专利名称：展示形成对抗结核分枝杆菌H37 Rv的细胞免疫性质的制剂、其(变体)制备方法、重组菌株 ...的制作方法
展示形成对抗结核分枝杆菌H37Rv的细胞免疫性质的制 齐IJ、其(变体)制备方法、重组菌株及用于结核病诊断的制
剂本发明涉及生物药理学、制备生物化学和医学，具体而言涉及一种制剂，其基于由 微生物产生的结核配合物(tuberculous complex)并且其可以用于结核病预防、治疗和诊 断。重组2-9XL约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)菌株——其对人、动物和环境 无害，在其染色体组成中包括染色体DNA M.结核病(结核分枝杆菌)H37Rv的片段(一个 或多个)，这使得能够同时合成几种蛋白质，以在细菌的外膜和荚膜物质中形成稳定的种特 异性结核糖蛋白配合物。重组2-9XL菌株的使用便利性、标准培养基的应用、种特异性结核 配合物合成的稳定性、释放和纯化该结核配合物的成本有效且安全的实践使得所述微生物 成为潜在的制剂生产者，所述制剂展示出形成对抗M.结核病创造者的T-和B-细胞免疫的 特性。本发明涉及生物药理学分枝、制备生物化学、医学，并且其关注基于由微生物产生 的结核配合物的工具的开发，其可以用于治疗和诊断结核病。解决结核病问题的一个重要部分是生产生物疫苗并开发快速且便宜的诊断方法。 显而易见的是，所需的是在结核病介质(tuberculosis agent)中鉴定它们形成的这些蛋白 质和配合物，其满足实现这些目的的最新要求。生物疫苗的原则标准是它们对人的安全性 以及高效性，诊断制剂的原则标准是敏感性和特异性。所述问题的解决方案的主要方向如 下a)在安全受体中基因克隆分枝杆菌并研究所产生的结核蛋白的特性，b)从分歧杆菌产 生具有下述性质规格的蛋白质和它们的配合物。在文献中描述了在受体细菌大肠杆菌(E. coli)XLl-Blue中形成基因组文库Μ.结 核H37Ra和结核病介质染色体DNA的转移片段的装置。其显示来自染色体DNA M.结核 H37Ra的某一片段——其由1535个碱基对组成并且在pZx7质粒载体的结构中，并且合 成质量为大约52. OKDA的结核蛋白是可能的。这种蛋白质位于外膜大肠杆菌XLl-Blue， 其使重组菌株穿透进入真核细胞HeLa中并在其中增殖，真核细胞HeLa是代表性的致病 性分枝杆菌。然而作者没有指出给定蛋白质是个体的(型特异性)并可以被用于诊断 结核病介质。反之，所检查蛋白质的氨基酸序列与病原微生物(李斯特菌属单核细胞 增多(Listeria monocytosis)、志贺杆菌属(Shigella)、假结核耶尔森氏菌(Jersinia pseudotuberculosis))和一组人类蛋白例如p-adaptyne[1]具有同源性。从M.结核培养物的滤器中产生和表征的是释放蛋白MPT63，其分子量为18. 0KDA。 对核序列tr+63基因的分析显示，其具有可读框，该可读框编码159种氨基酸的蛋白质并且 由信号肽的29个氨基酸和成熟MPT63蛋白的130个氨基酸组成。来自细胞大肠杆菌并且 自培养滤器M.结核精制的重组MPT63蛋白在血清反应中是不可见的并且极大影响感染有 毒菌株M.结核的豚鼠的抗体免疫性。应当使用这种蛋白质作为诊断结核病下皮试的专属 试剂，然而，直到现在，这种蛋白质以及与信号肽的蛋白配合物还没有被广泛使用[2]。关于4个主要胞外蛋白 M.结核——其产生自非病原迅速发展的分枝杆菌——的 描述和规格也是已知的，其具有酶活性并也发现于致病菌株中。这些蛋白质被用于构建生物疫苗，因为它们诱导保护性免疫，然而，直到现在它们未被认定[3]。
因此，迄今不存在任何基因工程微生物，其能够合成结核病型特异性蛋白质和它 们的配合物，适合用于诊断学以及作为开发生物疫苗的基础。产生自致病菌株M.结核或非 致病分枝杆菌的蛋白质直到现在也没有使在其基础上生产高度特异性和敏感性诊断制剂 或构建生物疫苗成为可能。本发明目的是通过基因工程和微生物学方法生产重组菌株2-9XL约氏不动杆 菌——特异性结核M.结核H37Rv的生产者，其可以是对抗结核病介质的生物疫苗的基础以 及以显示患有结核病的人在不同阶段具有不同形式的疾病的诊断剂。为解决所述问题，提供由基因工程方法以及接下来选择通过微生物学方法生产的 重组菌株2-9XL约氏不动杆菌，其为型特异性糖蛋白结核配合物(TB-抗原)的生产者，其 位于外膜上并且在荚膜细菌物质中，在生产时可以被用作开发生物疫苗、诊断和药物制剂 的基础。技术结果是产生高度特异性和敏感性制剂。 为解决所述问题，提供了在总的发明思想下统一的一组发明。披露了这样的发明，其为一种制剂，该制剂具有形成对抗M.