专利名称：鬼臼三氮唑类衍生物及在制备抗肿瘤抗病毒药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及鬼臼毒素类衍生物及用途，特别是涉及鬼臼三氮唑类衍生物及其在制备抗肿瘤抗病毒药物中的应用。
背景技术：
Sandoz制药公司的研究者分别在1966和1967年成功的合成出了依托泊苷(etoposide，VP-16)和替尼泊苷(teniposide，VM-26)，在1978年Sandoz公司获得了在英国生产依托泊苷和替泥泊苷的许可。它们已成为应用于临床的抗肿瘤代表药物，对霍吉金氏病、非霍吉金氏淋巴瘤、肺癌(包括小细胞和非小细胞肺癌)、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、睾丸癌、急性白血病以及恶性淋巴肿瘤等多种癌症均有良好的疗效。
近几年某些活性比依托泊苷和替尼泊苷更高的鬼臼毒素衍生物的发现引起人们对鬼臼毒素进行研究的浓厚兴趣。鬼臼毒素衍生物NK611、NPF、GL331、TOP53等作为抗肿瘤新药已进入临床研究。日本Nippon-Kayaku公司开发了NK611，它的抗癌活性与依托泊苷相似，但它有较好的水溶性和生物利用率，并且是一种更强的拓扑异构酶II抑制剂，对于多种癌症如肺癌、卵巢癌、乳腺癌、脑癌、白血病和颈部肿瘤等有更强的细胞毒性。GL331是由美国北卡罗莱纳大学Lee KH小组合成的，这个小组已经发表了大约两百篇的关于鬼臼衍生物的结构改造和抗癌活性方面的文章。印度的Bilal A.Bhat等人已运用点击化学方法成功合成了一系列的4-三氮唑鬼臼毒素类衍生物，但未见其在制备抗肿瘤和抗病毒药物方面的研究，并且近一年来未见进一步研究报导。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供鬼臼三氮唑类衍生物。
本发明的第二个目的在于提供鬼臼三氮唑类衍生物的无机酸盐或有机酸盐。
本发明的第三个目的在于提供鬼臼三氮唑类衍生物在制备抗肿瘤抗病毒药物中的应用。
本发明的第四个目的在于提供鬼臼三氮唑类衍生物的无机酸盐或有机酸盐在制备抗肿瘤抗病毒药物中的应用。
本发明的技术方案概述如下 鬼臼三氮唑类衍生物，如下述通式(I)
其中R1或R2相同或不相同； R1或R2选自氢、C3-C7的环烷基、C1-C6的烷基、取代的C1-C6的烷基、取代苯环或如通式(II)、通式(III)、通式(IV)所示；所述取代的C1-C6的烷基的取代基是氨基、羟基、氰基、卤素、取代苯环； 所述取代苯环上的取代基是氢、C1-C6的烷氧基、硝基、氨基、羟基、氰基、卤素、烷基部分具有C1-C18的烷氧羰基、烷基部分具有C1-C18碳原子的烷氧磺酰基、芳甲氧基；
所述通式(II)中X为O或N； R4表示氢、C1-C6的烷基、C3-C7的环烷基、苯环、取代苯环、吡咯环、取代吡咯环、呋喃环、取代呋喃环、噻吩、取代噻吩环、吡啶环、取代吡啶环、嘧啶环、取代嘧啶环、喹啉环或取代喹啉环；所述取代苯环、取代吡咯环、取代呋喃环、取代噻吩环、取代吡啶环、取代嘧啶环或取代喹啉环上的取代基是C1-C6的烷基、C3-C7的环烷基，C1-C6的烷氧基、C1-C6的烷磺酰氨基、硝基、氨基、羟基、氰基、卤素、烷基部分具有C1-C18的烷氧羰基、烷基部分具有C1-C18的烷氧磺酰基、芳甲氧基； 所述通式(III)
通式(III)中的R5、R6和R7相同或不同，R5、R6或R7选自氢、C1-C6的烷基、C3-C7的环烷基、C1-C6的烷氧基、C1-C6的烷磺酰氨基、硝基、氨基、羟基、氰基、卤素、C1-C6的烷氧羰基； 所述通式(IV)
其中n为0～6之1，Y为亚甲基、羰基或磺酰基，R8为氢、C1-C6的烷基或苯环，所述苯环可以被下列基团单一取代或多取代C1-C6的烷基、C3-C7的环烷基、C1-C6的烷氧羰基、C1-C6的烷磺酰基； R3表示羟基或C1-C6的烷氧基。
