专利名称：：含有赤杨树皮或树干提取物的抗流感病毒组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及含有赤杨(Alnusjaponica)提取物的抗病毒组合物，具体涉及制备赤杨树皮或树干提取物的方法以及含有该提取物的组合物，所述提取物具有高度的抗病毒活性。
背景技术：
：禽流感病毒属于正粘病毒科(orthomyxoviridaefamily)，并引起对家禽诸如小鸡、火鸡的伤害。根据致病性程度，禽流感病毒被分为高致病性、低致病性和非致病性禽流感病毒三种类型，其中高致病性病毒由世界动物卫生组织(WorldOrganizationforAnimalHealth,ΟΙΕ)分类为OIEListA疾病，并且在韩国分类为“1类家畜感染疾病”。根据核壳体蛋白和基质蛋白的抗原性，流感病毒分A、B或C型。此外，根据血凝素(HA)和唾液酸苷酶(NA)抗原结构的差别，HA被分为16个亚型，NA被分为9个亚型，其中HA帮助宿主细胞受体结合，并在宿主细胞膜与病毒包膜之间融合，引起病毒感染，并且当病毒在增殖后经过细胞膜出芽时NA起到重要作用。理论上讲，通过两种蛋白质组合存在144种病毒亚型。感染通过与受到污染的分泌物接触发生，此外，其可以粒子和小滴两种形式通过空气、人的足部、饲料运输车辆、设备和蛋表面上的粪便等传播。根据感染病毒的致病性虽然存在各种症状，一般说来，它们是呼吸系统症状，腹泻以及产蛋量急剧下降等。此外，在一些情况下，在头部区域诸如鸟冠出现黄萎病，在面部出现水肿或者羽毛竖起(ruffled)。根据致病性，致死率从0%到100%，但是由于症状与鸡新城疫(NewcastleDisease)、鸡传染性喉气管炎(infectiouslarynogotracheitis)、支原体感染以及类似疾病的症状相似，需要进行准确诊断。高致病性禽流感从1959到2003在全世界已经出现了23次，其中大多数是地方性的并被围控(contained)。H5W亚型高致病性禽流感的爆发于2003年12月在韩国已经出现，在包括欧洲、非洲和南亚的大多数国家诸如日本、中国、越南和印度尼西亚的超过30个国家已经出现并因此变得全球性流行。虽然已知人类不会受到禽流感的感染，由于人类在1997年感染H5W，1999年在香港从人类分离出H9N2禽流感病毒，以及2004年在加拿大人感染H7禽流感病毒的情况，禽流感的预防对于公共健康部门来说是极为重要的。根据世界卫生组织(WHO)的艮道(http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/country/cases_table_2006_06_20/en/index.html)，确认228人已经感染过H5m亚型病毒，并且其中10个国家的130人在2003年到2006年6月20日的时间内死亡。在韩国，H9N2亚型病毒引起的低致病性禽流感的爆发自1996年已经出现以来，在1999再次出现。如果在大多数国家出现禽流感爆发，则家禽需要被抛弃，并且其中出现禽流感爆发的国家不能出口家禽产品，由此引起家禽工业的极大损失。此外，当存在人类感染的风险时，这种损害传播到整个工业，包括旅游业以及运输业，由此引起巨大损失。天然物质指的是不含人工成分的最小加工程度的物质，被分类为GRAS(通常被识别为安全)的天然物质在其量或在使用天然物质的食物的使用中没有限制。在饲养业，天然物质被分为天然添加剂，并被用作食品添加剂，在国外，由于其极佳的功能性，其已经被用作健康食品和用于用户目的的药品而没有额外限制。同时，赤杨是桦木科山毛榉目的落叶双子叶树种，通常被称为赤杨树。它们分布在韩国、日本、中国等，并在沼泽条件下生长，其高度大约为20m，其树皮为深棕紫色(deeppurplish-brown)0其冬芽为长的卵圆形，正如朝下翻转的鸡蛋的形状，具有三条线和总花柄。