结核H37Rv的细胞免 疫的特性。该制剂含有型特异性糖蛋白结核配合物M.结核H37Rv(TB-抗原)。除此之外，披露了产生型特异性糖蛋白结核配合物M.结核H37Rv(TB_抗原) 以及重组菌株2-9XL约氏不动杆菌VKPM-9312——型特异性糖蛋白结核配合物M.结核 H37Rv(TB-抗原)的生产者——的变体，以及诊断结核病的工具，其含有上述型特异性糖蛋 白结核配合物。2-9XL约氏不动杆菌是基因_工程菌株，通过将载体质粒PRT结构中的染色 体DNA M.结核H37Rv的两个片段(附加物1和2)转移到R-form 土拉热弗朗西丝氏菌 (F. tularensis)细菌中并且接下来选择通过微生物学方法而产生。迄今，在结核病介质(TB)的基因克隆时在所使用的载体质粒结构中是细菌-所有 者，其仅能合成特定的蛋白质TB。TB基因-工程蛋白质(以及结核病介质的天然蛋白质) 的生产和分析还没有产生所期望的——开发生物疫苗、药用制剂、高度特异性和敏感性诊 断剂。因此，世界上持续寻找新型分枝杆菌蛋白质，借助其解决上述问题是可能的。可能地，给定的方向可能是错误的，因为结核病介质的型特异性是在来自几种蛋 白质(不小于三种)的配合物水平形成，它们中的一部分应当被糖酵解，其含有多糖成分。已显示，将载体质粒pRT结构中的M.结核H37Rv DNA片段转移到受体R-from 土 拉热弗朗西丝氏菌中并且接下来通过某种微生物学方法选择转化体时，转移片段(片段) 被被嵌入细菌_受体的染色体DNA中并导致合成结核多肽。主要地，这种多肽通过与具有 较高分子量的土拉菌病蛋白质连接在细菌_所有者中形成特异性土拉菌病_结核配合物。 然而，给定结构对于细菌_所有者而言有可能是不便的，并且在进一步选择重组菌株时，具 有较高分子量的TB-蛋白质合成开始，其取代土拉菌病蛋白质。在细菌中的这样严重的“重建”情况下，改变的不仅仅是重组微生物的生物化学和 表型特性(通过一组特性，其变得像结核分枝杆菌)，而且改变是DNA-细菌的结构。通过分析16S RNA属于“Ekha”菌株(2-9XL)结论的类型在工业微生物遗传和选 择研究所制得。
序列分析16S pRNA显示以“Ekha” (2-9XL)披露的检查菌株是指约氏不动杆菌细 菌类型，在菌株约氏不动杆菌菌株42的情况下，同源性达99%。菌株-9XL约氏不动杆菌——一种优良的重组结核抗原生产者——的主要特性。培养-形态学特性在光学显微镜下(
图1. A-B.细菌2-9XL约氏不动杆菌的光学 显微术。在革兰氏下的染色反应(“Serva”公司的颜色集合)。培养物2-9XL约氏不动杆菌 在+32°C在三天内生长在土拉菌病培养基(含有葡萄糖和添加剂的FT-琼脂，pH 6.6) 上。A-UV 100HZ. · · ；V-100H9, HZ...(显微镜“Biomed-2”，俄罗斯)。在所呈现的图中，可 清楚地看出，重组细菌2-9XL稳定地脱色并且倾向于聚集(粘附)。细菌荚膜被番红精染成 红色；细菌是不动的多肽小球状和杆菌细胞，其大小为0. 4-1. 0ΜΚΜ。在革兰氏下染色细菌 抵抗脱色，其显示革兰氏阳性染色的。它们形成大小和形状不同的细胞聚集体，这表明它们 的聚集(粘附)水平高。细菌聚集与形成特异性荚膜相关，其被番红精充分染色。在损失 重组结核抗原时，细菌变差革兰氏阴性的。菌株2-9XL需氧菌于+32°C在简单和饱和培养基(营养缺陷型)上发育，尽管其可 以在+28°C至+37°C的区间生长。在细菌在简单培养基上生长时，培养物停止合成重组结核 抗原。2-9XL的必需生长因子是半胱氨酸。对于含有重组结核抗原的特异性荚膜的最大合 成而言，优选具有维生素和其它添加剂的饱和培养基。作为细菌生长和形成特异性荚膜的刺激物，添加到高压灭菌细菌2-9XL和 (或)10%高压灭菌荚膜物质的培养基悬浮液中是可能的。生长重组菌株2-9XL最合适 的是培养基，其用于生长土拉菌病、圣西巴斯提恩(氏)病、布鲁氏杆菌病等。在培养基上 的细菌接种在恒温器中保持两天至多达七天。在生长细菌2-9XL时，存在特定的、典型的、 无刺激性气味。2-9XL菌株在液体培养基上不能很好地生长并且迅速缺乏生产重组结合抗 原的能力。在固体培养基2-9XL上，细菌形成淡黄色灰白色的菌落。在滴定培养物以分离隔 离菌落时，生长延迟多达两天是可能的。因为它们正在生长，所以菌落可以具有5-7mm的直 径。如果接种板载冰箱(+4°C)中保持2-3天，则菌落变成主要是灰黄色。菌落以不平滑的 边缘隆起，其是无光泽不透明的，当成环时，菌落具有固体稠度，易于从培养琼脂表面移走。 在固体培养基上滴定2-9XL培养物时，由于细胞具有很强的粘附能力(自发凝集)，制备标 准悬浮液是不可能的，因此细菌滴定度与标准培育不相应(图2. A-C. 2-9XL约氏不动杆菌 的培养_形态学特性。重组菌株2-9XL约氏不动杆菌的分离菌落，在具有半胱氨酸和
