调节低密度脂蛋白受体相关蛋白6(lrp6)的分子和方法

专利名称：调节低密度脂蛋白受体相关蛋白6(lrp6)的分子和方法
调节低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)的分子和方法
背景技术：
Wnt基因家族编码一大类涉及Intl/Wntl原癌基因和果蝇属无翅基因(“Wg”) (果蝇属的Wntl相应物)的分泌蛋白质(Cadigan等人(1997)Genes& Development 11 3286-3305)。Wnt表达于多种组织和器官且为许多发育过程所需，这些过程包括果蝇属 中的分节；秀丽隐杆线虫(C.elegans)中的内胚层发育；哺乳动物的肢极性建立、神经 脊分化、肾形态发生、性别决定和脑发育(Parr等人(1994)Curr. Opinion Genetics & Devel. 4 :523_528)。在胚胎发生过程和成熟生物体中，Wnt途径都是动物发育的主要调节 物(Eastman 等人(1999) Curr Opin Cell Biol 11 :233_240 ；Peifer 等人(2000) Science 287 1606-1609)。Wnt信号通过七跨膜结构域受体的Frizzled家族(“Fz”)转导(Bhanot等人 (1996)Nature 382:225-230)。Frizzled细胞表面受体(Fzd)在典型和非典型Wnt信号 传导中都发挥主要作用。在典型途径中，紧随Wnt蛋白质激活Fzd和LRP5/6 (低密度脂 蛋白受体相关蛋白5和6)，产生阻止“ β -联蛋白破坏复合体”对β _联蛋白进行磷酸 化和降解的信号，允许稳定的联蛋白转位并积累在细胞核内，从而使Wnt信号转导。 (Perrimon(1994)Cell 76 781-784) (Miller, J. R. (2001)Genome Biology ；3(1) :1_15)。 对非典型Wnt信号传导途径知之较少已提出了至少两条非典型Wnt信号传导途径，包括平 面细胞极性(PCP)途径、Wnt/Ca++途径和会聚伸展途径。糖原合酶激酶3 (GSK3，在果蝇属中称为shaggy)、肿瘤抑制基因产物APC (腺瘤结 肠息肉)(Gumbiner (1997) Curr. Biol. 7 :R443_436)和支架蛋白Axin都是Wnt途径的负调 节物，并一起形成“β-联蛋白破坏复合体”。在无Wnt配体时，这些蛋白质形成复合体并促 进β-联蛋白的磷酸化和降解，而Wnt信号传导钝化该复合体并阻止β-联蛋白降解。结果 稳定的联蛋白转运至细胞核，在此结合TCF(T细胞因子)转录因子(也称为淋巴样细 胞增强子结合因子-I(LEFl))，并作为TCF/LEF诱导的转录的辅激活物(Bienz等人(2000) Cell 103 :311-320 ;Polakis 等人(2000)Genes Dev 14:1837-1851)。Wnt信号传导通过典型和非典型机制发生。在典型途径中，紧随Wnt蛋白质激活 Fzd和LRP5/6，稳定的联蛋白在细胞核中积累并导致TCF靶基因的激活(如上所述)。 (Miller, J. R. (2001)Genome Biology ；3(1) :1_15)。对非典型Wnt 信号传导途径知之较少: 已提出了至少两种非典型Wnt信号传导途径，包括平面细胞极性(PCP)途径和Wnt/Ca++途 径。通过β -联蛋白的稳定化，异常高的Wnt途径激活在许多结肠直肠癌的肿瘤发生 中起关键作用。据估计，80%的结肠直肠癌(CRC)在肿瘤抑制APC中具有失活突变，其允许 不间断的Wnt信号传导。此外，越来越多证据表明，Wnt途径的激活可涉及黑素瘤、乳腺癌、 肝癌、肺癌和胃癌。在Wnt、正常发育和癌症之间存在公认已久的联系，c-Myc原癌基因被确 认为Wnt信号传导的靶基因，从而更进一步确立了这种联系(He等人(1998)SCienCe281 1509-3512)。此外，与Wnt信号传导的病理性的高或低水平相关的其他病症包括但不限于骨质疏松症、骨关节炎、多囊肾病、糖尿病、精神分裂症、血管病、心脏病、非致癌的增生性疾病和 神经变性疾病如阿尔茨海默病。Wnt信号传导的异常上调与癌症、骨关节炎和多囊肾病相 关，而Wnt信号传导的异常下调与骨质疏松症、肥胖症、糖尿病、纤维化疾病和神经元变性 疾病相关。目前开发Wnt信号传导相关病症(如结肠直肠癌)的疗法的范例是依赖靶向于 β-联蛋白或β-联蛋白下游的Wnt途径组分。然而，最近的研究表明，Wnt受体Frizzled 和LRP5/6介导的自分泌Wnt信号传导可以在调节肿瘤生长和存活中起关键作用。存在对 下述药物和方法的需要，所述药物和方法通过沿着其他关键结合点调节Wnt途径的激活来 抑制或增强Wnt信号转导活性，从而治疗、诊断、预防和/或改善Wnt信号传导相关病症。发明概述本发明涉及LRP6的表位、LRP6结合分子和使用这些分子的方法。LRP6结合分子 与LRP6相互作用，从而能够调节LRP6的功能。LRP6激动或拮抗结合分子可分别用来促进 或抑制Wnt途径信号传导；因此LRP6激动或拮抗结合分子可分别用来例如诊断、改善其症 状、防御和治疗与Wnt途径信号传导的异常低水平或异常高水平相关的Wnt信号传导病症。 与Wnt信号传导的异常上调相关的病症的非限制性实例是癌症(例如乳腺癌、肺癌和结肠 癌)。与Wnt信号传导的异常下调相关的病症的非限制性实例是特征为低骨矿物质密度 (BMD)的骨相关病症(例如骨质疏松症)。在多个方面，本发明提供调节(例如抑制或促进)LRP6的一种或多种生物学功 能的LRP6结合分子。例如，LRP6结合分子可调节β-联蛋白的磷酸化和随后的降解。作 为另一个实例，LRP6结合分子可干扰LRP6结合Wnt途径所有成员的能力，所述成员例如 DKKl (dickkopf 1)、DKK2、DKK4、SOSTl、SOSDl (USAGl)、sFRP(可溶性 Fzd 相关蛋白)1-4、 Wise (USAG1的小鼠版本)或Wnt配体本身。LRP6结合分子包括，例如结合LRP6的抗体(例如在LRP6的特定结构域或表位内， 如结合至LRP6胞外域的第一或第三螺旋桨，或结合至任意螺旋桨内的特异结构域(例如 EGF重复、YffTD样基序或其他))，和包含这类抗体的抗原结合部分的多肽。LRP6结合分子 还包括其中结合部分不是源自抗体的分子，例如源自具有免疫球蛋白样折叠的多肽的LRP6 结合分子，其中抗原结合部分通过随机化、选择和亲和力成熟而改造为结合LRP6。因此，在一方面，本发明涉及包含结合(例如特异地结合)至LRP6的抗体的抗 原结合部分的LRP6结合分子，其中抗原结合部分结合至人LRP6螺旋桨1 (SEQ ID NO 2 ；SEQ ID NO :1的残基20-326)内的表位，该表位在以下之一内或与之重叠(a) SEQ ID NO :1的氨基酸286-324 (即在以下序列内或与之重叠的表位NATNPCGIDN GGCSHLCLMS PVKPFYQCACPTGVKLLENG KTCK(SEQ ID NO 3)) ； (b) SEQ ID NO :1 的氨基酸66-69 (即在以下 序列内或与之重叠的表位YWSD) ； (c)SEQ ID NO 1的氨基酸110-113 (即在以下序列内或 与之重叠的表位YWTD) ； (d) SEQ IDNO 1的氨基酸153-156 (即在以下序列内或与之重叠 的表位YWTD) ； (e) SEQ ID NO=I的氨基酸197-200 (即在以下序列内或与之重叠的表位 YWAD)；和(f)SEQ ID NO 1的氨基酸238-241 (即在以下序列内或与之重叠的表位=YffTD)。在另一方面，本发明涉及包含结合(例如特异地结合)至LRP6的抗体的抗原结合 部分的LRP6结合分子，其中抗原结合部分结合至人LRP6螺旋桨1(SEQ ID NO 2 ；SEQ ID NO 1的残基20-326)内的表位，该表位在以下之一内或与之重叠(a) SEQ ID NO 1的氨基酸 20-65 ； (b) SEQ ID NO 1 的氨基酸 70-109 ； (c) SEQ ID NO :1 的氨基酸 114-152 ； (d) SEQ ID NO 1 的氨基酸 157-196 ；禾口 (e) SEQ ID NO 1 的氨基酸 201-237 ；禾口 (f) SEQ ID NO 1 的 氨基酸242-326。因此，在一方面，本发明涉及包含结合(例如特异地结合)至LRP6的抗体的抗原结 合部分的LRP6结合分子，其中抗原结合部分结合至人LRP6螺旋桨3 (SEQ ID NO 4 ；SEQ ID NO :1的残基631-932)内的表位，该表位在以下之一内或与之重叠(a) SEQ ID N0:1的氨 基酸889-929 (即在以下序列内或与之重叠的表位GW NECASSNGHC SHLCLAVPVGGFVCGCPAHY SLNADNRTC(SEQ ID NO 5)) ； (b) SEQ ID NO :1的氨基酸677-680 (即在以下序列内或与之重 叠的表位YWTD) ； (c)SEQ ID NO :1的氨基酸720-723 (即在以下序列内或与之重叠的表位 YWAD) ； (d) SEQ IDNO :1的氨基酸763-766 (即在以下序列内或与之重叠的表位YWTE) ； (e) SEQ ID NO :1的氨基酸806-809(即在以下序列内或与之重叠的表位YWTD)；和(f) SEQ ID NO 1的氨基酸846-849 (即在以下序列内或与之重叠的表位YWTD)。在另一方面，本发明涉及包含结合(例如特异地结合)至LRP6的抗体的抗原结合 部分的LRP6结合分子，其中抗原结合部分结合至人LRP6螺旋桨3 (SEQ ID NO 4 ；SEQ ID NO :1的残基631-932)内的表位，该表位在以下之一内或与之重叠(a) SEQ ID N0:1的氨 基酸 631-676 ； (b) SEQ IDNO 1 的氨基酸 681-719 ； (c) SEQ ID NO 1 的氨基酸 724-762 ； (d) SEQ IDNO 1 的氨基酸 767-805 ；禾口 (e) SEQ ID NO 1 的氨基酸 810-845 ；禾口 (f) SEQ IDNO 1 的氨基酸850-932。在多个实施方案中，LRP6结合分子(例如抗-LRP6拮抗抗体)以这样的方式结合 至人LRP6内的表位(例如结合至人LRP6螺旋桨1、螺旋桨3、或结合至其组件结构域或基 序)以阻止某些Wnt配体类似地结合。作为非限制性实例，拮抗Wnt信号传导途径的LRP6 结合分子阻止Wntl或Wnt3a配体结合LRP6。例如，Wnt3或Wnt3a特异的信号传导活性可 最有效地被Wnt3a特异的LRP6拮抗结合分子抑制。作为另一个非限制性实例，Wntl、Wnt2、 Wnt6,ffnt7a,ffnt7b和WntlO特异的信号传导活性可最有效地被Wntl特异的LRP拮抗结合 分子抑制。在多个实施方案中，LRP6结合分子(例如抗-LRP6拮抗抗体)能够结合至一个以 上的LRP6螺旋桨(例如同时地结合至螺旋桨1、螺旋桨3、或结合至其组件结构域或基序)。 在一些情况下，所述同时结合的LRP6结合分子能够阻止某些Wnt配体类似地结合LRP6。作 为非限制性实例，所述同时结合的LRP6结合分子能够阻止Wntl或Wnt3a配体结合LRP6。 作为非限制性实例，所述同时结合的LRP6结合分子能够抑制Wnt3和Wnt3a特异的信号传 导活性。作为另一个非限制性实例，所述同时结合的LRP6结合分子能够抑制Wntl、Wnt2、 Wnt6、Wnt7a、Wnt7b和WntlO特异的信号传导活性。在多个实施方案中，结合至人LRP6的螺旋桨1、螺旋桨3、或其组件结构域或基序 内的表位的LRP6结合分子(例如抗-LRP6激动或拮抗抗体)与非人类灵长动物(例如食 蟹猴或猕猴)的LRP6蛋白质(或其部分)交叉反应。在多个实施方案中，LRP6结合分子 与啮齿动物物种的LRP6(例如鼠LRP6、大鼠LRP6)交叉反应。在多个实施方案中，LRP6结 合分子与人LRP5交叉反应。在多个实施方案中，LRP6结合分子(例如抗-LRP6拮抗抗体)能够结合至并调节 (例如抑制)磷酸化的LRP6 (磷酸-LRP6)。
