专利名称：用于调节her3的rna拮抗剂化合物的制作方法
用于调节HER3的RNA拮抗剂化合物本发明涉及寡聚化合物(寡聚物)，其靶向细胞中的HER3mRNA，导致HER3 的表达降低。HER3表达的降低对于许多医学病症是有益的，例如过度增生性疾病 (hyperproliferative diseases)，包括癌症。本发明提供了包含寡聚物的治疗组合物以及 使用所述寡聚物调节HER3的表达的方法，包括治疗方法。相关的案件以下相关的申请在此引用作为参考，US 60/917, 392和US 61/023, 250。背景HER3属于受体酪氨酸激酶的ErbB家族，其包括四种不同的受体ErbB_l (EGFR、 HER1)、ErbB-2 (neu, HER2)、ErbB-3 (HER3)和 ErbB_4(HER4) (Yarden 等人，Nat. Rev. Mol. Cell.Biol,2001,2(2) :127_137)。这个家族的受体蛋白由细胞外配体结合区域、疏水的跨 膜区域和细胞质的含酪氨酸激酶的区域组成。EGF家族的生长因子结合大多数ErbB受体并 活化它们。Her-3 (ErbB3)特征在于缺乏酪氨酸激酶活性。EGFR、HER2和近来的HER3已经与 肿瘤形成相关联。例如，近来的研究已经表明，当与它们的正常组织对应物相比较时，EGFR 在许多恶性的人组织中过表达。编码EGFR的基因的过表达、扩增、删除和结构重排的高发 生率已经在脑肿瘤的活检中发现。在多形性胶质母细胞瘤肿瘤中EGFR基因的扩增是已知 的最一致的遗传学改变之一。ErbB-3mRNA水平的提高已经在人乳腺癌中检测到。近来，已 经表明，使用酪氨酸激酶抑制剂对Her2和EGFR酪氨酸激酶活性的抑制作用显示对HER2驱 动的乳腺癌作用有限，因为HER3表达的代偿性提高和随后通过PI3K/Akt途径的信号转导 (Sergina 等人，Nature, 2007,445 :437_441)。对于能够有效地抑制HER3功能的药物存在着需求。发明概述本发明提供长度为10-50个核碱基(例如10-30个核碱基)的寡聚物，其包含总 共为10-50个核碱基，或10-30个核碱基的连续(contiguous)核碱基序列，其中所述连续 核碱基序列与哺乳动物HER3基因或mRNA，例如SEQ IDNO :197，或其天然存在的变体的对应 区至少80%同源。本发明提供长度为10-50个核碱基的寡聚物，其包含总共为10-50个核碱基的连 续核碱基序列，其中所述连续核碱基序列与选自SEQ ID No 200-227的核酸序列的对应区 至少80%同源。本发明提供了长度10-50个核碱基的寡聚物，其包含总共10-50个核碱基的连续 核碱基序列，其中所述连续核碱基序列与选自SEQ ID N0:1-140和228-233的核酸序列的 对应区至少80%同源。本发明进一步提供包含根据本发明的寡聚物的缀合物，如以下缀合物，其除了包 含寡聚物的核碱基序列外还包含至少一个共价连接至本发明的寡聚物的非核苷酸(即非 核碱基)或非多核苷酸部分。该非核苷酸/非核碱基或非多核苷酸部分可由以下组成或包 含以下固醇基团如胆固醇，或促进进入细胞的其它部分(moiety)。本发明提供包含根据本发明的寡聚物的缀合物，如以 下缀合物，其除了包含寡聚物的核碱基序列外还包含含带正电部分的聚合缀合物，如聚乙二醇(PEG)-即根据本发明 的寡聚物可任选被聚乙二醇化。本发明提供了药物组合物，其包含根据本发明的寡聚物或缀合物，和药学上可接 受的稀释剂、载体、盐或佐剂。本发明提供了根据本发明的寡聚物或缀合物，其用作药物，例如用于治疗本文涉 及的一种或多种疾病，例如用于治疗过度增生性疾病如本文涉及的那些，例如癌症。
本发明进一步提供了根据本发明的寡聚物，其用于医药。本发明提供了根据本发明的寡聚物或缀合物在制备或制造用于治疗过度增生性 疾病，例如本文涉及的那些，例如癌症的治疗的药物中的用途。本发明提供了治疗过度增生性疾病，例如本文涉及的那些，例如癌症的方法，所述 方法包括向需要治疗的患者，例如患有或可能患有过度增生性疾病，例如本文涉及的那些， 例如癌症的患者给药根据本发明的寡聚物、缀合物或药物组合物。本发明提供了在表达HER3的细胞中抑制HER3的方法，所述方法包括向所述细胞 给药根据本发明的寡聚物或缀合物以在所述细胞中实现HER3的抑制。进一步提供的是下调(down-regulate)细胞或组织中HER3、任选的还有EGFR和/ 或HER2的表达的方法，包括在体内或体外用本发明的一种或多种寡聚物、缀合物或组合物 接触所述细胞或组织。还公开的是治疗认为患有或易于疾病或病症的动物、哺乳动物或人的方法，所述 疾病或病症与HER3 (和/或EGFR和/或HER2)的表达或过表达相关，通过向所述动物或人 给药治疗或预防有效量的本发明的一种或多种寡聚物、缀合物或组合物。进一步的，提供了使用寡聚物抑制HER3和任选的还有EGFR和/或HER2的表达、 以及治疗与HER3 (和/或EGFR和/或HER2)活性相关的疾病的方法。本发明提供了治疗疾病或病症，例如本文涉及的那些，例如过度增生性疾病，例如 癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者给药根据本发明的寡聚物、缀合物或药物组合 物。本发明提供了抑制或降低细胞或组织中HER3以及任选的还有EGFR和/或HER2 的表达的方法，所述方法包括用根据本发明的寡聚物、缀合物或药物组合物接触所述细胞 或组织的步骤，使得HER3以及任选的还有EGFR和/或HER2的表达被抑制或降低。本发明提供了触发细胞例如癌细胞中的细胞凋亡的方法，所述方法包括用根据 本发明的寡聚物、缀合物或药物组合物接触所述细胞的步骤，使得HER3、以及任选的还有 EGFR和/或HER2的表达被抑制或降低，和/或细胞凋亡被触发。本发明进一步提供了寡聚物，其包含或由连续核碱基序列组成，所述连续核碱基 序列与选自SEQ ID NO 1-140和228-233和SEQ ID NO :200_227的序列，例如选自SEQ ID NO :200、211、54和1的序列的对应区至少80%同源。本发明进一步提供了寡聚物，其包含或由连续核碱基序列组成，所述连续核碱基 序列相应于在选自 SEQ ID NO 169-196 和 SEQ ID NO :234，例如 SEQ ID NO 169 或 SEQ ID NO 180的序列中存在的等价序列。本发明进一步提供了寡聚物，其包含以下序列或由以下序列组成选自SEQ ID NO 169-196和234的序列，例如SEQ ID NO 169或180，或其包含以下序列或由以下序列组成与所述序列相应的连续核碱基序列。附图
的简要说明附图 1:分别与 SEQ ID NO :1、16、17、18、19、34、49、50、51、52、53、54、 55、56、57、 58、59、74、75、76、91、92、107、122、137、138、139 和 140 的寡核苷酸序列相应的 HER3 靶序列 以粗体和下划线显示，表明它们在HER3转录产物中的位置(Genbank登记号匪001982-SEQ IDNO 197)。附图2 在转染后24小时，在15PC3中的HER3mRNA的表达，SEQ IDNO :169_179附图3 在转染后24小时，在15PC3中的EGFR mRNA的表达，SEQ IDNO :169_179附图4 在转染后24小时，在15PC3中的HER2mRNA的表达，SEQ IDNO :169_179附图5 在转染后24小时，在15PC3中的HER3mRNA的表达，SEQ IDNO 180-194附图6 数据显示了细胞凋亡，其通过在用5和25nM浓度的寡核苷酸转染的HUH7 细胞中，在不同的时间点的活化的Caspase 3/7 (半胱氨酸蛋白酶3/7)而测定。结果相对 于模拟品(mock)处理的细胞来绘图，SEQ ID NO :235是乱序对照(scrambled control)的 寡核苷酸。附图7 数据显示了活细胞，其通过在用5和25nM浓度的寡核苷酸转染的HUH-7细 胞中，在不同的时间点使用MTS实验测定0D490值而测定。SEQ ID NO :235是乱序对照的
寡核苷酸。附图8A 数据显示了以25和50mg/kg q3dxl0用SEQ ID NO 180静脉注射治疗的 雌性裸小鼠上移植的15PC3异种移植肿瘤中肿瘤体积的改变百分比。盐水处理的小鼠用作 对照。附图8B 数据显示了以25和50mg/kg q3dxl0用SEQ ID NO 180静脉注射治疗的 雌性裸小鼠上移植的15PC3异种移植肿瘤中的HER3mRNA表达。结果相对于GAPDH标准化， 以盐水治疗对照的％表示。附图9 数据显示了在SEQ ID NO 180或SEQ ID NO 234连续三天用1或5mg/kg 寡核苷酸静脉注射治疗之后小鼠肝脏中的HER3mRNA的表达。结果相对于GAPDH标准化，以 盐水治疗对照的％表示。发明的详细说明寡聚物 本发明提供了用于调节HER3 (和/或EGFR和/或HER2)的表达的序列、组合物 和方法。特别是，本发明涉及HER3基因中的靶序列，其序列信息适合于用来产生能够下调 HER3的表达的相应的反义寡核苷酸。本发明进一步提供了特异性地与编码HER3的核酸杂 交的寡核苷酸(寡聚物)，和其药物制剂，以及它们用于治疗与HER3表达相关的疾病，特别 是癌症疾病的用途。本发明的寡核苷酸已经显示了下调HER3的表达。本发明的寡核苷酸 已经显示了还下调HER3的表达、以及在某些情况下还下调HER2和/或EGFR的表达。术语HER3在此与术语ErbB_3可互换使用。本发明采用了寡聚化合物(在此称为寡聚物)，用于调节编码哺乳动物HER3的核 酸分子，例如SEQ ID NO 197中所示的HER3核酸、以及编码哺乳动物HER3的这种核酸分子 的天然存在的变体(variants)的功能。在本发明的上下文中术语“寡聚物”是指通过两个或更多个核碱基(即，寡核苷酸)的共价连接形成的分子。在此，每个单独的核碱基还可以被称为单体或单元。寡聚物 包含或由长度10到50个，例如10到30个核碱基的连续核碱基序列组成。寡聚物可以包含天然的核苷酸单元，例如核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)， 或核酸类似物，或其混合物，如本文涉及的那些，优选包括锁核酸(LNA)。因而其包括由天然 存在的核碱基、糖和核碱基间连接构成的寡聚物，以及具有非天然存在的核碱基的寡聚物， 所述非天然存在的核碱基类似地起作用或具有特别改善的功能。完全或部分修饰的或取代 的寡聚物相对于天然形式常常是优选，因为这样的寡聚物具有一些期望的性质，例如，穿透 细胞膜的能力、对细胞外和/或细胞内核酸酶的良好抗性，以及对核酸靶的高亲和力和特 异性。考虑到上述的性质，例如，LNA类似物是特别优选。因此，在特别优选实施方式中，根 据本发明的寡聚物由核苷酸和核苷酸类似物单元(例如LNA单元)构成或由来自不同类的核苷酸类似物单元构成，形成10-50个、优选10-25个核碱基、更优选10-16个核碱基、再更 优选12-16个核碱基的寡核苷酸。在多种实施方式中，本发明的寡聚物不包含RNA (单元)。优选是，根据本发明的化 合物是链状分子，或合成为链状分子。所述寡聚物是单链的分子，优选不包含与相同寡聚物 内的等价区域(即，双链体(duplexes))互补的例如至少3、4或5个连续核碱基的短区，就 此来说，所述寡聚物(基本上(essentially))不是双链的。在多种实施方式中，所述寡聚 物基本上不是双链的，例如，不是siRNA。所述寡聚物包含连续核碱基序列或由连续核碱基 序列组成。在多种实施方式中，本发明的寡聚物可以完全由连续核碱基区组成。所述寡聚 物包含连续核碱基序列或由连续核碱基序列组成。在多种实施方式中，所述寡聚物的核碱 基序列由连续核碱基序列组成。然而，还设想的是，所述寡聚物可以包含一般在5'或3'末端之一侧翼于所述连 续核碱基序列的其它核碱基序列，或在5'和3'末端两处的进一步的核碱基序列。适当 地，这些5'和/或3' “侧翼”区域可以是长度1、2、3、4、5或6个核碱基。处在本发明的 寡聚物的末端的DNA或RNA核碱基预期当在体内使用时被内源的核酸外切酶从寡聚物上裂 解，因而包含侧翼的DNA或RNA单元可不影响所述寡聚物的体内性能。这些进一步的核碱 基或碱基可以相当于在本文缺口聚物(gapmer)寡聚物的上下文中描述的D区。在多种实 施方式中，所述一个或多个进一步的核碱基是核苷酸类似物，其在体内稳定所述寡聚物，例 如，保护寡聚物免于核酸酶(例如，在此描述的核苷酸类似物)降解。在多种实施方式中，所述连续核碱基序列的3'末端侧翼是1、2或3个DNA或RNA 单元。3' DNA单元常常在寡聚物的固态合成期间使用。在多种实施方式中，其可以是相同 的或不同的，所述连续核碱基序列的5'末端侧翼是1、2或3个DNA或RNA单元。革巴哺乳动物HER3优选是人HER3，例如由SEQ ID NO 197所示核酸编码的HER3，或天 然存在的变体，例如其等位变体(allelic variant)或同工型。 在此使用的术语“靶核酸”是指编码哺乳动物HER3多肽(和/或Her2和/或EGFR 多肽)的DNA,即HER3 (和/或Her2和/或EGFR)多肽编码核酸，例如，人HER3如SEQ ID NO 197，或其天然存在的变体，及由其衍生的RNA核酸，优选mRNA，例如pre-mRNA，而优选成 熟的mRNA。在多种实施方式中，例如，当在研究或诊断中使用时，所述“靶核酸”可以是源自 上述DNA或RNA核酸靶的合成的寡核苷酸或cDNA。根据本发明的寡聚化合物优选能够与靶核酸杂交。术语“靶核酸”在多种实施方式中可以是例如哺乳动物HER3mRNA，例如SEQ ID N0:197。其他哺乳动物HER3mRNA的实例包括，但不限于，具有登记号匪010153(小鼠 HER3mRNA)；匪 017218 (大鼠 HER3mRNA)；或 XM 509131 (预测的黑猩猩 HER3mRNA)的那些。当然，应当认识到，上述登记号涉及cDNA序列而非mRNA序列本身，成熟的mRNA序 列当然地可以从cDNA序列直接得出——胸腺嘧啶(T)残基被尿嘧啶(U)残基替代。如在此使用的，“杂交”是指在互补的核苷酸/核碱基碱基之间的氢键合，其可以是 Watson-Crick、Hoogsteen、反向的Hoogsteen氢键合，等等。Watson和Crick在大约五十年 前显示了，脱氧核糖核酸(DNA)由两条链组成，这两条链通过在两链中相对的互补核碱基 之间形成的氢键以螺旋构型保持在一起。通常在DNA中存在的四种核碱基是鸟嘌呤(G)、腺 嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)，其中G核碱基与C配对，A核碱基与T配对。