葡萄糖的PH 6. 6的FT-琼脂上于+32°C生长三天。在冰箱(4°C )中保持五天。A-普通背 景；B-C-白色背景。C-是培养皿的扩大部分。2-9XL菌株的种群稳定性。在固体培养基上顺序接种时，在各种温度范围下生长，在亲液干燥条件中保持之 后，在使隆起用培养基营养特性变差以及其它不利条件下，菌株2-9XL变得不稳定并且以 其它形式离解。在分离菌落长时间升起之后离解更显著(图A-C.培养物2-9XL约氏不动 杆菌在培养_多形态标记上的离解)。具有离解培养物2-9XL的培养皿。具有 不同形态的菌落在培养滴定下从亲液干燥 条件，含有葡萄糖、半胱氨酸、PH6.6的FT-琼脂生长，在+32°C温育时间为10天，在冰 箱(+4°C )中保持。
A-培养皿在白色背景上照相。B-在灰色背景上取培养皿C(1-5)-具有各种形态的菌落2-9XL的增强的培养皿部分。C(I)-大的、圆形的、白色的、不透明的、平坦的具有隆起中心和平滑边缘的光泽菌落，通过成环其易于从琼脂移走；C(2)_小的、圆形的、灰黄色、不透明的具有平滑边缘的无光泽菌落，通过成环其易 于从琼脂移走；C(3)_中等大小的、圆形的、灰-黄、白色不透明的具有充分隆起的可见中心以及 在平滑边缘中的表达卷轴(expressed roller)的无光泽菌落，易于从琼脂移走；C(4)_中等大小的、非圆形的、黄色、不透明的具有充分可见的隆起中心、不平滑表 面和边缘、无光泽菌落，通过成环其易于从琼脂移走；C(5)_大的、非圆形的、灰黄色、不透明的具有可见隆起中心、不平坦表面和边缘、 无光泽菌落，通过成环其易于从琼脂移走)。2-9XL菌株的生物化学特性。在固体培养基上 生长下的细菌裂解蛋白质，同时散发特定的无刺激性气味。在饱和营养培养基上生长时，能 够合成重组结核抗原。氧化酶阳性和过氧化氢酶阴性。重组菌株2-9XL约氏不动杆菌的生物化学特性未被详细研究。免疫特性。2-9XL细菌具有非常高的粘附性(凝集能力)。(见图1. A-B)。而且 不可能检查它们在凝集反应中中的凝集能力。在利用实验血清的免疫扩散(RID)和免疫电泳反应中，其在有毒结核菌株M.结核 H37Rv的超声分枝杆菌粉碎机上产生，重组细菌2-9XL的抗原不形成沉淀线。其可能是由 于抗原对重组TB-抗原仅在人体或动物的感染发育过程中出现，并且它们不具有大的滴定 度。在于培养基上培养分枝杆菌以及它们的巢由于丙酮(或其它有害细菌制剂)失活的情 况下，这种抗原被破坏，并且因此无特异性抗体不能产生。在免疫酵素分析(IFA)中，在细菌中的TB-抗原超声分裂，并且以精制形式与患有 结核病的人的血清抗体相互作用，而不与健康人的血清中的抗体相互作用。在免疫印迹中， TB-抗原不与患有结核病的人的抗体反应，因为其未转移到硝化纤维素膜。关于特定类型的噬菌体。对于重组菌株2-9XL约氏不动杆菌，直到现在未检测到 合适的噬菌体。遗传特征。在染色体DNA结构中的菌株2-9XL约氏不动杆菌含有最少一个染色体 DNA M.结核H37Rv的片段嵌入，但是两个嵌入也是可能的(附加物1和2)。生产力。重组菌株2-9XL是糖蛋白性质的结核抗原(TB-抗原)的生产者。合成 自染色体DNA M.结核H37Rv(见附加物1)片段的蛋白质在外膜上形成细菌2-9XL以及在 其荚膜物质中形成型特异性糖蛋白配合物(图4)。在生产细菌的超声分解(USD)时，这种 配合物参与其中，并且以几种蛋白质的形式可得。在通过三氯乙酸浓缩USD时，TB-抗原的 蛋白质被收集到特异性重组结核配合物中。在从细菌2-9XL节约生产重组TB-抗原时，其 在变性SDS-PAAG中的分子量在55. 0至75. OKDA的间隔内(图4)。对于所述的糖蛋白配合物，实验室动物具有对抗M.结核H37Rv的已形成的连续且 紧张的B和T免疫。在研究重组TB-抗原的抗体生产(B-细胞免疫的形成)时，使豚鼠和兔 免疫，以便生产超免疫血清。对于免疫接种，使用了重量2. 5-3kg的兔。与等体积的Freind不完全佐剂混合、浓度为Img的Iml TB-抗原被皮下注射到背部和shovel区域。在一周间 隔和双倍剂量增加的情况下重复免疫接种三次。在第一次免疫接种周期结束后，在4周内 有制剂的重复肌内注射，从2mg开始并增加剂量至8mg。豚鼠以300mcg/ml剂量的TB-抗原 以及Freind不完全佐剂被皮下免疫接种至背部和shovel区域。在三周内，重复注射制剂。 在最后注射TB-抗原之后在21天内评价实验室动物的抗体反应。为了进行评 价，采血，产生血浆，并且在扩散性沉淀作用限制中以及通过免疫酵素法测试可得的特异性 TB-抗原。