专利名称：一种用于血友病b基因治疗的腺病毒载体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种腺病毒载体，尤其是一种可以环化后整合入宿主基因组的用于治 疗血友病B的腺病毒载体及其用途。
背景技术：
血友病B是X性染色体连锁的遗传性出血性疾病，其病因为凝血因子IX(FIX)基 因缺陷所致，主要临床表现为反复的自发性软组织及大关节出血，反复的关节出血可导致 退行性血友病关节病，严重的可以致畸致残，血友病B患者出血的严重程度与循环中FIX的 水平相关。目前预防性因子替代疗法已经大大降低了出血发生的频率以及血友病性关节疾 病的发生，并提高了血友病患者的生存期和生活质量，但是患者仍存在致命性出血和慢性 关节损伤的风险。此外纯化FIX价格昂贵，在发展中国家绝大多数患者不可能实施终生的 预防性治疗。尽管重组FIX因子可以使患者免于输注血浆浓缩FIX导致的传染性疾病，但 大多数发展中国家的患者仍使用血浆来源的FIX，仍然有感染传染性疾病的风险。然而血友病B本身的特点为基因治疗提供了非常有利的条件①其临床表现完全 是因单一特异的基因产物FIX缺乏造成的，FIX以微量在血浆中循环；②FIX基因编码序列 相对较短(约1. 5kb)，这使其容易包装并易于载体转染到靶细胞；③FIX半衰期相对较长 (大约20小时)；④功能性的FIX表达不需要特定的组织器官；⑤最重要的是，血浆FIX水 平不需要严格的调控，其血浆水平的轻度升高(生理水平的5%)即可显著改善患者的出 血症状。所以，基因治疗作为血友病B的治疗手段前景十分看好。目前血友病B的基因治 疗主要使用病毒或非病毒载体把hFIX (human FIX)基因转染到靶细胞。病毒载体包括腺病 毒、腺相关病毒和逆转录病毒。腺病毒载体是在基因治疗、基因免疫等方面应用开发得较早 的一种基因载体，在美国近三分之一的基因治疗临床试验中采用腺病毒载体。腺病毒载体 的容量大，安全性高，在体外稳定，易于制备与纯化，既可感染分裂细胞，又可感染非分裂细 胞并以较高水平表达外源基因。腺病毒载体的不足之处在不能整合到宿主染色体上，所以 不能持续表达所需产物，表达时间短暂，需重复给予载体制剂治疗，但这样又能刺激免疫反 应，使反复治疗的效果会逐渐降低。腺相关病毒为基础构建基因转移载体的优点是安全稳 定，感染宿主细胞广泛并能特异整合于人的第19号染色体长臂末端，减少了插入突变的可 能性，但是它难以大量生产，复制需要辅助病毒，并且包装外源基因的能力有限，小于5kb， 因此腺相关病毒的利用受到一定限制。逆转录病毒载体能使外源基因完全整合到宿主细胞 染色体上，但也有明显的不足，主要表现在以下几个方面1)不能感染非分裂的细胞；2)可 能产生具有复制能力的病毒；3)由于是随机整合，可能会引起“插入诱变”，诱导肿瘤的发 生。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对单纯腺病毒的短效性，逆转录病毒的不安全 性，腺相关病毒的包装复杂性，提供一种定点整合入宿主基因组的安全的用于血友病B基因治疗的腺病毒载体及其用途。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种用于血友病B基因治疗 的腺病毒载体，该载体能同时表达hFIX与红色荧光蛋白；在hFIX与红色荧光蛋白串联基因 表达框两侧各有一个方向相同的Cre整合酶作用位点Ioxp位点，在表达框内部有位点特异 性整合酶PhiC31的作用位点attB。在其中一个Loxp位点与目的基因启动子之间存在一个attB位点，使其能在 Phic31整合酶存在的情况被整合到宿主基因组中。所述目的基因表达框5，端的Ioxp与attB相邻，形成Ioxpattb片段。能表达红色荧光蛋白，能作为腺病毒包装时的示踪蛋白，并且与传统绿色荧光蛋 白的腺病毒载体相区分，当两种腺病毒共同作用与宿主细胞能进行区分与示踪。能表达人凝血因子FIX。所述的腺病毒载体或其体外包装的腺病毒颗粒在治疗血友病B药物中的应用。本发明的有益效果得到由红色荧光蛋白标记的DNA可以环化的重组腺病毒载 体，并为该载体进一步经由attb序列整合入宿主基因组中发挥持久治疗血友病B打下基 石出。
