异源抗原。在一些情况下，异源抗原在酵母表面表达。本发明提供组合物，其含有通过上述任何方法和相关方面培养的酵母。本发明提供生产抗原表达酵母的方法，方式为在培养基中培养含有用于表达所述抗原的表达系统的酵母，其中所述培养基的pH为至少5.5。本发明还提供生产抗原表达酵母的方法，方式是培养含有用于表达所述抗原的表达系统的酵母，其中培养基维持在5.5-8的pH水平。在一个方面，酵母是酿酒酵母。在其他方面，培养基用琥珀酸盐或琥珀酸进行緩冲，或者培养基可以额外地含有大豆胨。在本发明的其他方面，酵母M免疫反应。在本发明的其他方面，酵母表达抗原，在一些情况下抗原是异源抗原。在一些情况下，异源抗原在酵母表面表达。在一些方面，与在pH低于5.5培养酵母相比，该异源抗原更易获得用于与其他细胞或物质相互作用。本发明还提供组合物，含有通过上文所公开的方法培养的酵母。本发明还提供诱导个体Thl型反应的方法，包括向个体施用含有抗原表达酵母的组合物，其中酵母已在pH水平至少5.5的培养基中培养。本发明还提供诱导个体Thl型反应的方法，包括向个体施用含有抗原表达酵母的组合物，其中酵母已在培养基中培养，其中培养基维持在5.5-8的pH水平。在一个方面，组合物含有荷载了已在中性pH培养、维持或收获的酵母的树突细胞。在另一方面，酵母是酿酒酵母。在其他方面，培养基用琥珀酸盐或琥珀酸进行緩沖，或者培养基可以额外含有大豆胨。在本发明的其他方面，酵母激发免疫反应。在本发明的其他方面，酵母表达抗原，在一些情况下抗原是异源抗原。在一些情况下，异源抗原在酵母表面表达。在一个方面，Thl型反应是产生干扰素i。在另一方面，Thl型反应是产生IL國12。本发明还提供了培养酵母的试剂盒，含有培养基和使用培养基培养酵母的说明书，其中培养基的pH至少5.5。本发明还提供了培养酵母的试剂盒，含有培养基和使用培养基培养酵母的说明书，其中培养基的pH维持在5.5-8的pH水平。在其他方面，培养基用琥珀酸盐或琥珀酸进行緩冲，或者培养基可以额外含有大豆胨。在一个方面，试剂盒额外包括酵母。在一些情况下，酵母是冷冻的或冻干的。在一些情况下，酵母已在至少pH5.5的培养基中进行过培养，或已在培养基的pH维持在5.5-8的pH水平的培养基中进行过培养。在其他情况下，酵母能够复制。附图的简短说明图l描绘了培养基pH水平对细胞生长以及对培养物pH水平的影响。图2描绘了培养基pH水平对细胞壁厚度的影响。图3描绘了测试pH大约6.5的不同緩冲液的结果。显示了对75-15细胞的生长和培养物pH的影响。图4描绘了通过葡聚糖酶裂解测量的、多种緩冲剂对细胞壁厚度的影响。培养基使用琥珀酸盐或柠檬酸盐进行緩沖，以緩冲培养基至大约6.5的pH水平。图5描绘了培养基配方研究的结果，其中测试了多种添加剂对生长和7pH水平的影响。图6描绘了作为培养基配方研究一部分的酵母细胞存活力结果。酵母细胞表面上HA的表面表达利用流式细胞计数测量。图7描绘了培养基配方研究中的细胞生长和pH曲线结果，其中测试了多种添加剂。图8描绘了可以自完整酵母释放的血细胞凝集素(HA)的免疫印迹测定结果，当在中性条件培养酵母时相对于在较低pH条件培养酵母时，完整细胞显示出HA可及性的差异。免疫印迹为来自YEX和GI-8103的DTT洗脱物的western印迹(蛋白质分析)。图9描绘了在中性和低pH水平培养酵母细胞对于荷载酵母细胞的树o^rAn必"Ar必rF1工^^、、，7、WJE4nA尺湖力。wyj刀'vuT^w，o发明详述本文公开的发明基于这样的发现，即在中性pH、至少pH5.5、或pH5.5-8、或pH6-8培养酵母将导致酵母具有更为期望的生物学特征。这些期望特征中的一些在下文详述，包括但不限于能够在增大的细胞密度下生长良好，保持酵母细胞壁的柔韧性(pliability)和对细胞壁消化酶消化的敏感性，以及以使抗原更易于被其他细胞和/或物质所获得的方式展示抗原。除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学和免疫学的常规技术，这些技术是本领域技术人员众所周知的。这样的技术在文献中有充分的解释，例如M^AoA</五f^yif^/ogv，194巻，Guthrie等编辑，冷泉港实验室出版社(1990);做da"/v/,/es1"flsts，Skinner等编辑，AcademicPress(1980);Me幼oifeZ"crto6omtofy附朋wa/，Rose等，冷7良港实验室出版牙土(1990);S"cc/^iwwyc":CW/C>c/eCW/J5/o/o^v，Pringle等编辑，冷泉港实验室出版社(1997);77^S"cc/ra/wwj;ces:(7ewe五a:/7"m/ow,Jones等编辑,冷泉港实验室出版牙土(1993);T7re投fl对iS"cc/rfl/y7考ces..D"a柳/"，iV。