已显示在第一次制剂注射之后特异性抗体已经产生。在进一步的注射中，血清中 的抗体滴定度增加。在免疫周期结束后，产生了具有高TB-抗原含量的超免疫血清。在针对 免疫进行的利用TB-抗原的免疫酵素分析中，豚鼠的抗体滴定度是1 6400，兔的抗体滴定 度是1 409600及以上，因此在扩散性沉淀作用反应中滴定度是1 8和1 16_1 32。因此，在动物体内可得的重组TB-抗原导致在B-类型下重建它们的免疫系统。连 续可得的TB-抗原或其重复注射产生免疫系统的稳定重建，这通过特异性抗体在动物血清 中的滴定度扩大来证实。结核人群和细菌携带者具有特异性B-细胞免疫，其由免疫酵素试验体系(IFA)中 的TB-抗原、硝化纤维素滤器(免疫印迹，斑点印迹)上的TB-抗原以及利用含有特异性抗 体的临床液体(血清、黏痰、胸膜液、背-脑液等)的其它反应中的TB-抗原定义。对于可得的特异性抗体的结核人群和健康人群的测试血清样本提供在表中。在T-细胞免疫的形成中测试TB-抗原的比活性通过结核性取样豚鼠进行。为 进行测试，豚鼠组被注射结核活菌素BCG(皮内注射在0. 2ml稀释流体中的0. 5mg)和有 毒菌株结核分枝杆菌H37RV，RlRV的微生物细胞悬浮液以及非典型菌株堪萨斯分枝杆菌 (M. Kansassi)、海分枝杆菌(M. marinum)(腹膜内，剂量为每只动物106给微生物细胞)。在 注射之后4周内，使用观察和测试的豚鼠。为了在一般程序下取样曼塔斯试验/关于使用结核精制干燥变应原用于经皮、皮 下和皮内应用的指示(干燥精制结核菌素)。在莫斯科卫生部USSR下的医疗-预防帮助的 主要给药。1986年8月11日/5个制剂浓度，经皮注射，在IOOmcl稀释流体中在普通蛋白 质上产生lOmcg。在24小时内以毫米计算形式为局部反应的延迟类型的特异性变态反应像 细胞浸润(丘疹)。比较的制剂是由RAO “BI0PREPARAT”生产的干燥精制结核菌素(精制 干燥结核菌素)，圣彼得堡疫苗和血清研究所-PPD-L-2 (皮内注射剂量是-25TE).用于菌株贮存和维持的培养基条件和结构。菌株2-9XL不动杆菌属的博物馆培养 物在温度+4°C下在含有葡萄糖和半胱氨酸添加剂的FT-培养基原料上保持可达2个月，并 且在亲液干燥条件下在蔗糖_明胶培养基中可达5天。发酵培养基。重组菌株2-9XL约氏不动杆菌于+32°C在具有葡萄糖和半胱氨酸的 固体FT-培养基上发酵。发酵时的技术特性。重组菌株2-9XL在液体培养基中生长不良并且迅速缺乏生产 的TB-抗原能力。因此，仅在固体生长培养基上制备用于TB-抗原进一步发育的生物质增 加。基质培养物在+32°C斜面生长2-3天，然后通过生理溶液洗掉细菌，并且1_2个床 垫从一个斜面被接种。使床垫在恒温器中在+32°C温育3-4，然后通过蒸馏水洗掉隆起的生 物质，并且所述生物质通过萃取从菌种生长培养基的可溶性组分中释放。从清除了菌种生长培养基组分的生物质中开始生产重组TB-抗原。本发明通过接下来是实施例阐述。实施例1.从重组菌株2-9XL约氏不动杆菌生产型特异性糖蛋白结核性配合物 (TB-抗原)。在pH6. 6的固体菌种生长培养基(斜面)上，该培养基含有相应比例的心-脑琼 脂(cardio-cerebral agar)、水解血红蛋白、半胱氨酸和葡萄糖，或者在添加半胱氨酸和葡 萄糖的FT-琼脂pH6. 6 (由FSUE SSC AM生产，Obolensk，俄罗斯)上，通过成环接种培养物 2-9XL。使接种物在恒温箱中于+32°C温育2天。通过生理溶液洗掉两天的培养物，并制备 浓度为5X109个微生物细胞(mc)/毫升的细菌悬浮液。[制备2-9XL细菌悬浮液是困难 的，因为培养物在烧瓶中被洗掉，其在混合时难于分离]。为制备大量生物质，所制备的悬浮 液以每1-2培养床(mattress) —个斜面被接种在培养床上(将400. Oml菌种生长培养基 倒入一个培养床中)。将接种物在恒温箱中于+32°C温育2天。用30ml生理溶液将三天的 培养物2-9XL从一个培养床洗掉。从洗掉的培养物悬浮液中制备用于光学显微镜的涂片，并且在革兰氏下使其染 色。[重组菌株2-9XL的细菌种群在菌种生长培养基结构中轻微变化、温度或其它条件可以 迅速以不生产TB-抗原的形式离解。在革兰氏染色下，这些细菌是革兰氏阴性的，为TB-抗 原生产者的细菌耐受脱色作用并且看起来像是革兰氏阳性的(见图1. A-B)。在隆起的生物 质2-9XL中，革兰氏阴性细菌的量不超过5-10% ]。从培养床洗掉的细菌的悬浮液在9000 转/min在30分钟内萃取(“BeCkman”G2-21，USA)。