在多个实施方案中，抗原结合部分结合至线性表位。在多个实施方案中，抗原结合部分结合至非线性表位。在一个实例中，抗原结合 部分结合至非线性表位，该表位包含或由以下每种线性表位的至少一个部分组成(a) SEQ ID NO 1 的氨基酸 286-324 ； (b) SEQ ID NO 1 的氨基酸 66-69 ； (c) SEQ ID NO 1 的氨基酸 110-113 ； (d)SEQ ID NO 1 的氨基酸 153-156 ； (e) SEQ ID NO 1 的氨基酸 197-200 ；禾口 (f) SEQ ID NO :1的氨基酸238-241。在另一个实例中，抗原结合部分结合至非线性表位，该 表位包含或由以下两个或三个线性表位的至少一个部分组成(a)SEQ IDNO=I的氨基酸 889-929 ； (b) SEQ ID NO 1 的氨基酸 677-680 ； (c) SEQ IDNO 1 的氨基酸 720-723 ； (d) SEQ ID NO 1 的氨基酸 763-766 ； (e) SEQ IDNO 1 的氨基酸 806-809 ；和(f) SEQ ID NO 1 的氨基 酸846-849。在多个实施方案中，LRP6结合分子的抗原结合部分以等于或小于1ηΜ、0. 5nM、 0. 25nM或0. InM的解离常数(Kd)结合至LRP6。在多个实施方案中，LRP6结合分子的抗原结合部分以等于或小于1ηΜ、0. 5nM、 0. 25nM或0. InM的Kd结合至非人类灵长动物(例如食蟹猴或黑猩猩)的LRP6，。在多个实施方案中，抗原结合部分以等于或小于1ηΜ、0. 5nM、0. 25nM或0. InM的Kd 结合至小鼠LRP6。抗体可以是嵌合(例如人源化)抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗原结合部分是人抗体的抗原结合部分。抗原结合部分可以是单克隆抗体或多克隆抗体的抗原结合部分。LRP6结合分子包括例如抗体的Fab片段、Fab，片段、F(ab，)2或Fv片段。LRP6结 合分子还包括例如完全抗体，例如二价IgG抗体。在一些实施方案中，能够拮抗LRP6的Fab 或其他单价抗体片段可以转化为能够激动LRP6的二价完全抗体，例如二价IgG抗体。在其他实施方案中，将LRP6结合分子与药物缀合或偶联来增加所述结合分子。 在一些情况下，将LRP6结合分子与人血清白蛋白(HSA)结合蛋白质缀合。在一些实施 方案中，将LRP6结合分子聚乙二醇化(例如用美国专利US 5,840, 526, US 5,874, 541, US 6，005，079、和 US 6，765，087 ( “Hamers 专利”)、和包含 PCT 公开物 W097/49805 的专 利族中任意一篇描述的专有技术)。在一些实施方案中，LRP6结合分子是聚乙二醇化的 Fab片段。可用来制备LRP6结合分子的所述缀合物的技术的非限制性实例可见于包含 以下一项或多项的专利族美国专利号US 5，840，526、US 5，874，541、US6, 005，079和US 6，765，087 ( "Hamers 专利”)；PCT 公开物 W097/49805 ；欧洲专利 EP1517921B1 ；美国专利 6，267，974 ；美国公开物 US2003-0175921。
0031 ] 在一个实施方案中，LRP6结合分子是人抗体。在一个实施方案中，LRP6结合分子包含单链Fv。在一个实施方案中，LRP6结合分子包含双价抗体(例如单链双价抗体或具有两条 多肽链的双价抗体)。在一些实施方案中，抗体的抗原结合部分产生自以下同种型之一的抗体IgGl、 IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施方案中，抗体的抗原结合部分产生自IgA或IgE同种型的 抗体。LRP6结合分子(例如结合至LRP6胞外域的第一或第三螺旋桨内的表位、或结合至所述螺旋桨内的特异结构域(例如EGF重复或YWTD样基序)的LRP6结合分子)可以显 示大量生物学活性中的一种或多种。在多个实施方案中，LRP6结合分子抑制LRP6结合至 多个 Wnt 信号传导途径成员(例如 DKKl (dickkopfl)、DKK2、DKK4、SOSTl、SOSDl (USAGl)、 sFRP(可溶性Fzd相关蛋白)1-4、Wise或Wnt配体本身)。例如，相对于对照(例如相对 于无LRP6结合分子时的结合)，LRP结合分子抑制LRP6结合至Wnt信号传导途径成员至少 5%、10%、15%、25%或 50%。在一个实施方案中，LRP6结合分子与Wnt信号传导途径成员(例如 DKK1 (dickkopfl)、DKK2、DKK4、SOST1、SOSD1 (USAG1)、sFRP (可溶性 Fzd 相关蛋白)1 -4、Wise 或Wnt配体本身)竞争结合LRP6，从而调节Wnt途径信号传导的生物学活性和结果。作为 非限制性实例，拮抗LRP6结合分子可通过与Wnt信号传导途径成员竞争结合LRP6来抑制、 减弱或阻止Wnt途径激活和信号传导。作为另一个非限制性实例，Wntl特异的拮抗LRP6结 合分子可阻止通过Wntl、Wnt2、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b和WntlO中任意一种的Wnt途径激活和 信号传导。作为另一个实例，拮抗LRP6结合分子(例如在LRP6的第一螺旋桨内结合的结 合分子)可抑制、减弱或阻止通过Wise或Wnt配体的Wnt途径激活和信号传导。作为另一 个实例，拮抗LRP6结合分子(例如在LRP6的第三螺旋桨内结合的结合分子)可抑制、减弱 或阻止通过例如DKKl和Wnt配体(如Wnt3和Wnt3a)的Wnt途径激活和信号传导。在一些实施方案中，LRP6结合分子能够激活、增强或保全Wnt信号传导途径，或使 细胞对Wnt信号传导敏感。作为非限制性实例，激动LRP6结合分子能够结合至LRP6 (例如 结合至第三螺旋桨)并引起联蛋白破坏复合体的溶解，从而使联蛋白稳定，转运至 细胞核并结合转录因子。在一些实施方案中，激动LRP6结合分子能够通过寡聚化LRP6来激活、增强或保全 Wnt信号传导途径，或使细胞对Wnt信号传导敏感。已知可通过使LRP6寡聚化形成(例如 Fzd-LRP6异寡聚体)的药物来取消对Wnt配体的需要，所述药物包括本发明的LRP6结合分 子。(Cong 等人(2004)Development 131 (20) :5103)。在一些实施方案中，所述 LRP6 结合 分子是如本文所述的二价IgG抗体。在一些实施方案中，LRP6结合分子通过调节LRP6以直接或间接方式正常地调节 下游生物学活性(例如调节β-联蛋白磷酸化和降解)。例如，相对于对照(例如相对于无 拮抗LRP6结合分子时的活性)，拮抗LRP6结合分子允许β -联蛋白磷酸化和降解的程度高 至少 5%、10%、15%、25%或 50%。在一个实施方案中，通过阻止通过Wntl、Wnt2、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b和WntlO中任 意一种的Wnt途径激活和信号传导，Wntl特异的拮抗LRP6结合分子允许β _联蛋白磷酸化 和降解的程度相对于对照高至少5%、10%、15%、25%或50%。在另一个实施方案中，通过 阻止通过Wnt3或Wnt3a的Wnt途径激活和信号传导，Wnt3a特异的拮抗LRP6结合分子允许 β -联蛋白磷酸化和降解的程度相对于对照高至少5%、10%、15%、25%或50%。在另一 个实施方案中，通过阻止Wise结合至LRP6，Wntl特异的拮抗LRP6结合分子允许β -联蛋 白磷酸化和降解的程度相对于对照高至少5 %、10 %、15 %、25 %或50 %。在另一个实施方 案中，通过阻止DKKl、Wnt配体(如Wnt3和Wnt3a)等结合至LRP6，Wnt3a特异的拮抗LRP6 结合分子允许β _联蛋白磷酸化和降解的程度相对于对照高至少5 %、10 %、15 %、25 %或 50%。