,e/wiS戸幼esis，朋</E"e/^//a，Broach等编辑，冷泉港实验室出版社(1992);《分子克隆实验室指南》(Mo/ecM/arC7ow/wg:J丄"6omto/jAf"w做/)第二版(Sambrook等,1989)和《分子克隆实验室指南》第三版(Sambrook和Russe11，2001),(在本文联合称为"Sambrook");Cw/rewf尸rotoco/s/"Mio/ecM/ar丑iV/ogv(F.M.Ausubel等编辑，1987，包括直至2001年的增补本)；尸C/:77^i^(v附emseC%fl/及e""/o"，(MuHis等编辑，1994);Harlow和Lane(1988)Jfift'6orf/^,J丄fl6omtoryMaw"fl/，冷泉港出版公司(ColdSpringHarborPublications),纽约；Harlow和Lane(1999)fZs/"gy4w,幼^'w^1flAom^vM""簡fl/冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(在本文联合称为"Harlow和Lane，，)，Beaucage等编辑，C"frewf/Votoco/s7V"c/e/c/4ciV/C^附/s^JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,2000)和^tc"7im，S.Plotkin和W.Orenstein编辑，第三版(1"9)。定乂如本文所用，一般使用的术语"中性pH，，是指至少5.5的pH水平。中性pH范围可以是大约pH5.5至大约pH8，优选大约pH6至大约8。本领域技术人员将会理解，用pH计测量时会发生微小的波动(例如十分之几或百分之几)，照此，在任何给定时间确定pH水平时应当将此考虑在内。如本文所用，一般使用的术语"抗原"指任何能够为获得性免疫系统所识别的分子。在一个方面，抗原是与抗体特异性结合的分子。所迷分子可以是天然存在或合成产生的蛋白质的任何部分(肽、部分蛋白质、全长蛋白质)；或是细胞组合物的部分(全细胞、细胞裂解物或破坏的细胞)；或是生物体的部分(整个生物体、裂解物或破坏的细胞)；或是糖或其部分。抗原本身或借助于其他化合物如佐剂(像破碎的酵母细胞)能够激发抗原特异性体液免疫反应。在另一方面，抗原在主要组织相容性复合体(MHC)的环境中净皮T、淋巴细胞(或T细胞)识别。在另一方面，抗原能够作为耐受原(toleragen)，对抗在接受该抗原施用的动物细胞和组织内所遭遇的相同或相似抗原。在本发明的一个方面，当述及刺激免疫反应时，"抗原"可以是"免疫原"。免疫原是能够激发获得性免疫反应、例如诱导抗体产生的分子。免疫原在一些情况下能够产生记忆细胞，这些细胞在将来接触所述抗原时将产生识别所述抗原的抗体。正如本领域技术人员众所周知的那样，免疫原也能够为T淋巴细胞所识别，尽管T淋巴细胞所识别的免疫原的形式将有别于抗体所识别的免疫原的形式。絲發賴才法本发明提供了培养酵母的方法，所述酵母产生期望的特征；例如期望抗原的高表达，细胞壁的柔韧性，抗原的展示。这些方法广泛适用于所有酵母。酵母为归属于下述三纲之一的单细胞;微生物子嚢菌纲(^scowj;cC^)、担子菌纲(5"wV/zVwycetes)和半知菌纲/附;^/^"0。虽然根据本发明能够使用致病性酵母菌林或其非致病性突变林，但在一个方面，使用非致病性酵母菌株。非致病性酵母菌林的实例包括酵母菌属CSacd^/wi^cM)、假丝酵母属(OmJfV/a)、隐球菌属(Oy/^,ococc"s)、汉逊酵母属(jfiTia"5^""/tf)、克鲁维酵母属(JT/""m附j;ce51)、毕赤酵母属(尸/c似a)、红酵母属(及/^fitotorM/ff)、裂殖酵母属0Sc/^仍flccAfl/wiij;ce5)和耶氏酵母属(KwroH^)。在一个方面，使用酵母菌属、假丝酵母属、汉逊酵母属、毕赤酵母属和裂殖酵母属。而在其他方面，寸吏用酉良酒酵母、卡尔酵母(Sacc/rcar/sAgi^ews/s1)、白假丝酵母(Omf/,V/"fl/ft/cflrts)、乳酒假丝酵母(OmdiV/ff^/3的、热带假丝酵母(Om必^！