弃掉含有菌种生长培养基的可溶性组 分的悬浮液，并将残余物悬浮于40ml去离子水中，并且所有接下来的步骤在+4°C下进行。 进一步的是通过NaOH溶液处理2-9XL 0. 5N培养物，使pH从6. 0增加到9. 0。此时将含有 型特异性重组TB-抗原的细菌荚膜以小份单独溶解并且在几小时内谨慎混合悬浮液。以此 种方式处理的细菌悬浮液被留在冰箱(+4°C )中过夜(15-16小时)。第二天将该细菌悬浮液2-9XL在12000转/min离心40分钟。将含有重组菌株 2-9XL的溶解荚膜的水部分与残留物分离。由于荚膜不完全溶解，因此以相同的顺序重复碱 处理残余物的步骤。荚膜制剂2-9XL的第一萃取部分用0. 5N三氯乙酸(TCA)溶液进行冷中和至6. 0， 并且因为其含有大量细菌，使其在15000转/min离心40分钟。弃掉残余物，并用0. 5N TCA 使上清液酸化至PH3. 0-3. 5。此时，以配合物收集TB-抗原并开始沉淀。将制剂留在冰箱 (+40C )中过夜(15-16小时)。在该溶液中放置过夜的TCA-残余物可以被保持在+4°C下 多达两星期，而不损失其中的TB-抗原的比活性。制剂的第二部分被留置在冰箱中过夜以 形成TB-抗原残留物。第三天含有放置残留物的第一制剂部分在9000转/min下离心30分钟。弃掉上清 液。将每个培养床的残留物溶解在l_2ml PBS-缓冲液(0. 0067M KH2PO4、0. 0067M Na2HPO4, 0. 138M NaCUO. 0027M KCl ρΗ7· 0)中。在PBS-缓冲溶液中，主要存在型特异性TB-抗原 (见图4Α)，其已经显示其比活性，但是需要另外的澄清。留置过夜的第二制剂部分要重复所有所需的步骤(通过0. 5Ν TCA中和至ρΗ6. 0， 从静止细胞释放，通过0. 5Ν TCA酸化至ρΗ3. 0-3. 5，以及含有放置残留物的溶液被 留置过 夜)。放置过夜的TCA-残留物可以被贮存在+4°C下达两周，而不损失其TB-抗原的比活性。
第二天将第二部分的制剂溶解在l_2ml PBS-缓冲液中。其主要含有型特异性 TB-抗原。通过上述方法生产的可用TB-抗原SDS-PAAG电泳凝胶上显示(图4A)。
合并第一和第二部分的TB-抗原并使其经历进一步的澄清。作为所进行试验的结 果，其叙述道a)重组型特异性TB-抗原位于细菌2-9XL的外部结构(外膜和荚膜物质)并 且可以通过上述步骤进行萃取和浓缩，b)在进行上述步骤时，重组菌株2-9XL的细菌实际 上未被破坏，并且与溶液中的其它物质如细菌的蛋白质、脂质和多糖相比，所产生的TB-抗 原的份额足够高。因此，可以考虑所进行的实施例是从重组菌株2-9XL约氏不动杆菌生产 TB-抗原的最经济的方法，但是其不排除通过任何其它方法生产TB-抗原的装置(细菌通过 超声或通过冻_融而分解，接下来浓缩TB-抗原)。实施例2.从重组菌株2-9XL约氏不动杆菌生产型特异性糖蛋白结核配合物 (TB-抗原)。在pH 6.6的固体菌种生长培养基(斜面)上，该培养基含有相应比例的心-脑 琼脂(cardio-cerebral agar)、水解血红蛋白、半胱氨酸和葡萄糖，或者在FT-琼脂pH 6. 6 (FSUE SSC AM产品，Obolensk，俄罗斯)上，通过成环接种培养物2-9XL。使接种物在恒 温箱中于+32°C温育三天。通过生理溶液洗掉三天的培养物，并制备浓度为5X109个微生物细胞(mc)/毫升 的细菌悬浮液。所产生的悬浮液以每1-2培养床一个斜面被接种在培养床(mattress)上(将 400. Oml菌种生长培养基倒入一个培养床中)。将接种物在恒温箱中于+32°C温育三天。用 30ml生理溶液将三天的培养物2-9XL从一个培养床洗掉。从洗掉的培养悬浮液制备用于光 学显微镜的涂片并在革兰氏下染色。(测试重组细菌2-9XL中可得的TB-抗原)。从培养床洗掉的细菌的悬浮液在9000转/min离心30分钟(“BeCkman”G2-21， USA)。弃掉含有菌种生长培养基的可溶性组分的悬浮液，并将残余物悬浮于40ml冷却的去 离子水中，并且所有接下来的步骤在+4°C下进行。此外，通过0.5N NaOH溶液处理培养物 2-9XL 0. 5N培养物，使pH从6. 0到9. 0。此时，通过以小份添加NaOH并在几小时内小心混 合悬浮液，单独进行溶解含有型特异性重组TB-抗原的细菌荚膜的步骤，并且在几小时内 谨慎混合悬浮液。以此种方式处理的细菌悬浮液被留在冰箱(+4°C)中过夜(15-16小时)。第二天将该细菌悬浮液2-9XL在12000转/min离心40分钟。将上清液(重组菌 株2-9XL的部分溶解荚膜，含有TB-抗原)与残留物(2-9XL细菌，已经保留或没有保留荚 膜)分离。