专利名称：一种RANKL-Fc融合蛋白及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种RANKL-Fc融合蛋白及其制备方法和用途。
背景技术：
骨形成和骨吸收是正常骨新陈代谢过程中密切相关的两个过程。骨质疏松症患者因破骨细胞活性增加，骨吸收率超过骨形成率，导致骨质疏松，其中并无骨矿物质缺陷。骨骼也是通常的肿瘤转移侵袭部位，多发性骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌和肺癌等都常转移至骨骼。肿瘤细胞和成骨细胞相互作用，从而刺激骨髓内前体细胞分化成破骨细胞，因此，骨骼内肿瘤转移部位常见破骨细胞数量增加，破骨细胞性的骨吸收也相应地增加。总体上，破骨细胞(Osteoclast)的过多形成是造成骨质疏松和肿瘤引起的骨吸收(Bone resorption)的主要原因。人体破骨细胞来自于分化的单核细胞(Monocyte)/巨噬细胞(Macrophage)。骨质疏松容易导致骨折，根据中国2000年第五次人口普查骨质疏松症的结果及预测，中国60岁以上的老人在2050年将达到4.1亿，占中国总人口的27.4％。随着老年人口的迅速增加，骨质疏松易患人群也迅速增加。美国有2,800万骨质疏松病人，其中150万人因为骨质疏松而发生骨折(70万人脊椎骨折，25万人胯骨骨折)。世界卫生组织将2000年至2010年列为“骨与关节疾病十年”。根据世界卫生组织资料，近年来全世界因为骨质疏松而引起的骨折增加了4倍，肿瘤转移致使破骨细胞活跃而引起的溶骨病变也不断增加。美国有50万病人因肿瘤转移引起骨吸收而造成骨折，最常见的是多发性骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌等引起的骨破坏。不管是妇女停经后引起的绝经期骨质疏松，还是肿瘤转移引起的骨吸收，原因都是人体内的破骨细胞过多而形成骨质疏松。为了解决骨质疏松的病理状况，全世界生物医学界都在寻找一种有效的方法抑制破骨细胞的形成和其活性。美国辉瑞(Pfizer Inc.)正在申请美国食品和药品管理局批准其用以治疗绝经后女性患者骨质疏松症新药Fablyn的上市，Fablyn工作机理与荷尔蒙雌性激素类似，这类药物被称作选择性雌激素受体调节剂。2005和2006年，美国食品和药品管理局两次拒绝辉瑞的申请，其理由都是担心该药存在导致患者罹患子宫内膜癌的风险。辉瑞在2007年底再次递交了Fablyn作为骨质疏松症治疗药物的上市请求，并提交了全新的数据。美国Amgen生物医药公司正在开发骨保护素(Osteoprotegerin，OPG)的蛋白药物来抑制核因子κB受体配体活化剂(Receptor Activator for Nuclear FactorκBLigand)(RANKL)的活性，以期控制破骨细胞的过量形成。同时，美国洛杉矶的骨髓瘤/骨肿瘤研究所也正在研究发展一种减少破骨细胞形成的生物制剂-肿瘤坏死因子受体关联因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，简称为TRAF6)抑制性多肽(TRAF6dn)。
RANKL属于TNF家族，属于II型跨膜蛋白，共由317个氨基酸构成，其中氨基端的1-47氨基酸残基构成RANKL的胞内区域，48-67氨基酸残基构成RANKL的跨膜区域，68～317氨基酸残基构成RANKL的胞外区域。RANKL的141-317氨基酸残基也可以从细胞膜上脱落，形成可溶的RANKL。RANKL是破骨细胞分化所必需的。RANKL的晶体结构显示其胞外结构中含有一个独特部分可激活破骨前体细胞表面的受体RANK，从而刺激破骨细胞的形成。RANK受体表达于单核巨噬细胞，软骨细胞和破骨细胞前体，它是调节破骨细胞分化的主要受体。当肿瘤细胞转移至骨骼部位后，RANKL是破骨细胞形成的主要生理调节子，可由肿瘤细胞直接分泌，无需基质细胞支持直接刺激破骨细胞形成。
自从发现RANKL/RANK信号通路，调节破骨细胞形成和激活的分子机理研究取得了快速进展。RANKL与RANK受体结合，激活了含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)接头分子DAP12或FcRγ，接头分子与破骨细胞前体细胞表面的对应得免疫球蛋白样受体结合，介导胞内的钙信号。钙信号与RANKL/RANK信号通路的中间物质合作，激活了破骨细胞分化的关键信号分子NFATc1，导致破骨前体细胞分化成破骨细胞。
然而，ITAM的信息传导系统受到了基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)的抑制。ITIM作为抑制性信息传导系统通过含SH2域的肌醇多磷酸5’磷酸酶(SHIP)1(SH2domain-containing inositol polyphosphate 5’phosphatase)和含SH2域的蛋白酪氨酸磷酸酶(SHP1/2)(SH2 domain-containing protein tyrosine phosphatase)的激活来平衡ITAM的信息传导系统。然而，目前通过激活细胞内ITIM的信息传导系统来抑制ITAM的信息传导，达到减少破骨细胞形成的RANKL重组蛋白还未见报道。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明的一个目的在于提供一种RANKL-Fc融合蛋白。