frop/cfl"s)、罗伦隐球酵母(Oj/7tococc附/a"rcMft7)、新型隐球酵母(CV^,oc0ccw51fi^/br附朋力、异常汉逊酵母(J7aw5wiw/aflfio附fl/fl)、多形汉逊酵母(/T"w5WfM/fl/w/戸o/77/ra)、脆壁克鲁维酵母(^7wjvmwij^s/nigi7/s)、乳酸克鲁维酵母(JT/wjnwwwj;c"/flc泡)、马克斯克鲁维酵母乳酸变种(A/wj;vm考ce51附cm/a""s/"/s)、巴斯德毕赤酵母(尸/c/r/fl/7肪tor/s)、深红酵母(及/roflfo,or"/tfrw6m)、栗酒裂殖酵母(iSc/r/凍ffCc/f"n附yces1"附Ae)和解脂耶氏酵母(Kwrow/a/f)w(^/ca)。应当理解本发明不局限于上述物种清单，本领域技术人员能够将本文的教导应用于任何类型的酵母。在另一方面，使用酿酒酵母实施本发明的方法。优选酿酒酵母是因为其易于进行分子操作，且用作食品添加剂"公认安全"("GenerallyRecognizedAsSafe"，"GRAS，，)(GRAS，FDA提出的细则62FR18938,1997年4月17日)。pH水平在酵母培养中十分重要。本领域技术人员将会理解，培养过程不仅包括酵母培养物的起始，而且还包括培养物的维持。酵母培养物可以始于任何pH水平，可是由于酵母培养物的培养基倾向于随着时间的推移而变得更酸(即，pH降低)，因此在培养过程中必须小心监测pH水平。在本」t明的一些方面，酵母在pH水平至少5.5的培养^^中生长。在其他方面，酵母在大约5.5的pH水平生长。在其他方面，酵母在5.5-8的pH水平生长。在一些情况下，酵母培养物在5.5-8的pH水平维持。在其他方面，酵母在6-8的pH水平生长。在一些情况下，酵母培养物在6-8的pH水平维持。在其他方面，酵母在6.1-8.1的pH水平生长和/或维持。在其他方面，酵母在6.2-8.2的pH水平生长和/或维持。在其他方面，酵母在6.3-8.3的pH水平生长和/或维持。在其他方面，酵母在6.4-8.4的pH水平生长和/或维持。在其他方面，酵母在5.5-8.5的pH水平生长和/或维持。在其他方面，酵母在6.5-8.5的pH水平生长和/或维持。在其他方面，酵母在大约5.6、5.7、5.8或5.9的pH水平生长。在另一方面，酵母在大约6的pH水平生长。在另一方面，酵母在大约6.5的pH水平生长。在其他方面，酵母在大约6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0的pH水平生长。在其他方面，酵母在大约7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0的pH水平生长。在其他方面，酵母在高于8的pH水平生长。在一个方面，培养酵母以便培养基的pH水平不降至pH5.5以下。在一些情况下，降至pH5.5以下的时间不长于5分钟。在其他情况下，降至pH5.5以下的时间不长于10分钟、优选20、30、40、50或60分钟。在ii其他情况下，降至pH5.5以下的时间不长于l小时。在另一方面，培养酵母以《更培养基的pH水平不降至pH5.0以下。在一些情况下，降至pH5.0以下的时间不长于5分钟。在其他情况下，降至pH5.0以下的时间不长于IO分钟、优选20、30、40、50或60分钟。在其他情况下，降至pH5.0以下的时间不长于l小时。照此，酵母在至少pH5.5或以上的培养基中培养的时间越长，就获得具有下文所述期望特征的酵母而言结果就越好。在一个方面，利用中性pH方法生长酵母细胞意p木着在至少50%的酵母培养时间中酵母细胞生长在中性pH。更优选，在酵母培养的至少60%时间中，更优选至少70%的培养时间中，更优选至少80%的培养时间中，最优选至少90%的培养时间中，酵母在中性pH生长。在另一方面；在中性pH生长酵母包括在中性pH培养酵母细胞至少5分钟，优选在中性pH至少15分钟，更优选在中性pH至少1小时，更优选至少2小时，甚至更优选至少3小时或更长时间。如早先所指出的那样，随着酵母生长和复制，细胞密度变得更大，且培养基的酸度水平升高。照此，建议当酵母密度增大时将酵母培养在至少5.5的pH水平和/或维持在至少pH5.5。在一个方面，当酵母密度为0.5酵母单位(YU)/ml或以上时，将酵母培养和/或维持在5.5-8的pH。