通过40ml去离子水添加残留物，并重复荚膜溶解、生产第二制剂部分的步骤。所生产的荚膜2-9XL制剂通过0. 5N三氯乙酸(TCA)溶液中和至6. 0，然后添加硫 酸铵[(NH4)2SO4]至30%饱和。使溶液在+4°C下留置过夜，以便残留物沉淀。第二天在12000 转/min离心制剂40分钟。弃掉残留物(主要是其含有恰好的细菌和它们的大片段)。主 要含有TB-抗原的上清液被补充硫酸铵至100%饱和。使制剂在+4°C下留置过夜，进行沉 淀。荚膜2-9XL的第二制剂部分通过0. 5N三氯乙酸(TCA)溶液中和至6. 0，然后添加 硫酸铵[(NH4)2SO4]至30%饱和，并且使其在+4°C下留置过夜，以便沉淀。第二天，使通过硫酸铵以100%沉淀的TB-抗原沉淀制剂在12000转/min下离心40分钟。弃掉上清液，将残留物溶解在2. Oml PBS-缓冲液pH7.0中(每一个培养床)并用 大量PBS-缓冲液透析。在一 天内，PBS-缓冲液体积变化不少于三次，以从透析sac.中完全去除硫酸铵。使含有30%硫酸铵的第二制剂部分在12000转/min离心40分钟，并弃掉残留物， 用硫酸铵使上清液饱和至100%并在+4°C下留置过夜。第二天，使在100%硫酸铵沉淀下沉淀的TB-抗原第二部分制剂在12000转/min 下离心40分钟。弃掉上清液；将残留物溶解在2. Oml PBS-缓冲液pH7. 0中(每个培养床) 并用大量PBS-缓冲液透析。在一天内，PBS-缓冲液体积变化不少于三次，以从透析sac.中完全去除硫酸铵。在制剂的第一和第二部分透析之后在PBS-缓冲液中的可得的浓缩TB-抗原在 SDS-PAAG电泳上控制(图4B)。联合第一和第二部分的TB-抗原并进一步纯化。因此，从重组菌株生产并浓缩2-9XL型特异性糖蛋白结核配合物(TB-抗原)是可 能的，这不仅仅是通过借助三氯乙酸达到PH3. 5-4. 0而从碱性溶胞产物沉淀来实现，如在 实施例1中所示。利用借助各种盐例如硫酸铵的TB-抗原沉淀方法或其它方法是可能的， 洗脱物含有分子量为55. 0至75. OKDA的精制TB-抗原以及20%至50%的可利用碳水化合 物。实施例3.从重组菌株2-9XL约氏不动杆菌生产的型特异性糖蛋白结核配合物 (TB-抗原)的净化。在低压下利用Si^phadex G-200作为基质，通过凝胶过滤通过分馏大分子进行特异 性结合抗原2-9X进一步纯化。将通过沉淀溶胞产物0. 5N TCA或100 %硫酸铵沉淀(实施例2)而生产的PBS-缓 冲液中的合并的浓缩TB-抗原应用于尺寸为25X600的柱。作为洗脱物，使用的是50TM TRIS-HCl pH7. 5溶液，其中添加有IOOmM NaCl，洗脱速度为25ml/小时。收集峰；通过 Bradford描述的方法测量蛋白质[4]。总碳水化合物含量(Total carbohydrate containt) 通过酚染色法确定[5]。取决于从微生物细胞的溶解荚膜中沉淀TB-抗原的类型(实施 例1和2)、所应用样本的体积和蛋白质浓度，洗脱物含有分子量为55. 0至75. OKDA的精制 TB-抗原以及20%至50%的可利用碳水化合物。将特异性结核重组抗原在亲液干燥状态下贮存于+4°C下。通过上述方法生产的可用TB-抗原及其结构在SDS-PAAG电泳凝胶中显示(图 4C)。生产精制TB-抗原是可能的，其不仅仅利用各种载体作为基质通过凝胶过滤分馏 大分子，也可以通过离子交换层析。实施例4.在人类结核病诊断学中使用精制型特异性TB-抗原。在人类结核患者的潜在、慢性和急性形式下，对特定药剂-M.结核H37Rv具有特异 性的抗体在他们的血液中形成，其使得通过所述症状来诊断疾病成为可能。为寻找特异性抗体，使用了试验系统，其恰好是具有相分离的间接免疫酵素分 析，其中作为固体载体，使用的是96-it Jiflno HcicacneuHiHHecKHX
a η τ η τ e Ji HcnoJTLsyIOTTeCT-CHCTeMy, KOTopannpΘΑ0ΤΕΒπΗΘΤ0θ6θ ΗβΠρΗΜθ ΗΜΜγΗθφθρΜΘΗΤΗω HaHajiMscpasflejieHHeMiJiaSjrfleBKaHecTBeTBep
AoroHOCHTeiiflHcnoiitsyIOT 96-孔板。ELISA 底物是结核抗原，其通 过层析分馏由重组菌株2-9X产生。