所述通式(I)化合物优选的是 4β-(2-吡啶基-1，2，3-三氮唑)-4-脱氧鬼臼毒素(ZS-26)； 4β-(4-乙氧基甲酰基-1，2，3-三氮唑)-4-脱氧鬼臼毒素(ZS-30)； 4β-(4-二乙胺甲酰基-1，2，3-三氮唑)-4-脱氧鬼臼毒素(ZS-34)； 4β-(4-邻氯苯胺甲酰基-1，2，3-三氮唑)-4-脱氧鬼臼毒素(ZS-41)； 4β-(4-苯胺甲基-1，2，3-三氮唑)-4-脱氧鬼臼毒素(ZS-51)； 4β-(4-甲基哌嗪甲酰基-1，2，3-三氮唑)-4-脱氧鬼臼毒素(ZS-55)； 5β-(4-N，N-二甲基乙二胺甲酰基-1，2，3-三氮唑)-4-脱氧鬼臼毒素(ZS-56)； 鬼臼三氮唑类衍生物的无机酸盐或有机酸盐。
鬼臼三氮唑类衍生物的无机酸盐优选为盐酸盐、硫酸盐或磷酸盐。
鬼臼三氮唑类衍生物的有机酸盐优选为乙酸盐、乳酸盐、丙二酸盐、马来酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、甲磺酸盐、三氟乙酸盐、琥珀酸盐、烟酸盐或对甲苯磺酸盐。
鬼臼三氮唑类衍生物在制备抗肿瘤抗病毒药物中的应用。
鬼臼三氮唑类衍生物的无机酸盐或有机酸盐在制备抗肿瘤抗病毒药物中的应用。
本发明的鬼臼三氮唑类衍生物或鬼臼三氮唑类衍生物的有机盐或鬼臼三氮唑类衍生物的无机盐，与药学上可接受的载体或稀释剂或赋形剂组成组合物，按常规技术，可以制成片剂、胶囊剂、针剂、栓剂、贴剂、可吸入的粉末制剂、混悬剂、乳膏剂和软膏剂。
本发明的优点 本发明首次提供了结构新颖的鬼臼三氮唑类衍生物；并首次研发了其在抗肿瘤和抗病毒活性；首次研发了该类化合物相关制剂在抗肿瘤和抗病毒方面的应用。
图1为ZS-26的1H-NMR图谱； 图2为ZS-28的1H-NMR图谱； 图3为ZS-29的1H-NMR图谱； 图4为ZS-30的1H-NMR图谱； 图5为ZS-31的1H-NMR图谱； 图6为ZS-34的MS图谱； 图7为ZS-40的1H-NMR图谱； 图8为ZS-41的1H-NMR图谱； 图9为ZS-42的MS图谱； 图10为ZS-44的1H-NMR图谱； 图11为ZS-45的MS图谱； 图12为ZS-46的1H-NMR图谱； 图13为ZS-47的MS图谱； 图14为ZS-51的1H-NMR图谱； 图15为ZS-53的1H-NMR图谱。
具体实施例方式 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
本发明鬼臼三氮唑类衍生物的制备方法记载于下列反应方案的步骤中，所有这些化合物可以按照记载的方法制备或者按照类似方法制备。
方案一 合成通式
第1步 将鬼臼毒素或者4′-R3取代鬼臼毒素(1摩尔当量)溶解于无水质子溶剂、非质子性极性溶剂或非极性有机溶剂中，(溶剂可以选异丙醇、四氢呋喃、二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二氧六环、甲苯或二氯甲烷)小心加入叠氮钠(4摩尔当量)搅拌，1.5摩尔当量的三氟乙酸溶于适量上述溶剂如无水二氯甲烷中，冰浴下缓慢滴加至反应液中，滴加完毕后，撤冰浴，搅拌过夜，温度为0-65℃(优选30-80℃、更优选50-65℃)反应完成后，将反应液过滤，滤液用饱和氯化钠溶液洗涤分出有机层，水层用乙酸乙酯(5mL×3)萃取，合并有机相减压蒸干，得到泡状白色产物经重结晶、蒸馏或者用硅胶或氧化铝柱色谱或快速柱色谱纯化得到4-叠氮鬼臼毒素，石油醚∶乙酸乙酯(5∶2，体积比)展开，收率65-95％。