本发明的第二个目的在于提供编码上述RANKL-Fc融合蛋白的基因序列。
本发明的第三个目的在于提供上述RANKL-Fc融合蛋白的制备方法。
本发明的第四个目的在于提供上述RANKL-Fc融合蛋白在制备用于治疗骨吸收疾病的药物组合物中的应用。
本发明的第五个目的在于提供一种包含上述RANKL-Fc融合蛋白的药物组合物。
本发明提供了一种RANKL-Fc融合蛋白，所述RANKL-Fc融合蛋白为P1-P2和P1-L-P2形式，其中P1为RANKL蛋白的胞外区域，P2为人IgG Fc蛋白，L为连接肽。
所述RANKL胞外区域片段选自 1)SEQ ID NO1所示的RANKL氨基酸序列； 2)从SEQ ID NO1中第68-188位之间任何一个氨基酸残基，包含第68和188位氨基酸残基，至SEQ ID NO1末端氨基酸残基所组成的氨基酸序列； 3)在2)所述氨基酸序列前加Asp形成的氨基酸序列。
所述人Ig G的Fc蛋白如SEQ ID NO2所示的蛋白序列，或SEQ ID NO2中第16位氨基酸残基Ala到最后一位氨基酸残基Lys。
所述连接肽的序列为(Gly4Ser)3。
本发明还提供了编码RANKL胞外区域与Fc融合蛋白的核酸序列。本发明分别提供一种编码RANKL胞外区域的核苷酸序列(SEQ ID NO3)和一种编码人Ig G Fc蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO4)。
本发明还进一步提供了一种融合基因RANKL-Fc，所述融合基因RANKL-Fc为编码RANKL胞外区域与Fc所组成的融合蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO5)。
由于一种氨基酸可以有多种密码子编码。因此在某些实施方案中，可以根据实际需要对上述编码RANKL胞外区域与Fc融合蛋白的核酸序列的核酸密码子进行突变，特别是使用CHO细胞偏爱的密码子，但编码RANKL-Fc融合蛋白的氨基酸序列不变。
本发明还提供了上述RANKL-Fc融合蛋白的制备方法，具体包括如下步骤 a)将编码RANKL胞外区域片段的核苷酸序列和编码人Ig G的Fc的核苷酸序列连接于表达载体，得到RANKL-Fc融合蛋白的重组表达载体； b)将步骤a)中的重组表达载体转入宿主细胞，筛选获得表达RANKL-Fc融合蛋白的工程细胞株； c)培养步骤b)获得的工程细胞株； d)从步骤c)中的培养产物中分离RANKL-Fc融合蛋白。
所述步骤a)中的表达载体可以选用各种已知的载体，优选为载体pCDNA3.1或载体pSecTag。
所述步骤b)中的宿主细胞优选为CHO细胞，更优选的，宿主细胞为CHO-K1或CHO-DG44细胞株。
在本发明的一个优选的实施例中，上述RANKL-Fc融合蛋白的制备方法为将经筛选得到的工程细胞株培养在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，培养条件为温度36℃～37.5℃，CO2浓度为5％。培养15天后，离心培养液得上清，Protein A亲和层析分离RANKL-Fc融合蛋白。
本发明进一步提供了RANKL-Fc融合蛋白作为破骨细胞形成及其生物学活性抑制剂的用途。
本发明还进一步提供了RANKL-Fc融合蛋白在制备用于治疗骨吸收疾病的药物组合物中的应用。
本发明更进一步提供了一种用于治疗骨吸收疾病的药物组合物，仅含有治疗有效量的RANKL-Fc融合蛋白的药物制剂，或者是治疗有效量的RANKL-Fc融合蛋白与药学上可接受的载体一起组成的药物制剂。
所述骨吸收类疾病选自骨质疏松症、佩吉特病、骨髓炎、血钙过多、与手术或服用类固醇相关的骨质减少、骨坏死、由类风湿关节炎引起的骨吸收、牙周骨吸收、溶骨性转移或与癌症相关的骨吸收类疾病。
本发明所提供的药物组合物可以多种剂型存在，如用于静脉注射等的注射剂，用于皮下注射、表皮外敷等的经皮吸收剂，用于喷鼻、喉、口腔、表皮、粘膜等的喷雾剂，用于滴鼻、眼、耳等的滴剂，用于肛肠等的栓剂、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式，及肺部给药制剂及其他非肠道给药的组合物。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。该药用组合物还可以加入香味剂、甜味剂等。
如上所述的RANKL-Fc融合蛋白的药物制剂可对哺乳动物临床使用，包括人和动物，可以经静脉注射或者口、鼻、皮肤、肺吸入等途径给药。上述药物的优选周剂量为0.1-5mg/kg体重，优选的疗程为10至30天。一次性给药，或分次给药。无论采用何种给药方法，个体人的最佳剂量应根据具体的治疗而定。