赤杨的树叶交错生长，并且它们是鸡蛋状的卵圆形形状(两端或多或少为圆形，底部最宽)或者披针状。叶片的两侧有光泽，并且叶边为锯齿状。赤杨的花在三到四月开放，雌雄异体，并且形成柔荑。雄蕊花穗(Staminatespike)开雄花，并且每个苞叶将3_4朵花包在叶腋内。每朵花有四个花被和四个雄蕊。果实在10月成熟，并且产生2-6个果实。其为长卵圆形，看起来象松果。有关赤杨提取物的常见专利的例子包括含有赤杨提取物的化妆品组合物(韩国专利公开号.10-2003-0074500)以及制备对于解酒有效的含有赤杨和绿茶叶提取物的健康饮料的方法(韩国专利公开号.10-2006-0023093)等等。近来，全世界付出了许多研究努力来开发抗病毒试剂。用于治疗HIV(人体免疫缺陷病毒)_1和乙肝病毒的拉米夫定(Lamibudine)，用于治疗疱疹病毒感染的更昔洛韦(gancyclovir)，主要用于治疗呼吸道合胞体病毒感染症状但当在急救时也可用于治疗各种病毒感染症状的病毒唑(ribavirin)，以及人工合成的作为流感病毒唾液酸苷酶抑制剂的zanamivirRELENZA和oseltamivirTAMIFLU均可在获得批准后从市场上购买。但是，被许可用于治疗A型流感病毒的金刚烷胺(amantadine)及其类似物金刚烷乙胺(rimantadine)的使用由于抗性病毒的出现及其副作用而减少。近来，在H5W禽流感病毒中对奥赛米韦(oseltamivir)抗性的病毒已经出现，因此，存在对于开发各种抗病毒剂的迫切需要。本发明的发明人在韩国专利注册号.10-0721703和韩国专利注册号.10-0769050中已经证实赤杨的甲醇提取物的抗病毒活性。但是，上面提到的专利具有的缺点在于仅仅当提取物以高浓度给药时才显示抗病毒活性，因此其可能的应用受到限制。因此，本发明的发明人付出了极大的努力来开发对正常细胞具有低毒性的天然物质，同时即便在低浓度给药时也具有极佳的流感病毒增殖抑制效果，结果确定，通过在30-80°C下以80-90%的乙醇提取赤杨的树皮或树干得到的提取物具有极好的抗病毒效果，由此完成了本发明。
发明内容本发明的主要目的在于提供制备赤杨树皮或者树干提取物的方法，所述提取物具有高抗流感病毒活性。本发明的另一目的在于提供预防或改善流感病毒感染的食物组合物，其含有由上述方法制备的赤杨树皮或树干的提取物。本发明的还一目的在于提供用于预防或治疗流感病毒感染的药物组合物，其含有由上述方法制备的赤杨树皮或树干的提取物。为了实现上述目的，本发明提供了制备具有抗流感病毒活性的赤杨树皮或者树干提取物的方法，所述方法包括下列步骤(a)在30-80°C下使用80-100%的乙醇从韩国本土赤杨的树皮或者树干中提取；并且(b)回收得到的提取物溶液。本发明还提供了预防或者改善流感病毒感染的食物组合物，其包括由上述方法制备的赤杨树皮或树干的提取物以及营养学上可接受的辅助添加剂。本发明还提供了预防或者改善流感病毒感染的药物组合物，其包括由上述方法制备的赤杨树皮或树干的提取物作为活性成分。本发明还提供了由上述方法制备的赤杨树皮或树干的提取物用于治疗流感病毒感染的应用。本发明还提供了利用由上述方法制备的赤杨树皮或树干的提取物治疗流感病毒感染的方法。在本发明中，流感病毒优选选自下组，该组由人类流感病毒，猪流感病毒，马流感病毒和禽流感病毒组成。优选地，禽流感病毒为KBNP-0028(KCTC10866BP)。本发明的其他特征和实施例将通过下面的详细描述和随附的权利要求书进一步阐明。具体实施例方式在一个方面，本发明涉及制备具有抗流感病毒活性的赤杨树皮或者树干提取物的方法，所述方法包括下列步骤(a)在30-80°C下使用80-100%的乙醇从韩国本土赤杨的树皮或者树干中提取；并且(b)回收得到的提取物溶液。