在RNA 中，核碱基胸腺嘧啶被核碱基尿嘧啶(U)替代，其与T碱基类似地与A配对。参与标准双螺 旋形成的核碱基中的化学基团构成了 Watson-Crick面。几年后Hoogsteen显示了嘌呤核 碱基(G和A)除了它们的Watson-Crick面之外具有Hoogsteen面，其可以从双螺旋的外部 识别，用于通过氢键结合嘧啶寡核苷酸，从而形成三螺旋结构。高度优选是，本发明的化合物能够与靶核酸例如mRNA杂交。本发明的适合的寡聚物能够抑制，例如，下调HER3基因的表达。所述寡聚物当被 导入表达HER3基因的哺乳动物细胞例如人细胞时，优选引起H ER3mRNA水平的降低，引起 细胞中HER3表达水平的降低。所述寡聚物当被导入表达HER3基因的细胞中时，优选引起 HER3mRNA水平的降低，引起细胞中HER3的表达水平的降低。在人细胞中，HER3以两种选择 性剪接同工型(spliced isoforms) (NP 001973. 2和NP 001005915. 1，其氨基酸和相应的 核酸在此引用作为参考)存在。同工型1是更长的同工型，由mRNANM 001982编码，在此引 用作为参考。靶mRNA可以是两种“同工型”之一或两者，而在多种实施方式中，编码同工型 1的mRNA是靶mRNA。例如，SEQ ID NO 180靶向两种同工型。在多种实施方式中，当所述寡聚物被导入表达HER2基因的哺乳动物细胞，例如人 细胞中时，优选引起HER2mRNA水平的降低，引起细胞中HER2表达水平的降低。在多种实施方式中，当所述寡聚物被导入表达EGFR基因的哺乳动物细胞，例如人 细胞中时，优选引起EGFR mRNA水平的降低，引起细胞中EGFR表达水平的降低。人HER2mRNA 显示为 SEQ ID NO :199。人 EGFR mRNA 显示为 SEQIDN0 :198。在多种实施方式中，本发明的寡聚物结合至靶核酸，且与正常的表达水平相比产 生至少10 %或20 %的表达抑制作用，更优选与正常的表达水平相比至少30 %、40 %、50 %、 60%、70%、80%、90%或95%的抑制。在某些实施方式中，当使用1到25nM的本发明的化 合物时观察到这种调节。在相同的或不同的实施方式中，表达的抑制低于100%，例如低于 98%的抑制、低于95%抑制、低于90%抑制、低于80%抑制，例如低于70%抑制。表达水平 的调节可以通过测量蛋白水平来确定，例如，通过例如SDS-PAGE随后使用针对靶蛋白产生 的适合的抗体的蛋白质印迹的方 法。或者，表达水平的调节，例如抑制，可以通过测量mRNA 的水平，例如，通过RNA印迹或定量RT-PCR来确定。当通过mRNA水平测量时，在使用合适 的剂量，例如1到25nM浓度时，在多种实施方式中，抑制或下调的水平一般达到不存在本发 明的化合物的情况下正常水平的10-20 %的水平。
本发明因而提供了在表达HER3.蛋白和/或mRNA的细胞中下调或抑制HER3蛋白 和/或mRNA的表达的方法，所述方法包括向所述细胞给药根据本发明的寡聚物或缀合物来 下调或抑制所述细胞中HER3蛋白和/或mRNA的表达。适合地，所述细胞是哺乳动物细胞， 例如人细胞。在多种实施方式中，给药可以发生于体外。在多种实施方式中，给药可以发生 于体内。在此使用的术语“靶核酸”是指编码哺乳动物HER3多肽例如人HER3的DNA，例如 SEQ ID NO: 197。HER3编码核酸或其天然存在的变体，和由此衍生的RNA核酸，优选mRNA， 例如pre-mRNA，而优选成熟的mRNA。在多种实施方式中，例如，当在研究或诊断中使用时， 所述“靶核酸”可以是源自上述DNA或RNA核酸靶的合成的寡核苷酸或cDNA。根据本发明 的寡聚物优选能够与靶核酸杂交。术语“其天然存在的变体”是指HER3多肽或核酸序列的变体，其在规定的分类群， 例如哺乳动物，例如小鼠、猴和优选人中天然地存在。一般地，当涉及多核苷酸的“天然存 在的变体”时，该术语还可涵盖HER3编码基因组DNA (在染色体Chr 12 54. 76-54. 78Mb处 通过染色体转位或复制存在的)，以及RNA(例如，由此衍生的mRNA)的任何等位变体。“天 然存在的变体”还包括来自HER3mRNA的选择性剪接的变体。当涉及特定的多肽序列时，例 如，该术语还包括天然存在形式的蛋白质，因此其可被加工，例如，通过其翻译时或翻译后 修饰，例如信号肽裂解、蛋白酶裂解(proteolytic cleavage)、糖基化，等等。变体序列，例如，但不限于等位变体(例如HER3)基因存在于人基因座染色体Chr 12 54. 76-54. 78Mb上，这样的靶序列也在本发明的范围内。变体序列可以与HER3中的靶序 列具有至少60%、更优选至少70%、更优选至少80%、更优选至少85%、更优选至少90%、 更优选至少95%或至少98%的序列同源性。一般地，与所述变体序列相应的本发明的寡 聚物仍然能够下调HER3。应当理解的是，来自HER2和/或EGFR基因的靶序列可以具有 与H ER3靶序列的该同源性，且与所述变体序列相应的本发明的寡核苷酸可以仍然能下调 HER3。术语“至少一个(种)”包含大于或等于1的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等等。在多种实施方式中，例如当涉及本发明的化合物的 核酸或蛋白质靶时，术语“至少一个(种)”包括术语“至少两个(种)”和“至少三个(种)” 和“至少四个(种)”等等的术语，“至少两个(种)”可以包含术语“至少三个(种)”和 “至少四个(种)”。序列本发明提供了寡聚物、组合物和方法，其用于下调HER3 (和任选HER2和/或EGFR) 的表达。特别是，本发明涉及靶向HER3的寡聚物和寡核苷酸序列。同时对于靶HER3mRNA/ cDNA序列寡核苷酸在哪里设计没有限制，在多种实施方式中，所述寡核苷酸序列包含下列 序列、或来源于(例如包含所述SEQ ID内存在的相应的连续核碱基序列)下列序列选自 SEQ ID NO -.200-227 的序列。所述寡聚物包含连续核碱基序列或由连续核碱基序列组成，所述连续核碱基序 列相应于存在于所述靶核酸例如SEQ ID NO 197或选自SEQ IDNO 200-227、1-140和 228-233(参见表1)的序列的核苷酸序列，其中所述寡聚物(或其连续核碱基部分)可以任 选地包含相对于所述被选序列的一个、两个或三个错配。包含16个核碱基的寡聚物序列的实例示于 SEQ ID NO :1、16、17、18、19、34、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、74、75、76、 91、92、107、122、137、138、139和140。更短的序列可以来自其中。更长的序列可以包括来 自SEQ ID NO中例示的那些的全部或至少10个核碱基。本发明进一步提供了 HER3基因中的靶序列，特别是与SEQ ID NO :1_140相应(即， 其反向补体)的那些，其中与所述靶序列相应的反义寡核苷酸(寡聚物)能够下调HER3。 例如，分别与反义寡核苷酸序列 SEQ ID NO :1、16、17、18、19、34、49、50、51、52、53、54、55、 56、57、58、59、74、75、76、91、92、107、122、137、138、139 和 140 相应的靶序列在附图 1 中示 出(粗体和下划线的，具有上文所述的相应的寡聚SEQ ID NO)。还公开了寡核苷酸的设 计，例如在SEQ ID N0:141-168中所示的那些。还公开了 LNA寡核苷酸的具体的设计，例如 在 SEQ ID NO: 169-196 和 234 中所示的那些，尤其是在 SEQ ID NO 169、170、173、174、180、 181、183、185、187、188、189、190、191、192、194 和 / 或 SEQ ID NOS :169、170、172、174、175、 176和179中所示的那些。在一个实施方式中，本发明的寡聚物包含或由SEQ ID NO :169、 180或234组成，或者包含或由与SEQ IDNO 169、180或234相应的连续核碱基序列组成，或 是其缀合物的形式。在优选实施方式中，本发明的寡核苷酸被认为是HER3mRNA和蛋白质表 达的有效的抑制剂。在一个方面，本发明提供了能够结合HER3基因的靶序列并下调HER3的表达的反 义寡核苷酸(寡聚物)，所述寡核苷酸包含下列序列或由下列序列组成与靶序列相应的 10-50个、优选10-25个核碱基、更优选10-16个核碱基的(连续)序列，并且其中优选至少 两个所述的核碱基是核苷酸类似物。这样的寡聚序列的实例的列表在表1中给出(实施例 3)。优选，寡核苷酸序列包含10-16个核碱基的序列。包含16个核碱基的寡核苷酸序 列的实例示于选自 SEQ ID NO :1、16、17、18、19、34、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、
74、75、76、91、92、107、122、137、138、139和140 的 SEQ ID。具有更少的核碱基，例如 10、11、 12、13、14或15个核碱基的寡核苷酸序列，因而可以具有与子序列相应的连续核碱基序列， 例如在 SEQ ID NO :1、16、17、18、19、34、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、74、75、76、 91、92、107、122、137、138、139和140中存在的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至 少13、至少14或15个连续核碱基。因而，更短的序列可以来自其中。更长的序列可以包 括来自SEQ ID NO中例示的那些的全部或至少10个核碱基。一般地，如果寡核苷酸的仅一 部分序列是选自 SEQ ID NO :1、16、17、18、19、34、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、74、
75、76、91、92、107、122、137、138、139和140的SEQID，则寡核苷酸的序列的其余部分与所 述SEQ ID侧翼的相应核苷酸同源。两个感兴趣的序列基序为SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :54。本发明的寡聚物包含缺口聚物或由缺口聚物核碱基序列组成，所述缺口聚物核碱 基序列选自 SEQ ID NO 141 到 168，例如 SEQ ID NO 141 禾口 152。在某些实施方式中，所述寡聚物可以包含连续核碱基序列或由连续核碱基序列组 成，所述连续核碱基序列与编码哺乳动物HER3的核酸的等价区域完全互补(或完美互补)， 艮口，包含反义核苷酸序列。然而，在某些实施方式中，当与靶序列杂交时，所 述寡聚物可以包含1、2、3或4个 (或更多个)错配，并仍然足以结合靶以显示期望的效果，即，靶的下调。例如，错配可以通过提高寡聚物核碱基序列的长度和/或提高核碱基序列中存在的核苷酸类似物(如LNA) 的数量来补偿。在多种实施方式中，所述连续核碱基序列包含相对于靶序列，例如相对于编码哺 乳动物HER3的核酸的对应区的不超过3个，例如不超过2个的错配。在多种实施方式中，连续核碱基序列包含相对于靶序列，例如编码哺乳动物HER3 的核酸的对应区的不超过1个的错配。本发明的寡聚物的核碱基序列或连续核碱基序列优选与选自SEQ IDNO =200-227, 1-140和228-233的相应序列至少80%同源，例如至少85%、至少90%、至少91%、至少 92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同源，例 如100%同源(相同)。本发明的寡聚物的核苷酸序列或连续核苷酸序列优选与SEQ ID N0:197中存在的 相应序列至少80%同源，例如至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少 94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同源，例如100%同源(相同)。本发明的寡聚物的核苷酸序列或连续核苷酸序列优选至少80%与SEQID NO 197 中存在的子序列互补，例如至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少 94%、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %互补，例如100 %互补(完美互 补)。