相反地，例如，相对于对照(例如相对于无激动LRP6结合分子时的活性)，激动 LRP6结合分子稳定β -联蛋白蛋白质水平的程度高至少5%、10%、15%、25%或50%。本发明还涉及非抗体的LRP6结合分子。非抗体LRP6结合分子包含LRP6结合结 构域，该结构域具有源自非抗体多肽的免疫球蛋白样(Ig样)折叠的氨基酸序列，所述非 抗体多肽例如以下之一腱糖蛋白、N-钙粘蛋白、E-钙粘蛋白、ICAM、纤连蛋白、肌联蛋白、 GCSF受体、细胞因子受体、糖苷酶抑制剂、抗生素色蛋白、髓鞘质膜粘附分子Ρ0、CD8、CD4、 ⑶2、I类MHC、T-细胞抗原受体、⑶1、C2和VCAM-I的I_set结构域、肌球蛋白结合蛋白质 C的I-set免疫球蛋白结构域、肌球蛋白结合蛋白质H的I-set免疫球蛋白结构域、端蛋白 的I-set免疫球蛋白结构域、NCAM、颤搐蛋白、神经胶质蛋白、生长激素受体、促红细胞生成 素受体、催乳素受体、干扰素_ Y受体、β “半乳糖苷酶/葡糖醛酸糖苷酶、β “葡糖醛酸糖 苷酶、转谷氨酰胺酶、T-细胞抗原受体、超氧化物岐化酶、组织因子结构域、细胞色素F、绿 色荧光蛋白、GroEL或竹芋蛋白。一般而言，相对于免疫球蛋白样折叠的氨基酸序列，改变 LRP6结合结构域的氨基酸序列以使LRP6结合结构域特异地结合至LRP6 (即，其中免疫球蛋 白样折叠不能特异地结合至LRP6)。在多个实施方案中，LRP6结合结构域的氨基酸序列与纤连蛋白、细胞因子受体或 钙粘蛋白的免疫球蛋白样折叠的氨基酸序列至少60 %相同(例如至少65 %、75 %、80 %、 85%或90%相同)。在多个实施方案中，LRP6结合结构域的氨基酸序列与以下之一的免疫球蛋白样 折叠的氨基酸序列至少60%、65%、75%、80 %、85%或90%相同腱糖蛋白、N-钙粘蛋白、 E-钙粘蛋白、ICAM、肌联蛋白、GCSF受体、细胞因子受体、糖苷酶抑制剂、抗生素色蛋白、髓 鞘质膜粘附分子PO、CD8、CD4、CD2、I类MHC、T-细胞抗原受体、CDl、C2和VCAM-I的I-set结 构域、肌球蛋白结合蛋白质C的I-set免疫球蛋白结构域、肌球蛋白结合蛋白质H的I-set 免疫球蛋白结构域、端蛋白的I-set免疫球蛋白结构域、NCAM、颤搐蛋白、神经胶质蛋白、生 长激素受体、促红细胞生成素受体、催乳素受体、干扰素_ Y受体、β “半乳糖苷酶/葡糖醛 酸糖苷酶、β -葡糖醛酸糖苷酶、转谷氨酰胺酶、T-细胞抗原受体、超氧化物岐化酶、组织因 子结构域、细胞色素F、绿色荧光蛋白、GroEL或竹芋蛋白。在多个实施方案中，LRP6结合结构域以等于或小于InM(例如0. 5nM、0. InM)的Kd 结合至LRP6。在一些实施方案中，Ig样折叠是纤连蛋白的Ig样折叠，例如III型纤连蛋白的Ig 样折叠(例如纤连蛋白III的组件10的Ig样折叠)。本发明还提供对应于LRP6抗原性表位的肽。在一个方面，本发明涉及由与以下氨 基酸序列之一至少90%相同的氨基酸序列组成的肽LRP6的第一螺旋桨(SEQ ID NO 2)； NATNPCGIDN GGCSHLCLMSPVKPFYQCAC PTGVKLLENG KTCK (SEQ ID NO 3) ；LRP6 的第三螺旋桨 (SEQ ID NO 4)；或 GW NECASSNGHC SHLCLAVPVGGFVCGCPAHY SLNADNRTC(SEQ ID NO :5)。在另一个方面，本发明提供对动物施用该组合物时导致特异地结合至LRP6的 抗体的组合物。该组合物包含例如以下肽之一LRP6的第一螺旋桨(SEQ ID NO 2)； NATNPCGIDN GGCSHLCLMS PVKPFYQCACPTGVKLLENG KTCK(SEQ ID NO 3) ；LRP6 的第三螺旋桨 (SEQ IDNO 4)；或GW NECASSNGHC SHLCLAVPVG GFVCGCPAHYSLNADNRTC(SEQ ID NO 5)；具有 少于5个氨基酸改变的肽；或它们的片段(例如包含5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸的片段)。可以修饰该肽来提高抗原性，例如通过偶联至载体蛋白质。本发明还涉及包含本文所述LRP6结合分子的药物组合物。所述组合物包含例如 LRP6结合分子和可药用的载体。本发明还涉及使用本文所述LRP6结合分子的方法。在一方面，本发明涉及抑制肿瘤细胞生长的方法。该方法包括将肿瘤细胞与拮抗 LRP6结合分子(例如包含特异地结合至LRP6的抗体的抗原结合部分的LRP6结合分子)接 触，从而稳定β -联蛋白破坏复合体，引起β -联蛋白磷酸化和降解，阻止肿瘤细胞内的Wnt 途径信号转导。在另一个方面，本发明涉及在肿瘤细胞中诱导凋亡的方法。该方法包括将肿瘤细 胞或宿主细胞环境与拮抗LRP6结合分子(例如包含特异地结合至LRP6的抗体的抗原结合 部分的LRP6结合分子)接触，从而稳定β-联蛋白破坏复合体，引起β-联蛋白磷酸化和 降解，阻止肿瘤细胞内的Wnt途径信号转导。在另一个方面，本发明涉及侵蚀癌性肿瘤基质支持的方法。该方法包括将肿瘤细 胞与拮抗LRP6结合分子(例如包含特异地结合至LRP6的抗体的抗原结合部分的LRP6结 合分子)接触，从而杀伤肿瘤所依赖的血管(血管发生或其他方式)和/或其他结构组分。在上述情况下，可分别以对抑制肿瘤细胞生长或在肿瘤细胞中诱导凋亡有效的量 施用拮抗LRP6结合分子。相对于施用组合物前的所述比例，个体的癌细胞与健康细胞的比 例可降低至少10% (例如癌细胞与健康细胞的比例降低至少25%、30%、50%、60%、75% 或100%)。在一些实施方案中，个体还接受化疗剂的治疗。在一个方面，本发明的LRP6激动或拮抗结合分子可用来例如诊断、改善其症状、 防御和治疗本文所定义的骨相关病症。在一个方面，本发明涉及提高个体骨矿物质密度的方法。该方法包括以对提高骨 矿物质密度有效的量对个体施用激动LRP6结合分子(例如包含特异地结合至LRP6的抗体 的抗原结合部分的LRP6结合分子)。在一些实施方案中，所述激动LRP6结合分子干扰LRP6 和Sclerostin间的结合事件，并能够激活、增强或保全Wnt信号传导途径，或使细胞对Wnt 信号传导敏感。Sclerostin是由SOST基因编码的蛋白质，是涉及骨相关病症的Wnt信号传 导途径的负调节物(Wnt信号传导对正常生理条件下的骨形成是很重要的)。作为非限制性实例，激动LRP6结合分子能够结合至LRP6 (例如结合至LRP6的第 三螺旋桨)并引起β-联蛋白破坏复合体的溶解，从而使β-联蛋白稳定，转运至细胞核并 结合转录因子，从而以此过程提高骨矿物质密度。作为其他非限制性实例，激动LRP6结合 分子能够结合至LRP6的第三螺旋桨之外的区域。在这些情况下，所述LRP6激动抗体能够 寡聚化LRP6，以激活、增强或保全Wnt信号传导或使细胞对Wnt信号传导敏感。在另一个方面，本发明涉及降低个体骨矿物质密度的方法。该方法包括以对降低 骨矿物质密度有效的量对个体施用拮抗LRP6结合分子(例如包含特异地结合至LRP6的抗 体的抗原结合部分的LRP6结合分子)。在一些实施方案中，所述拮抗LRP6结合分子模拟 Sclerostin的作用，从而能够以类似的方式负调节Wnt途径。在一些实施方案中，拮抗LRP6结合分子是Wntl特异的，并结合至LRP6的第一螺 旋桨。在一些其他实施方案中，拮抗LRP6结合分子是Wntl特异的，结合至LRP6的第一螺 旋桨并阻止配体Wntl、Wnt6和/或Wnt7与LRP6相互作用和启动Wnt途径。
在其他方面，本发明涉及改善或预防代谢综合征和/或冠状动脉病症状的方法。 该方法包括以对改善或预防代谢综合征和/或冠状动脉病症状有效的量对个体施用激动 LRP6结合分子(例如包含特异地结合至LRP6的抗体的抗原结合部分的LRP6结合分子)。 在一些实施方案中，所述激动LRP6分子能够激活、增强或保全Wnt信号传导途径，或使细胞 对Wnt信号传导敏感。作为非限制性实例，所述激动LRP6结合分子能够结合至LRP6 (例如 结合至LRP6的第三螺旋桨)，诱导LRP6的寡聚化，引起β -联蛋白破坏复合体的溶解，从而 使联蛋白稳定，转运至细胞核并结合转录因子，从而以此过程改善或预防代谢综合征 和/或冠状动脉病的症状。在一些实施方案中，在静脉内施用组合物。本发明的一个或多个实施方案的细节在以下所附的图和描述中给出。可从描述和 图以及权利要求书中明白本发明的其他特征、目的和优点。附图简述本专利或申请文件包含至少一幅彩图。收到请求和支付必要的费用后，办公室将 提供本专利或专利申请公开的带有彩图的拷贝。

图1是鉴定优先抑制Wntl诱导的Wnt信号传导的抗-LRP6拮抗Fab的图示。图2是鉴定优先抑制Wnt3A诱导的Wnt信号传导的抗-LRP6拮抗Fab的图示。图3是鉴定抗-LRP6激动Fab的图示。图4显示产生LRP6平截突变体进行LRP6结构域作图的位置。图4B以每幅图对 应于不同突变体显示平截突变体的FACS分析。上一排从左至右涉及LRP6全长、LRP6缺失 I和LRP6缺失II。下一排从左至右涉及LRP6缺失III、LRP缺失I和II、和LRP6缺失I 和III。用抗-Flag抗体染色细胞。图4C显示以每幅图对应于不同突变体显示平截突变体 的 FACS 分析。排列与图 4B 中相同，用 Fab005、Fab021、FabO 10, Fab004、Fab002、Fab026、 Fab025和对照(抗-溶酶体Fab)染色细胞。图5是大量Fab转化为IgG时活性变化的图示。图5A显示由Wntl诱导，图5B显 示由Wnt3A诱导。图6是抗-LRP6结合分子抑制磷酸化的LRP6 (磷酸-LRP6)的能力的图示。图6A 显示PA-I (卵巢畸胎瘤)细胞中的磷酸-LRP6抑制，图6B显示NCI-H929 (多发性骨髓瘤) 细胞中的磷酸-LRP6抑制。发明详述本发明提供了结合至LRP6(低密度脂蛋白受体相关蛋白6)的分子(“LRP6结合 分子”)，尤其是结合至人LRP6并调节其功能的人抗体和其部分。本文还提供LRP6的表位 和结合这些表位的药物。人LRP6(hLRP6)的全长序列见于 Genbank 检索号 GI 148727288、 gb |NP_002327，其在表I中显示为SEQ ID NO :1。编码hLRP6的mRNA序列见于检索号GI 148727287,ΝΜ_002336ο表1 人LRP6氨基酸序列1 MGAVLRSLLA CSFCVLLRAA PLLLYANRRD LRLVDATNGK ENATIVVGGL EDAMVDFVF61 SHGLIYffSDV SEEAIKRTEF NKTESVQNVV VSGLLSPDGL ACDWLGEKLY WTDSETNRIE121 VSNLDGSLRK VLFffQELDQP RAIALDPSSG FMYffTDffGEV PKIERAGMDG SSRFIIINSE
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1501EFGYSSNSPSTHRSYSYRPYSYRHFAPPTTPCSTDVCDSDYAPSRRMTSVATAKGYTSDL
1561NYDSEPVPPPPTPRSQYLSAEENYESCPPSPYTERSYSHHLYPPPPSPCTDSS (SEQ I
(SEQ ID NO 1)
人LRP6蛋白质序列(SEQ ID NO 1)内的结构域定位如下信号肽可见于SEQ ID