在本发明的一种实施方式中，在将赤杨树皮或树干粉末化并通过热水提取、冷水提取、回流冷却提取或者超声提取方法使用水或者乙醇提取之后，将它们离心，由此得到赤杨树皮或树干的提取物。在本发明中，在将含有赤杨树皮或者树干提取物的组合物加入到由禽流感病毒感染的SPF孵化蛋中并培养之后，进行平板凝血反应检测(platehemagglutinationtest),结果确定含有赤杨树皮或树干提取物的组合物具有极好的抗流感病毒效果，即便以低浓度给药时也是如此。在另一方面，本发明涉及预防或者治疗流感病毒感染(流感病毒病)的药物组合物，其包括由上述方法制备的赤杨树皮或树干的提取物作为活性成分。在本发明中，流感病毒优选选自下组，该组由人类流感病毒，猪流感病毒，马流感病毒和禽流感病毒组成。更优选地，禽流感病毒为KBNP-0028(KCTC10866BP)。本发明的赤杨树皮或树干的提取物是天然物质，因此没有毒性，能够作为医疗产品大剂量长期给药。包括本发明的赤杨树皮或树干的提取物的组合物可通过将药剂诸如抗组胺剂、消炎止痛剂、抗肿瘤剂以及抗生素混合在一起制备，或者可与它们组合使用。药物剂量形式的本发明的组合物可以药物学上可接受的盐的形式使用，并且还可单独或者以适当地结合使用，以及与其他药物活性化合物组合使用。包括本发明的提取物的药物组合物可根据常规制备方法制成口服制剂诸如粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬液、乳液、糖浆、气雾剂等，外用制剂，栓剂和无菌注射液等。包括本发明的提取物的药物组合物可包括载体、赋形剂和稀释剂，合适的载体、赋形剂和稀释剂的例子可包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藻糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯橡胶、藻酸盐、白明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、7jC、轻苯甲酉旨(methylhydroxylbenzoate)、轻苯丙酉旨(propylhydroxylbenzoate)、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。本发明的组合物可与常规稀释剂或者赋形剂一起制成制剂形式，诸如与填充剂、延伸剂、结合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等一起制成制剂。用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂等，并且固体制剂通过将提取物与至少一种赋形剂混合来制备，例如与淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、白明胶等混合来制备。而且，除赋形剂之外还使用润滑剂诸如硬脂酸镁和滑石粉。用于口服给药的液体制剂包括悬浮剂、齐培丙醇(zipeprol)、乳剂、糖浆等，并且除常规稀释剂诸如水和液体石蜡之外各种赋形剂例如湿润剂、矫臭剂、香味剂、保护剂等可被包含在其中。注射给药制剂包括无菌水溶液、非水溶液、悬液、乳液、冻干剂和栓剂。非水溶液和悬液的例子包括菜油诸如丙二醇、聚乙二醇和橄榄油，以及可注射酯诸如醋酸乙酯及其类似物。栓剂的基质包括半合成脂肪酸酯(witepsol)，聚乙二醇(macrogol),吐温60,可可黄油(cacaobutter),月桂油(laurinbutter),甘油白明胶及其类似物。虽然根据本发明的提取物的剂量基于患者体重和状况、疾病的严重程度、剂型、给药途径和治疗阶段而变化，但本领域技术人员可正确确定剂量。