在多种实施方式中，所述寡聚物(或其连续核碱基部分)选自，或包含，选自SEQ ID NO :220-227、1-140和228-233的序列之一或其至少10个连续核碱基的子序列，其中所 述寡聚物(或其连续核碱基部分)可以任选地包含相对于所述选择的序列的一个、两个或 三个错配。在多种实施方式中，所述子序列可以由11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28或29个连续核碱基，例如12-22个，例如12-18个核碱基组成。适合 地，在多种实施方式中，所述子序列具有与本发明的寡聚物的连续核碱基序列相同的长度。然而，认识到的是，在多种实施方式中，所述寡聚物的核碱基序列可以包含附加的 5'或3'核碱基，例如，独立地，1、2、3、4或5个附加的核碱基5'或3'，其与靶序列不互 补。在这点上，在多种实施方式中，本发明的寡聚物可以包含在5'和/或3'侧翼具有附 加核碱基的连续核碱基序列。在多种实施方式中，附加的5'或3'核碱基是天然存在的核 苷酸，例如DNA或RNA。在多种实施方式中，附加的5'或3'核碱基可以代表如本文缺口聚 物寡聚物的上下文中所涉及的D区。在多种实施方式中，根据本发明的寡聚物包含以下序列或由以下序列组成根据 SEQ ID NO 200的核碱基序列、或其子序列。在多种实施方式中，根据本发明的寡聚物包含以下序列或由以下序列组成根据 SEQ ID NO 201的核碱基序列、或其子序列。在多种实施方式中，根据本发明的寡聚物包含以下序列或由以下序列组成根据 SEQ ID NO :202的核碱基序列、或其子序列。在多种实施方式中，根据本发明的寡聚物包含以下序列或由以下序列组成根据 SEQ ID NO :203的核碱基序列、或其子序列。在多种实施方式中，根据本发明的寡聚物包含以下序列或由以下序列组成根据SEQ ID NO 204的核碱基序列、或其子序列。在多种实施方式中，根据本发明的寡聚物包含以下序列或由以下序列组成根据SEQ ID NO :205的核碱基序列、或其子序列。在多种实施方式中，根据本发明的寡聚物包含以下序列或由以下序列组成根据 SEQ ID NO :206的核碱基序列、或其子序列。在多种实施方式中，根据本发明的寡聚物包含以下序列或由以下序列组成根据 SEQ ID NO :207的核碱基序列、或其子序列。在多种实施方式中，根据本发明的寡聚物包含以下序列或由以下序列组成根据 SEQ ID NO :208的核碱基序列、或其子序列。在多种实施方式中，根据本发明的寡聚物包含以下序列或由以下序列组成根据 SEQ ID NO :209的核碱基序列、或其子序列。在多种实施方式中，根据本发明的寡聚物包含以下序列或由以下序列组成根据 SEQ ID NO 210的核碱基序列、或其子序列。在多种实施方式中，根据本发明的寡聚物包含以下序列或由以下序列组成根据 SEQ ID NO 211的核碱基序列、或其子序列。在多种实施方式中，根据本发明的寡聚物包含以下序列或由以下序列组成根据 SEQ ID NO :212的核碱基序列、或其子序列。在多种实施方式中，根据本发明的寡聚物包含以下序列或由以下序列组成根据 SEQ ID NO :213的核碱基序列、或其子序列。在多种实施方式中，根据本发明的寡聚物包含以下序列或由以下序列组成根据 SEQ ID NO :214的核碱基序列、或其子序列。在多种实施方式中，根据本发明的寡聚物包含以下序列或由以下序列组成根据 SEQ ID NO :215的核碱基序列、或其子序列。在多种实施方式中，根据本发明的寡聚物包含以下序列或由以下序列组成根据 SEQ ID NO :216的核碱基序列、或其子序列。在多种实施方式中，根据本发明的寡聚物包含以下序列或由以下序列组成根据 SEQ ID NO :217的核碱基序列、或其子序列。在多种实施方式中，根据本发明的寡聚物包含以下序列或由以下序列组成根据 SEQ ID NO :218的核碱基序列、或其子序列。在多种实施方式中，根据本发明的寡聚物包含以下序列或由以下序列组成根据 SEQ ID NO :219的核碱基序列、或其子序列。在多种实施方式中，根据本发明的寡聚物包含以下序列或由以下序列组成根据 SEQ ID NO :220的核碱基序列、或其子序列。在多种实施方式中，根据本发明的寡聚物包含以下序列或由以下序列组成根据 SEQ ID NO 221的核碱基序列、或其子序列。在多种实施方式中，根据本发明的寡聚物包含以下序列或由以下序列组成根据 SEQ ID NO :222的核碱基序列、或其子序列。在多种实施方式中，根据本发明的寡聚物包含以下序列或由以下序列组成根据 SEQ ID NO :223的核碱基序列、或其子序列。
在多种实施方式中，根据本发明的寡聚物包含以下序列或由以下序列组成根据 SEQ ID NO :224的核碱基序列、或其子序列。在多种实施方式中，根据本发明的寡聚物包含以下序列或由以下序列组成根据 SEQ ID NO :225的核碱基序列、或其子序列。在多种实施方式中，根据本发明的寡聚物包含以下序列或由以下序列组成根据 SEQ ID NO :226的核碱基序列、或其子序列。在多种实施方式中，根据本发明的寡聚物包含以下序列或由以下序列组成根据 SEQ ID NO :227的核碱基序列、或其子序列。当确定本发明的寡聚物(或连续核碱基序列)和编码哺乳动物HER3(或Her2或 EGFR)的核酸(例如在此公开的那些)之间的“同源性”或“互补性”时，同源性的确定可以通 过与本发明化合物的相应核苷酸序列和编码哺乳动物HER3的核酸(或靶核酸)的对应区 或其补体的简单比对来进行，通过计算对齐(align)的碱基的数目并除以本发明的化合物 中连续核碱基的总数，并乘以100来确定同源性。在这样的比较中，如果存在缺口(gaps)， 优选是这些缺口仅仅是错配而不是一些下述区域，其中缺口内核苷酸数量在本发明的核苷 酸序列和靶序列之间不同。氨基酸和多核苷酸同源性可以使用标准设置的ClustalW算法确定参见httD:// www, ebi. ac. uk/emboss/align/index.html,方法EMB0SS:水(局部)缺 口产生(Gap Open) = 10.0，缺口延伸(Gap extend) = 0· 5，使用Blosum 62 (蛋白质)，或用于核苷酸/ 核碱基序列的DNAfull。这样的比对也可以用于鉴定编码来自人和不同的哺乳动物物种如 猴、小鼠和/或大鼠的HER3的核酸的区域，其中该区有足够长度的核酸互补性，以允许设计 同时靶向人HER3靶核酸和不同哺乳动物物种中存在的相应核酸的寡核苷酸，例如，包含以 下区域或由由以下区域组成的寡聚物至少10个、例如至少12个、例如至少14个、例如至 少16个、例如至少18个，例如11、12、13、14、15、16、17或18个连续核碱基，所述连续核碱 基与编码来自人的HER3的核酸、以及编码来自不同哺乳动物物种的HER3的核酸的等价的 区域100%互补。在多种实施方式中，本发明的寡聚物包含连续核碱基序列或由连续核碱基序列组 成，所述连续核碱基序列与编码来自人的HER3的核酸、以及编码来自不同哺乳动物物种的 HER3的核酸(例如编码HER3的小鼠核酸)的对应区至少80%、例如至少85%、例如至少 90%、例如至少95%、例如至少98%、例如至少99%、或100%同源(即，与人和小鼠序列两 者的等价区域(equivalent region)80%或100%互补)。优选是，所述寡聚物的连续核碱 基序列与人HER3mRNA的等价区域100%互补。术语“对应”和“相应”是指寡聚物的核碱基序列或连续核碱基序列与下述的等 价核苷酸序列之间的比较i)核酸靶的反向补体，核酸靶例如编码靶蛋白质的mRNA，例如 HER3蛋白，例如SEQ ID NO 197 ；和/或(ii)本文提供的核苷酸的序列，例如选自SEQ ID NO :200-227、1-140和228-233。核苷酸类似物直接地与它们等价的或相应的核苷酸比较。术语“相应的核苷酸类似物”和“相应的核苷酸”是指核苷酸类似物和天然存在的 核苷酸中的核碱基是相同的。例如，当核苷酸的2-脱氧核糖单元与腺嘌呤连接时，“相应的 核苷酸类似物”含有与腺嘌呤连接的戊糖单元(不同于2-脱氧核糖)。本发明进一步提供了包含与HER3基因中的靶序列相应的寡聚序列的反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸不仅能够下调HER3表达，还能够下调受体酪氨酸激酶的ErbB家族的 其他成员中一个或多个，特别是HER2和/或EGFR的表达。能够有效地下调两种靶的寡核 苷酸被称为“双特异性的(bispecific)，，；能够有效地下调三种靶的寡核苷酸被称为“三特 异性的(trispecific)”。更一般地，本发明的反义寡核苷酸是多特异性的，即，能够下调受 体酪氨酸激酶的Erb家族的多个成员的表达。术语“双特异性的”和“三特异性的”因而仅 仅为了便于描述，而不能理解为是限制性的。举例来说，双特异性寡核苷酸可能对第三靶具 有某些效果，而三特异性寡核苷酸可能对它的靶之一具有非常弱的因而不明显的效果。因而，在另一个方面，本发明提供了双特异性反义寡核苷酸，S卩，能够下调HER3的 表达和受体酪氨酸激酶的ErbB家族的另一种成员的表达的寡核苷酸。优选，这样的双特异 性寡核苷酸能够有效地下调HER3和HER2的表达。或者以及也优选，这样的双特异性寡核 苷酸能够有效地下调HER3和EGFR的表达。在另一个方面，本发明提供了三特异性反义寡核苷酸，S卩，能够下调HER3和受体 酪氨酸激酶的erbB家族的另两种其他成员的表达的寡核苷酸。优选，这样的三特异性寡核 苷酸能够有效地下调HER3、HER2和EGFR的表达。有效地下调HER3的寡核苷酸的实例是SEQ ID NO 169-196和234。有效地下调 HER3和HER2的寡核苷酸的实例是SEQ ID NO 177和178。有效地下调HER3和EGFR的寡 核苷酸的实例是SEQ ID NO 171和173。有效地下调HER3、HER2和EGFR的 核苷酸的实 例是 SEQ ID NO 169、170、172、174-176 和 179。根据本发明的双特异性或三特异性寡核苷酸可以容许1、2、3、4、5或更多个错配 以充分地分别结合两种、或全部三种靶。根据本发明的双特异性或三特异性寡核苷酸的靶可以选自受体酪氨酸激酶的 ErbB家族，特别是选自HER3、HER2和EGFR。两种或更多种所述靶的下调可以通过提供充分 地与编码相应靶的核酸例如信使RNA杂交的反义寡核苷酸来实现。还公开了 LNA寡核苷酸的具体设计，例如在SEQ ID NO 169-196和SEQ ID NO 234 到236中所显示的那些。本发明的寡聚物被认为是HER3mRNA和蛋白表达的有效的抑制剂。在多种实施方式中，所述寡聚物包含连续核碱基序列或由连续核碱基序列组成， 所述连续核碱基序列与编码哺乳动物HER3、和/或独立地HER2和/或独立地EGFR的核酸 的对应区至少80%、例如至少90%、例如至少95%同源。长度所述寡聚物包含以下序列或由以下序列组成总共10-50个核碱基的连续核碱基 序列，例如长度 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30
个连续核碱基。在多种实施方式中，所述寡聚物包含以下序列或由以下序列组成总共10-25个、 10-24个、12-25个、12-24个或10-22个的连续核碱基序列，例如，长度12-18个，例如13-17 个或12-16个，例如13、14、15、16个连续核碱基。在多种实施方式中，所述寡聚物包含以下序列或由以下序列组成总共10-22个 或10-18个的连续核碱基序列，例如，长度12-18个，例如13-17个或12-16个，例如13、14、 15、16个连续核碱基。在多种实施方式中，所述寡聚物包含以下序列或由以下序列组成总 共10-16、12-16或12-14个核碱基的连续核碱基序列。在多种实施方式中，所述寡聚物包含以下序列或由以下序列组成总共14-18或14-16个核碱基的连续核碱基序列。在多种实施方式中，所述寡聚物包含以下序列或由以下序列组成长度总共10、 11、12、13或14个连续核碱基的连续核碱基序列。在多种实施方式中，根据本发明的寡聚物由不超过22个核碱基，例如不超过20个 核碱基，例如不超过18个核碱基，例如15、16或17个核碱基组成。在多种实施方式中，本 发明的寡聚物包含低于20个核碱基。核苷酸类似物如在此使用的，术语“核苷酸，，是指包含糖部分、碱基部分和共价连接的磷酸基团 的糖苷，包括天然存在的核苷酸，例如DNA或RNA，优选DNA。包含修饰的糖类和/或碱基部 分的非天然存在的核苷酸在此被称为“核苷酸类似物”。术语“核碱基”用于涵盖天然的(DNA或RNA型)核苷酸以及核苷酸类似物。非天然存在的核苷酸包括具有修饰的糖部分的核苷酸，例如二环的核苷酸或2' 修饰的核苷酸，例如2'取代的核苷酸。“核苷酸类似物”是通过在糖和/或碱基部分的修饰而得到的天然核苷酸如DNA或 RNA核苷酸的变体。在寡核苷酸的情况下，类似物原则上可以仅仅是“沉默”或“等价”于天 然核苷酸，即，对于寡核苷酸抑制靶基因表达的作用方式没有功能上的影响。这样的“等价” 类似物可以仍然是有用的，如果例如，它们更容易或更便宜地制造，或对于保存或制备条件 更为稳定，或表示标签或标记。然而，优选，所述类似物将对寡聚物抑制表达的作用方式具 有功能性影响；例如，通过产生对靶的提高的亲和力，和/或对细胞内核酶的提高的抗性， 和/或更方便地转运到细胞中。术语“核碱基”被用作集合性的术语，其包括了核苷酸和核苷酸类似物。核碱基序 列是包含至少两个核苷酸或核苷酸类似物的序列。在多种实施方式中，核碱基序列可以仅 包含核苷酸，例如DNA单元，在可选择的实施方式中，所述核碱基序列可以仅包含核苷酸类 似物，例如LAN单元，或在多种实施方式中，所述核碱基序列可以包含核苷酸和核苷酸类似 物单元两者。术语“核酸”被定义为由两个或更多个核苷酸的共价连接形成的分子。术语“核酸”和“多核苷酸”在此可互换使用。核碱基的“碱基部分”包括了天然存在的以及非天然存在的核碱基的碱基。因而， 碱基部分不仅包括了已知的嘌呤和嘧啶杂环，还包括了其杂环类似物和互变异构体。这样的碱基部分的实例包括但不限于，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、 尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶(isocytosine)、假异胞嘧啶 (pseudoisocytosine)、5_溴尿嘧啶、5_丙炔基尿嘧啶、6_氨基嘌呤、2_氨基嘌呤、肌苷、二 氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。在多种实施方式中，所述寡聚物中存在的至少一个核碱基包含修饰的碱基，例如， 选自5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、 2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。核苷类似物的具体实例由例如Freier&Altmann ；Nucl. AcidRes.，1997，25， 4429-4443 和 Uhlmann ;Curr. Opinion in Drug Development，2000，3 (2)，293-213 描述，以 及在示例1中描述 示例 1寡聚物因而可以包含以下序列或由以下序列组成天然存在的核苷酸——优选 2'-脱氧核苷酸(在此一般称为“DNA”)的简单序列，但还可能的是核糖核苷酸(在此一 般称为“RNA”)，或这些天然存在的核苷酸和一种或多种非天然存在的核苷酸，即，核苷酸类 似物的组合。这样的核苷酸类似物可以适当地增强寡聚物对靶序列的亲和力。适合的和优选核苷酸类似物的实例在W02007/031091中描述，因而在此引用作为 参考，或参考其中的内容。核苷酸的一种优选修饰包括其中糖部分被修饰来提供2'-取代基团或来产生桥 接的(锁核酸-LNA)结构的核苷酸，其增强了结合亲和力，以及还能提供某些提高的核酸酶 抗性；将核苷酸间连接从其正常的磷酸二酯修饰为对核酸酶攻击有10倍抗性的一种，例如 硫代磷酸酯或硼烷磷酸脂，这两种可以被RNase H裂解，还容许在调节HER3表达中的反义 抑制的途径。在寡聚物中掺入亲和力增强的核苷酸类似物，例如LNA或2'取代的糖，能使 特异性结合寡聚物的大小降低，还可以在发生非特异性或异常的结合之前降低寡聚物大小的上限。在多种实施方式中，所述寡聚物包含至少2个核苷酸类似物。在某些实施方式中， 所述寡聚物包含3-8个核苷酸类似物，例如6个或7个核苷酸类似物。