N0:1的氨基酸残基1-19 ；四个YWTD(酪氨酸、色氨酸、苏氨酸和天冬氨酸)-型β-螺旋桨 结构域(其每一个形成六瓣式β-螺旋桨结构(Springer (1998) J. Mol. Biol. ；283 837 ； Jeon 等人(2001)Nat. Struct. Biol. 22 1172))可见于 SEQ ID NO :1 的氨基酸 20-326、 SEQ ID NO 1 的氨基酸 327-630、SEQ ID NO 1 的氨基酸 631-932、SEQ ID NO 1 的氨基酸 933-1246。人 HRP6 在 N42、N81、N281、N433、N486、N692、N859、N865、N926 和 N1039 处 N-糖 基化。 小鼠LRP6的氨基酸序列具有GenBank检索号GI 148727327、NP_032540。果蝇属 的Arrow序列见于检索号GI :24653390、NP_524737，非洲爪蟾属(Xenopus)的LRP6序列见 于检索号GI :10280605、AAG15429。人LRP6是通过其与LRP5的同源性而鉴定的，LRP5最初 是通过其与LDLR(低密度脂蛋白受体)的同源性而分离的。ArrOW/LRP5/LRP6是分别具有 1678、1615和1613个氨基酸残基的I型单跨膜蛋白质。LRP5和LRP6在胞外域和胞内域中 分别具有73%和64%的同一性，而Arrow同等地与LRP5和LRP6相关(40%相同)。事实 上，在培养的果蝇细胞中，LRP6在Wg信号传导过程中替换ArroW(SchWeizer等人(2003)BMCCell Biol. 4，4)，组成性活化的Arrow在哺乳动物细胞和非洲爪蟾胚胎中激活Wnt/ β -联 蛋白信号传导(Tamai 等人(2004)Nature 407 :530)。^JL如本文所用，术语“Wnt信号传导相关病症”指与异常Wnt信号传导相关的疾病和 病症，其包括但不限于癌症，例如结肠直肠癌(CRC)、黑素瘤、乳腺癌、肝癌、肺癌和胃癌；其 他非致癌的增生性疾病，如增生性皮肤病(例如牛皮癣、皮炎)；骨质疏松症；骨关节炎；纤 维化病症；精神分裂症；血管病；心脏病；异常的头发生长或生发困难；创伤愈合；再生性 需要(肝、肺、肢)；和神经变性疾病，如阿尔茨海默病。Wnt信号传导的异常上调与癌症、骨 关节炎和多囊肾病相关，而Wnt信号传导的异常下调与骨质疏松症、肥胖症、糖尿病和神经 元变性疾病相关。如本文所用，“Wnt信号传导相关癌症”包括但不限于结肠直肠癌(CRC)、黑素瘤、 乳腺癌、肝癌、肺癌和胃癌。如本文所用，术语“Wnt相关癌症”还包含恶性髓母细胞瘤和其 他原发性CNS恶性神经外胚层瘤、横纹肌肉瘤、肺癌、肠源肿瘤(包括但不限于食道、胃、胰 腺和胆管系统的癌症)；前列腺癌和膀胱癌；结肠癌；白血病和其他血液癌症(例如慢性淋 巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性骨髓 性白血病(CML)和骨髓增生异常综合征(MDS))；和淋巴瘤(例如霍奇金淋巴瘤和非霍奇金 淋巴瘤)。如本文所用，“调节”指直接或间接地控制或影响的能力，作为非限制性实例，可以 选择地表示抑制或刺激、激动或拮抗、妨碍或促进以及加强或减弱。如本文所用，“拮抗”指抑制或阻止例如信号传导途径(如Wnt)的能力。作为实 例，通过例如干扰LRP6结合Wnt途径成员(例如DKKl (dickkopfl)、DKK2、DKK4、SOSTU SOSDl (USAGl)、sFRP(可溶性Fzd相关蛋白)l-4、Wise或Wnt配体)的能力，本发明的拮抗 LRP6结合分子可以阻止经由Wnt信号传导途径的信号转导，从而促进β -联蛋白的磷酸化 和降解。如本文所用，“激动”指引起、促进、增强或帮助例如信号传导途径(如Wnt)的能 力。作为实例，通过例如促进LRP6结合Wnt途径成员(例如DKKl (dickkopfl)、DKK2、DKK4、 SOSTl、SOSDl (USAGl)、sFRP(可溶性Fzd相关蛋白)l_4、Wise或Wnt配体)的能力，本发明 的激动LRP6结合分子可以促进或增强经由Wnt信号传导途径的信号转导，从而阻止β _联 蛋白的磷酸化和降解(从而允许β-联蛋白到达细胞核并结合转录因子)。如本文所用，“骨相关病症”包含其中骨矿物质密度(BMD)相对于健康个体异常和 /或病理性地偏高的病症，和其中骨矿物质密度(BMD)相对于健康个体异常和/或病理性地 偏低的病症。表征为高BMD的病症包括但不限于硬化性狭窄病、Van Buchem病、骨质增生 病症和过度生长综合征(SGBS)。表征为低BMD和/或骨脆性的病症包括但不限于原发性和 继发性骨质疏松症、骨质减少、骨软化症、骨质疏松症_假神经胶质瘤综合征(OPPG)、成骨 不全(01)、无血管性坏死(骨坏死)、骨折和植入物愈合(牙植入物和髋植入物)和由其他 病症引起的骨丢失(例如与HIV感染、癌症或关节炎相关的)。其他“骨相关病症”包括但 不限于类风湿性关节炎、骨关节炎、骨折、关节炎和溶骨性病变的形成和/或存在。如本文所用，“纤维化病症”指人类中的任何纤维化病症，其特征为过度的成纤维 细胞或肌成纤维细胞增殖和结缔组织基质(包括胶原、纤连蛋白和糖胺聚糖(GAG))的产生。所述病症包括但不限于皮肤瘢痕形成；进行性系统性硬化病(PSS)；肝硬化；特发性和 药理性诱发的肺纤维化；慢性移植物抗宿主病；硬皮病(局部的和系统性的)；佩罗尼病； 做膀胱镜后的尿道狭窄；手术后的内部粘连；特发性和药理性诱发的腹膜后纤维化；和骨 髓纤维化。如本文所用，“纤维化病症”还包括但不限于肺纤维化病症(例如辐射诱发的纤维 化以及与哮喘、COPD和结节病相关的纤维化)；肝纤维化病症(例如酒精性、丙肝相关性和 原发性胆汁性纤维化，以及非酒精性脂肪变性、硬化性胆管炎和源自血吸虫病的纤维化)； 肾纤维化病症(例如糖尿病肾病、狼疮性肾小球硬化症、奥尔波特综合征和慢性肾移植排 斥)；心血管纤维化病症(例如心肌梗塞后瘢痕形成、心脏肥大、动脉再狭窄和动脉粥样硬 化)；皮肤纤维化病症(例如肥厚性瘢痕形成、灼伤瘢痕形成和肾源性纤维化皮肤病)；眼 纤维化病症(例如玻璃体视网膜病变和眼球后纤维化)。本发明的LRP6结合分子的“治疗有效剂量”可导致疾病症状的严重度的降低(例 如与异常高的Wnt信号传导相关的病症症状的降低(例如肿瘤细胞数目、生长速率或恶性 程度的降低)，或与异常低的Wnt信号传导相关的病症症状的降低(例如LDL和甘油三酯水 平的增加))、无疾病症状时期的频率和持续时间的增加、或预防由于遭受疾病而使功能缺 损或失能。术语“个体”旨在包括患有或遭受与异常的Wnt信号传导相关的疾病、病症或病状 的生物体，例如真核生物。个体的实例包括哺乳动物，例如人、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、 小鼠、兔、大鼠和转基因非人动物。在某些实施方案中，个体是人，例如患有、具有罹患风险 的或可能能够患上癌症(例如结肠癌)和其他增生性疾病、骨质疏松和精神分裂症、和本文 所述的其他疾病或病状(例如Wnt信号传导相关病症)的人。如本文所用，术语“抗体”指完整抗体或其抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或 单链(即轻链或重链)。完整抗体是包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L) 链的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本文缩写为Vh)和重链恒定区组成。重链恒定区由 CHU CH2和CH3三个结构域组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为和轻链恒定区 组成。轻链恒定区由Q—个结构域组成。V1^nt区可进一步再分为高变区(称为互补决 定区(CDR))，其与更保守的区域(称为框架区(FR))互相间隔。每条V1^Pt由三个CDR 和四个FR组成，它们从氨基端至羧基端按以下顺序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、 FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免 疫球蛋白结合至宿主组织或因子，包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞)和经典补体 系统的第一成分(Clq)。如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”指完整抗体的一个或多个片段，其保持 了特异结合至给定抗原(例如hLRP6)的能力。抗体的抗原结合功能可以通过完整抗体的 片段执行。包含于术语抗体的“抗原结合部分”的结合片段的实例包含Fab片段，其是由八、 Vh, (^和CHl结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，其是包含通过铰链区二硫键连接的两个 Fab片段(一般一个来自重链，一个来自轻链)的二价片段；由V1^P CHl结构域组成的Fd 片段；由抗体单臂的\和Vh结构域组成的Fv片段；单结构域抗体(dAb)片段(Ward等人 1989 Nature 341 :544_546)，其由Vh结构域组成；和分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域\和Vh由独立的基因编码，但可用重组方法，通过人工肽连接体将它们连接，使它们能被制备为单蛋白链，其中\和Vh区配对形成单价分 子(称为单链 Fv(scFv)；参见如 Bird 等人 1988 Science 242 :423_426 ；和 Huston 等人 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85 =5879-5883)。这类单链抗体包含抗体的一个或多个“抗原结 合部分”。这些片段用本领域技术人员已知的常规技术获得，并以与完整抗体相同的方式， 筛选这些片段的效用。还可将抗原结合部分掺入单结构域抗体、大抗体(maxibodies)、微抗体 (minibodies)、细胞内抗体、二价抗体、三价抗体、四价抗体、v_NAR和双-scFv中(参见如 Hollinger 和 Hudson，2005，Nature Biotechnology，23，9，1126-1136)。抗体的抗原结合部 分可以移植到基于多肽(如III型纤连蛋白(Fn3))的框架中(参见美国专利号6，703，199， 其描述了纤连蛋白多肽单价抗体)。抗原结合部分可以掺入包含一对串联Fv片段(Vh-CHI-Vh-CHI)的单链分子中， 其与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等人1995 Protein Eng. 8 (10) 1057-1062 ；和美国专利号 5，641，870)。如本文所用，术语“骆驼抗体”指完整抗体蛋白质的一个或多个片段，所述 完整抗体蛋白质获得自骆驼和单峰骆驼(双峰驼(Camelus bactrianus)和Calelus dromaderius)科的成员，包括新大陆的成员例如美洲驼羊(Llama)种(美洲驼(Lama paccos)、大羊驼(Lama glama)和小羊驼(Lama vicugna))。