本发明通过基因克隆技术来合成一种RANKL-Fc融合蛋白，该融合蛋白中的RANKL部分是RANKL的胞外区域，通过激活细胞内ITIM的信息传导系统来抑制ITAM的信息传导，达到减少破骨细胞形成的目的。通过将RANKL-Fc融合蛋白的基因克隆到一个表达载体中，转化CHO细胞，筛选得到高表达的工程细胞株，通过细胞培养制备RANKL-Fc融合蛋白。CHO细胞表达的蛋白更具有天然的修饰和结构，利用CHO细胞表达的RANKL-Fc融合蛋白具有更高的生物活性。
图1RANKL-Fc与RANKL受体结合能力鉴定结果示意图。
图2RANKL-Fc与FcγRII受体结合能力鉴定结果示意图。
图3RANKL-Fc抑制破骨细胞形成实验结果示意图。
图4RANKL-Fc抑制破骨细胞生物学活性实验结果示意图。
具体实施例方式 下面用实施例对本发明作进一步阐述。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而非对本发明有任何限制。本领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施中所作的任何变动都将落在权利要求书的范围内。
实施例1融合蛋白RANKL-Fc的表达 RANKL-Fc融合蛋白的表达过程包括以下步骤合成基因；把基因插入表达载体，用表达载体转染CHO细胞；利用Hygromycin筛选表达RANKL-Fc融合蛋白CHO工程细胞株，培养该细胞株，最后从细胞培养液中分离纯化RANKL-Fc蛋白。具体包括 1)基因合成 委托基因合成的专业公司(上海生工生物工程技术服务有限公司)合成SEQ ID NO5所示的核苷酸序列，其中5-10是Nhe I的酶切位点；11-73是编码Igκ链分泌信号肽的核苷酸序列；74-823是编码人RANKL胞外区域的核苷酸序列，其编码的RANKL部分对应于SEQ ID NO1中的68-317；824-1522是编码人Ig G Fc片段的核苷酸序列；编码的蛋白对应于SEQ ID NO中的1-232。1523-1528是Xba I酶切位点。
2)表达载体的构建 从基因合成公司(上海生工生物工程技术服务有限公司)得到上述合成的基因后，用Nhe I和Xba I双酶切基因和载体pCDNA3.1(美国Invitrogen公司)，分别回收基因和载体的酶切片段，用T4连接酶将基因插入到载体中，构建表达载体pCDNA/RANKL-Fc。
3)CHO工程细胞株的建立 利用大肠杆菌扩增上述表达载体。抽提质粒后，用电转的方法把表达载体转入CHO-K1细胞中。将细胞培养与含有500mg/L的hygromycin(潮霉素)的10％FBS-DMEM培养基中，14天后，得到抗性细胞库。将细胞进行限定稀释并按每孔1个细胞的接种到20个96孔板上，最后得到50～200个单克隆。按表达量排序，取前20个克隆反复传代10代，比较10代培养中的蛋白表达量，其中有不少于5个克隆的蛋白表达量始终保持在5pg/cell/day以上。应用这些细胞株生产蛋白。
4)RANKL-Fc融合蛋白的生产 利用10％FBS-DMEM(INVITROGEN，CA)培养基，在37℃，5％CO2培养上述CHO工程细胞株15天，2000rpm离心后，收集上清，再用蛋白A亲和层析柱(PHARMACIA)分离纯化得到RANKL-Fc融合蛋白。
实施例2RANKL-Fc融合蛋白与RANK(RANKL受体)结合实验 利用磁珠分离技术，从人外周血中分离出单核细胞。将1×106单核细胞分别培养于MCSF和RANKL培养基72小时后与5微克实施例1中纯化的RAKL-Fc融合蛋白在4℃反应1小时，加入5微升FITC标记的抗人RANKL抗体(CALTAG，CA)，用流式细胞仪检测荧光标记细胞。结果如图1所示，表明实施例1中表达的融合蛋白RIG可与RANK结合，THP1细胞呈FITC阳性。图1中，SSC-H为细胞内颗粒数，FSC-H为细胞大小，FL2-H为PE，FL1-H为FITC。
实施例3RANKL-Fc融合蛋白与FcγRII受体结合实验 HMC-1是实施例1中传代筛选出的一株高表达细胞株，在细胞的表面表达有FcγRII。HMC-1细胞培养在含有10％的胎牛血清的DMEM培养基中。将1×106HMC-1细胞与5微克实施例1中纯化的RANKL-Fc融合蛋白在4℃反应1小时，加入5微升FITC标记的抗人IgG FITC标记抗体(CALTAG，CA)，用流式细胞仪检测细胞。结果如图2所示，表明实施例1中表达的融合蛋白RIG可与FcγRII受体结合，HMC-1细胞呈FITC阳性。图2中，SSC-H为细胞内颗粒数，FSC-H为细胞大小，FL2-H为PE，FL1-H为FITC。
实施例4RANKL-Fc融合蛋白抑制破骨细胞形成实验 利用抗CD14微球(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)从多发性骨髓瘤病人的骨髓或PBMC中分离出CD14+细胞。用含有50ng/ml RANKL和20ng/ml M-CSF的培养基培养细胞。三天后，将RAKL-Fc融合蛋白和对照试剂加入到培养基中，14天培养后，收获细胞并固定，进行TRAP染色分析(TRAP-staining kit；Sigma，St Louis，MO，USA)鉴定多核破骨细胞的数量，根据融合指数评价破骨细胞的频率。