在最优选实施方式 中，至少一个所述核苷酸类似物是锁核酸(LNA)；例如，至少3或至少4、或至少5、或至少6、 或至少7、或8个核苷酸类似物可以是LNA。在某些实施方式中，所有核苷酸类似物可以是 LNA。将认识到的是，当涉及仅由核苷酸组成的优选核苷酸序列基序或核苷酸序列时，由该序列限定的本发明的寡聚物可以包含相应的核苷酸类似物来代替所述序列中存在的 一个或多个核苷酸，例如LNA单元或其他核苷酸类似物，其提高寡聚物/靶双链体的双螺旋 稳定性/Tm (即，亲和力增强的核苷酸类似物)。在多种实施方式中，寡聚物和靶序列的核碱基序列之间任何错配优选在所述亲和 力增强核苷酸类似物(例如，A区和C区)之外的区域中存在，例如本文涉及的B区、和/或 本文涉及的D区之内，和/或在非修饰的位点处，例如寡核苷酸中的DNA核苷酸，和/或在 所述连续核碱基序列的5'或3'的区域中。核苷酸的这种修饰的实例包括修饰糖部分来提供2'取代基团或产生桥接的(锁 核酸)结构，其增强结合亲和力并可能还提供提高的核酸酶抗性。优选核苷酸类似物是LNA，例如氧-LNA (例如β -D-氧基-LNA，和α -L-氧 基-LNA)，和/或氨基-LNA (例如β -D-氨基-LNA和α -L-氨基-LNA)和/或硫基-LNA (例 如β -D-硫基-LNA和α -L-硫基-LNA)和/或ENA (例如β -D-ENA和α -L-ENA)。在多种 实施方式中，所述LNA单元是β -D-氧基-LNA。在某些实施方式中，本发明的寡聚物内存在的核苷酸类似物(例如，在本文提及 的A区和C区中)独立地选自，例如2，-0-烷基-RNA单元、2，-氨基-DNA单元、2，-氟-DNA 单元、LNA单元、阿拉伯糖核酸(ANA)单元、2，-氟-ANA单元、HNA单元、INA(intercalating nucleic acid-Christensen, 2002. Nucl. Acids. Res. 200230 :4918_4925，在此引用作为参 考)单元和2’ MOE单元。在多种实施方式中，仅有一种上述类型的核苷酸类似物存在于本 发明的寡聚物或其连续核碱基序列中。在多种实施方式中，核苷酸类似物是2’-0-甲氧基乙基-RNA(2’Μ0Ε)、2’_氟-DNA 单体或LNA核苷酸类似物，因而本发明的寡核苷酸可以包含核苷酸类似物，其独立地选自 这三种类似物，或可以包含选自三种类型的仅一种类型的类似物。在多种实施方式中，至少 一个所述核苷酸类似物是2’-M0E-RNA，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个2’_M0E_RNA核苷酸 单元。在多种实施方式中，至少一个所述核苷酸类似物是2’-氟DNA，例如2、3、4、5、6、7、8、 9或10个2，-氟-DNA核苷酸单元。在多种实施方式中，根据本发明的寡聚物包含至少一个锁核酸(LNA)单元，例如 1、2、3、4、5、6、7或8个LNA单元，例如3-7个或4到8个LNA单元，或3、4、5、6或7个LNA 单元。在多种实施方式中，所有的核苷酸类似物是LNA。在某些实施方式中，所述寡聚物可 以包含β -D-氧基-LNA以及一种或多种以下的LNA单元β -D或α -L构型的硫基-LNA、 氨基-LNA、氧基-LNA和/或ENA或其组合。在多种实施方式中，全部LNA胞嘧啶单元是5 ‘ 甲基-胞嘧啶。在本发明的各种实施方式中，寡聚物可以包含LNA和DNA单元。优选，LNA 和DNA单元的组合的总数是10-25个，优选10-20个，再更优选12-16个。在本发明的各种实施方式中，寡聚物的核苷酸序列，例如连续核碱基序列由至少一个LNA组成，其余的核苷酸单元是DNA单元。在多种实施方式中，所述寡聚物仅包含LNA核苷酸类似物和天然存在 的核苷酸(例如RNA或DNA，最优选DNA核苷酸)，任选的具有修饰的核苷酸间连接，例如硫 代磷酸酯(phosphorothioate)。在多种实施方式中，所述寡聚物中存在的至少一个核碱基具有修饰的碱基，其选 自5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、 2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。LNA术语“LNA”是指二环的核苷酸类似物，称为“锁核酸(Locked NucleicAcid) ”。它 可以指LNA单体，或当在“LNA寡核苷酸”或“LNA寡聚物”的上下文中使用时，是指含有一 个或多个这样的二环的核苷酸类似物的寡聚物。本发明的寡聚物中使用的LNA优选具有通式I的结构，及其碱盐(basicsalts)和
酸加成盐 其中X 选自-O-、-S-、-N(Rn*)-、-C(R6R6*)-；B选自氢、任选取代的Cy-烷氧基、任选取代的CV4-烷基、任选取代的Cy-酰基 氧基、核碱基、DNA嵌入剂、光化学活性基、热化学活性基、螯合基、报道基(import groups) 和配体；P表示与在后的单体之间的核苷酸间连接(internucleotide linkage)的基团位 置，或5'-末端基团，该核苷酸间连接或5'-末端基团任选包括取代基R5或等同适用取 代基R5、P*表示与在前的单体的核苷酸间连接，或3'-末端基团；R4*和R2* —起表示由1-4个选自下列的基团/原子组成的二价基团 (biradical) -C (RaRb)-、-C (Ra) = C (Rb)-、-C (Ra) = N-、-0-、-Si (Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-禾口> C = Z，其中Z选自-0-、-S-和-N (Ra) _，且Ra和Rb各自独立地选自氢、任选取代的Ch2-烷 基、任选取代的C2_12-烯基、任选取代的c2_12-炔基、羟基、CV12-烷氧基、c2_12-烷氧基烷基、 c2_12-烯基氧基、羧基、CV12-烷氧基羰基、CV12-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳基氧基-羰基、 芳基氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳基氧基-羰基、杂芳基氧基、杂芳基羰基、氨基、单和二 ((V6-烷基)氨基、氨基甲酰基、单和二(Cp6-烷基)-氨基-羰基、氨基-Cu-烷基-氨基羰 基、单和二(Cu-烷基)氨基-CV6-烷基-氨基羰基、CV6-烷基-羰基氨基、脲基、Cu-烷酰 基氧基、磺基(sulphono)、CV6-烷基磺酰基氧基、硝基、叠氮基、硫基(sulphanyl)、Cp6-烷 基硫基、卤素、DNA嵌入剂、光化学活性基、热化学活性基、螯合基、报道基和配体，其中芳基 和杂芳基可任选被取代，且其中两个成对的(geminal)取代基Ra和
Rb 一起可表示任选取代的亚甲基(=CH2)，和存在的取代基R1*、R2、R3、R5、R5*, R6和Rw各自独立地选自氢、任选取代的C^12-烷 基、任选取代的C2_12-烯基、任选取代的c2_12-炔基、羟基、CV12-烷氧基、c2_12-烷氧基烷基、 c2_12-烯基氧基、羧基、CV12-烷氧基羰基、CV12-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳基氧基-羰基、 芳基氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳基氧基-羰基、杂芳基氧基、杂芳基羰基、氨基、单和二 ((V6-烷基)氨基、氨基甲酰基、单和二((V6-烷基)-氨基-羰基、氨基-Cu-烷基-氨基 羰基、单和二(Cp6-烷基)氨基-CV6-烷基-氨基羰基、(V6-烷基-羰基氨基、脲基、Cp6-烷 酰基氧基、磺基、CV6-烷基磺酰基氧基、硝基、叠氮基、硫基(sulphanyl)、Cp6-烷基硫基、 卤素、DNA嵌入剂、光化学活性基、热化学活性基、螯合基、报道基和配体、其中芳基和杂芳 基可任选被取代，且其中两个成对的取代基一起可表示氧代、硫代、亚氨基或任选取代的亚 甲基，或一起可形成由1-5个碳原子亚烷基链组成的螺环二价基团，所述亚烷基链任选插 入一个或多个杂原子/基团和/或被一个或多个杂原子/基团终止，所述杂原子/基团选 自-0-、-S-和-(NRn)-，其中Rn选自氢和Cy-烷基，且其中两个相邻的(非成对的)取代 基可表示另一键，导致形成双键；且Rw，当存在且不涉及二价基团时，选自氢和CV4-烷基；在多种实施方案中，R5*选自 H，-CH3, -CH2-CH3, -CH2-O-CH3 和 _CH = CH2。在多种实施方案中，R4*和R2*—起表示二价基团，其选自-C (RaRb) -0-、_C (RaRb) -C (R cRd) -0-、-C (RaRb) -C (RcRd) -C (ReRf) -0-、_C (RaRb) -O-C (RcRd) -、_C (RaRb) -O-C (RcRd) -0-、_C (RaRb) -C (RcRd) -、-C (RaRb) -C (RcRd) -C (ReRf) -、_C (Ra) = C (Rb) -C (RcRd) -、_C (RaRb) -N (Rc) -、_C (RaRb) -C (RcRd) -N(Re)-,-C (RaRb) -N (Rc) -0-和-C (RaRb) -S-、-C (RaRb) -C (RcRd) -S-，其中 Ra、Rb、Rc、Rd、Re和 Rf各自独立地选自氢、任选取代的Ch2-烷基、任选取代的C2_12-烯基、任选取代的C2_12-炔 基、轻基、Cp12- -烷氧基、c2_12-烷氧基烷基、c2_12-烯基氧基、羧基、(V12-烷氧基羰基、Ch2-烷 基羰基、甲酰基、芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳基氧基-羰基、杂 芳基氧基、杂芳基羰基、氨基、单和二(Ch6烷基)氨基、氨基甲酰基、单和二((V6-烷基)-氨 基-羰基、氨基-Ch6-烷基-氨基羰基、单和二((V6-烷基)氨基-Cu-烷基-氨基羰基、 (V6-烷基-羰基氨基、脲基、Cp6-烷酰基氧基、磺基、Cp6-烷基磺酰基氧基、硝基、叠氮基、硫 基(sulphanyl)、CV6-烷基硫基、卤素、DNA嵌入剂、光化学活性基、热化学活性基、螯合基、 报道基和配体，其中芳基和杂芳基可任选被取代，且其中两个成对的取代基Ra和Rb —起可 表示任选取代的亚甲基(=CH2)，在另一实施方案中R4*和R2*—起表示二价基团，其选自-CH2-0-、-CH2-S-、-CH2-NH -、-CH2-N (CH3) _、-CH2-CH2-0-、-CH2-CH (CH3) -、-CH2-CH2-S-、-CH2-CH2-NH-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-C H2-CH2-O-、-CH2-CH2-CH (CH3) -,-CH = CH-CH2-, -CH2-O-CH2-O-, -CH2-NH-O-, -CH2-N (CH3) -0-、 -CH2-O-CH2-、-CH (CH3) -0-、-CH (CH2-O-CH3) -0-。对于所有手性中心，不对称的基团可为R或S取向。优选地，本发明的寡聚物中使用的L NA包括至少一个根据任一下式的LNA单元
其中Y为-0-、-O-CH2-, -S-、-NH-或N(Rh) ；Z和Ζ*独立地选自核苷酸间连接、末 端基团或保护基；B构成天然或非天然核苷酸碱基部分，且Rh选自氢和Cy-烷基。特别优选的LNA单元示于示例2 示例 2术语〃硫基-LNA〃包括其中上述通式中的Y选自S或-CH2-S-的锁核碱基(locked nucleobase) (LNA)。硫基-LNA 可为 β -D 和 α -L-构型。术语〃氨基-LNA 〃包括其中上述通式中的Y选自-N(H)-、N(R)-, CH2-N(H)-和-CH2-N(R)-,其中R选自氢和C^4-烷基的锁核碱基(LNA)。氨基-LNA可为β -D 和α-L-构型。术语〃氧基-LNA"包括其中上述通式中的Y表示-0-或-CH2-O-的锁核碱基 (LNA)。氧基-LNA可为β -D和α -L-构型。
术语〃 ΕΝΑ"包括其中上述通式中的Y为-CH2-0-(其中-CH2-O-的氧原子连接至 相对碱基B的2’ -位)的锁核碱基(LNA)。在优选实施方案中LNA选自β -D-氧基-LNA、α -L-氧基-LNA、β -D-氨基-LNA 和β -D-硫基-LNA，特别是β -D-氧基-LNA。在本文中，术语"Cy-烷基"是指直链或支链的饱和烃链，其中该链具有1至4个 碳原子，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。RNAse H 募集应认识到寡聚化合物可通过非RNase介导的靶mRNA的降解起作用，如通过翻译的 位阻，或其它方法，然而，本发明优选的寡聚物能募集核糖核酸内切酶(RNase) ^RNase H。在多种实施方案中，该寡聚物或连续核碱基序列，包含至少6个，如至少7个连续 核苷酸或核碱基单元，如至少8或至少9个相连核碱基单元(残基)，包括7，8，9，10，11， 12，13，14，15或16个连续核苷酸或核碱基的区域，当其与互补靶RNA形成双链体时能募集 RNase。能募集RNAse的连续序列可为本文所述的缺口聚物(gapmer)涉及的B区。在多种 实施方案中，能募集RNAse的连续序列(如B区)的尺寸可更大，如10，11，12，13，14，15， 16，17，18，19或20个核碱基单元。EP 1222309提供了体外测定RNaseH活性的方法，其可用于测定募集RNaseH的能 力。使用EP 1222309的实施例91-95提供的方法，如果当提供互补RNA靶时，具有的初始 速率(以pmol/1/min测量)，为等效DNA(equivalent DNA)的至少1%，如至少5%，如至 少10%或少于20%，该等效DNA仅为寡核苷酸，没有2’取代，且在寡核苷酸中的所有核苷 酸间具有硫代磷酸酯连接基，则认为该寡聚物能募集RNase H。在多种实施方案中，使用EP 1222309的实施例91_95提供的方法，如果当提供互 补RNA靶和RNaseH时，该RNaseH初始速率(以pmol/1/min测量)，少于使用等效DNA测 定的初始速率的1 %，如少于5%，如少于10%或少于20%，该等效DNA仅为寡核苷酸，没有 2’取代，且在寡核苷酸中的所有核苷酸间具有硫代磷酸酯连接基，则认为该寡聚物基本不 能募集RNase H。在其它实施方案中，使用EP 1222309的实施例91_95提供的方法，如果当提供互 补RNA靶和RNaseH时，该RNaseH初始速率(以pmol/1/min测量)，为使用等效DNA测定 的初始速率的至少20 %，如至少40 %，如至少60 %，如至少80 %，该等效DNA仅为寡核苷酸 (即具有相同的碱基序列，但仅含有DNA单元)，没有2’取代，且在寡核苷酸中的所有核苷 酸间具有硫代磷酸酯连接基，则认为该寡聚物能募集RNase H。