在其他方面，当酵母密度为至少0.6YU/ml或以上、优选0.7YU/ml或以上、0.8YU/ml或以上、0.9YU/ml或以上、或者1YU/ml或以上时，将酵母培养和/或维持在5.5-8的pH。在另一方面，当酵母密度为0.5YU/ml或以上时，将酵母培养和/或维持在6-8的pH。在其他方面，当酵母密度为至少0.6YU/ml或以上、优选0.7YU/ml或以上、0.8YU/ml或以上、0.9YU/ml或以上、或者1YU/ml或以上时，将酵母培养和/或维持在6-8的pH。在一些方面，优选收获时酵母培养物处于中性pH水平。在一些情况下，酵母培养物在收获时将处于6-8的pH水平。在其他情况下，酵母培养物在收获时将处于5.5-8的pH水平。培养基可以通过任何手段达到至少5.5的pH水平。在一个方面，利用琥珀酸(及任何相关形式，如阴离子琥珀酸才艮)緩沖培养基。如实施例中进一步详述的那样，利用琥珀酸盐緩沖培养基至至少pH5.5，允许酵母具有大约两个到两个半小时的倍增时间。琥珀酸盐可由商业可获得来源(例如西格玛化学(SigmaChemicals))获得。在其他方面，可利用柠檬酸盐使培养基达到pH至少5.5。本领域技术人员将能够容易地确定可用来使培养基达到pH至少5.5而同时保持酵母存活的其他緩沖剂。緩冲剂保持溶液处于稳定pH水平的概念是本领域熟知的，照此本文将不作详细讨论。如果根据本发明培养的酵母用于药物制品(例如疫苗)，则建议使用GMP级的材料。另外，可以向培养基中添加其他增补物以改善培养基。特别有助于添加到培养基中的其他增补物包括大豆胨。大豆胨可容易地由商业来源(例如BDDifco)获得。如实施例和附图中所显示的那样，向培养基中添加大豆胨支持在中性pH更高密度的生长。此外，添加大豆胨支持目的抗原流感病毒血细胞凝集素(HA)的表达。可以向酵母培养物中添加其他添加剂用于其他目的，例如包括表达异源基因。在一些方面，利用铜诱导血细胞凝集素表达。不过，中性pH使用铜并不理想，因而，为控制诱导型基因在于中性pH培养的酵母中表达，建议非铜的添加剂。尹'胜户好^f棼母培养參时参询利用中性pH培养酵母可以促进若干生物学效应，就利用酵母作为载体进行免疫调节和/或激发免疫反应而言这些效应是期望的特征。在一个方面，在中性pH培养酵母允许酵母生长良好而对倍增时间没有任何负面影响(例如减慢倍增时间)。酵母能够持续生长至高密度而不丧失其细胞壁柔韧性。在另一方面，中性pH的使用，例如至少5.5的pH或pH5.5-8，允许在所有收获密度产生具有柔韧细胞壁的酵母，和/或对细胞壁消化酶(例如葡聚糖酶)具有敏感性的酵母。照此，本发明提供了有关具有如通过传统测定法(例如对葡聚糖酶的敏感性)所测量的细胞壁柔韧性的酵母的方法和组合物。以前的实验已经确立酵母在大约0.5YU(酵母单位)/ml的收获密度时丧失其对细胞壁消化酶消化的敏感性。照此，一个优势在于可以利用与在标准生长培养基中以0.5YU/ml培养的酵母进行的比较，来比较于任何密度的中性pH生长。这种性状是期望的，因为具有柔性细胞壁的酵母能够呈现出独特的免疫反应，例如促进酵母寄宿的细胞中的细胞因子(例如INF-力分泌。本领域技术人员会使用中性pH方法的另一原因在于其允许位于细胞壁中的抗原具有更高的可及性。这有助于所表达蛋白质的更大的免疫原性和抗体检测，如通过标准技术如流式细胞仪所测量的那样。在中性pH培养的酵母中所观察到的另一期望特征是抗原以有益于免疫调节目的的方式表达。在一个方面，酵母用作为载体用于抗原表达(例如参见美国专利No.5,830,463和7,083,787)。抗原可以是酵母的天然抗原，或者是酵母表达的异源抗原。在一些方面，利用酵母表达抗原有助于研发疫苗、预防剂和治疗剂，以对抗多种疾病和紊乱(例如传染性疾病或癌症)。利用中性pH方法，本领域技术人员能够产生抗原携带酵母，其中抗原更易于被其他细胞(例如用于免疫共刺激功能或免疫调控)或其他物质(例如抗体用于检测)所获得。另外，对一些抗原，例如流感HA抗原，使用中性pH,允许通过二硫苏糖醇(DTT)处理释放二硫键键合的HA，这在HA表达酵母于pH降至pH5以下的培养基中培养的情况下是不可能的。在一些情况下，itiC生在pH降至pH5以下任意长的时间的情况下。在其他情况下，这发生在pH降至pH5以下1分钟或几分钟或者1或多个小时的情况下。按照中性pH方法培养的酵母所呈现的另一期望特征在于与所迷酵母接触的细胞将分泌Thl型细胞因子。Thl型细胞因子的实例包括但不限于干扰素个IL-12和IL-2。