可以通过基因工程获得被鉴 定为Vhh的小的、单可变结构域的骆驼抗体区域，以产生对靶标具有高度亲和力的小蛋白 质，得到低分子量的来自抗体的被称为“骆驼纳米抗体(mmobody)”的蛋白质。见美国专 利号 5，759，808 ；还见 Stijlemans 等人 2004 J. Biol. Chem. 279 :1256_1261 ；Dumoulin 等 人2003 Nature 424 :783_788 ；Pleschberger等人2003 Bioconjugate Chem. 14 440-448 ； Cortez-Retamozo 等人 2002 Int. J. Cancer 89 :456_62 ；禾口 Lauwereys.等人 1998 EMBO J. 17 :3512-3520。如本文所用，“分离的LRP6结合分子”指基本不含对LRP6以外的抗原具有抗原特 异性的分子的结合分子(例如分离的特异结合hLRP6的抗体基本不合特异结合hLRP6以外 抗原的抗体)。然而，分离的特异结合hLRP6的结合分子可以对其他抗原具有交叉反应性， 例如来自其他物种的LRP6分子。若基本不含细胞物质，则结合分子是“纯化的”。如本文所用，术语“单克隆抗体组合物”指单分子组合物的抗体分子的制剂。单克 隆抗体组合物针对具体表位显示单一结合特异性和亲和力。如本文所用，术语“人抗体”旨在包含具有其中框架区和CDR区均源自人源序列的 可变区的抗体。此外，若抗体包含恒定区，则恒定区也源自该人序列，例如人种系序列、或人 种系序列的突变版本。本发明的人抗体可以包含不是由人序列编码的氨基酸残基(例如通 过在体外随机或位点专一诱变或通过在体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用， 术语“人抗体”并不旨在包含其中源自其他哺乳动物物种的种系(如小鼠)的CDR序列已 被移植至人框架序列中的抗体。术语“人单克隆抗体”指显示单一结合特异性的抗体，其具有其中框架区和CDR区 均源自人序列的可变区。在一个实施方案中，通过杂交瘤产生人单克隆抗体，该杂交瘤包含 与永生化细胞融合的获自转基因非人类动物(例如转基因小鼠，其具有包含人重链转基因 和轻链转基因的基因组)的B细胞。
如本文所用，术语“重组人抗体”包含通过重组方法制备、表达、产生或分离的任何 人抗体，例如分离自人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或从其制 备的杂交瘤的抗体；分离自经转化表达人抗体的宿主细胞的抗体，例如分离自转染瘤；分 离自重组的组合人抗体文库的抗体；通过包括剪接人免疫球蛋白基因的全部或部分序列至 另一 DNA序列的任何其他方法而制备、表达、产生或分离的抗体。这类重组人抗体具有可 变区，其中框架区和CDR区源自人种系的免疫球蛋白序列。然而，在某些实施方案中，这类 重组人抗体可进行体外诱变(或者，当使用人Ig序列的转基因动物时，进行体内体细胞诱 变)，从而使重组抗体Vh和\区的氨基酸序列是这样的序列，虽然其源自和涉及人种系的 Vh和\序列，但可以不是天然存在于人中的人抗体种系的所有成分中。如本文所用，“同种型”指重链恒定区基因编码的抗体种类(例如IgM、IgE、IgG(如 IgGl 或 IgG4))。短语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异的抗体”在本文中与术语“特异结合至抗 原的抗体”可互换使用。如本文所用，“特异结合至LRP6”的LRP6结合分子(例如抗体或其抗原结合部分) 是指以1 X IO-7M或更小的Kd结合至LRP6的LRP6结合分子。“与抗原交叉反应”的LRP6结 合分子(例如抗体)是指以1 X IiT6M或更小的Kd结合该抗原的LRP6结合分子。与给定抗 原“不发生交叉反应”的LRP6结合分子(例如抗体)是指这样的LRP6结合分子，其不能以 可检测的水平结合至给定抗原，或者以IX IiT5M或更大的Kd结合给定抗原。在某些实施方 案中，在标准结合测定中，这类不与抗原交叉反应的结合分子针对这些蛋白质具有基本不 可检测的结合。如本文所用，当提到IgG抗体时，术语“高亲和力”指抗体对靶抗原具有ICT9M或更 小的KD。若核苷酸序列被改变为使用生产细胞或生物中优选的密码子来编码氨基酸序列， 则所述核苷酸序列称作“优化的”，所述生产细胞或生物一般是真核细胞，例如酵母细胞如 毕赤酵母(Pichia)、昆虫细胞、哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人细胞。优化的 核苷酸序列被改造为编码与最初的原始核苷酸序列(也称作“亲本”序列)所编码的氨基 酸序列相同或几乎相同的氨基酸序列。在以下部分中更详细地描述本发明的多个方面。本领域已知用来评价分子结合至多个物种的LRP6和LRP6特定表位的能力的标准 测定，包括例如ELSA和蛋白质印记。可使用肽表位竞争测定来测定LRP6结合分子是否结 合至LRP6的特异表位。例如，在肽的饱和浓度下，将LRP6结合分子与对应于LRP6目的表 位的肽孵育。例如通过Biaeore 分析，对预孵育的LRP6结合分子与固定化的LRP6的结合 进行测试。与肽的预孵育对LRP6结合的抑制表明LRP6结合分子结合至该肽表位(参见如 美国专利公开物20070072797)。还可通过本领域已知的标准测定来评价结结合动力学，例 如通过Biaeore 分析或通过FACS分析表观结合。下文更详细地描述了评估LRP6结合分 子对LRP6功能特性的影响的测定法。因此，如根据本领域已知的和本文所述的方法测定，“抑制” 一种或多种这些LRP6 功能特性(例如生化、细胞、生理或其他生物学活性等)的LRP6结合分子应理解为，相对于 无结合分子时所观察到的(例如在具有不相关的特异性的对照分子存在时)，在具体的功能特性中产生统计学上显著的降低。抑制LRP6活性的LRP6结合分子造成所测量参数降低 至少5%这样的统计学显著的降低。在某些实施方案中，与对照相比，拮抗抗体或其他LRP6 结合分子可以在所选择的功能特性中产生至少10%、20%、30%或50%的降低。在一些实施方案中，通过测量Wnt信号传导途径中的蛋白质或蛋白质稳定性水平 (例如 Wnt、Wi se、DKK1、DKK2、DKK4、SOST1、SOSD1 (USAG1)、sFRP (可溶性 Fzd 相关蛋白)1 -4、 Axin或联蛋白)来测定LRP6抑制。在其他实施方案中，生物学、生理学和/或形态学 变化表明LRP6结合分子抑制LRP6，例如抑制肿瘤细胞的生长或在肿瘤细胞中诱导凋亡；或 降低骨矿物质密度。相反，激动或促进LRP6活性的LRP6结合分子造成所测量参数增加至少5%这样的 统计学显著的增加。在某些实施方案中，与对照相比，激动抗体或其他LRP6结合分子可以 在所选择的功能特性中产生至少10%、20%、30%或50%的增加。在一些实施方案中，通过测量Wnt信号传导途径下游mRNA信使或蛋白质的表达或 稳定性水平(例如Axin, Axin2、β -联蛋白、VEGF、cMyc、细胞周期蛋白DU SNAIL)来测定 LRP6抑制。在其他实施方案中，生物学、生理学和/或形态学变化表明LRP6结合分子抑制 Wnt信号传导，例如低于正常的骨矿物质密度或胰岛素分泌。本文所述抗-LRP6抗体包含人单克隆抗体。在一些实施方案中，将结合至LRP6的 抗体的抗原结合部分(例如Vh和\链)被“混合和搭配”，产生其他抗-LRP6的结合分子。 可以使用前述结合测定法(例如FACS、ELISA)测试这类“混合和搭配”的抗体的结合。当 选择Vh与特定\序列混合和搭配时，通常选择在结构上与其在与\配对中所代替的Vh相 似的VH。类似地，一般用结构上类似的全长重链序列代替来自具体全长重链/全长轻链配 对的全长重链序列。类似地，应当用结构上类似的\序列代替来自具体配对的\序 列。类似地，应当用结构上类似的全长轻链序列代替来自具体全长重链/全长轻链配对的 全长轻链序列。在本文中，鉴定结构相似性是本领域公知的方法。在其他方面，本发明提供包含一个或多个LRP6结合抗体的重链和轻链⑶R1、⑶R2 和⑶R3(以各种组合)的抗体。考虑到这些抗体中的每一个都能够结合至LRP6，且抗原 结合特异性主要由⑶Rl、2和3区域提供，所以可以将Vh⑶Rl、2和3序列与Vl⑶Rl、2和 3 “混合和搭配”(即来自不同抗体的CDR可以混合和搭配)。可以使用本文所述的结合测 定法(例如ELISA)来测试这类“混合和搭配”的抗体的LRP6结合。当混合和搭配Vh⑶R 序列时，应当用结构上类似的CDR序列代替来自具体Vh序列的CDRl、CDR2和/或CDR3序 列。类似地，当混合和搭配\⑶R序列时，应当用结构上类似的⑶R序列代替来自具体八 序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列。在本文中，鉴定结构相似性是本领域公知的方法。如本文所用，人抗体包含重链或轻链可变区或全长重链或轻链，若抗体的可变区 或全长链获得自用人种系的免疫球蛋白基因作为序列来源的体系，则所述重链或轻链可变 区或全长重链或轻链是具体种系序列的“产物”或者“源自，，或“产生自，，具体的种系序列。 在一个这样的体系中，人抗体产生于带有人免疫球蛋白基因的转基因小鼠中。用目的抗原 (例如本文所述的hLRP6表位)免疫转基因小鼠。或者，提供展示于噬菌体上的人免疫球 蛋白基因文库并用目的抗原(例如本文所述的hLRP6或hLRP6表位)筛选文库来鉴定人抗 体。