通常，形成连续核碱基序列的寡聚物的区域，当与互补靶RNA形成双链体时，能募 集由核苷酸单元(其与RNA靶形成DNA/RNA状的双链体)组成的RNase-且可包括α -L构 型的DNA单元和LNA单元，特别优选为α -L-氧基LNA。本发明的寡聚物可包含核碱基序列，其包括核苷酸和核苷酸类似物，且可为缺口 聚物(gapmer)、头聚物(headmer)或混合聚物(mixmer)的形式。头聚物如下定义在5’ -端的 连续的一段非_募集RNase的核苷酸类似物，接着 直到3’ -端的连续的一段可由RNAse识别和裂解的DNA或修饰的核苷酸(类似物)单元 (如至少7个该核苷酸)，而尾聚物(tailmer)如下定义在5’-端的连续的一段可由RNAse 识别和裂解的DNA或修饰的核苷酸(类似物)(如至少7个该核苷酸)，接着直到3’-端的连续的一段非-募集RNase的核苷酸类似物。其它根据本发明的“嵌合”寡聚物，称为“混 合聚物”，其由下述交替组分构成i)可由RNAse识别和裂解的DNA或修饰的核苷酸，和ii) 非-募集RNase的核苷酸类似物。一些核苷酸类似物也能介导RNaseH，结合和裂解。因为 α -L-LNA募集RNaseH活性到一定程度，可能需要可由RNAseH识别和裂解的DNA或修饰的 核苷酸的较小区域(例如缺口-或B区)用于缺口聚物构建体，且混合聚物构建中会引入 更多的柔性。缺口聚物设计 优选地，本发明的寡聚物是缺口聚物。缺口聚物寡聚物是包含一段连续的核苷酸 或核碱基的寡聚物(该核苷酸或核碱基能募集RNAse，如RNAseH)，如至少6或7个DNA核 苷酸的区域，在本文涉及的为B区，其中B区的5’和3’的侧翼均为核苷酸类似物的区域， 如增强亲和力的核苷酸类似物，如1-6个核苷酸类似物，5’和3’连接至一段连续的能募集 RNAse的核苷酸-涉及的这些区分别称为A区和C区。优选该缺口聚物包含下式的(聚)核苷酸序列(5’至3’)A-B_C，或任选A-B-C-D 或D-A-B-C，其中；A区(5’区)由以下组成或包含以下至少一个核苷酸类似物，如至少一 个LNA单元，如1-6个核苷酸类似物，如LNA单元，和；B区由以下组成或包含以下至少5 个能募集RNAse (当与互补RNA分子，如mRNA靶形成双链体时)的连续核苷酸或核碱基，如 DNA核苷酸，和；C区(3’区)由以下组成或包含以下至少一个核苷酸类似物，如至少一个 LNA单元，如1-6个核苷酸类似物，如LNA单元，和；D区，当存在时由以下组成或包含以下 1，2或3个核苷酸单元，如DNA核苷酸。在多种实施方案中，A区由1，2，3，4，5或6个核苷酸类似物(如LNA单元)组成， 如2-5个核苷酸类似物，如2-5个LNA单元，如3或4个核苷酸类似物，如3或4个LNA单 元；和/或C区由1，2，3，4，5或6个核苷酸类似物(如LNA单元)组成，如2_5个核苷酸类 似物，如2-5个LNA单元，如3或4个核苷酸类似物，如3或4个LNA单元。在多种实施方案中，B由以下组成或包含以下5，6，7，8，9，10，11或12个能募集 RNAse的连续核苷酸或核碱基，或6-10，或7_9，如8个能募集RNAse的连续核苷酸或核碱 基。在多种实施方案中，B区由以下组成或包含以下至少一个DNA核苷酸单元，如1-12个 DNA单元，优选4-12个DNA单元，更优选6_10个DNA单元，如7_10个DNA单元，最优选8，9 或10个DNA单元。在多种实施方案中，A区由3或4个核苷酸类似物(如LNA)组成，B区由7，8， 9或10个DNA单元组成，且C区由3或4个核苷酸类似物(如LNA)组成。这些设计包括 (A-B-C)3-10-3,3-10-4，4-10-3，3_9_3，3_9_4，4_9_3，3_8_3，3_8_4，4_8_3，3_7_3，3-7-4， 4-7-3，且可进一步包括D区，其可具有1个或2个核苷酸单元，如DNA单元。其它缺口聚物设计公开于W02004/046160且在此引入作为参考。美国临时申请，60/977409和PCT/EP2008/053314，在此引入作为参考，涉及‘短聚 物(shortmer) ’缺口聚物寡聚物，在多种实施方案中，其可为本发明的缺口聚物寡聚物。在多种实施方案中，该寡聚物由总共10，11，12，13或14个核碱基单元的连续核碱 基序列组成，其中该连续核碱基序列为式(5’ -3’)，A-B-C，或任选A-B-C-D或D-A-B-C，其 中；A由1，2或3个核苷酸类似物单元(如LNA单元)组成；B由7，8或9个连续核苷酸或 核碱基单元组成，当与互补RNA分子(如mRNA靶)形成双链体时，所述核苷酸或核碱基单元能募集RNAse ；且C由1，2或3个核苷酸类似物单元(如LNA单元)组成。当存在时，D
由单一 DNA单元组成。在多种实施方案中，A由1个LNA单元组成。在多种实施方案中，A由2个LNA单元 组成。在多种实施方案中，A由3个LNA单元组成。在多种实施方案中，C由1个LNA单元组 成。在多种实施方案中，C由2个LNA单元组成。在多种实施方案中，C由3个LNA单元 组 成。在多种实施方案中，B由7个核苷酸单元组成。在多种实施方案中，B由8个核苷酸单 元组成。在多种实施方案中，B由9个核苷酸单元组成。在多种实施方案中，B包含1-9个 DNA单元，如2，3，4，5，6，7或8个DNA单元。在多种实施方案中，B由DNA单元组成。在多种 实施方案中，B包含至少一个0-14勾型的11^单元，如2，3，4，5，6，7，8或9个α-L-构型的 LNA单元。在多种实施方案中，B包含至少一个α-L-氧基LNA单元或其中所有α-L-构型 的LNA单元为α-L-氧基LNA单元。在多种实施方案中，A_B_C中存在的核苷酸数选自(核 苷酸类似物单元-B区-核苷酸类似物单元)1-8-1，1-8-2，2-8-1，2-8-2，3-8-3，2-8-3， 3-8-2，4-8-1，4-8-2，1-8-4，2-8-4，或；1-9-1，1-9-2，2-9-1，2-9-2，2-9-3，3-9-2，1—9—3， 3-9-1,4-9-1,1-9-4，或；1-10-1,1_10_2，2-10—1，2-10—2，1_10_3，3-10-1。在多种实施方 案中，A-B-C 中的核苷酸数选自2-7-1，1-7-2，2-7-2，3-7-3，2-7-3，3-7-2，3-7-4 和 4-7-3。 在多种实施方案中，A和C各自都由两个LNA单元组成，且B由8或9个核苷酸单元，优选 DNA单元组成。其它缺口聚物设计包括以下那些其中A区和或C区由3，4，5或6个核苷酸类似 物组成，如选自2’-0-甲氧基乙基-RNA(2’ Μ0Ε)和2’ -氟-DNA单体的核苷酸类似物，且B 区由8，9，10，11或12个核苷酸，如DNA单元(或核碱基)组成，如5_10_5和4_12_4缺口 聚物设计。其它缺口聚物设计公开于WO 2007/146511A2，在此引入作为参考。连接基术语〃连接基〃或“核苷酸间连接(internucleotide linkage) ”是指能将两个核 苷酸或核碱基、两个核苷酸类似物、以及核苷酸和核苷酸类似物等共价结合在一起的基团。 具体且优选的实例包括磷酸基(phosphate group)和硫代磷酸酯基(phosphorothioate)。本发明的寡聚物或其连续核碱基序列的核碱基通过连接基结合在一起。合适地， 各核碱基通过连接基连接至3’邻近(adjacent)的核碱基。合适的连接基包括列于W02007/031091的那些，例如列于W02007/031091的第34
页第一段的连接基(在此引入作为参考)。也就是说，在多种实施方案中，优选将连接基从其正常磷酸二酯修饰为对核酸酶 攻击更有抗性的基团，如硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯(boranophosphate)-这两个可被RNase H裂解，也产生在减少靶基因的表达中反义抑制的途径。本文提供的合适的含硫(S)连接基可为优选的。硫代磷酸酯连接基也是优选的， 尤其对于缺口聚物的缺口(gap)区(B)。硫代磷酸酯连接也可用于侧翼区(A和C，且用于 将A或C连接至D，且在D区内，视情况而定)。然而A、B和C区可包含除硫代磷酸酯外的其它连接基，如磷酸二酯连接，特别地， 例如当使用核苷酸类似物防止A和C区内的连接基进行内切核酸酶降解-如当A和C区包 含LNA核苷酸时。
寡聚物中的连接基可为磷酸二酯、硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯以使得RNase H裂解靶向的RNA。优选硫代磷酸酯，这是由于改善的核酸酶抗性和其它原因，如易于制造。在本发明的寡聚物的一方面，该核苷酸和/或核苷酸类似物通过硫代磷酸酯基彼此连接。应认识到将磷酸二酯连接，如一个或两个连接，加入到其它硫代磷酸酯寡聚物，特 别是介于核苷酸类似物单元之间或相邻于核苷酸类似物单元(典型地在A区和或C区)可 修饰寡聚物的生物利用度和/或生物分布_参见W02008/053314，在此引入作为参考。在一些实施方案中，如上述实施方案，其中适当且非特异表明，所有剩余的连接基 为磷酸二酯或硫代磷酸酯，或其混合物。在一些实施方案中所有核苷酸间连接基为硫代磷酸酯。当涉及具体的缺口聚物寡核苷酸序列，如那些在此提供的，应理解在多种实施方 案中，当该连接为硫代磷酸酯连接时，可使用如那些在此公开的其它连接，例如可使用磷酸 酯(磷酸二酯)连接，特别是用于核苷酸类似物，如LNA单元之间的连接。同样，当涉及具 体缺口聚物寡核苷酸序列时，如在此提供的那些，当C残基注释为5’甲基修饰的胞嘧啶时， 在多种实施方案中，寡聚物中存在的一个或多个C可为未修饰的C残基。寡聚化合物本发明的寡聚物可以选自SEQ ID NO 169-196和234，如在实施例8中的表4中 所示。缀合物在本文中术语"缀合物(conjugate)“是表示通过将本文所述的寡聚物共价连接 (“缀合”)至一个或多个非核苷酸/非核苷酸_类似物(即非核碱基)，或非多核苷酸部分 形成的异源(heterogenous)分子。非核苷酸或非多核苷酸部分的实例包括大分子试剂如 蛋白质、脂肪酸链、糖残基、糖蛋白、聚合物或其组合。典型的蛋白质可为靶蛋白的抗体。典 型聚合物可为聚乙二醇。因此，在多种实施方案中，本发明的寡聚物可包含多核苷酸区和非核苷酸区，该多 核苷酸区即为核苷酸/核碱基区，其通常由核碱基的连续序列组成。当涉及本发明的由连 续核碱基序列组成的寡聚物，该化合物可包含非核苷酸/非核碱基组分，如缀合物组分。在本发明多种实施方案中，该寡聚化合物连接至配体/缀合物，其可用于例如增 加寡聚化合物的细胞吸收。W02007/031091提供了合适的配体和缀合物，其在此引入作为参 考。本发明还提供缀合物，其包含本文所述的根据本发明的化合物和至少一种共价连 接至所述化合物的非核苷酸或非多核苷酸部分。因此，在多种实施方案中，其中本发明的化 合物由特定的核酸或核碱基序列组成，如本文所公开，该化合物也可包含至少一种非核苷 酸或非多核苷酸部分(例如不包含一种或多种核苷酸或核苷酸类似物)共价连接至所述化 合物。缀合物可增强本发明的寡聚物的活性、细胞分布或细胞吸收。这些部分包括，但不 限于，抗体、多肽、脂质部分如胆固醇部分、胆酸、硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇、硫胆固 醇(thiocholesterol)、脂肪链，例如，十二烷二醇或十一烷基残基、磷脂，例如，二-十六烷 基-rac-甘油或1，2- 二 _o_十六烷基-rac-甘油_3_h_膦酸三乙基铵、聚胺或聚乙二醇链、 金刚烷乙酸、棕榈基部分、十八烷基胺或己基氨基_羰基-氧基胆固醇部分。
本发明的寡聚物也可缀合至活性药物，例如，阿司匹林，布洛芬，磺胺药物，抗糖尿 药，抗菌药或抗生素。在多种实施方案中该缀合的部分为固醇，如胆固醇。 在多种实施方案中，该缀合的部分包含或由以下组成带正电荷的聚合物，如带正 电荷的肽，例如长度为1-50，如2-20如3-10个氨基酸残基，和/或聚环氧烷如聚乙二醇 (PEG)或聚丙二醇-参见WO 2008/034123，在此引入作为参考。合适地该带正电荷的聚合 物，如聚环氧烷可通过连接基连接至本发明的寡聚物，如描述于WO 2008/034123的可释放 的连接基。活化的寡聚物本文所用的术语“活化的寡聚物”，是指共价连接(S卩，官能化)至至少一个官能部 分(functional moiety)的本发明的寡聚物，该官能部分允许寡聚物共价连接至一个或多 个缀合的部分(即本身不为核酸或单体的部分)，以形成本文描述的缀合物。典型地，官能 部分将包含能通过以下连接共价连接至寡聚物的化学基团例如，3’ -羟基或腺嘌呤碱基 的环外NH2基，优选亲水性间隔基(spacer)和能结合至缀合的部分的末端基团(例如，氨 基、巯基或羟基)。在一些实施方案中，末端基团未被保护，例如，为NH2基团。在其它实施方 案中，末端基团被保护，例如，被任何合适的保护基，如描述于Theodora WGreene和Peter G M Wuts,第三版(John Wiley&Sons, 1999)的"ProtectiveGroups in Organic Synthesis" 的那些保护。合适的羟基保护基的实例包括酯如乙酸酯，芳烷基如苄基，二苯基甲基，或三 苯基甲基和四氢吡喃基。合适的氨基保护基的实例包括苄基，α-甲基苄基，二苯基甲基， 三苯基甲基，苄基氧基羰基，叔丁氧基羰基和酰基如三氯乙酰基或三氟乙酰基。在一些实施 方案中，该官能部分是自裂解的(self-cleaving)。在其它实施方案中，该官能部分为生物 可降解的。参见例如，美国专利号7，087，229，其以其整体在此引入作为参考。在一些实施方案中，本发明的寡聚物在5’端官能化以使缀合的部分共价连接至寡 聚物的5’端。在其它实施方案中，本发明的寡聚物可在3’端官能化。在其它实施方案中， 本发明的寡聚物可沿着主链或在杂环碱基部分上官能化。在其它实施方案中，本发明的寡 聚物可在多于一个位置官能化，所述位置独立地选自5’端、3’端、主链和碱基。在一些实施方案中，本发明的活化的寡聚物通过在合成过程中掺入一个或多个共 价连接至官能部分的单体而合成。在其它实施方案中，本发明的活化的寡聚物使用未被官 能化的单体合成，且该寡聚物在合成完成后立即官能化。在一些实施方案中，该寡聚物使 用含氨基烷基连接基的位阻酯官能化，其中该烷基部分具有式(CH2)w，其中w为1至10 的整数，优选约6，其中烷基氨基的烷基部分可为直链或支链的，且其中该官能团通过酯基 (-O-C(O)-(CH2)wNH)连接至寡聚物。