如实施例中进一步详述的那样，与在低(酸性)pH培养基中培养的酵母相比，荷载了依照中性pH方案培养的酵母的树突细胞呈现出增加水平的干扰素-Y分泌和表达。利用中性pH培养方法时IL-12的分泌水平并无下降。由此，本领域技术人员能够将本文公开的中性pH方法用于免疫调节目的，例如在罹患将得益于增强的Thl型反应的疾病或紊乱的个体中诱导Thl型反应。尹#才法培#的脊#付逸合#本发明还考虑含有利用本文公开的中性pH方法所培养的酵母的组合物。在一个方面，组合物含有在其表面、内部或表面及内部表达天然抗原的酵母。这类组合物可用于多种目的，例如作为佐剂给药。在另一方面，组合物含有在其表面、内部或表面及内部表达异源抗原的酵母。这类组合物可用于多种目的，例如对需要的个体进行免疫调节以及研发疫苗。这些组合物还可以包括可药用的赋形剂和/或载体。可药用的载体可以包括无菌水性或非水性溶液、混悬液和乳液。非水性溶剂的实例有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、以及可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或混悬液，包括盐水和緩冲介质。胃肠外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖液、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发油。静脉内载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏葡萄糖液的那些)等等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等等。用可药用赋形剂配制含有中性pH条件下培养的酵母的组合物，对于本领域技术人员而言是一般常规的。本发效时试,y盒本发明考虑含有用于在中性pH条件下培养酵母的培养基组分的试剂盒。在一个方面，试剂盒包括培养基组分和有关其4吏用的一务沈明书，其中所述培养基组分含有琥珀酸盐或琥珀酸，可用于使培养基达到至少5.5的pH。在另一方面，试剂盒还包括大豆胨作为附加组分。在另一方面，试剂盒还包括酵母细胞。酵母细胞可以是冷冻的，用于通过本文公开的方案起始培养物。在另一方面，酵母细胞可以在冷冻以包装为试剂盒的一部分之前就已经通过本文公开的方法进行过培养。在另一方面，酵母细胞可以是冻干的，并任选地纳入在试剂盒之中。在另一方面，试剂盒含有根据本文^Hf的方法制备的、能够复制的酵母。提供如下实施例以举例说明本发明的某些方面。它们并非旨在以任何方式限制本发明。实施例实施例1酵母培养基配方多种类型的培养基可用来培养酵母并可以进行调整以使pH水平为中性。下文给出了可以使用的几种培养基的实例，不过，应当理解本发明并不局限于这些培养基组分或培养基方案的使用。一种标准培养基配方是如下的ULDM培养基:<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>另一标准培养基配方是如下的UL2培养基:<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>另一标准培养基配方是如下的UL3培养基:<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>另一标准培养基配方是如下的UL4培养基:<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>另一标准培养基配方是如下的UDM培养基:<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>标准培养基配方可以补加额外的氨基酸。如下方案为例示性的培养基配方。ULDMaa培养基配方如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>调整至pH6.9的U3S培养基配方如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>实施例2培养基pH对细胞生长和培养物pH的影响如图1所示，测试了培养基pH对细胞生长和培养物pH的影响。细胞养生长在补加了Bis-Tris緩冲液，pH7.2或磷酸盐緩冲液，pH7.2的U2培养基中。对照培养物生长在未向培养基中添加緩冲剂的U2培养基中。