如图3所示，本实施例证明RANKL-Fc融合蛋白可阻断RANKL介导破骨细胞形成，并存在剂量依赖性。
实施例5RANKL-Fc融合蛋白抑制破骨细胞的生物学活性 通过破骨细胞的骨吸收分析，进一步考察RANKL-Fc融合蛋白对破骨细胞的生物学活性的抑制作用。简要地，用无菌水和超声波清洗直径为6mm，厚度为150um的猛犸象长牙牙质薄片，然后，在70％的乙醇中消毒，紫外照射过夜。从正常人的PBMC或骨髓分离得到CD14+细胞，分别培养于MCSF和RANKL培养基的CD14+单核细胞(5×104)在上述牙质薄片上利用RIG融合蛋白刺激21天。为了考察骨吸收面积，首先使用蒸馏水洗去薄片上的分化细胞，然后对薄片脱水和风干。用Toluidine蓝染色，利用光学显微镜鉴别吸收坑和图象分析测量每个薄片上的腔隙性吸收面积。如图4所示，本实施例证明RANKL-Fc融合蛋白可抑制破骨细胞生物学活性。
实施例6RANKL140-317-Fc融合蛋白的制备及功能评价 利用实施例1的方法，制备融合蛋白RANKL140-317-L-Fc。该融合蛋白的RANKL的氨基酸序列对应于SEQ ID NO1中的140-317氨基酸残基，其编码核苷酸序列对应于SEQ ID NO3中的217-750。在RANKL140-317和Fc之间为连接肽，氨基酸序列为GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer，对应的编码核苷酸序列为GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGCGGT GGC GGA TCG。Fc的氨基酸序列对应于SEQ ID NO2中的16-232，其编码的核苷酸序列对应于SEQ ID NO4中的46-699。按实施例1的方法制备该融合蛋白RANKL140-317-L-Fc，并利用实施例2的方法评价该融合蛋白与RANK和FcγRII的结合(表1)，以及实施例3的方法评价该融合蛋白对破骨细胞分化的抑制作用(表2)，和实施例4的方法评价该融合蛋白对骨吸收的抑制作用(表3)。结果表明，融合蛋白RANKL140-317-L-Fc具有明显的抑制破骨头细胞分化和骨吸收的作用。
表1表达RANK的单核细胞和表达FcγRII的HMC-1细胞 对融合蛋白RANKL140-317-Fc的结合率(％)
实验结果为3次独立实验的平均值。
表2融合蛋白RANKL140-317-Fc对破骨细胞生成的抑制作用
*20个显微镜观察视野中的破骨细胞数量之和。
表3融合蛋白RANKL140-317-Fc对骨吸收的抑制作用
*20个显微镜观察视野中骨吸收点数量之和。
本实施例中的融合蛋白RANKL-Fc融合蛋白组成成份全部来源于人源(human)性免疫球蛋白和RANKL，因此，该蛋白作为一种药物进入人体，没有任何异体蛋白的免疫源性。RANKL-Fc融合蛋白可将RANKL和Fcγ交联在一起，从而诱发细胞内的抑制信号，抑制RANK-ITAM反应的发生。本发明的RANKL-Fc融合蛋白通过启动细胞内抑制信号传导系统ITIM，从而强有力地抑制了破骨细胞形成，将在骨质疏松和肿瘤引起的骨吸收的治疗中发挥重要作用。
序列表
<110>上海富莼科芯生物技术股份有限公司
<120>RANKL-Fc融合蛋白及其制备方法和用途
<130>090184
<160>5
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>317
<212>PRT
<213>人工合成
<400>1
Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Thr Lys Tyr Leu Arg Gly Ser Glu
1 5 10 15
Glu Met Gly Gly Gly Pro Gly Ala Pro His Glu Gly Pro Leu His Ala
20 25 30
Pro Pro Pro Pro Ala Pro His Gln Pro Pro Ala Ala Ser Arg Ser Met
35 40 45
Phe Val Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gln Val Val Cys Ser Val
50 55 60
Ala Leu Phe Phe Tyr Phe Arg Ala Gln Met Asp Pro Asn Arg Ile Ser
65 70 75 80
Glu Asp Gly Thr His Cys Ile Tyr Arg Ile Leu Arg Leu His Glu Asn
85 90 95
Ala Asp Phe Gln Asp Thr Thr Leu Glu Ser Gln Asp Thr Lys Leu Ile
100 105 110
Pro Asp Ser Cys Arg Arg Ile Lys Gln Ala Phe Gln Gly Ala Val Gln
115 120 125
Lys Glu Leu Gln His Ile Val Gly Ser Gln His Ile Arg Ala Glu Lys