在其它实施方案中，该寡聚物使用含(CH2)w_巯基(SH)连接基的位阻酯官能化， 其中w为1至10的整数，优选约6，其中烷基氨基的烷基部分可为直链或支链的，且其中该 官能团通过酯基(-O-C(O)_(CH2)wSH)连接至寡聚物。在一些实施方案中，巯基-活化的寡核苷酸与聚合物部分如聚乙二醇或肽缀合 (通过二硫键的形成)。上述包含位阻酯的活化的寡聚物可通过任何本领域已知的方法合成，且特别是通 过公开于PCT公开号WO 2008/034122和其实施例中的方法，其以其整体在此引入作为参考。在其它实施方案中，本发明的寡聚物通过使用官能化试剂(fimctionalizing reagent)向寡聚物引入巯基、氨基或羟基而官能化，该官能化试剂基本上描述于美国 专利号4，962，029和4，914，210，S卩，为基本上链状的试剂，其在一端具有亚磷酰胺 (phosphoramidite)通过亲水性间隔基链连接至相对的端，该相对的端包含保护的或未保 护的巯基、氨基或羟基。这些试剂主要与寡聚物的羟基反应。在一些实施方案中，该活化的 寡聚物具有官能化试剂结合至寡聚物的5’ -羟基。在其它实施方案中，该活化的寡聚物具 有官能化试剂结合至3’ -羟基。在其它实施方案中，本发明的活化的寡聚物具有官能化试 剂结合至寡聚物的主链上的羟基。在其它实施方案中，本发明的寡聚物使用多于一种官能 化试剂官能化，该官能化试剂描述于美国专利号4，962，029和4，914，210中，以其整体在此 引入作为参考。合成该官能化试剂和将它们加入单体或寡聚物的方法公开于美国专利号 4，962，029 和 4，914，210。在一些实施方案中，固相结合的寡聚物的5’ -端使用二烯基亚磷酰胺衍生物官能 化，然后将脱保护的寡聚物与例如氨基酸或肽通过Diels-Alder环加成反应而缀合。在多种实施方案中，将含2’ _糖修饰的单体，如2’ _氨基甲酸酯取代的糖或 2' -(0-戊基-N-邻苯二甲酰亚氨基)_脱氧核糖的糖掺入寡聚物促进缀合的部分与寡聚 物的糖的共价连接。在其它实施方案中，一个或多个单体的2'-位具有含氨基的连接基 的寡聚物使用以下试剂制备例如，5' -二甲氧基三苯甲基-2' -0-(e-邻苯二甲酰亚氨 基氨基戊基)_2'-脱氧腺苷-3' -N，N-二异丙基-氰基乙氧基亚磷酰胺。参见，例如， Manoharan,等人，Tetrahedron Letters，1991，34，7171。在其它实施方案中，本发明的寡聚物可在核碱基上具有含胺的官能部分，包括在 N6嘌呤氨基上，在鸟嘌呤的环外N2上，或在胞嘧啶的N4或5位上。在多种实施方案中，该 官能化可通过使用已在寡聚物合成中官能化的商业试剂实现。一些官能部分是可商购的，例如，异双官能(heterobifunctional)和同双官 能(homobifunctional)连接部分可购自 Pierce Co. (Rockford, 111·)。其它可商购的 连接基为5'-氨基-修饰体(Modifier)C6和3'-氨基-修饰体试剂，均可购自Glen Research Corporation (Sterling，Va.)。5'-氨基-修饰体 C6 也可作为 Aminolink-2 购 自 ABI (Applied Biosystems Inc. ,Foster City，Calif.)，且 3‘-氨基-修饰体也可购自 Clontech Laboratories Inc. (Palo Alto, Calif.)。组合物本发明的寡聚物可用于药物制剂和组合物。合适地，该组合物包含药学可接受的 稀释剂、载体、盐或佐剂。W02007/031091提供了合适和优选的药学可接受的稀释剂、载体和 佐剂-其在此引入作为参考。合适的剂量、制剂、给药途径、组合物、剂型、与其它治疗剂的 组合，前药制剂也提供于W02007/031091-其也在此引入作为参考。如本文所述，术语"药学可接受的 盐"是指保持本文鉴别的化合物的所需生物活 性且显示最小的不希望有的毒理学作用的盐。这些盐的非限制性实例可通过与有机氨基酸 形成，以及与金属阳离子形成的碱加成盐，该金属阳离子如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、 镉、钠、钾等，或与由氨形成的阳离子，N，N’ - 二苄基乙二胺，D-葡糖胺，四乙基铵，或乙二胺 形成的碱加成盐；或(a)和(b)的(c)组合；例如，鞣酸锌盐等。
应用本发明的寡聚物可用作研究试剂，用于例如，诊断、治疗和预防。在研究中，该寡聚物可用于特异抑制细胞和实验动物中HER3的表达或合成(通常 通过降解或抑制mRNA从而防止蛋白质形成)，从而促进该靶的功能分析或评估其作为治疗 干预的靶的有用性。在诊断中该寡聚物可用于通过RNA印迹法、原位杂交或类似技术检测和定量细胞 和组织中的HER3表达。对于治疗，疑患疾病或病症的动物或人(其可通过调节HER3 (和任选HER2和/或 EGFR)的表达治疗)通过给药本发明的寡聚化合物，如有效量的寡聚物(或其缀合物)而治 疗。本文进一步提供了治疗哺乳动物的方法，如治疗人，其疑患疾病或症状或易患疾病或症 状，该疾病或症状与HER3的表达相关，该方法通过给药治疗或预防有效量的本发明的一种 或多种寡聚物或组合物。
本发明还提供本发明所述的化合物或缀合物在制备用于治疗本文涉及的疾病的 药物中的用途，或提供治疗本文所述的疾病的方法。本发明还涉及本文所述的寡聚物、组合物或缀合物用作药物。合适地，当涉及本发 明的方法时，本发明的寡聚物或缀合物的给药通过给药有效量的寡聚物或缀合物进行，例 如能有效提供治疗的量或有效抑制或下调细胞中HER3表达的量。本发明还提供治疗本文涉及的疾病的方法，所述方法包括向需要的患者给药本发 明的化合物，和/或本发明的缀合物，和/或本发明的药物组合物。在多种实施方案中，该寡聚物或其缀合物，通过例如氢键合至靶核酸而结合，在人 体内引起所需的治疗效果。该寡聚物或其缀合物，通过氢键合(杂交)至靶的mRNA导致基 因表达减少，引起靶的表达减少(抑制)。还可看出本文公开的寡聚化合物和缀合物可具有 非治疗应用，如诊断应用。在多种实施方式中，本发明的寡聚物能够诱导其中导入了它的细胞的细胞凋亡， 例如癌细胞，例如本文涉及的细胞株(例如，在此处公开的半胱氨酸蛋白酶实验中)。然而， 在多种实施方式中，本发明的寡聚物可以不诱导细胞凋亡，例如，如通过半胱氨酸蛋白酶实 验所确定的。就此来说，虽然细胞凋亡对于有效的杀死细胞例如癌细胞是期望的，在多种实 施方式中，它可以与对非靶细胞和组织的更为毒性的效果负相关。因而，取决于要治疗的医 学适应症，可能有益的是选择触发细胞凋亡非常有效的寡核苷酸，而其他的，在医学适应症 可能不立即危急生命的时候，在触发细胞凋亡方面不那么有效的寡聚物可能是适合的。医学适应症如本文涉及的，过度增生性疾病在多种实施方式中是癌症。在更具体的实施方式 中，所述癌症选自淋巴瘤和白血病(例如，非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、急性白血 病例如急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞样白血病、慢性淋巴细胞 性白血病、多发性骨髓瘤)、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肾细胞癌、 肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、子宫颈癌、睾丸癌、肺癌、膀胱癌、黑素瘤、头颈癌、脑癌、未知 原发位点的癌症(cancers ofunknown primary sits)、赘癌(neoplasm)、外周神经系统的 癌症、中枢神经系统的癌症、不同种类的肿瘤(例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨 肉瘤、骨原性肉瘤(osteogenic sarcoma)、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮细胞肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、鳞状细胞癌、基底 细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、精原细 胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯氏肿瘤、小细胞肺癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅 咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、成神经细 胞瘤和视网膜母细胞瘤)、重链病、转移(metastases)，或以不受控制的或异常的细胞生长 为特征的任何疾病或病症。在某些特别的实施方式中，所述癌细胞选自乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠 癌和脑癌。根据本发明的这样的疾病或病症的治疗可以与一种或多种其他抗癌治疗，例如放 射治疗、化学治疗或免疫治疗组合。在多种实施方式中，在此使用的术语“治疗”是指现有疾病(例如，本文涉及的疾 病或病症)的治疗，或防止疾病，即，预防。因而要认识到的是，本文涉及的治疗，在多种实 施方式中，可以是预防性的。一般地，本发明的一个方面涉及治疗患有或易感于与异常的HER3水平相关的病 症的哺乳动物的方法，包括向所述哺乳动物给药治疗有效量的靶向HER3的寡聚物，例如包 含一个或多个LNA单元的寡聚物。
在多种实施方式中，本文涉及的疾病或病症可以与HER3基因、或其蛋白质产物与 HER3相关或相互作用的基因的突变相关。因而，在多种实施方式中，靶mRNA是HER3序列的 突变形式。本发明的令人感兴趣的方面涉及在此定义的寡聚物(化合物)或在此定义的缀合 物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗本文涉及的疾病、病症或症状。可以采用本发明的方法用于治疗或预防由异常水平的HER3所引起的疾病。做为选择，在多种实施方式中，本发明还涉及治疗异常水平的HER3的方法，所述 方法包括向有需要的患者给药本发明的寡聚物、或本发明的缀合物或本发明的药物组合 物。W02007/031091中还提供了适合的剂量、制剂、给药途径、组合物、剂型、与其他治 疗试剂的组合、前药制剂——其在此引入作为参考。本发明还提供了药物组合物，其包含在 此描述的化合物或缀合物，以及药学上可接受的稀释剂、载体或佐剂。W02007/031091提供 了适合的和优选药学上可接受的稀释剂、载体和佐剂——其在此引入作为参考。本发明进一步涉及在此定义的寡聚物(化合物)、组合物或缀合物在制备药物中 的用途，所述药物用于治疗异常HER3水平或HER3的突变形式(例如，等位变体，例如与本 文涉及的疾病之一相关的那些)的表达。本发明还涉及在此定义的寡聚物、组合物或缀合物，其用作药物。此外，本发明涉及治疗患有例如本文涉及那些的疾病或病症的受试者的方法。需要治疗的患者是患有或可能患有所述疾病或病症的患者。在多种实施方式中，本文涉及的疾病或病症可以与HER3基因、或其蛋白质产物与 HER3相关或相互作用的基因的突变相关。因此，在多种实施方式中，靶mRNA是HER3序列的 突变的形式，例如，它可以包含一个或多个单点突变，例如与癌症相关的SNPs。根据本发明的寡聚物和其他组合物可以用于治疗与HER3的突变形式的过表达或表达相关的疾病。已经由本领域的先驱科学家表明的是，HER3的药物介入将产生针对过度增生性疾病(hyperproliferative disorder)，例如癌症，例如本文涉及的那些的治疗选 择。本发明的一个方面涉及治疗患有或易感于与HER3、突变的HER3或HER3的异常水 平相关的疾病的哺乳动物的方法，包括向所述哺乳动物给药治疗有效量的靶向HER3的、包 含一个或多个LNA单元的寡聚物。然而认识到的是，在多种实施方式中，所述疾病，例如过度增生性疾病，例如本文 涉及的癌症，可不必与HER3的过表达、或HER3相关的基因产物相关联。本发明的一个方面涉及治疗患有或易感于与HER2、突变的HER2或HER2的异常水 平相关的疾病的哺乳动物的方法，包括向所述哺乳动物给药治疗有效量的靶向HER3(和任 选地HER2和/或EGFR)的、包含一个或多个LNA单元的寡聚物。本发明的一个方面涉及治疗患有或易感于与EGFR、突变的EGFR或EGFR的异常水 平相关的疾病的哺乳动物的方法，包括向所述哺乳动物给药治疗有效量的靶向HER3(和任 选地HER2和/或EGFR)的、包含一个或多个LNA单元的寡聚物。其中，HER3的突变导致HER3活性的异常水平的这些疾病的实例有乳腺癌。因而， 在一个特定的实施方式中，所述根据本发明的治疗的癌症是乳腺癌。根据本发明所指的癌症，可以选自上文提及的癌症的形式之一。此外，在此描述的发明包括了预防或治疗疾病的方法，包括向需要这样的治疗的 人给药治疗有效量的HER3调节寡聚物。本发明进一步包括短期给药HER3调节寡核苷酸化 合物的用途。做为选择，在多种实施方式中，本发明还涉及治疗异常水平的HER3的方法，所述 方法包括向有需要的患者给药本发明的寡聚物、或本发明的缀合物或本发明的药物组合 物，并进一步包括给药其他药物或其他活性成分。所述进一步的给药可以是这样，使得所述 其他药物或其他活性成分与本发明的化合物缀合、存在于所述药物组合物中、或在独立的 制剂中给药。本发明进一步涉及在此定义的化合物、组合物或缀合物在制备药物中的用途，所 述药物用于治疗异常水平的HER3或HER3的突变形式(例如等位变体，例如与本文涉及的 疾病之一相关的那些)的表达。需要治疗的患者是患有或可能患有所述疾病或病症的患者。与其他反义寡聚物组合在此认识到的是，本发明的寡聚物可以靶向HER3、HER2和/或EGFR靶。因而认识 到的是，在多种实施方式中，本发明涉及超过一个寡聚物的用途，所述寡聚物容许或优化两 个或三个靶的靶向，例如，靶向HER3的寡聚物和靶向EGFR或Her2的第二寡聚物，或甚至任 选独立地靶向HER3、Her2和EGFR靶的三种寡聚物。在多种实施方式中，根据本发明的药物组合物可以包含靶向Her2的其他治疗剂， 例如靶向Her2mRNA的反义寡聚物。在多种实施方式中，其可以是相同的或不同的，根据本发明的药物组合物可以包 含靶向EGFR的其他治疗剂，例如靶向EGFR mRNA的反义寡聚物。对于靶向Her2或EGFR mRNA的寡聚物(例如缺口聚物和短聚物)、和其缀合物的结构，除了该寡聚物将与Her2或EGFR mRNA的对应区互补(或至少80%互补)，或在一种 情况中，相对于相应的靶区域包含1、2、3或4个错配，在多种实施方式中，可以具有与根据 本发明寡聚物相同的结构(即，除了核碱基的特异性序列之外)。