对于标记为对照(同培养基pH5.5—样)或培养基pH7.2的条件，这些对照的生长培养基在接种酵母之前用碱(NaOH)调整至pH5.5或pH7.2。培养物于30。C孵育，并进行细胞计数和培养物pH监测长达16小时。结果表明在不同pH水平的緩冲液影响酵母的生长速率。如图l所示，倍增时间为2.8至4.5小时。在未緩冲的pH7培养基中pH在2.0YU/mL时为5.5，这表明需要某种形式的緩冲剂以保持pH处于中性水平。实施例3培养基pH对细胞壁厚度的影响测试了培养基pH的效应以确定其是否对细胞壁厚度有任何影响。生长培养基和M与实施例1相同。在0.5-2.0YU/mL的密度收获培养物。在图2的图例中，培养物收获时的密度列为破折号后面的数字，例如"对照-0.6"表示细胞在pH5.5的未緩沖的培养基中培养，然后在细胞达到0.6YU/mL的密度时收获。烧瓶1-3(例如1-0.5、2-2.0或3-1.0)的#^在图下方列出，而收获时的细胞密度在图例中标出。所用的裂解测定法方案如下(l)将10YU经洗涤的细胞重悬在1mLTris-BME中；(2)抽取"0时间点，，的样品，并测量600nm处的OD值；(3)添加加U的葡聚糖酶；(4)于30。C旋转；(5)每10分钟取样，并测量OD值。如在图2中所观察到的那样，对照培养物(培养基pH5.5)随着细胞密度增大显示出更为低效的裂解。烧瓶2显示了培养基在pH7.2无緩冲剂时的效应。烧瓶2显示了培养基在pH7.2、有Bis-Tris緩冲液时的效应。烧瓶3显示了培养基在pH7.2、有磷酸盐緩冲液时的效应。因而，结果表明緩冲在大约？115.5或更高的培养中酵母在所有收获密度下保持细胞壁的柔韧性和对细胞壁消化酶消化(例如用溶细胞酶/葡聚糖酶制备原生质球)的敏感性。与此形成对照，使用许多酵母实验室常用的标准方法，在收获密度X).5YU/mL时敏感性丧失。为便于比较，0.5YU/mL加标准生长培养基常用来与任何密度下的中性pH生长进行比较。实施例475-15细胞的构建对命名为TK75-15的融合蛋白进行了工程化，以利用Aga2序列由r￡7。启动子驱动在细胞壁上表达流感HA蛋白。在此构建体中，蛋白质经构建具有C-末端连接Aga2序列的HA序列。当此蛋白在也表达Agalp(在本案中由启动子驱动)的细胞中表达时，定位于酵母细胞的外细胞壁以及胞质溶胶。包含流感HA抗原的融合蛋白为单条多肽，从N-端到C-端具有按读框融合的下列序列元件(融合蛋白的氨基酸序列在本文以SEQIDNO:l给出)l)全长酿酒酵母Aga2蛋白序列(SEQIDNO:l第1-87位)，包括其天然18个氨基酸的ER靶向信号序列(SEQIDNO:l第1-18位；2)将Aga2与HA主体分隔开的间隔区(第88-89位)；3)流感HA蛋白(SEQIDNO:1第90-600位)，该蛋白缺失其信号序列，且缺失HA的36个C-末端残基，从而消除了其C-末端的膜锚定序列和胞质尾区；4)将HA蛋白主体与组氨酸标签分隔开的三甘氨酸间隔臂(SEQIDNO:l第601-603位)；和5)C-末端六组氨酸标签(SEQIDNO:l第604-609位)。编码SEQIDNO:l的融合蛋白的核,列在本文如SEQIDNO:2所示。此融合蛋白及表达之的Tarmogen可称为75-15。所用的蛋白质序列如下(SEQIDNO:1):MQLLRCFSIFSVIASVLAQELTTICEQIPSPTLESTPYSLSTTTILANGK50AM(3GVFEYYKSVTFVSNCGSHPSTTSKGSPINTQYVFTSDTICIGYHANN100STDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCRLKGIAPLQLGKCNIAGWL150LGNPECDPLLPVRSWSYIVETPNSENGICYPGDFIDYEELRE(2LSSVSSF200ERFEIFPKESSWPNHNTNGVTAACSHEGKSSFYRNLLWLTEKEGSYPKLK250NSYVNKKGKEVLVLWGIHHPSNSKEQQNLYQNENAYVSVVTSNYNRRFTP300EIAERPKVRD(3AGRMNYYWTLLKPGDTIIFEANGNLIAPMYAFALSRGFG350SGIITSNASMHECNTKCQTPLGAINSSLPYQNIHPVTIGERPKYVRSAKL400RMVTGLRNIPSIQSRGLFGAIAGF正GGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYA450ADQKSTQNAINGITNKVNTV正KMNIQFTAVGKEFNKLEKRMENLNKKVD500DGFLDIWTYNAELLVLXENERTLDFHDS画KNLYEKVKS(2LKNNAKEIGN550GCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPKYSEESKLNREKVDGVKLESMGIYQ600GGGHHHHHH*相应的核酸序列如下(SEQIDNO:2):261801GGTGGCGGGCATCACCATCACCATCACTAGTGA实施例5不同緩冲液(pH6.5培养基)对75-15细胞生长和培养物DH的影在75-15细胞上测试了不同的緩冲剂以确定其对细胞生长的影响以及对培养物pH的影响。这些緩冲剂示于图3，包括琥珀酸盐、柠檬酸盐和碳酸盐。没有一种緩冲液导致沉淀形成。所用的所有緩冲剂在标准生长培养基中溶解良好。在接种酵母之前将所有测试培养物的pH调整至pH6.5。培养物随之在摇瓶中于30。C培养长达15小时。当细胞在碳酸盐緩冲液中培养时，看到极小程度生长直至无生长。如在图3中能够看到的那样，不同緩冲剂的使用影响生长速率。在中性pH(至少pH5.5)时生长更快。特别是，具有琥珀酸盐緩冲液的培养基就倍增时间(2.5hr的倍增时间)而言表现最佳。与此形成对照，如果酵母细胞在低于5.5的pH(更为酸性的条件)生长，则倍增时间较慢，在3.5hr。柠檬酸盐具有相似的倍增时间(3.5hr)。0.05M的柠檬酸盐比0.02M的琥珀酸盐具有更大的緩冲能力。在这些实验中，所有培养物均接受0.35mM的铜以诱导表达。实施例6多种緩冲剂对细胞裂解的影响图4显示了用不同緩沖剂如琥珀酸盐和柠檬酸盐进行的实验的结果。培养物如实施例！所述进行培养。酵母被葡聚糖酶裂解的能力利用上文的裂解测定法方案测量。对照培养物(培养基pH5.2)中的酵母随着细胞密度增大显示出更为低效的被葡聚糖酶裂解(细胞密度表示为破折号后面的数字，如上文有关附图2的说明那样)。然而，对于琥珀酸盐和柠檬酸盐緩冲的培养基两者而言，收获时的细胞密度对酵母在上文所述的裂解测定法中被细胞壁消化酶裂解的能力没有任何影响。琥珀酸盐和柠檬酸盐緩沖的培养基中的酵母在渐增的细胞密度(例如0.5YU/ml、0.9YU/ml和2.1或2.2YU/ml)下依然对裂解敏感。实施例7培养基配方研究测试了添加到酵母培养基中的其他物质的贡献，结果示于图5。U2或U4指基本培养基组成。由于蛋白质表达处于铜诱导型启动子的控制之下，向培养基中添加0.35mM的铜，以诱导酵母细胞表达HA蛋白。大豆胨(图5中的大豆)是可商购的、通过大豆的肽消化获得的复杂营养物混合物。添加大豆胨得到最快的生长和最高的产率(30YU/mL)。0,08M琥珀酸的使用显示出较佳的緩冲能力。细胞于30。C培养的时间在x轴上显示。图6显示了培养基配方研究的结果，其中利用Guava技术确定细胞存活力。表达铜诱导型Aga2-HA的酵母菌林75-15在摇瓶中于30。C培养。当向培养物中添加铜时，Aga2-HA蛋白得以表达，并展示在细胞表面，它反映了表面展示HA的酵母细胞的数目(阳性信号％)。也可以利用其他方法(例如血球计数计或锥虫蓝)确定细胞存活力。以U2观察到最高的信号，甚至是在8YU/mL的细胞密度(该密度超出了细胞倾向于减慢其生长速率的细胞密度)下。使用大豆胨的培养物表现出清晰的细胞密度效应，其中高密度表现出蛋白质的下降。总体来说U4的使用得到低的信号。这些结果也表明了由于pH对细胞壁的影响而带来的检测可及性，以及HA特异性抗体检测所i^面表达的蛋白质的能力。使用不同浓度的大豆胨进行了额外的实验。图7图示了结果。在0.5g/1到lg/l之间的大豆胨，未观察到生长或pH的差异。在U4-YNB培养基中比在U2培养基中观察到更快的生长。实施例8酵母在中性pH条件下培养时HA可及性的差异利用不同pH水平的培养基评估了特定抗原就与其他物质如检测用抗体相互作用而言的可及性。图8显示了当酵母细胞在小于5的pH培养时以及当酵母在大于6的pH培养时，自完整酵母可释放的流感血细胞凝集素(HA)的免疫印迹测定。如流式细胞仪染色所确定的那样，就表达HA的细胞数和每个细胞的HA量两者而言，在中性pH培养的酵母使得表面展示的HA对于抗体检测具有高得多的可及性。另外，在中性pH培养的酵母更易于操作以通过二硫苏糖醇(二硫化物还原剂)处理释放二硫键键合的HA。