作为人种系免疫球蛋白序列的“产物”或者“源自，，或“产生自，，人种系免疫球蛋白 序列的人抗体可以如下鉴定将人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列比 较，并选择在序列上与人抗体序列最接近(即最大的同一性百分数)的人种系免疫球蛋白 序列。作为具体人种系免疫球蛋白序列的“产物”或者“源自，，或“产生自，，具体人种系免疫 球蛋白序列的人抗体可以包含与该种系编码的序列相比不同的氨基酸，这归因于例如天然 存在的体细胞突变或人工位点定向突变。然而，选择的人抗体通常具有与人种系免疫球蛋 白基因编码的氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列，并包含与其他物种的种系免疫球蛋 白氨基酸序列(例如鼠种系序列)比较时人抗体被鉴定为属于人的氨基酸残基。在某些情 况下，人抗体在氨基酸序列上可与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少60%、70%、 80%、90%，或至少95%，或甚至至少96%、97%、98%或99%相同。为了两条序列的最佳比对，要考虑需要引入的缺口数和每个缺口的长度，两条 序列之间的同一性百分数是序列共享的相同位置数目的函数(即，同一性％=相同位置 数/总位置数χ 100)。使用PAM120权重残数表、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分，用 E.Meyers 和 W. Miller (1988 Comput. Appl. Biosci.，4 11-17)的算法来确定序列的比较和 两条序列间同一性百分数的测定，所述算法已被引入ALIGN程序(2. 0版)。通常，产生自具体人种系序列的人抗体的￥11或\将显示与人种系免疫球蛋白基因 编码的氨基酸序列不超过10个氨基酸的差异。在某些情况下，人抗体的Vh或\可显示与 种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不超过5个，或甚至不超过4、3、2或1个氨基酸的 差异。骆驼抗体已经针对大小、结构复杂性和对人类个体的抗原性，表征了从骆驼和单峰骆驼 (双峰驼和Calelus dromaderius)科的成员获得的抗体蛋白质，所述成员包括新大陆的成 员，例如美洲驼羊物种(美洲驼、大羊驼和小羊驼)。在该科哺乳动物中天然存在的某些IgG 抗体缺乏轻链，因此在结构上与其他动物抗体的两条重链和两条轻链的典型四链的四级结 构不同。参见WO 94/04678。可以通过遗传工程获得被鉴定为Vhh的小的、单可变结构域的骆驼抗体区，以 产生对靶标具有高亲和力的小蛋白质，得到低分子量的、产生自抗体的、称作“骆驼纳 米抗体”的蛋白质。见美国专利号5，759，808 ；还见Stijlemans等人2004 J.Biol. Chem. 279 1256-1261 ；Dumoulin 等人 2003Nature 424 783~788 ；Pleschberger 等人 2003 Bioconjugate Chem. 14 440-448 ；Cortez-Retamozo 等人 2002 Int. J. Cancer 89 :456_62 ； 和Lauwereys等人1998 EMBO J. 17 :3512_3520。经改造的骆驼抗体和抗体片段文库可从 商业上获自例如Ablynx，Ghent，比利时。与非人来源的其他抗体一样，可以通过重组方法 改变骆驼抗体的氨基酸序列，获得更类似于人序列的序列，即可以将纳米抗体“人源化”。因 此，可以进一步降低骆驼抗体对人的天然低抗原性。骆驼纳米抗体具有约为人IgG分子十分之一的分子量，且蛋白质仅具有几纳米的 物理直径。小尺寸的一个结果是骆驼纳米抗体能结合对更大的抗体蛋白质在功能上不可见 的抗原位点的能力，即骆驼纳米抗体适合用作检测使用经典免疫学技术时以其他方式隐藏 的抗原的试剂，且适合用作可能的治疗剂。因此，小尺寸的另一个结果是骆驼纳米抗体由于 结合至靶蛋白的沟或窄裂口中的特异位点而能够抑制，并因此可发挥与经典抗体相比更类似于经典低分子量药物功能的能力。低分子量和致密尺寸进一步导致骆驼纳米抗体的极端耐热、对极端pH和蛋白水 解消化稳定且免疫原性弱。另一结果是骆驼纳米抗体易于从循环系统移动进入组织甚至穿 过血脑屏障，并且能够治疗影响神经组织的病症。纳米抗体可进一步促进药物转运穿过血 脑屏障。见2004年8月19日公开的美国专利公开号20040161738。这些特征与在人中的 低抗原性结合，表明巨大的治疗潜能。另外，这些分子可在原核细胞例如大肠杆菌中充分表 达。因此，本发明的一种特征是对LRP6具有高亲和力的骆驼抗体或骆驼纳米抗体。在 本文的某些实施方案中，骆驼抗体或纳米抗体天然产生于骆驼科动物中，即，使用本文针对 其他抗体所述的技术，在用LRP6或其肽片段免疫后由骆驼产生。或者，改造抗-LRP6骆驼 纳米抗体，即以本文所述的LRP6或LRP6表位为靶标而使用淘选方法，从展示恰当突变的骆 驼纳米抗体蛋白质的噬菌体文库中选择产生。可以通过遗传工程进一步定制改造的纳米抗 体，将在受体个体中的半衰期从45分钟增加至两周。双价抗体双价抗体是二价的、双特异性的分子，其中V1^Pt结构域在单条多肽链上表达，通 过连接体连接，该连接体很短因而不允许同一条链上的两个结构域间配对。Vh和\结构域 与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点(参见例如Holliger等人1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 ；Pol jak等人 1994 Structure 2 :1121_1123)。可 以通过在同一细胞中表达具有结构VHA-\B和Vhb-Vla 构型)或Vu-Vhb和νω-νΗΑ(\-νΗ 构型)的两条多肽链而产生双价抗体。其中大部分可以以可溶形式在细菌中表达。通过用约15个氨基酸残基的连接体将形成双价抗体的两条多肽链连接，产生 单链双价抗体(scDb)(见 Holliger 禾口 Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4) 128-30 ;Wu 等人 1996 Immunotechnology, 2 (1) :21_36)。可以以可溶的活性单 体形式在细菌中表达 scDb(见 Holliger 和 Winter, 1997Cancer Immunol. Immunother.， 45(34) 128-30 ；Wu 等人 1996 Immunotechnology, 2(1) 21-36 ；Pluckthun 禾Π Pack, 1997Immunotechnology, 3 (2) 83-105 ；Ridgway ^A 1996 Protein Eng. ,9(7) :617_21)。双价抗体可以与Fc融合，产生“双-双价抗体”(见Lu等人2004 J. Biol. Chem.， 279(4) :2856-65)。经改造和经修饰的抗体可以使用具有一个或多个Vh和/或\序列的抗体作为起始材料来改造经修饰的 抗体，从而制备本发明的抗体，所述经修饰的抗体可具有相对于起始抗体改变的特性。可以 通过修饰一个或两个可变区(即V1^n/或内，例如一个或多个CDR区内和/或一个或 多个框架区内的一个或多个残基，来改造抗体。此外或备选地，可以通过修饰恒定区内的残 基来改造抗体，例如改变抗体的效应物功能。可以进行的一种可变区改造是⑶R移植。抗体主要通过位于六个重链和轻链⑶R 中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。为此，CDR中的氨基酸序列比CDR外的序列在各抗体 之间的差异更大。因为CDR序列负责大部分抗体-抗原相互作用，所以可能通过构建表 达载体来表达模拟特定天然存在的抗体的特性的重组抗体，所述表达载体包含来自特定 天然存在的抗体的CDR序列，所述CDR序列被移植到来自具有不同特性的不同抗体的框架序歹丨J (参见例如 Riechmann 等人 1998 Nature 332 :323_327 Jones 等人 1986 Nature 321 -.522-525 ； Queen 等人 1989 Proc. Natl. Acad,见美国 86 10029-10033 ；美国专利号 5，225，539 和美国专利号 5，530，101,5, 585，089,5, 693，762 和 6，180，370)。框架序列可获得自包含种系抗体基因序列的公共DNA数据库或出版的参考文献。 例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可见于“Vbase”人种系序列数据库(可在 因特网上 www. mrc-cpe. cam. ac. uk/vbase 处获得)中，以及 Kabat 等人 1991 Sequences of Proteins of Immunologicallnterest，第 5 版，美国卫生和人类服务部，NIH Publication No. 91-3242 ；Tomlinson 等人 1992 J. Mol. Biol. 227 :776_798 ；和 Cox 等人 1994 Eur. J. Immunol. 24 :827_836 ；其中每篇参考文献的内容在此明确引用作为参考。可以将Vh⑶Rl、2和3序列和\⑶Rl、2和3序列移植至框架区，所述框架区具 有与在框架序列所源自的种系免疫球蛋白基因中的框架区相同的序列，或者可以将CDR 序列移植至与种系序列相比包含一个或多个突变的框架区。例如，已发现在某些情况下 框架区内的残基突变对维持或增强抗体的抗原结合能力是有益的(参见例如美国专利号 5，530，101,5, 585，089,5, 693，762 和 6，180，370)。也可以将CDR移植入免疫球蛋白结构域以外的多肽框架区中。适当的支架形成构 象稳定的框架，所述框架展示移植的残基，以使它们形成定位的表面并结合目的靶标(例 如LRP6)。例如，可以将⑶R移植至支架上，其中框架区基于纤连蛋白、锚蛋白、脂质运载蛋 白、新制癌菌素、细胞色素b、CPl锌指、PST1、卷曲螺旋、LACI-D1、Z结构域或淀粉酶抑肽(参 见例如 Nygren 禾口 Uhlen，1997 Current Opinion in Structural Biology，7，463—469)。另一种类型的可变区修饰是使Vh和/或Vl⑶R1、⑶R2和/或⑶R3区中的氨基 酸残基突变，从而改进目的抗体的一个或多个结合特性(例如亲和力)，这称作“亲和力成 熟”。可进行位点定向诱变或PCR介导的诱变以引入突变，并且可如本文所述在体外或体内 测定中评估对抗体结合或其他目的功能特性的影响。可以引入保守修饰。突变可以是氨基 酸取代、添加或缺失。此外，通常改变CDR区中不超过一个、两个、三个、四个或五个的残基。本发明的经改造的抗体包含对其中Vh和/或\内的框架残基进行了修饰例如以 改进抗体特性的抗体。通常进行这类框架修饰来降低抗体的免疫原性。例如，一种途径是 将一个或多个框架残基“回复突变”为相应的种系序列。更具体而言，经历过体细胞突变的 抗体可包含与产生抗体的种系序列不同的框架残基。可以通过比较抗体框架序列与产生抗 体的种系序列来鉴定这类残基。为了将框架区序列回复为其种系构型，可以通过例如位点 定向诱变或PCR介导的诱变，将体细胞突变“回复突变”为种系序列。这类“回复突变的”抗 体也涵盖在本发明中。框架修饰的另一种类型涉及框架区内或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个 残基的突变，以去除T细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。该途径也称作“去免疫 化”，并且在Carr等人的美国专利公开号20030153043中进一步详细描述。除了在框架或CDR区内进行的修饰以外或备选地，可以将本发明的抗体改造为在 Fc区内包含修饰，通常来改变抗体的一种或多种功能特性，例如血清半衰期、补体结合、Fc 受体结合和/或抗原依赖性的细胞毒性。此外，本发明的抗体可以进行化学修饰(例如可 将一个或多个化学部分连接至抗体)，或修饰改变其糖基化，进而改变抗体的一种或多种功 能特性。