成套试剂盒(kitsof parts) 本发明还提供了成套试剂盒，其中第一部分包含根据本发明的寡聚物、缀合物和/ 或药物组合物，和其他部分，包含其他活性成分(即，本文涉及的其他治疗试剂或寡聚物)， 例如本文涉及的那些。因而设想的是，所述部件试剂盒可以用于治疗方法，如本文涉及的， 其中所述方法包括同时地或相继地给药所述第一部分和其他部分。本发明还提供了成套试剂盒，其中第一部分包含根据本发明的寡聚物、缀合物和/ 或药物组合物，和其他部分，所述其他部分包含能够降低Her2和/或EGFR的表达的反义寡 核苷酸。因而设想的是，所述部件试剂盒可以用于治疗方法，如本文涉及的，其中所述方法 包括同时地或相继地给药所述第一部分和其他部分。进一步的实施方式以下实施方式还涉及本发明的说明书和摘要，并且可以与本文涉及的本发明的实 施方式组合，包括权利要求中涉及的实施方式1.反义寡核苷酸，其能够结合SEQ ID NO 197的HER3基因或其等位基因的靶序 列、并下调HER3的表达，所述寡核苷酸包含与所述靶序列相应的10-50个核碱基的序列。2.实施方式1的反义寡核苷酸，其中所述靶序列选自SEQ ID N0:l_140所示的 HER3基因或其等位变体的区域。3.实施方式1或实施方式2的寡核苷酸，包含SEQ ID NO :1、16、17、18、19、34、49、 50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、74、75、76、91、92、107、122、137、138、139 和 140 中所示 的10-16个核碱基的序列或其等位变体。4.根据实施方式1-3中任一项的寡核苷酸，包含SEQ ID NO :1_140所示的序列中 的任一个。5.前述实施方式中任一项的寡核苷酸，其由SEQ ID NO :141_196所示。6.实施方式1的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸进一步能够下调SEQ IDNO 199的 HER2基因或其等位变体、和/或SEQ ID NO 198的EGFR基因或其等位变体的表达。7.实施方式6的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸能够下调SEQ ID NO 199的HER2基 因或其等位变体的表达，以及其中所述寡核苷酸由SEQ IDNO 177或178所示。8.实施方式6的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸能够下调SEQ ID NO 198的EGFR基 因或其等位变体的表达，以及其中所述寡核苷酸由SEQ IDNO 171或173所示。9.实施方式6的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸能够下调SEQ ID NO 199的HER2基 因或其等位变体、以及SEQ ID NO: 198的EGFR基因或其等位变体的表达。10.实施方式9的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸由SEQ ID NO 169、170、172、174、 175、176和179的任一个所示。11.根据前述实施方式中任一项的寡核苷酸，其中所述核碱基序列包含独立地选 自磷酸二酯、硫代磷酸酯和硼烷磷酸脂的核碱基间连接。12.前述实施方式中任一项的寡核苷酸，其中所述核碱基的至少两个是核苷酸类 似物。
13.根据实施方式5的寡核苷酸，其中所述核碱基的序列包含，在5'到3'方向 上，(i) A区一段2-4个核苷酸类似物，随后是(ii)B区一段不同于A区的6-11个核苷酸 或核苷酸类似物，随后是(iii)C区一段2-4个核苷酸类似物，以及任选随后是(iv)D区 一个或两个核苷酸。14.根据实施方式13的寡核苷酸，其中所述A区包含在两个核苷酸类似物单元和 /或核苷酸类似物单元与B区的核碱基单元之间的至少一个磷酸二酯连接。15.根据实施方式13或实施方式14的寡核苷酸，其中C区在两个核苷酸类似物单 元和/或核苷酸类似物单元与B区的核碱基单元之间的包含至少一个磷酸二酯连接。16.根据实施方式1到11中任一项的寡核苷酸，其中所有的核碱基间连接是硫代 磷酸酯。17.根据实施方式12到16中任一项的寡核苷酸，其中所述核苷酸类似物单元独 立地选自2 ‘ -0-烷基-RNA、2 ‘-氨基-DNA、2 ‘-氟-DNA、锁核酸(LNA)、阿拉伯糖核酸 (ANA)、2'-氟 _ANA、HNA、嵌入核酸(intercalating nucleic acid) (ΙΝΑ)和 2，ΜΟΕ。18.根据实施方式17的寡核苷酸，其中所述核苷酸类似物独立地选自 2，-M0E-RNA、2，-氟 -DNA 禾口 LNA019.根据实施方式18的寡核苷酸，其中所述核苷酸类似物的至少一个是锁核酸 (LNA)。20.根据实施方式19的寡核苷酸，其中所有核苷酸类似物是LNA。21.根据实施方式17到20中任一项的寡核苷酸，其中LNA选自β _D_氧基-LNA、 α -L-氧基-LNA、β -D-氨基-LNA 和 β -D-硫基-LNA。22.缀合物，其包含前述实施方式的任一项中寡核苷酸和与所述寡核苷酸共价连 接的至少一个非核苷酸或非多核苷酸部分。23.根据实施方式22的缀合物，其中所述非核苷酸或非多核苷酸部分包含固醇基 团例如胆固醇或由固醇基团例如胆固醇组成。24.药物组合物，包含根据实施方式1到21中任一项的寡核苷酸或根据实施方式 22或实施方式23的缀合物，以及药学上可接受的稀释剂、载体或佐剂。25.根据实施方式1到23中任一项的寡核苷酸或缀合物，其用作药物。26.根据实施方式1到23中任一项的寡核苷酸或缀合物在制备药物中的用途，所 述药物用于治疗异常水平的HER3和/或HER2和/或EGFR、或需要(indicate)下调HER3 和/或HER2和/或EGFR表达的疾病或病症。27.根据实施方式26的用途，其中所述疾病或状况是癌症。28.治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向有需要的受试者给药根据实 施方式1到24中任一项的药物组合物、寡核苷酸或缀合物的步骤。29.实施方式27或28的用途或方法，其中所述癌症选自乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前 列腺癌、结肠癌和脑癌。30. HER3基因中的靶序列，其中与所述靶序列相应的反义寡核苷酸能够下调HER3 的表达。31.实施方式30的靶序列，其中所述靶序列选自与SEQ ID NO 1_140互补的HER3 基因或其等位变体的区域。
32.下调细胞中HER3的表达的方法，包括用根据实施方式1_21中任一项的寡核苷 酸接触所述细胞。
实施例实施例1 单体合成LNA单体构建块(building blocks)和衍生物根据公开的方法和其中引述的参考 文献来制备——参见W007/031081和其中引证的参考文献。实施例2 寡核苷酸合成寡核苷酸根据W007/031081中描述的方法来合成。表1显示了本发明的反义寡核 苷酸基序的实例。实施例3 寡核苷酸的设计根据本发明，设计一系列不同的寡核苷酸除了人HER3 (GenBank登记号 NM_001982，在此作为SEQ ID NO 197示出)之外还靶向人EGFR(GenBank登记号匪 005228，在此作为SEQ ID NO 198示出)和人HER2 (GenBank登记号NM 004448，在此作为 SEQ ID N0:199示出)的不同区域。表1 本发明的反义寡核苷酸序列。SEQ ID NO :1_50、53、139和140是寡聚序列 (oligo sequences)，其被设计为除了人HER3之外还靶向人EGFR和人HER2。显示了与HER3、 EGFR和HER2的序列同源性的百分比。所述寡聚物具有相对于EGFR的0到2个错配，相对 于HER2的1到2个错配。
表3 本发明的寡核苷酸设计在SEQ ID NO :141_168中，大写字母表示核苷酸类似物单元，下标“S”代表硫代磷
酸酯连接。小写字母代表核苷酸(DNA)单元。没有“S”(如果存在的话)表示磷酸二酯连接。
表3-寡聚物设计‘ 实施例4 体外模型细胞培养反义寡核苷酸对靶核酸表达的作用可以在多种细胞类型的任一种中测试，条件是 该靶核酸以可检测的水平存在。靶可内源性表达或通过对编码所述靶的核酸进行瞬时转染 或稳定的转染而表达。靶核酸的表达水平可常规地使用，例如，RNA印迹分析、实时PCR、核 糖核酸酶保护测试而确定。为了例示，提供以下细胞类型，但可常规使用其它细胞类型，条 件是该靶在所选的细胞类型中表达。细胞如下所述在合适的培养基中培养，并保持在37°C和95-98%湿度和5% CO2下。细胞每周常规传代2-3次。15PC3 人前列腺癌细胞株 15PC3 在 DMEM (Sigma) +10 % 胎牛血清(FBS) +2mM Glutamax 1+庆大霉素(25 μ g/ml)中培养。HUH7 人肝癌细胞株在 DMEM(Sigma)+10% 胎牛血清(FBS)+2mMGlutamax 1+庆大 霉素(25 μ g/ml)+Ix非必需氨基酸中培养。
实施例5 体外模型用反义寡核苷酸处理将细胞用寡核苷酸处理，使用阳离子脂质体制剂LipofectAMINE 2000 (Gibco)作 为转染载体。将细胞接种于6-孔细胞培养板(NUNC)并当铺满80-90%时进行处理。使用的 寡核苷酸浓度范围为InM至25nM终浓度。寡核苷酸-脂质复合物的配制基本上按照制造商 的说明进行，其使用无血清OptiMEM(Gibco)且最终脂质浓度为5 μ g/mL的LipofectAMINE 2000。将细胞在37°C培养4小时且通过去除含寡核苷酸的培养基终止处理。清洗细胞且添 加含血清的培养基。寡核苷酸处理后，使细胞恢复20小时，然后将其收集用于RNA分析。实施例6 体外模型RNA的提取和cDNA合成使用Qiagen RNeasy试剂盒(Qiagen cat. no. 74104)根据厂家的说明书从如上所 述转染的细胞提取总RNA。根据厂家的说明书使用来自Ambion的逆转录酶试剂(Reverse Transcriptase reagents) iH^fT^I一lil^fj^。对于每个样品，使用无RNase H2O将0. 5 μ g总RNA调节到10. 8 μ 1，并与2 μ 1十碱 基的随机引物(random decamers) (50 μ Μ)禾口 4 μ 1 dNTP混合物(每种dNTP 2. 5mM)混合， 加热到70°C保持3分钟，在这之后样品在冰上快速冷却。在冰上冷却样品之后，将2μ IlOx 缓冲液RT、1 μ 1的MMLV逆转录酶(100U/ μ 1)和0. 25 μ 1 RNase抑制剂(10U/ μ 1)添加到 各样品中，随后在42°C孵育60分钟，酶在95°C加热灭活10分钟，然后将样品冷却到4°C。实施例7 体外模型通过实时PCR分析HER3、EGFR和HER2表达的寡核苷酸抑制 作用HER3、EGFR和HER2表达的反义调节可以以本领域已知的多种方式分析。举例来 说，HER3、EGFR和HER2mRNA水平可以通过例如RNA印迹分析、竞争性聚合酶链式反应(PCR) 或实时PCR来定量。实时定量PCR当前是优选。可以对总细胞RNA或mRNA进行RNA分析。RNA分离和RNA分析的方法例如RNA印迹分析是本领域常规的，在例如Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 禾口 Sons 中教导了。实时定量的(PCR)可以使用可从Applied Biosystems商业上获得的Multi-Color Real Time PCR检测系统方便地实现。HER3、EGFR和HER2mRNA水平的实时定量PCR分析人HER3、EGFR 和 HER2mRNA 的样品含量使用人 HER3、EGFR 和 HER2AB I Prism Pre-Developed TaqMan Assay Reagents(Applied Biosystemscat. no. Hs00951444_ ml (HER3)、Hs00193306_ml (EGFR)和 Hs00170433_ml (HER2)根据厂家的说明书来定量。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)mRNA的量用作内源对照用于标准化样品制备中 的任何变化。人GAPDH mRNA的样品含量使用人GAPDH ABIPrism Pre-Developed TaqMan Assay Reagent (Applied Biosystems cat. no. 4310884E)根据厂家的说明书来定量。实时定量PCR是本领域公知的技术，在例如Heid等人.Real timequantitative PCR, Genome Research (1996), 6 :986_994 中教导了。
实时PCR将来自第一链合成的cDNA(如实施例5中描述进行的)稀释2_20倍，通过使用 来自 Applied Biosystems 的 Taqman 7500FAST 或 7900FAST 的实时定量 PCR 来分析。将 引物和探针与 2XTaqman Fast Universal PCR 主混合物(master mix) (2X) (Applied Biosystems Cat. #4364103)混合，添加到4 u lcDNA中至10 yl的终体积。一式两份分析每 种样品。测试2倍稀释的cDNA得到该测试的标准曲线，该cDNA从表达感兴趣的RNA的细 胞株纯化的物质制备。使用无菌的H20代替cDNA用于无模板对照。PCR程序95°C 30秒， 然后进行 40 个循环，95°C 3 秒，60°C 20-30 秒。使用 Applied BiosystemsFast System SDS 软件版本1. 3. 1. 21.或SDS软件版本2. 3根据计算的阈值循 环测定靶mRNA的相对数量。实施例8 体外分析寡核苷酸化合物对人HER3、EGFR和HER2表达的反义抑制评估表3中呈现的寡核苷酸在1、5和25nM浓度下在15PC3细胞(或如*所指示 的 Huh-7)中敲减 HER3、EGFR 和 HER2mRNA 的潜力(参见附图 2、3、4 和 5)。SEQ ID NO 235 和236是乱序(scrambled)对照。表4 寡核苷酸对人HER3、EGFR和HER2表达的反义抑制表4中的数据被表示为在25nM下相对于模拟品转染的细胞的mRNA下调百分比。 小写字母代表DNA单元，粗体大写字母代表3-D-氧基-LNA单元。所有的LNAC是5'甲 基C。下标“s”表示硫代磷酸酯连接。