向板孔中引入IOOmcl在磷酸缓冲液中的浓度为lOmcg/ml抗原，并使它们在室温 下温育18小时。将小细胞用含有0. 05% Tween 20的缓冲生理溶液pH7. 2 (BPS)洗涤三次， 洗干净，并在1小时内补充牛血清白蛋白在BPS中的溶液。在三次洗涤干净之后，向板 的第一条垂直线的孔中引入IOOmcl血液天然血清——其不含1 200稀释的特异性抗体 (阴性对照)，以及向第三至第十二垂直线的孔引入相同体积的BPS。然后向第二垂直线的每个孔中添加200mcl的1 100稀释的测试血清，并且通过 八端自动吸管通过双重步骤对它们进行滴定，从最后一条线移走IOOmcl。为稀释血清，使用 的是BFS pH 7.2。板在37°C温育1小时。作为阳性对照，使用的是具有先前已知的高滴度 的特异性抗体的血清(校准)。板孔之一(最后一个)被留下以控制底物，向偶联物中添加 IOOmcl底物。在通过体积为170mcl的BPS-0. 05% Tween 20五次将板洗涤干净而移走非 结合抗体之后，添加免疫球蛋白，以用于重复结合IOOmcl拟模式IgG抗体与免疫球蛋白A、 M、G，其通过辣根过氧化物酶(Sigma)以1 5000的工作稀释结合。将反应混合物在37°C温育1小时，之后通过BPS-Tween 20洗涤细胞五次，洗干 净。向IOml新制备的0. IM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲溶液pH5.0中的0.04%染色体基因 AzBTS(ApliHem)添加3mcl 30% H2O2，制备底物溶液，并向每个孔中添加IOOmcl溶液。为开发染色反应，将板在+37°C温育1小时，引入IOOmcl SDS以终止发酵反 应，并在Bio-Rad公司型号680的垂直光度计上测量405nm下的吸光度值。将结果与空白垂 直线孔比较，在空白垂直线孔中存在无特异性抗体的血清(图5)。如其在图5中所示，精制 重组TB-抗原仅与结核病患者的血清抗体相互作用而不与健康人群的血清抗体相互作用。因此，重组TB-抗原2-9XL在固相载体上、硝化纤维素膜上以及在其它试验系统中 用于诊断目的，通过其可鉴定特异性抗体，该抗体由人体产生而可利用或者产生结核病介 质——M.结核H37Rv。由人体响应结核病介质在其中穿透和发展而产生的特异性抗体不仅 可见于血浆中，而且可见于其它临床液体(黏痰、渗出物、尿等)中。响应精制重组TB-抗原而产生的各种动物(兔、小鼠、豚鼠等)的单克隆抗体或超 免疫血清可用于诊断方法，以在人类的临床液体中(黏痰、渗出物、微或组织检查材料等) 搜寻结核大细菌和特异性组分。上面提供的实施例提取和利用了产生自基因_工程菌株2-9XL约氏不动杆菌的重 组型特异性结核抗原——其对人类和动物是安全的，所述实施例证明，给定的微生物作为 有用的产品来源，可在公众健康和医学中广泛使用，用于诊断、预防和治疗人类结核病。考虑到重组菌株约氏不动杆菌9XL的特性，特定微生物29. 11.05以索引 VKPMB-9312保藏于全俄微生物菌种保藏中心(ACIM)FSUEState RI Genetics。文献名单S. Arruda, G. Bomfim. R. Rnights, T. Huima-Byron, L.W.Riley “ Cloning of Μ.tuberculosis DNA Fragment Associated with Entry andSurvival inside Cells" Science" ，1993，N261(5127)，p.1454-1457。
C. Man c a , K. Lyaschenko, H. G. W i k e r , D . U s ai , R. Colangeli , Μ. L. Gennaro. " Molecular Cloning,Purification and SerologicalCharacterization of MPT63,a Novel Antigen Secreted by Mycobacteriumtuberculosis。G. Hart, Bai-yu Lee, M. A. Horwitz. " High-Level HeterologousExpression and Secretion in Rapidly Growing NonpathogenicMycobacteria of Four Major Mycobacterium tuberculosis ExtracellularProteins Considered to Be Leading Vaccine Candidates and DrugTargets. ” Infection and Immunity “ ，June 1997, p.2321-2328。Bradford. Anal. Biochem. 72, 248 (1976) , and also Anal. Biochem. 86, 142(1978)。F. Gerhard "Methods of general bacteriology，，1984, v. 2。表通过免疫酵素方法在不同人集合的血清样本中对抗人类结核病介质的可用抗体 的诊断(诊断方法在实施例4中给出)