第2步 将4-叠氮鬼臼(1摩尔当量)，R1或者R2取代的炔类化合物(1摩尔当量)，加入适量无水质子溶剂、非质子性极性溶剂或非极性有机溶剂中，(溶剂举例异丙醇、四氢呋喃、二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二氧六环、甲苯或二氯甲烷)，加热回流搅拌8.5小时，反应的发生温度为60-120℃(优选80-90℃、更优选85-90℃。)反应完成后，将反应液过滤，滤液用饱和氯化钠溶液洗涤分出有机层，水层用乙酸乙酯(5mL×3)萃取，合并有机相减压蒸干。得到泡状白色产物经重结晶、蒸馏或者用硅胶或氧化铝柱色谱纯化得到4-(5-R1-1，2，3-三氮唑)-4-脱氧鬼臼毒素和4-(4-R2-1，2，3-三氮唑)-4-脱氧鬼臼毒素，所用的洗脱剂例如丙酮∶乙醚＝1∶1(体积/体积)比例混合的混合液或者乙酸乙酯∶石油醚＝3∶2(体积/体积)比例混合的混合液。
实施例1 按照方案一中的通法，合成下面化合物 4β-(5-乙氧基甲酰基-1，2，3-三氮唑)-4-脱氧鬼臼毒素(zs-31) 第1步 制备中间体4-叠氮鬼臼 鬼臼毒素(413mg，1mmol)溶于10mL无水二氯甲烷中，小心加入叠氮钠(260mg，4mmol)搅拌，2mL三氟乙酸溶于2mL无水二氯甲烷中，冰浴下缓慢滴加至反应液中，滴加完毕撤冰浴，室温下搅拌过夜；过滤，滤液用饱和氯化钠溶液洗涤分出有机层，水层用乙酸乙酯(5mL×3)萃取，合并有机相减压蒸干。薄层色谱分离，石油醚∶乙酸乙酯(1∶1，体积比)展开，产物浅黄色粉末0.388g，收率88.4％。
MSm/z 439.92(M+H) 第2步 合成4β-(5-乙氧基甲酰基-1，2，3-三氮唑)-4-脱氧鬼臼毒素 4-叠氮鬼臼(878mg，2mmol)，丙炔酸乙酯(200mg，2mmol)，加入10mL无水乙醇中，加热回流搅拌8.5小时；减压蒸干。薄层色谱分离，石油醚∶乙酸乙酯(1∶1，体积比)展开，产物白色粉末226mg，收率21.0％。
MSm/z 538.02 方案二 合成通式
第1步 将鬼臼毒素或者4′-R3取代鬼臼毒素(1摩尔当量)溶解于无水质子溶剂、非质子性极性溶剂或非极性有机溶剂中，所述的溶剂举例异丙醇、四氢呋喃、二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二氧六环、甲苯或二氯甲烷。小心加入叠氮钠(4摩尔当量)搅拌，1.5摩尔当量的三氟乙酸溶于适量上述溶剂如无水二氯甲烷中，冰浴下缓慢滴加至反应液中，滴加完毕后，撤冰浴，搅拌过夜，并维持温度为0-65℃、优选30-80℃、更优选50-65℃。；反应完成后，将反应液过滤，滤液用饱和氯化钠溶液洗涤分出有机层，水层用乙酸乙酯(5mL×3)萃取，合并有机相减压蒸干。得到泡状白色产物经重结晶、蒸馏或者用硅胶或氧化铝柱色谱或快速柱色谱纯化得到4-叠氮鬼臼毒素类化合物，石油醚∶乙酸乙酯(5∶2，体积比)展开，收率88.6％。
第2步 将4-叠氮鬼臼(1摩尔当量)，R1或者R2取代的胺类化合物(1摩尔当量)、溴丙炔、催化量的CuI，加入适量无水质子溶剂、非质子性极性溶剂或非极性有机溶剂中，所述的溶剂举例甲醇、异丙醇、四氢呋喃、二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二氧六环、甲苯或二氯甲烷或上述溶剂的混合液中，室温搅拌搅拌24小时，反应的发生温度为0-25℃、优选15-25℃、更优选20-25℃。反应完成后，将反应液过滤，蒸除滤液中的有机溶剂，用乙酸乙酯萃取、饱和氯化钠溶液洗涤，分出有机层，水层用乙酸乙酯(5mL×3)萃取，合并有机相减压蒸干。经重结晶、蒸馏或者用硅胶或氧化铝柱色谱或快速柱色谱纯化得到4-4-(R1-氨甲基)-1，2，3-三氮唑-4-脱氧鬼臼毒素，所用的洗脱剂例如乙酸乙酯∶二氯甲烷＝2∶1(体积/体积)比例混合的混合液或者乙酸乙酯∶石油醚＝3∶2(体积/体积)比例混合的混合液。