在一个实施方案中，修饰CHl的铰链区以改变铰链区中半胱氨酸残基的数量，例 如增加或减少。此方法进一步描述于Bodmer等人的美国专利号5，677，425中。改变CHl铰 链区中的半胱氨酸残基数，从而例如帮助轻链和重链的组装，或提高或降低抗体的稳定性。在另一个实施方案中，突变抗体的Fc铰链区以降低抗体的生物半衰期。更明确 地，将一个或多个氨基酸突变引入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区中，使抗体相对于 天然Fc-铰链结构域的葡萄球菌蛋白质A(SpA)结合而言具有受损的SpA结合。此方法在 Ward等人的美国专利号6，165，745中进一步详细描述。在另一个实施方案中，修饰抗体以提高其生物半衰期。多种途径是可能的。例 如，美国专利号6，277，375描述了提高其体内半衰期的IgG中的以下突变T252L、T254S、 T256F。备选地，为了提高生物半衰期，可以在CHl或CL区内将抗体改变为包含补救受体结 合表位，所述补救受体结合表位取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环，如Presta等人的 美国专利号5，869，046和6，121，022中所述。还在其他实施方案中，通过用不同的氨基酸残基代替至少一个氨基酸残基来改变 Fc区，以改变抗体的效应物功能。例如，可以用不同的氨基酸残基代替一个或多个氨基酸， 使抗体针对效应物配体具有改变的亲和力，但保留亲本抗体的抗原结合能力。与之亲和力 改变的效应物配体可以是例如Fc受体或补体的Cl成分。此途径在Winter等人的美国专 利号5，624，821和5，648，260中进一步详细描述。在另一个实施方案中，可以用不同的氨基酸残基代替一个或多个选自氨基酸残基 的氨基酸，使抗体具有改变的Clq结合和/或降低或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。此 途径在Idusogie等人的美国专利号6，194，551中进一步详细描述。在另一个实施方案中，改变一个或多个氨基酸残基，从而改变抗体结合补体的能 力。此途径在Bodmer等人的WO 94/29351中进一步描述。还在另一个实施方案中，通过修饰一个或多个氨基酸来修饰Fc区，以提高抗体 介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力，和/或提高抗体对Fc γ受体的亲和力。此途 径在Presta的WO 00/42072中进一步描述。此外，已对人IgGl上针对Fc γ RI、Fc γ RII、 Fc γ RIII和FcRn的结合位点进行了作图，并描述了具有改进的结合的变体(见Shields， R.L.等人 2001 J. Biol. Chem. 276 :6591_6604)。还在另一个实施方案中，改变了抗体的糖基化。例如，可以制备无糖基化的抗体 (即抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化来例如提高抗体对抗原的亲和力。可以通过例如改 变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现这类糖类修饰。例如，可以进行导致一个或 多个可变区框架糖基化位点消除的一个或多个氨基酸取代，从而消除该位点上的糖基化。 这种无糖基化可提高抗体对抗原的亲和力。该途径在Co等人的美国专利号5，714，350和 6，350，861中进一步详细描述。此外或备选地，可以产生具有改变的糖基化类型的抗体，例如具有减少的岩藻糖 残基含量的低岩藻糖基化抗体，或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。这类改变的糖基 化模式已显示提高抗体的ADCC能力。可以通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞 中表达抗体来实现这类糖修饰。具有改变的糖基化机制的细胞是本领域中已描述过的，并 且可以用作在其中表达本发明重组抗体的宿主细胞，从而产生具有改变的糖基化的抗体。 例如，Hang等人的EP 1，176，195描述了下述细胞系，该细胞系具有功能性断裂的编码岩藻糖基转移酶的FUT8基因，使得在该细胞系中表达的抗体显示低岩藻糖基化。Presta的 PCT公开号WO 03/035835描述了变体CHO细胞系Lecl3细胞，其具有降低的将岩藻糖连接 至连接Asn (297)的糖类的能力，也导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(还 β Shields, R. L.等人 2002 J. Biol. Chem. 277 :26733_26740)。Umana 等人的 WO 99/54342 描述了改造为表达糖蛋白修饰的糖基转移酶(例如β (1，4)-Ν乙酰葡糖胺基转移酶 III(GnTIII))的细胞系，使得在经改造的细胞系中表达的抗体显示增加的二等分GlcNac 结构，其导致抗体的提高的ADCC活性(也见Umana等人1999 Nat. Biotech. 17 176-180)。本发明关注的本文中抗体的另一种修饰是聚乙二醇化。可以使抗体聚乙二醇化， 以例如提高抗体的生物(例如血清)半衰期。为了将抗体聚乙二醇化，通常将抗体或其片 段与聚乙二醇(PEG)，例如PEG的反应性酯或醛衍生物，在一个或多个PEG部分成为与抗体 或抗体片段结合的条件下反应。可以通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合 物)的酰化反应或烷化反应进行聚乙二醇化。如本文所用，术语“聚乙二醇”旨在包含用于 衍生化其他蛋白质的任意形式的PEG，例如单(Cl-ClO)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚 乙二醇_马来酰亚胺。在某些实施方案中，进行聚乙二醇化的抗体是无糖基化的抗体。聚 乙二醇化蛋白质的方法是本领域已知的，并可应用于本发明的抗体。见例如Nishimura等 人的 EP 0 154 316 和 Ishikawa 等人的 EP 0 401 384。此外，通过引入非天然氨基酸，可以在本发明的LRP6结合多肽的任何部分中实 现聚乙二醇化。可以通过 Deiters 等人 J Am Chem Soc 125 :11782_11783，2003 ;Wang 和 Schultz, Science 301 :964_967，2003 ；Wang 等人 Science 292 498-500, 2001 ；Zhang 等人 Science 303 :371_373，2004或美国专利号7，083，970中所述的技术引入某些非天然氨基 酸。简言之，这些表达体系中的一些涉及位点定向诱变，从而将无义密码子例如琥珀TAG引 入编码本发明多肽的开放读码框中。然后将这类表达载体引入宿主中，所述宿主能够利用 对所引入的无义密码子特异且带有选择的非天然氨基酸的tRNA。对将部件与本发明多肽缀 合的目的而言，有益的具体非天然氨基酸包含具有乙炔和叠氮基侧链的氨基酸。然后可以 将包含这些新氨基酸的多肽在蛋白质中这些选定位点上聚乙二醇化。改造抗体的方法如上文所讨论，可以使用抗-LRP6抗体，通过修饰全长重链和/或轻链序列、Vh和 /或\序列或与之连接的恒定区，来产生新的抗-LRP6抗体。例如，可以将抗体的一个或多 个⑶R区与已知的框架区和/或其他⑶R重组组合，产生新的、重组改造的抗-LRP6抗体。 其他修饰类型包含前一部分中所述的修饰。改造方法的起始材料是一条或多条Vh和/或 八序列，或其一个或多个⑶R区。为了产生经改造的抗体，不必实际地制备(即作为蛋白质 表达)具有一个或多个V1^n/或\序列或其一个或多个CDR区的抗体。相反，将序列中包 含的信息用作起始材料，产生源自最初序列的“第二代”序列，然后制备“第二代”序列并表 达为蛋白质。可使用标准分子生物学技术制备和表达改变的抗体序列。改变的抗体序列所编码 的抗体是保留了其所源自的抗LRP6抗体的一种、一些或所有功能特性的抗体，所述功能特 性包括但不限于特异地结合至LRP6、干扰LRP6结合Wnt途径成员(例如DKKl (dickkopfl)、 DKK2、DKK4、SOSTl、SOSDl (USAGl)、sFRP (可溶性 Fzd 相关蛋白)1_4、Wise 或 Wnt 配体)的 能力和调节联蛋白磷酸化和降解。可以使用本领域中可获得的和/或本文所述的标准测定法(例如ELISA)来评价改变的抗体的功能特性。在本发明的改造抗体的方法的某些实施方案中，可以沿着抗-LRP6抗体编码序列 的整体或部分，随机地或选择性地引入突变，并可如本文所述，针对结合活性和/或其他功 能特性(例如特异地结合至LRP6、干扰LRP6结合Wnt途径成员(例如DKKl (dickkopfl)、 DKK2、DKK4、SOSTl、SOSDl (USAGl)、sFRP(可溶性 Fzd 相关蛋白)l_4、Wise 或 Wnt 配体)的 能力和调节β-联蛋白磷酸化和降解)筛选所得到的经修饰的抗-LRP6抗体。在本领域中 已描述了突变方法。例如，Short的PCT公开WO 02/092780描述了使用饱和诱变、合成连 接组装或其组合产生和筛选抗体突变的方法。备选地，Lazar等人的WO 03/074679描述了 使用计算筛选方法优化抗体的物理化学特性的方法。非抗体的LRP6结合分子本发明还提供显示抗体的功能特性，但其框架和抗原结合部分产生自其他多肽 (例如抗体基因编码的多肽或通过抗体基因体内重组产生的多肽以外的多肽)的LRP6结合 分子。通过定向进化方法产生这些结合分子的抗原结合结构域(例如LRP6结合结构域)。 见美国专利号7，115，396。具有与抗体可变结构域的折叠类似的总体折叠(“免疫球蛋白 样”折叠)的分子是适当的支架蛋白质。