对抗结核病介质的可用的抗体；0.3>OD<0.6 -不确定的结果(“灰色区域”)； OD<0.3 -表示没有针对结核病介质的抗体；MBT+ - “结核病”诊断通过从患者中 回收到分枝杆菌而被证实；MBT-“结核病”诊断通过临床放射学方法证实。HIV-人类免疫缺陷病毒；VHV-乙型肝炎病毒；VHC-丙型肝炎病毒。结论1.从227个结核病患者的血清样本中，71. 4%检测到对抗结核病介质M.结 核H37Rv的抗体。在45个供体(健康人群)的血样中，没有检测到对抗结核病介质M.结核H37Rv 的抗体。在危险组的血清样本中，对抗结核病介质M.结核11371^的可得抗体是2.3%至 18. 2%。
权利要求
重组菌株2-9XL约氏不动杆菌VKPM-9312，为型特异性糖蛋白结核配合物结核分枝杆菌H37 Rv(TB-抗原)的生产者，其被保藏在工业微生物遗传和选择研究所。
2.生产型特异性糖蛋白结核配合物结核分枝杆菌H37Rv(TB-抗原)的方法，其特征在 于重组菌株2-9XL约氏不动杆菌的培养物在菌种生长培养基在32°C发酵2-3天、通过生理 溶液洗掉，离心所产生的细菌悬浮液，使通过NaOH溶液处理至pH6. 0-9. 0的残余物在15-16 小时内在4°C悬浮于水中，离心所产生的悬浮液，残留物通过NaOH溶液重复处理，并且将含 有菌株2-9XL的溶解细菌荚膜的上清液通过0. 5NTCA溶液中和至pH6. 0，离心，以及向所述 悬浮液中添加0. 5N TCA溶液至pH3. 0-3. 5，将所述溶液保持15-15小时以产生TB-抗原的 配合物，此时，在通过NaOH溶液重复处理的一部分残留物的情况下，含有TB-抗原配合物的 第一和第二溶液以所述顺序通过TCA溶液中和，在TCA处理之后沉淀，离心并将所产生的含 有TB-抗原的残留物溶解在PBS缓冲液中，合并溶液并通过在S印hadex G-200分馏凝胶过 滤或通过离子交换层析进行纯化，洗脱物含有分子量为55. 0至75. 0KDA的精制TB-抗原和 20至50%的可利用碳水化合物。
3.生产型特异性糖蛋白结核配合物结核分枝杆菌H37Rv(TB-抗原)的方法，其特征在 于重组菌株2-9XL约氏不动杆菌的培养物在菌种生长培养基在32°C发酵3天、通过生理溶 液洗掉，离心所产生的细菌悬浮液，使通过NaOH溶液处理至pH6. 0-9. 0的残余物在15-16 小时内在4°C悬浮于水中，离心所产生的悬浮液，残留物通过NaOH溶液重复处理，并且将 含有菌株2-9XL的溶解细菌荚膜的上清液通过0. 5N TCA溶液中和至pH6. 0，添加硫酸铵至 30 %饱和度，保持在4°C，离心，向所述上清液中添加硫酸铵至100 %饱和，保持在4°C，此 时，由NaOH溶液重复处理的残留部分借助TCA进行中和，并且将100%硫酸铵饱和之后产生 在上述顺序两种残留物中的硫酸铵沉淀溶解在PBS-缓冲液pH7. 0中，用大量PBS缓冲液透 析，合并含有TB-抗原的浓缩溶液并通过在S印hadex G-200进行凝胶过滤分馏或通过离子 交换层析进行纯化，洗脱物含有分子量为55. 0至75. 0KDA的精制TB-抗原和20至50%的 可利用碳水化合物。
4.形成对抗结核分枝杆菌H37Rv的B-和T-细胞免疫的工具，其含有通过菌株2-9XL 约氏不动杆菌生产的型特异性糖蛋白结核配合物(TB-抗原)结核分枝杆菌H37 Rv，其特征 在于pt. lo
5.诊断结核病的工具，其含有通过pt.2下的方法生产的型特异性糖蛋白结核配合物 (TB-抗原)结核分枝杆菌H37 Rv。
全文摘要
本发明涉及生物药学、制备生物化学医学领域，尤其涉及由微生物制备的基于结核性络合物制剂，其能够用于肺结核的预防、治疗和诊断。在组合物中包括对人、动物和环境无害的重组2-9XL约氏不动杆菌菌株，及其染色体、染色体DNA片段。肺结核H37 Rv能够同时人工合成若干蛋白质用于在细菌外膜和包膜中形成稳定的种特异性的结核性糖蛋白。不使用重组2-9XL菌株，而使用标准培养基，种特异性结核络合物合成的稳定性，稀释和纯化结核性络合物的经济性和易于实施使所述微生物潜在生产试剂体现的特能够性形成T和B细胞免疫来对抗M.肺结核病原。
文档编号A61K39/04GK101861166SQ200880024159
公开日2010年10月13日 申请日期2008年4月29日 优先权日2007年5月10日
发明者尼古拉·尼古拉耶维奇·丝里奇凯 申请人:百特有限公司