130 135 140
Ala Met Val Asp Gly Ser Trp Leu Asp Leu Ala Lys Arg Ser Lys Leu
145 150 155 160
Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Thr Asp Ile Pro
165 170 175
Ser Gly Ser His Lys Val Ser Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly
180 185 190
Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Phe Ser Asn Gly Lys Leu Ile Val
195 200 205
Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His
210 215 220
His Glu Thr Ser Gly Asp Leu Ala Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Met Val
225 230 235 240
Tyr Val Thr Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Thr Leu Met
245 250 255
Lys Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe
260 265 270
Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ser Gly Glu Glu
275 280 285
Ile Ser Ile Glu Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp
290 295 300
Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Arg Asp Ile Asp
305 310 315
<210>2
<211>232
<212>PRT
<213>人工合成
<400>2
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
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130 135 140
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<212>DNA
<213>人工合成
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ttctatttca gagcgcagat ggatcctaat agaatatcag aagatggcac tcactgcatt60
tatagaattt tgagactcca tgaaaatgca gattttcaag acacaactct ggagagtcaa120
gatacaaaat taatacctga ttcatgtagg agaattaaac aggcctttca aggagctgtg180
caaaaggaat tacaacatat cgttggatca cagcacatca gagcagagaa agcgatggtg240
gatggctcat ggttagatct ggccaagagg agcaagctgg aagctcagcc ttttgctcat300
ctcactatta atgccaccga catcccatct ggttcccata aagtgagtct gtcctcttgg360
taccatgatc ggggttgggc caagatctcc aacatgactt ttagcaatgg aaaactaata420
gttaatcagg atggctttta ttacctgtat gccaacattt gctttcgaca tcatgaaact480
tcaggagacc tagctacaga gtatcttcaa ctaatggtgt acgtcactaa aaccagcatc540
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tctgaattcc atttttattc cataaacgtt ggtggatttt ttaagttacg gtctggagag660
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<211>699
<212>DNA
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<400>4
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ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc360