适合用于衍生抗原结合分子的支架蛋白质包括纤 连蛋白或纤连蛋白二聚体、腱糖蛋白、N-钙粘蛋白、E-钙粘蛋白、ICAM、肌联蛋白、GCSF-受 体、细胞因子受体、糖苷酶抑制剂、抗生素色蛋白、髓鞘质膜粘附分子P0、CD8、CD4、CD2、I类 MHC,T-细胞抗原受体、⑶1、C2和VCAM-I的I_set结构域、肌球蛋白结合蛋白质C的I_set 免疫球蛋白结构域、肌球蛋白结合蛋白质H的I-set免疫球蛋白结构域、端蛋白的I-set 免疫球蛋白结构域、NCAM、颤搐蛋白、神经胶质蛋白、生长激素受体、促红细胞生成素受体、 催乳素受体、干扰素_ Y受体、β "半乳糖苷酶/葡糖醛酸糖苷酶、β "葡糖醛酸糖苷酶、转 谷氨酰胺酶、T-细胞抗原受体、超氧化物岐化酶、组织因子结构域、细胞色素F、绿色荧光蛋 白、GroEL和竹芋蛋白。非抗体结合分子的抗原结合结构域(例如免疫球蛋白样折叠)可以具有小于IOkD 或大于7. 5kD的分子量(例如7. 5-10kD之间的分子量)。用来产生抗原结合结构域的蛋白 质是天然存在的哺乳动物蛋白质(例如人蛋白质)，并且与其所源自的蛋白质的免疫球蛋 白样折叠相比，抗原结合结构域包含至多50% (例如至多34%、25%、20%或15%)的突变 氨基酸。具有免疫球蛋白样折叠的结构域一般包括50-150个氨基酸(例如40-60个氨基 酸)。为了产生非抗体结合分子，建立克隆文库，其中形成抗原结合表面的支架蛋白质 区(例如在位置和结构上与抗体可变结构域CDR的免疫球蛋白折叠相似的区域)中的序列 被随机化。针对与目的抗原(例如hLRP6)的特异性结合和其他功能(例如LRP6生物活性 的抑制)来测试文库克隆。选择的克隆可以用作进一步随机化和选择的基础，产生对抗原 具有更高亲和力的衍生物。选择方案的一个实例描述于美国专利号6，207，446中。例如使用纤连蛋白III(kiFM)的第十模块作为支架，产生高亲和力结合分子。针 对1QFN3的残基23-29、52-55和78-87处的三个⑶R样环中的每一个构建文库。为了构建 每个文库，通过寡核苷酸合成，将与每个⑶R样区域重叠的DNA区段编码序列随机化。用 于产生可选择的kiFM文库的技术描述于美国专利号6，818，418和7，115，396 ；Roberts和 Szostak, 1997Proc. Natl. Acad. Sci USA 94 12297 ；美国专利号 6，261，804 ；美国专利号6，258，558 ；和 Szostak 等人 W098/31700。非抗体结合分子可以作为二聚体或多聚体产生，以提高对靶抗原的亲合力。例如， 将抗原结合结构域表达为与抗体恒定区(Fe)的融合物，其形成Fc-Fc 二聚体。参见例如美 国专利号7, 115，396。编码本发明抗体的核酸分子本发明的另一个方面涉及编码本发明的LRP6结合分子的核酸分子。核酸可存 在于完整细胞中、细胞裂解液中，或者可以是部分纯化或基本上纯形式的核酸。当通过标 准技术从其他细胞成分或其他污染物(例如其他细胞核酸或蛋白质)中纯化出时，核酸 是“分离的”或“基本上纯的”，所述标准技术包含碱/SDS处理、CsCl区带离心、柱层析、琼 脂糖凝胶电泳和本领域公知的其他方法。见F. Ausubel等编辑，1987 Current Protocols inMolecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York。本发明 的核酸可以是例如DNA或RNA，且可以包含或不包含内含子序列。在一个实施方案中，核酸 是cDNA分子。核酸可以存在于载体例如噬菌体展示载体中，或存在于重组质粒载体中。可使用标准分子生物学技术获得本发明的核酸。对于杂交瘤(例如从带有人免疫 球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤，如下文进一步描述)表达的抗体，可以通过标准 的PCR扩增或cDNA克隆技术，获得编码杂交瘤产生的抗体轻链和重链的cDNA。对于从免疫 球蛋白基因文库(例如使用噬菌体展示技术)获得的抗体，可以从文库成员的多个噬菌体 克隆中回收编码抗体的核酸。一旦获得编码Vh和\区段的DNA片段，即可通过标准重组DNA技术进一步操作这 些DNA片段，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这 些操作中，将编码\或Vh的DNA片段有效连接至另一 DNA分子，或有效连接至编码另一蛋 白质如抗体恒定区或柔性连接体的片段。如本文所使用，术语“有效连接”是指两条DNA片 段以功能性方式接合，例如使得两条DNA片段编码的氨基酸序列保持符合读框，或者使得 蛋白质在期望的启动子控制下表达。可以通过将编码Vh的DNA与编码重链恒定区(CHI、CH2和CH3)的另一 DNA分子有 效连接，将分离的编码Vh区的DNA转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列为本领 域已知(见例如Kabat等人 1991Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5版，美国卫生和人类服务部，NIH Publication No. 91-3242)，并且可以通过标准PCR扩增 获得包含这些区域的DNA片段。重链恒定区可以是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM 或IgD恒定区。对于Fab片段重链基因，编码Vh的DNA可以有效连接至仅编码重链CHl恒 定区的另一 DNA分子。可以通过将编码Vl的DNA与编码轻链恒定区CL的另一 DNA分子有效连接，将分 离的编码\区的DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的 序列为本领域己知(见例如 Kabat 等人 1991Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美国卫生和人类服务部，NIH Publication No. 91-3242)，并且可以通过 标准PCR扩增获得包含这些区域的DNA片段。轻链恒定区可以是κ和λ恒定区。为了产生scFv基因，将编码Vh和\的DNA片段与编码柔性连接体例如编码氨基 酸序列(Gly4-Ser)3的另一片段有效连接，使得％和\序列可以表达为连续的单链蛋白 质，其中Vl和Vh区通过柔性连接体连接(见例如Bird等人1988 Science 242 =423-426 ；Huston等人 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 ；McCafferty 等人 1990 Nature 348 552-554)。单克降抗体的产牛可以通过多种技术来产生单克隆抗体(mAb)，所述技术包含常规的单克隆抗体方 法，例如Kohler和Milstein (1975 Nature, 256 495)的标准体细胞杂交技术，或者使用文 库展示方法，例如噬菌体展示。用于制备杂交瘤的动物系统是鼠系统。在小鼠中产生杂交瘤是良好建立的方法。 免疫方案和分离用于融合的经免疫的脾细胞的技术是本领域已知的。融合伙伴(例如鼠骨 髓瘤细胞)和融合流程也是已知的。可以根据按上述制备的鼠单克隆抗体的序列，制备本发明的嵌合抗体或人源化抗 体。可从目的鼠杂交瘤获得编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA，并使用标准分子生物学技术 将其改造为包含非鼠(例如人)的免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可以使用本 领域已知的方法(见例如Cabilly等的美国专利号4，816，567)，将鼠可变区连接至人恒定 区。为了产生人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入人的框架中。参见 例如美国专利号 5，225，539 和美国专利号 5，530，101,5, 585，089,5, 693，762 和 6，180，370。在某个实施方案中，本发明的抗体是人单克隆抗体。可以使用带有人免疫系统部 分而不是小鼠免疫系统的转基因小鼠或转染色体小鼠产生这类针对LRP6的人单克隆抗 体。这些转基因小鼠和转染色体小鼠包括在本文中分别称为HuMAb小鼠和KM小鼠，并且在 本文中集体称作“人Ig小鼠”的小鼠。HuMAb mouse (Medarex, Inc.)包含人免疫球蛋白基因微基因座(miniloci)以 及使内源性μ和κ链基因座失活的定向突变，所述微基因座编码未重排的人重链(μ和 Y)和κ轻链免疫球蛋白序列(见例如Lonberg等人1994 Nature 368(6474) :856_859)。 因此，小鼠显示降低的小鼠IgM或κ表达，并且在免疫应答中，引入的人重链和轻链转基 因经历类型转换和体细胞突变，产生高亲和力的人IgGK单克隆(Lonberg，N.等，1994，见 上文；综述于 Lonberg, N. , 1994 Handbook of Experimental Pharmacologyl 13 :49_101 ； Lonberg, N.禾口 Huszar, D.,1995 Intern. Rev. Immunol. 13 :65_93 ； 禾口 Harding, F.禾口 Lonberg, N.，1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764 :536_546)。HuMAb 小鼠的制备和应用，以及这类 小鼠带有的基因组修饰进一步描述于Taylor，L.等人1992 Nucleic Acids Research20 6287-6295 ；Chen, J.等人 1993 International Immunology 5 647-656 ；Tuaillon 等 人 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 3720-3724 ；Choi 等人 1993 Nature Genetics 4 117-123 ；Chen, J.等人 1993 EMBO J. 12 :821_830 ；Tuaillon 等人 1994 J. Immunol. 152 2912-2920 ；Taylor,L.等人 1994International Immunology 579-591 ；和 Fishwild，D.等 人1996 NatureBiotechnology 14 :845_851，所述所有参考文献的内容在此明确地整体引 入作为参考。还参见美国专利号 5，545，806,5, 569，825,5, 625，126,5, 633，425,5, 789，650、 5，877，397、5，661，016、5，814，318、5，874，299 和 5，770，429，均属于 Lonberg 和 Kay ； Surani 等的美国专利号 5，545，807 ；PCT
发明者F·从, S·M·兰瓦拉, S·古特, S·埃滕伯格 申请人:诺瓦提斯公司