但是，为了达到所需效果，本发明的提取物以每天0.01-200mg/kg的剂量给药，优选每天0.l-100mg/kg。前述剂量可作为每天的单剂量给药，或者分成多个剂量，并且该剂量不以任何方式限制本发明的范围。本发明的提取物可经各种途径给药到动物，包括大鼠，小鼠，家畜，人类等哺乳动物。给药模式可包括例如口服和直肠给药，或者静脉、肌肉、皮下、子宫内膜或者侧脑室(intracerebroventricular)注身寸0在另一方面，本发明提供了预防或改善流感病毒感染的食物组合物，其含有由上述方法制备的赤杨树皮或树干的提取物以及营养学上可接受的辅助添加剂。在该方面的一种实施方式中，流感病毒优选选自下组，该组由人类流感病毒，猪流感病毒，马流感病毒和禽流感病毒组成。更优选地，禽流感病毒为KBNP-0028(KCTC10866BP)。当制备各种功能性食品和健康功能性食品时，包括本发明的提取物或其药物学上可接受的盐的组合物可被用作主要成分、食物添加剂和辅助成分。在本发明中，术语“功能性食品”指的是通过将本发明的提取物加入到其中其功能得到改善的食品。功能在广义上可分为如合成香料的物理功能和天然香料生理学功能。当将本发明的提取物加入到一般食品诸如合成香料和天然香料中时其生理学功能得到改善。因此，在本发明中，具有改善的功能的食品广义上被定义为功能性食品。除了上面提到的以外，本发明的提取物可含有各种营养成分、维生素、矿物质(电解质)、香料诸如合成香料和天然香料、着色物质、增强剂(奶酪、巧克力等)果胶酸及其盐、褐藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增厚剂、PH控制剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精和用于碳酸化饮料用途的碳化剂等。另外，本发明的提取物可含有天然果汁以及用于果汁饮料和蔬菜饮料食品(provision)的果浆。这些成分可单独或者组合使用。这些添加剂的比例不是6严格的，但一般基于100重量份的本发明的提取物，选自0.01-20重量份的范围。实施例此后，将通过实施例更详细地描述本发明。但是，对本领域技术人员来说容易想到的是，这些实施例仅用于说明的目的，而不解释为对本发明的范围的限制。实施例1赤杨提取物的制备1-1各种温度下提取物溶剂和提取物的制备将购自韩国首尔市Kyungdong市场的韩国本土赤杨的树皮在室温下干燥24小时，切碎并粉碎，将Ikg得到的树皮碎片使用IOL95%的乙醇在40°C、60°C和80°C下回流提取8小时，或者在10(TC下使用IOL水提取4小时，并在真空下过滤以收集上清液，接着从得到的碎片中洗脱有用物质。将洗脱的有用物质在真空下干燥24小时以得到IOOg赤杨粉末，然后将得到的粉末在99.9%的二甲亚砜(DMSO)溶液中溶解至浓度为20mg/ml，然后用于下面的实验。为了进行对比实验，通过韩国专利注册号.10-0721703和韩国注册号.10-0769050的实施例1中的方法制备赤杨树皮提取物(含有赤杨提取物的抗病毒组合物)作为对照组。1-2使用来自不同区域的赤杨的提取物制备将购自韩国首尔市Kyungdong市场的韩国本土赤杨的树皮或树干以及购自中国延边市场的中国本土赤杨树皮在室温下干燥24小时，切碎并粉碎，将Ikg得到的树皮碎片分别使用IOL的80%乙醇和95%乙醇在40°C下回流提取并在真空下过滤以收集上清液，接着从得到的碎片中洗脱有用物质。将洗脱的有用物质在真空下干燥24小时以得到IOOg赤杨粉末，然后将得到的粉末在99.9%的二甲亚砜(DMSO)溶液中溶解至浓度为20mg/ml，然后用于下面的实验。实施例2赤杨提取物的抗病毒效果测定2-1:KBNP-0028的制备当在实验中使用禽流感病毒时，使用将A/鸡/韩国/SNU0028/2000(H9N2)病毒(于2000年分离自韩国)在鸡胚中传代之后克隆的超增殖(hyperproliferative)KBNP-0028(KR2006-0026591)。