如在表4中所示，在这些实验中在15PC3细胞中，SEQ ID NO 169、170、173、174、 180、181、183、185、187、188、189、190、191、192 和 194 的寡核苷酸在 25nM 展现了的 85%或 更大的对HER3mRNA表达抑制。同样优选的是，基于列举的反义寡聚序列的寡核苷酸，例如，改变长度(更短或更 长)和/或核碱基含量(例如，类似物单元的类型和/或比例)，其也提供了对HER3表达的 良好的抑制。实施例9 :LNA寡核苷酸的细胞凋亡诱导在转染的前一天，将HUH7细胞以2. 5 X 105个细胞/孔的密度接种在6孔培养平板 (NUNC)中。当75-90%汇合时利用阳离子脂质体制剂LipofectAMINE 2000 (Gibco)作为转 染载体用寡核苷酸处理细胞。使用的寡聚物浓度是5nM和25nM(反应孔中的终浓度)。寡聚 物_脂质复合物的配制基本上如厂家所描述的进行，使用无血清OptiMEM(Gibco)和5 y g/ mL的最终的脂质浓度的LipofectAMINE 2000。细胞在37°C孵育4小时，通过除去含有寡聚 物的培养基来停止处理。在用Optimem洗涤之后，将300iU的胰蛋白酶添加到每个孔中直 到细胞从孔脱离。通过向孔中添加3ml HUH7培养基来灭活胰蛋白酶，通过上下地轻轻地吸 移细胞悬浮液来产生单细胞悬浮液。乱序的寡聚物SEQ ID N0:235用作对照。在这之后，将100 ill的细胞悬浮液添加到来自Nunc的白色96孔平板 (cat#136101))的每个孔中(制备四个平板，用于在不同时间点测量)。将平板然后在37°C、95%湿度和5% CO2中孵育直到进行分析。半胱氨酸蛋白酶分析细胞凋亡特异件半胱氨酸蛋白酶3和7的活性使用荧光 Caspase-Glo 3/7-底物分析(来自Promega的Cat#G8091)来测量。要分析的平板平衡 到室温保持15分钟。Caspase- Glo 3/7缓冲液与Caspase- (}1θ 3/7底物混合，得到 Caspase-G10 工作溶液，将其平衡到室温。然后，将100 μ 1的Caspase-Glo 工作溶 液小心地添加到96孔平板的每个孔的培养基中(重要 的是避免气泡和孔之间的污染)。 平板小心地振摇1分钟，在这之后，将它在室温避光孵育1小时。半胱氨酸蛋白酶活性以 LuminoscanAscent仪器(Thermo Labsystems)中的每秒的相对光单元(RLU/s)来测量。相 对于被设置为1的模拟品(mock)的平均值将数据进行相关和绘图。参见附图6。实施例10 使用LNA寡核苷酸对增殖的体外抑制如实施例9中所述，转染HUH7细胞并收集成单细胞悬浮液。SEQ IDNO :235充当 乱序的对照。在这之后，将100 μ 1的细胞悬浮液添加到96孔平板(” OrangeScientific")的 每个孔中用于MTS实验(制备四个平板，用于在不同的时间点测量)。然后将平板在37°C、 95%湿度和5% CO2中孵育直到进行实验。增殖的活细胞的测定(MTS分析)对于增殖分析，将10 μ 1 CellTiter 96 AQueous One Solution CellProliferation Assay (Promega, G3582)添加到96孔平板的每个孔的培养基中，小心 地振摇平板，并在测量前在37°C、95%湿度和5% CO2孵育1小时。在分光光度计中测量 490nm处的吸光度，减去从仅含有培养基的孔中得到的实验背景。490nm处的吸光度与活细 胞的数量成比例，对模拟品转染的细胞和对用寡聚物转染的细胞相对于时间进行绘图。参 见附图7。实施例11 靶mRNA敲减的体内评估为了评估HER3寡聚化合物的体内敲减(knockdown)效力，带有15PC3异种移植物 的雌性裸小鼠(通过向右侧腋下肋部皮下注射5 X IO6个细胞/小鼠得到)，在多种剂量和 注射方案(即，单剂量、每天(qd)、每3天(q3d)、每4天(q4d))下用寡聚物静脉内注射。乱 序的寡聚物SEQ ID N0:236充当阴性对照。最后注射后24小时，小鼠被麻醉，将肝脏和肿 瘤组织采集在RNAlater溶液(Ambion)中。从组织纯化总RNA，通过使用QuantiTect Probe RT-PCR 试剂盒(Cat# :204443 ；Qiagen)的定量逆转录实时 PCR(qRT-PCR)测定 HER3mRNA 的 水平。GAPDH mRNA充当内部对照。小鼠 ErbB3 探针cca cac ctg gtc ata gcg gtg a (SEQ ID NO 237)，引物 _1 ctg ttt agg cca age aga gg(SEQ ID NO 238)，弓丨物_2 :att ctg aat cct gcg tcc ac (SEQ ID NO 239)。A ErbB3 探针cat tgc cca acc tcc gcg tg(SEQ ID NO 240)，引物 _1 :tgcagt gga ttc gag aag tg(SEQ ID NO 241),弓丨物 _2 :ggc aaa ctt ccc ate gta ga(SEQIDN0 242)。人GAPDH 探针act ggc get gcc aag get gt (SEQ ID NO 243)，引物_1 :cca ccc aga aga ctg tgg at (SEQ ID NO 244),弓丨物 _2 :ttc age tea ggg atg acc tt (SEQ ID NO 245)。
小鼠GAPDH 探针age tgt ggc gtg atg gcc gt (SEQ ID NO 246)，引物 _1 :aac ttt ggc att gtg gaa gg(SEQ ID NO 247)，弓丨物_2 :gga tgc agg gat gat gtt ct (SEQ ID NO 248)。在PCR反应中使用200ng的总RNA。通过使用包括软件的ABI-7500PCR Fast System进行数据分析。参见表5。表5 小鼠肝脏和肿瘤中HER3mRNA的抑制作用表5中的数据表示为，在按照指定的剂量用寡核苷酸连续5天对动物静脉给药后， 在肝脏和肿瘤样品中，相对于盐水治疗的对照HER3mRNA水平的％。 实施例12 肿瘤生长抑制的评估ErbB3特异性LNA抑制体内肿瘤生长的能力在带有15PC3异种移植物的裸雌性小 鼠中评估。15PC3人前列腺肿瘤模型通过向右侧腋下肋部皮下注射5X IO6个细胞/小鼠来 构建。肿瘤体积将通过卡尺测量2个方向来测定，并使用下式来计算肿瘤体积=(长度X 宽度2)/2)。当肿瘤达到70-100mm3的平均体积时，将带有肿瘤的小鼠被分成治疗组和对照 组。以q3d xlO的方案，小鼠分别静脉注射25和50mg/kg的SEQ ID N0:180。盐水或乱序对照SEQ ID NO :236充当对照。每周两次地测量小鼠的体重和肿瘤大小。通过临床观察、临 床化学和组织病理学检验来估计毒性。通过如实施例11描述的QPCR测量肿瘤HER3mRNA。 参见附图8A和8B。实施例13 小鼠肝脏中HER3mRNA的抑制连续三天以1或5mg/kg寡核苷酸对NMRI小鼠静脉给药(每组5只小鼠)。反义寡 核苷酸(SEQ ID NO 180和SEQ ID NO 234)溶于0.9%盐水(NaCl)中。在最后的给药后24 小时处死动物，采样肝脏组织，并保存在RNA later (Ambion)中直到RNA提取和QPCR分析。 提取总RNA，肝脏样品中的HER3mRNA表达使用小鼠HER3QPCR实验(cat. no. Mm01159999_ ml, Applied Biosystems)，如实施例7中描述的通过QPCR来测量。结果对小鼠GAPDH(cat. no. 4352339E, Applied Biosystems)进行标准化，相对于盐水处理的对照绘图(参见附图 9)。实施例14 =SEQ ID NO 141或SEQ ID NO 152和聚乙二醇的缀合物的制备具有SEQ ID NO 141或SEQ ID NO 152的寡聚物，通过利用常规的亚磷酰胺化学 作用将用阻断基团例如Fmoc阻断的氨基烷基基团例如己烷-1-胺连接到寡聚物的5'磷 酸基团，来在5'末端功能化，氧化产生的化合物，将它脱保护，纯化来得到具有式(II)或 (III)的功能化的寡聚物 其中SEQ ID NO 141或SEQ ID NO 152中的粗体大写字母和下标“S”具有如上所 述的相同的含义。活化的PEG的方案，例如在式(IV)中所示的一种
(IV)其中PEG部分具有12，OOODa的平均分子量，且的式(II)或(III)化合物在PBS 缓冲液中在室温下搅动12小时。反应溶液用二氯甲烷提取三次，合并的有机层用硫酸镁干燥，并过滤，溶剂减压蒸发。残余物溶于双蒸水，并加载到阴离子交换柱上。未反应的PEG 连接基(linker)用水洗脱，产物用NH4HCO3溶液洗脱。收集含有纯产物的级分，冻干得到式 (V)或(VI)的缀合物
(VI)其中SEQ ID N0:141或SEQ ID NO : 152的寡聚物经由可释放的连接基连接到具有 12，000平均分子量的PEG聚合物上。以下是 SEQ ID NO :180、SEQ ID NO 234 和 SEQ ID NO 169 的缀合物的实例 实施例15 使用不同的给药周期评估靶mRNA体内敲减使用如上在实施例11中描述的方案，在带有来自15PC3细胞或A549细胞(NSCLC) 或N87细胞(胃癌)的异种移植肿瘤的裸小鼠中，体内评估寡聚物的敲减效力。寡聚物通 过每三天2-4剂注射给药。在最后的注射后3或4天收集组织。表6和7中的数据表示为相对于盐水治疗的对照，在用指定的寡聚物对动物静脉 给药后，在肝脏和肿瘤样品中HER3mRNA或HIF-I α mRNA水平的％。 观察到的具有SEQ ID Ν0:169和SEQ ID NO :180的序列的寡聚物的敲减效果不是 对15PC3肿瘤细胞独特的，因为在来自Α549 (NSCLC)和Ν87 (胃癌)细胞的肿瘤中观察到了 相似的效果。参见以下的表7。
权利要求
长度为10-25个核碱基的寡聚物，其包含总共10-24个核碱基的连续核碱基序列，其中，i)所述连续核碱基序列与选自SEQ ID NO211和SEQID NO200的序列的对应区100％同源；或(ii)所述连续核碱基序列相对于选自SEQ ID NO211和SEQ ID NO200的序列的对应区包含不超过一个错配。
2.长度为10-50个核碱基的寡聚物，其包含总共10-50个核碱基的连续核碱基序列，其 中所述连续的核碱基序列与哺乳动物HER3基因或mRNA，例如SEQ ID NO 197或其天然存 在的变体的对应区至少80%同源。
3.根据权利要求1或2的寡聚物，其中所述连续核碱基序列与选自SEQIDNO 200-227,SEQ ID N0:l_140 和 SEQ ID NO :228_233 的序列，例如选自 SEQ ID NO 1,54,200 和211的序列的对应区至少80%同源。
4.根据权利要求1-3中任一项的寡聚物，其中，相对于SEQID NO 197的对应区，所述 连续核碱基序列不包含错配，或包含不超过一个或两个错配。
5.根据权利要求1-4中任一项的寡聚物，其中所述寡聚物的核碱基序列由连续核碱基 序列组成。
6.根据权利要求1-5中任一项的寡聚物，其中所述连续核碱基序列长度为10-18个核苷酸。
7.根据权利要求1-6中任一项的寡聚物，其中所述连续核碱基序列包含核苷酸类似物。
8.根据权利要求7的寡聚物，其中所述核苷酸类似物是糖修饰的核苷酸，例如选自锁 核酸(LNA)单元；2，-0-烷基-RNA单元、2，-OMe-RNA单元、2，-氨基-DNA单元和2，-氟-DNA 单元的糖修饰的核苷酸。
9.根据权利要求7的寡聚物，其中所述核苷酸类似物是LNA。
10.根据权利要求7-9中任一项的寡聚物，其是缺口聚物。
11.根据权利要求1-10中任一项的寡聚物，其抑制表达HER3基因或mRNA的细胞中 Her-3基因或mRNA的表达。
12.根据权利要求1-11中任一项的寡聚物，其中所述寡聚物选自SEQIDN0:169-196和 234，例如 SEQ ID NO 169 和 180。
13.缀合物，其包含权利要求1-12中任一项的寡聚物、以及共价连接于所述寡聚物的 至少一个非核苷酸或非多核苷酸部分。
14.药物组合物，其包含权利要求1-12中任一项的寡聚物、或权利要求13的缀合物，以 及药学上可接受的稀释剂、载体、盐或佐剂。
15.根据权利要求1-12中任一项的寡聚物，或根据权利要求13的缀合物，其用作药物， 例如用于治疗过度增生性疾病，例如癌症。
16.根据权利要求1-12中任一项的寡聚物、或权利要求13中定义的缀合物在制备用于 治疗过度增生性疾病例如癌症的药物中的用途。
17.治疗过度增生性疾病例如癌症的方法，所述方法包括向患有或可能患有过度增生 性疾病例如癌症的患者给药权利要求1-12中任一项的寡聚物、或权利要求13的缀合物、或 权利要求14的药物组合物。
18.在表达HER3的细胞中抑制HER3的方法，所述方法包括向所述细胞给药权利要求1-12中任一项的寡聚物、或权利要求13的缀合物，以抑制所述细胞中的HER3。
19.降低或抑制细胞或组织(其表达HER3和/或HER2和/或EGFR)中HER3和/或 HER2和/或EGFR的表达的方法，所述方法包括用权利要求1_12中任一项定义的寡聚物、或 权利要求13中定义的缀合物、或权利要求14中定义的药物组合物与所述细胞或组织接触 的步骤，使得HER3和/或HER2和/或EGFR的表达被降低或抑制。
20.触发细胞例如癌细胞凋亡的方法，所述方法包括用权利要求1-12中任一项定义的 寡聚物、或权利要求13中定义的缀合物、或权利要求14中定义的药物组合物与所述细胞或 组织接触的步骤，使得HER3和/或HER2和/或EGFR的表达被抑制或降低，和/或细胞凋 亡被触发。
全文摘要
本发明涉及寡聚化合物(寡聚物)，其靶向细胞中的HER3mRNA，导致HER3和/或HER2和/或EGFR的表达降低。HER3和/或HER2和/或EGFR表达的降低对于许多医学病症是有益的，例如过度增生性疾病，包括癌症。本发明提供了包含寡聚物的治疗组合物以及使用所述寡聚物调节HER3和/或HER2和/或EGFR的表达的方法，包括治疗的方法。
文档编号A61P35/00GK101849007SQ200880024089
公开日2010年9月29日 申请日期2008年5月9日 优先权日2007年5月11日
发明者马杰·赫德贾恩 申请人:桑塔里斯制药公司;安佐制药股份有限公司