实施例2按照方案二中的通法，合成下面化合物 4β-(4-对甲苯氨甲酰基-1，2，3-三氮唑)-4-脱氧鬼臼毒素 第1步 制备中间体4-取代叠氮鬼臼毒素 鬼臼毒素(413mg，1mmol)溶于10mL无水二氯甲烷中，小心加入叠氮钠(260mg，4mmol)搅拌，2mL三氟乙酸溶于2mL无水二氯甲烷中，冰浴下缓慢滴加至反应液中，滴加完毕撤冰浴，室温下搅拌过夜；过滤，滤液用饱和氯化钠溶液洗涤分出有机层，水层用乙酸乙酯(5mL×3)萃取，合并有机相减压蒸干。薄层色谱分离，石油醚∶乙酸乙酯(1∶1，体积比)展开，产物浅黄色粉末0.388g，收率88.4％。
MSm/z 439.92(M+H) 第2步 合成4β-(4-对甲苯胺甲基-1，2，3-三氮唑)-4-脱氧鬼臼毒素 4β-叠氮鬼臼(878mg，2mmol)，对甲苯胺(214mg，2mmol)，溴丙炔(238mg，2mmol)加入10mL N，N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌24小时；减压蒸干。洗涤萃取，薄层色谱分离，石油醚∶乙酸乙酯(1∶2，体积比)展开，产物白色粉末226mg，收率21.0％。
MSm/z 584.23 按照方案一、方案二合成的4-三氮唑鬼臼类衍生物的结构如通式一，通式1中R1、R2、R3的取代基如表1所示 表1 4β-鬼臼三氮唑类衍生物结构及物理性质表
抗病毒活性 1抗MDCK细胞细胞毒性试验MDCK细胞分别以每毫升4×105个接种于96孔培养板中，37℃、5％CO2培养24h，分别加入鬼臼三氮唑类衍生物阳性对照化合物利巴韦林，每浓度接种3孔，每孔100μl。同时设正常细胞对照。置37℃、5％CO2培养5～7d。每隔24h在倒置显微镜下观察并记录细胞形态变化。用Reed-Muench法计算药物半数中毒浓度(TD50)和最大无毒浓度(TD0)。
2在MDCK细胞细胞培养内对A3病毒毒力的测定在MDCK细胞培养内对A3病毒毒力的测定MD(MDCK细胞以每毫升4×10个接种于96孔培养板中，37℃、5％CO2培养24h。在MDCK细胞中加入A3病毒，10倍稀释成1×10-1×10-4共4个浓度，每个浓度设置3孔，每孔100μL同时设正常细胞对照。33℃5％CO2培养5～7d。每隔24h在倒置显微镜下观察并记录细胞形态变化。用Reed-Muench法计算病毒半数感染浓度(TCID50)。
3在MDCK细胞培养内对A3的抑制试验 MDCK细胞分别以每毫升4×105个接种于96孔培养板中，37℃培养24～48h至细胞单层，弃去培养液，分别加入体积比为1∶30的A3病毒液(每孔100L，33℃吸附3h)，弃去病毒液。分别加入对细胞的最大无毒浓度(TD0)的鬼臼三氮唑类衍生物和利巴韦林溶液，二倍稀释7个浓度，每浓度设3孔，每孔100μLo阳性对照利巴韦林选用对细胞的最大无毒浓度(TD0)，二倍稀释7个浓度，每浓度设3孔，每孔100μL。同时设病毒对照和正常细胞对照，37℃、5％CO2培养5～7d，每隔24h在倒置显微镜下观察病毒细胞形态变化，至病毒对照细胞病变出现50％～100％的细胞形态变化时结束试验。试验重复3次，计算化合物半数有效浓度(IC50)测定结果见表2。
表2 4β-鬼臼三氮唑类衍生物对感染A3的抑制作用(μg/ml) 抗肿瘤活性测试 体外抗肿瘤活性筛选将对数生长期细胞稀释成1×104cell/ml，立即接种于96孔培养板，0.1ml/孔，然后在实验孔中加入含不同浓度4β-三氮唑鬼臼毒素的培养基，每浓度平行三孔，对照组加等体积溶剂，置37℃CO2培养箱培养96，然后离心(1000r/min，20min)，弃上清液，每孔加0.2ml新鲜配置的0.2mg/ml MTT的无血清培养基，37℃继续培养4h，再离心，倾出血清后，0.2ml DMSO溶解MTT甲簪沉淀，用微型超声震荡器震荡5min混匀，在MR700型酶标仪上测定570nm处的光密度，并计算抑制肿瘤细胞生长率。