也就是说，SNU0028[A/鸡/韩国/SNU0028/2000(H9N2)；2005年5月9日分离并报告给NationalVeterinaryResearchandQuarantineService]是低致病性H9N2亚型禽流感病毒，并于2000年1月28日分离自位于NorthjeolaProvince的养鸡场的开始大量死亡并且产蛋减少症状的鸡群中。分离方法如下将来自感染小鸡的肾脏和气管样品溶解后，悬浮在磷酸缓冲液中，并使用0.45μm滤纸过滤，将每种样品接种到三个SPF(无特定病原体，SpecificPathogenFree)尿囊腔孵化蛋(SunriseCo.，NY)中，并在37°C下培养得到尿囊液。将20μ1尿囊液和20μ1从SPF孵化蛋孵化的小鸡提取的0.鸡血红细胞滴到玻璃板上，并混合以进行平板凝血反应检测。结果，在通过培养肾脏样品和气管样品得到的所有尿囊液中均出现凝血反应。使用Η9Ν2专一性引物进行RT-PCR和碱基序列分析(KimMinChul,Master'sThesis,2002,SeoulNationalUniversity)对病毒进行鉴定，并在_70°C下储存。其中，分离自气管样品的病毒在实验中使用。为了在孵化蛋中选择具有高产率的牛痘株(vacciniastrain)将SNU0028使用磷酸缓冲液稀释至浓度为0.05到0.5HAU/ml，并将200μ1稀释液接种到10-11日龄的SPF孵化蛋(SunriseCo.,NY)的尿囊腔中，然后在37°C下培养三天。经早晨和下午检查，每天将3天前死亡的孵化蛋抛弃。将存活3天的孵化蛋在4°C下储存12-24小时，从其中收集尿囊液以测定每个蛋的体积和凝血反应滴度。其中，使用上面描述的相同方法将具有最大量和最高凝血反应滴度的尿囊液接种到孵化蛋中，并传代19次以选择其凝血感应滴度和产量显示产量增加的尿囊液，因此，将毒株命名为KBNP-0028并于2005年10月26日保藏在位于韩国大田市儒城区鱼隐洞的基因银行(KCTC10866BP)处。2-2培养孵化蛋壳碎片将1011日龄的SPF孵化蛋(SunriseCo.，NY)的蛋壳使用70%酒精洗涤并除去所有鸡胚和所有体液。将得到的蛋壳切成8mm长8mm宽的片，同时保持绒毛和尿囊粘附于蛋壳的内表面上，将每片加入到24孔培养板中。通过下列方式制备培养基(i)将199培养基(GIBCO-BRL,NY,USA)与FlO培养基(GIBCO-BRL，NY，USA)以11的比例混合，(ii)加入0.075%的碳酸氢钠和100μg/ml的庆大霉素。通过将100μ14-10倍稀释的在实施例2-1中制备的尿囊液原液ΚΒΝΡ-0028加入到孵化蛋壳碎片的绒毛和尿囊中并在37°C下培养30分钟使10-11日龄SPF孵化蛋(SunriseCo.，NY)感染病毒，并加入1000μ1培养基，然后将在实施例1_1和实施例1_2中制备的赤杨提取物分别以各种浓度加入到6个孔板中，接着在37°C下培养7天。2-3抗病毒效果的检测加入了各种浓度赤杨提取物的在实施例2-2中培养7天的所述病毒感染液的培养液进行平板凝血反应检测。将25μ1培养液和25ul鸡血细胞(0.)滴到玻璃板上并均勻混合。根据上下左右移动玻璃板在两分钟内是否出现血液凝集反应来确定病毒增殖。表1对照提取物溶剂赤杨提取物(μ/ml)病毒无病毒400200100506/60/6800C,95%乙醇0/60/62/65/6600C,95%乙醇0/60/62/65/6400C,95%乙醇0/60/61/63/61000C,水1/64/66/66/699.9%甲醇0/62/66/6-结果，如表1所示，在加入100°C水提取物作为阴性对照的样品中，400μg/ml的6个测试样品中有一个出现血液凝集反应，显示了部分抗病毒效果，但是，在50μg/ml和100μg/ml的6个检测样品中都显示血液凝集反应活性，表明病毒增殖没有受到抑制。