实施例9中性pH对细胞因子生产的影响利用荷栽了在pH维持或未维持在pH5.5以上的培养基中生长的YVEC酵母(不表达异源抗原)的树突细胞(DC),研究了在中性pH培养酵母对细胞因子生产的影响。小鼠骨髓来源的树突细胞通过在RPMI培养基中37。C(与酵母)一起孵育48hr，以每个DC荷载10个酵母。然后对上清液分析分泌的细胞因子。图9显示了这些实验的结果。下图表明荷载了在中性pH(即至少5.5或更高)生长的酵母的树突细胞的IFN-y分泌显著增加，这种现象在酵母于允许pH降至低于5.5的培养基中生长时是不存在的。权利要求1.培养酵母的方法，包括在培养基中培养酵母，其中培养基在5.5-8的pH水平维持至少50％的酵母培养时间。2.培养酵母的方法，包括在培养基中培养酵母，其中培养基维持在5.5-8的pH水平，且其中酵母的密度为至少0.5酵母单位/ml。3.培养酵母的方法，其中在至少50%的酵母培养时间中酵母培养在pH水平至少5.5的培养基中。4.权利要求3的方法，其中培养基维持在5.5-8的pH水平。5.权利要求3的方法，其中酵母是酿酒酵母。6.权利要求3的方法，其中培养基用琥珀酸盐或琥珀酸进行緩冲。7.权利要求6的方法，其中培养M含有大豆胨。8.权利要求3的方法，其中在向个体施用时酵母激发免疫反应。9.权利要求8的方法，其中酵母表达异源抗原。10.权利要求9的方法，其中异源抗原在酵母表面表达。11.组合物，含有通过权利要求l、2或3中任一方法培养的酵母。12.生产抗原表达酵母的方法，其中在培养基中培养含有用于表达所述抗原的表达系统的酵母，其中所述培养基的pH为至少5.5。13.生产抗原表达酵母的方法，其中培养含有用于表达所述抗原的表达系统的酵母，其中培养基维持在5.5-8的pH水平。14.权利要求12或13的方法，其中酵母是酿酒酵母。15.权利要求14的方法，其中培养基用琥珀酸盐或琥珀酸进行緩冲。16.权利要求15的方法，其中培养基还含有大豆胨。17.权利要求12或13的方法，其中在向个体施用时酵母激发免疫反应。18.权利要求17的方法，其中酵母表达异源抗原。19.权利要求18的方法，其中异源抗原在酵母表面表达。20.权利要求18的方法，其中与在低于5.5的pH培养酵母时相比，所述异源抗原更易于获得用于与其他细胞或物质相互作用。21.组合物，含有通过权利要求12或13所述的任一方法培养的酵母。22.诱导个体Thl型反应的方法，其中向个体施用含有抗原表达酵母的组合物，其中酵母已在pH水平至少5,5的培养基中进行过培养。23.诱导个体Thl型反应的方法，其中向个体施用含有抗原表达酵母的组合物，其中酵母已在培养基中进行过培养，其中所述培养基维持在5.5-8的pH7jC平。24.权利要求23的方法，其中组合物含有荷载了已在中性pH培养、维持或收获的酵母的树突细胞。25.权利要求23的方法，其中酵母是酿酒酵母。26.权利要求23的方法，其中培养基用琥珀酸盐或琥珀酸进行緩沖。27.权利要求26的方法，其中培养基还含有大豆胨。28.权利要求23的方法，其中在向个体施用时酵母激发免疫反应。29.权利要求28的方法，其中酵母表达异源抗原。30.权利要求29的方法，其中异源抗原在酵母表面表达。31.权利要求23的方法，其中Thl型反应是产生干扰素^。32.权利要求23的方法，其中Thl型反应是产生IL-12。33.培养酵母的试剂盒，含有培养基和使用培养基培养酵母的说明书，其中培养基的pH为至少5.5。34.培养酵母的试剂盒，含有培养基和使用培养基培养酵母的说明书，其中培养基的pH维持在5.5-8的pH水平。35.权利要求34的试剂盒，其中培养基用琥珀酸盐或琥珀酸进行緩冲。36.权利要求34的试剂盒，其中培养Ui含有大豆胨。37.权利要求34的试剂盒，其中试剂盒还包括酵母。38.权利要求37的试剂盒，其中酵母是冷冻的或冻干的。39.权利要求37的试剂盒，其中酵母已在至少pH5.5的培养基中培养过，或已在培养基的pH维持在5.5-8的pH水平的培养基中培养过。40.权利要求37的试剂盒，其中酵母能够复制。全文摘要本发明提供了在中性pH水平培养酵母的方法。在中性pH条件下培养的酵母呈现出可用于生物学目的如研发疫苗、预防剂和治疗剂的期望特征。本发明还提供了含有使用本文公开方法所培养的酵母的组合物和试剂盒。文档编号A61K36/06GK101687030SQ200880010797公开日2010年3月31日申请日期2008年2月1日优先权日2007年2月2日发明者A·弗兰祖索夫,D·奎克申请人:环球免疫公司