表3 4β--鬼臼三氮唑类衍生物对Hela、KB肿瘤细胞的抑制作用(×10-6mol/L) 药理测试已证明本发明所涉及的化合物具有抗肿瘤、抗病毒方面的活性。
权利要求
1.鬼臼三氮唑类衍生物，如下述通式(I)
其中R1或R2相同或不相同；
R1或R2选自氢、C3-C7的环烷基、C1-C6的烷基、取代的C1-C6的烷基、取代苯环或如通式(II)、通式(III)、通式(IV)所示；所述取代的C1-C6的烷基的取代基是氨基、羟基、氰基、卤素、取代苯环；
所述取代苯环上的取代基是氢、C1-C6的烷氧基、硝基、氨基、羟基、氰基、卤素、烷基部分具有C1-C18的烷氧羰基、烷基部分具有C1-C18碳原子的烷氧磺酰基、芳甲氧基；
所述通式(II)中X为O或N；
R4表示氢、C1-C6的烷基、C3-C7的环烷基、苯环、取代苯环、吡咯环、取代吡咯环、呋喃环、取代呋喃环、噻吩、取代噻吩环、吡啶环、取代吡啶环、嘧啶环、取代嘧啶环、喹啉环或取代喹啉环；所述取代苯环、取代吡咯环、取代呋喃环、取代噻吩环、取代吡啶环、取代嘧啶环或取代喹啉环上的取代基是C1-C6的烷基、C3-C7的环烷基，C1-C6的烷氧基、C1-C6的烷磺酰氨基、硝基、氨基、羟基、氰基、卤素、烷基部分具有C1-C18的烷氧羰基、烷基部分具有C1-C18的烷氧磺酰基、芳甲氧基；
所述通式(III)
通式(III)中的R5、R6和R7相同或不同，R5、R6或R7选自氢、C1-C6的烷基、C3-C7的环烷基、C1-C6的烷氧基、C1-C6的烷磺酰氨基、硝基、氨基、羟基、氰基、卤素、C1-C6的烷氧羰基；
所述通式(IV)
其中n为0～6之1，Y为亚甲基、羰基或磺酰基，R8为氢、C1-C6的烷基或苯环，所述苯环可以被下列基团单一取代或多取代C1-C6的烷基、C3-C7的环烷基、C1-C6的烷氧羰基、C1-C6的烷磺酰基；
R3表示羟基或C1-C6的烷氧基。
2.根据权利要求1所述的鬼臼三氮唑类衍生物，其特征是所述通式(I)化合物为
4β-(2-吡啶基-1，2，3-三氮唑)-4-脱氧鬼臼毒素；
4β-(4-乙氧基甲酰基-1，2，3-三氮唑)-4-脱氧鬼臼毒素；
4β-(4-二乙胺甲酰基-1，2，3-三氮唑)-4-脱氧鬼臼毒素；
4β-(4-邻氯苯胺甲酰基-1，2，3-三氮唑)-4-脱氧鬼臼毒素；
4β-(4-苯胺甲基-1，2，3-三氮唑)-4-脱氧鬼臼毒素；
4β-(4-甲基哌嗪甲酰基-1，2，3-三氮唑)-4-脱氧鬼臼毒素；
5β-(4-N，N-二甲基乙二胺甲酰基-1，2，3-三氮唑)-4-脱氧鬼臼毒素；
3.权利要求1或权利要求2的鬼臼三氮唑类衍生物的无机酸盐或有机酸盐。
4.根据权利要求3所述的鬼臼三氮唑类衍生物的无机酸盐为盐酸盐、硫酸盐或磷酸盐。
5.根据权利要求3所述的鬼臼三氮唑类衍生物的有机酸盐为乙酸盐、乳酸盐、丙二酸盐、马来酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、甲磺酸盐、三氟乙酸盐、琥珀酸盐、烟酸盐或对甲苯磺酸盐。
6.权利要求1的鬼臼三氮唑类衍生物在制备抗肿瘤抗病毒药物中的应用。
7.权利要求3的鬼臼三氮唑类衍生物的无机酸盐或有机酸盐在制备抗肿瘤抗病毒药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了鬼臼三氮唑类衍生物及在制备抗肿瘤抗病毒药物中的应用，鬼臼三氮唑类衍生物，如所述通式(I)。本发明的鬼臼三氮唑类衍生物具有抗肿瘤和抗病毒活性。
文档编号A61K31/4427GK101602769SQ20091006981
公开日2009年12月16日 申请日期2009年7月21日 优先权日2009年7月21日
发明者虹 陈, 松 左, 明 赵, 奕 郑, 陆艳玲, 敏 冯, 波 曹, 元 张, 吕晶晶, 白淑芳 申请人:中国人民武装警察部队医学院