另一方面，在加入了95%乙醇提取物(80°C下)的样品中，血液凝集反应在400μg/ml和200μg/ml的6个检测样品中都没有发生，显示病毒增殖完全被抑制，在100yg/ml的6个检测样品中有两个出现了血液凝集反应，显示了部分病毒抑制效果，在50yg/ml的6个检测样品中有五个出现了血液凝集反应，显示了弱病毒抑制效果。加入了95%乙醇提取物(60°C下)的样品显示了与95%乙醇提取物(80°C下)相同的血液凝集反应结果。400μg/ml和200μg/ml的95%的乙醇提取物(40°C)显示了与95%乙醇提取物(分别在80°C、65°C下)相同的血液凝集反应结果，因此，在所有样品中都没有显示血液凝集反应活性，表明病毒增殖完全被抑制，并显示在100μg/ml的6个检测样品中有一个出现了部分抗病毒效果的血液凝集反应，在50μg/ml的6个检测样品中有三个出现血液凝集反应，由此确定提取物以各种有效甚至很低的浓度显示了高抗病毒活性。以100μg/ml的提取物浓度为基础，各种溶剂的抗病毒活性顺序如下95%乙醇提取物(40°C下)>95%乙醇提取物(80°C下)以及95%乙醇提取物(60°C下)>水提取物(100°C下)。因此确定，95%赤杨提取物(40°C下)最适合作为制备本发明的抗病毒组合物的赤杨提取物。为了比较对病毒增殖显示最高抑制效果的40°C下并以各种提取溶剂提取不同来源的赤杨的抗病毒效果，在表2中显示的条件下进行上述相同的实验。表权利要求1.一种制备具有抗流感病毒活性的赤杨树皮或者树干提取物的方法，所述方法包括下列步骤(a)在30-80°C下使用80-100%的乙醇从韩国本土赤杨的树皮或者树干中提取；并且(b)在相同温度下通过真空浓缩回收得到的提取物溶液并干燥。2.一种预防或者改善流感病毒感染的食物组合物，其特征在于，含有由权利要求1的方法制备的赤杨树皮或树干提取物以及营养学上可接受的辅助添加剂。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，流感病毒选自下组，该组由人类流感病毒、猪流感病毒、马流感病毒和禽流感病毒组成。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述禽流感病毒为KBNP-0028(KCTC10866BP)。5.一种预防或者改善流感病毒感染的药物组合物，其含有由权利要求1的方法制备的赤杨树皮或树干提取物作为活性成分。6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述流感病毒选自下组，该组由人类流感病毒、猪流感病毒、马流感病毒和禽流感病毒组成。7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述禽流感病毒为KBNP-0028(KCTC10866BP)。全文摘要本发明涉及含有赤杨提取物的抗病毒组合物，具体涉及制备含有赤杨树皮或树干提取物的高度活化的抗流感病毒组合物的方法以及含有该提取物的抗流感病毒组合物。根据本发明的赤杨的树皮或者树干的提取物对正常细胞具有很低的毒性，同时具有极佳的抗病毒效果，即便在以很低的浓度给药时也是如此，因此，含有赤杨提取物的组合物可在预防和治疗流感病毒感染中有效使用。文档编号A61K36/185GK102215851SQ200880125161公开日2011年10月12日申请日期2008年12月4日优先权日2007年12月11日发明者俞锡铉,权赫俊,罗正灿,金炳启申请人:Rnl生物技术株式会社