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatccagg420
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc480
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct540
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc600
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac660
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga 699
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caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt900
cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg960
cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg1020
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ctccctgtct ccgggtaaat gatctagagc tg 153权利要求
1.一种RANKL-Fc融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的结构形式为P1-P2或P1-L-P2，其中，P1是RANKL蛋白的胞外区域片段，P2为人Ig G的Fc蛋白，L为连接肽。
2.如权利要求1所述的RANKL-Fc融合蛋白，其特征在于，所述RANKL胞外区域片段选自如下序列
1)如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列；
2)从SEQ ID NO1中第68-188位之间任何一个氨基酸残基，包含第68和188位氨基酸残基，至SEQ ID NO1末端氨基酸残基所组成的氨基酸序列；
3)在2)所述氨基酸序列前加Asp形成的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的RANKL-Fc融合蛋白，其特征在于，所述连接肽的序列为(Gly4Ser)3。
4.如权利要求1所述的RANKL-Fc融合蛋白，其特征在于，所述人Ig G的Fc蛋白如SEQ ID NO2所示的蛋白序列，或SEQ ID NO2中第16位氨基酸残基Ala到最后一位氨基酸残基Lys。
5.一种融合基因RANCL-Fc，其特征在于，所述融合基因RANCL-Fc的序列如SEQ ID NO5所示。
6.权利要求1-4所述的RANKL-Fc融合蛋白的制备方法，包括如下步骤
a)将编码RANKL胞外区域片段的核苷酸序列和编码人Ig G的Fc的核苷酸序列连接于表达载体，得到RANKL-Fc融合蛋白的重组表达载体；
b)将步骤a)中的RANKL-Fc融合蛋白的重组表达载体转入宿主细胞，筛选获得表达RANKL-Fc融合蛋白的工程细胞株；
c)培养步骤b)获得的工程细胞株；
d)从步骤c)中的培养产物中分离RANKL-Fc融合蛋白。
7.如权利要求6所述的RANKL-Fc融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤a)中的表达载体为载体pCDNA3.1或载体pSecTag。
8.如权利要求6所述的RANKL-Fc融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤b)中的宿主细胞为CHO细胞。
9.权利要求1所述的RANKL-Fc融合蛋白作为破骨细胞形成及其生物学活性抑制剂的应用。
10.权利要求1所述RANKL-Fc融合蛋白在制备治疗骨吸收疾病药物上的应用。
11.如权利要求10所述的RANKL-Fc融合蛋白在制备治疗骨吸收疾病药物方面的应用，其特征在于，所述骨吸收类疾病选自骨质疏松症、佩吉特病、骨髓炎、血钙过多、与手术或服用类固醇相关的骨质减少、骨坏死、由类风湿关节炎引起的骨吸收、牙周骨吸收、溶骨性转移或与癌症相关的骨吸收类疾病。
全文摘要
本发明涉及一种RANKL-Fc融合蛋白及其制备方法和用途。RANKL-Fc融合蛋白具有P1-P2或P1-L-P2的结构形式，其中P1为RANKL蛋白的胞外区域片断；P2为人Ig G的Fc部分，L为连接肽。本发明提供的融合蛋白可用于制备治疗用于骨吸收疾病的药物。
文档编号A61K47/48GK101514232SQ20091004820
公开日2009年8月26日 申请日期2009年3月25日 优先权日2009年3月25日
发明者骏 包, 陈海明, 祝道成 申请人:上海富莼科芯生物技术股份有限公司