图1载体A中的Ioxp序列。图 2 载体 C 经 BamHI 和 BstXI 双酶切鉴定(1 :DL2000Marker ；2 载体 C BamHI+BstXI)。图3载体E中Ioxpattb片段测序图。图4载体Bgl II和SacI凝胶电泳分析(1 :DL2000marker ；2载体B Bglll+BamHI)。图 5 含有 loxpattb-CMV-hFIX-PA-CMV-DsRed-PA-loxp 的穿梭质粒载体 E 经 Sal I 与 Not I 双酶切鉴定(1 载体 E Sal I+Not I 2 λ HindIIImarker)。图6穿梭质粒载体E中各主要部分的PCR鉴定(1 :DL2000marker ；2 =DsRed产物； 3 =PA-CMV 产物；4 :hFIX 产物)。图7穿梭质粒载体E的构建示意图。图8pAd-attb-hFIX_DsRed(Ioxp)的凝胶电泳分析(1、2 两个克隆的Pac I酶切 产物；3 λ HindIII marker)。图 9pAd-attb-hFIX_DsRed (Ioxp)中主要组分的 PCR 鉴定(1 :DsRed 产物；2 PA-CMV 产物；3 :hFIX 产物；4 :DL2000marker)。图 10pAd-attb-hFIX-DsRed (Ioxp)体外转染 293A 后 24h,用 trizol 一步法 提取RNA，逆转录，用PCR的方法对hFIX的基因表达进行鉴定(1 以水代替模板阴性 对照；2 转染 pAdtrack 的 293A ；3 转染 pAd-attb-hFIX-DsRed (Ioxp)的 293A ；4 以 pAd-attb-hFIX-DsRed(Ioxp)质粒为模板的阳性对照；5 :DL2000marker)。
具体实施例方式本发明用于血友病B基因治疗的腺病毒载体，该载体能同时表达hFIX与红色荧光 蛋白；在hFIX与红色荧光蛋白串联基因表达框两侧各有一个方向相同的Cre整合酶作用位点Ioxp位点，在表达框内部有位点特异性整合酶PhiC31的作用位点attB。在其中一个Loxp位点与目的基因启动子之间存在一个attB位点，使其能在 Phic31整合酶存在的情况被整合到宿主基因组中。所述目的基因表达框5，端的Ioxp与attB相邻，形成Ioxpattb片段。能表达红色荧光蛋白，能作为腺病毒包装时的示踪蛋白，并且与传统绿色荧光蛋 白的腺病毒载体相区分，当两种腺病毒共同作用与宿主细胞能进行区分与示踪。能表达人凝血因子FIX。所述的腺病毒载体或其体外包装的腺病毒颗粒在治疗血友病B药物中的应用。本发明通过一系列的载体构建过程，提供一种由红色荧光蛋白为标记物，表达人 凝血因子IX的腺病毒载体，表达框两侧存在可以被重组酶Cre环化的两个方向相同的Ioxp 位点，内部加入一个可以被位点特异性整合酶phiC31识别的attB位点。(1)用重叠PCR的方法，从pIRES2-EGFP载体中扩增出加A尾信号PA，在其3’端引 入一个Ioxp序列，并插入载体pShuttle中，酶切位点为KpnI和NotI，其中PA是加polyA 尾的信号，形成载体A ；(2)从h FIX-pIRES2-EGFP中扩增出启动子CMV，插入该载体原启动子与h FIX编 码序列之间的Bgl II与Sac I位点，CMV是最常用的基因启动子，形成载体B; (3)改造pIRES2-EGFP载体，用PA-CMV替代IRES2序列，酶切位点为BamHI和 BstXI，新载体命名为载体C;(4)从pDsRed2-Cl中克隆出红色荧光蛋白编码序列，替换载体A中的绿色荧光蛋 白编码序列，酶切位点为NotI，构成载体D ；(5)以载体A为模板，利用重叠PCR的方法，扩增出Loxp序列，并在其后面加入 attb 序列，形成 Ioxpattb 片段 ATA ACT TCG TAT AGC ATA CATTAT ACG AAG TTA TGG TGC CAG GGC GTG CCC TTG GGC TCC CCG GGC GCG插入到载体D 的 AseI 与 Bgl II 位点，形成载 体E ；(6)载体B经由Bgl II与BamH双酶切，切下其中的CMV-hFIX片段，连入载体E中 的Bgl II与BamH两酶切位点之间，新载体命名为载体F ；(7)载体F 经由 Sal I 和 Not I 双酶切，切下 loxpattb-CMV-hFIX-PA-CMV-DsRed， 连入载体A的相应酶切位点中，最终构成载体G，该载体成为一个有红色荧光蛋白标记的， 可以表达hFIX的腺病毒载体系统的穿梭载体，此二蛋白表达框两端由方向相同的Ioxp环 绕，其中还包含attb位点；(8)将载体G与骨架载体共转染至BJ5183细菌内，通过细菌内同源重组得到重组 载体。(9)该重组腺病毒载体体外转染293A后，在荧光显微镜下可见表达红色荧光蛋白 的细胞，用hFIX的特异检测引物，经逆转录PCR的方法可以检测出hFIX的表达。下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细说明一、一个Ioxp位点的引入Loxp 是一个 34bp 的序列，为 ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT。我们利用 重叠PCR的方法，将该序列引入加A尾信号的3’端，形成PA-Ioxp片段，插入腺病毒穿梭质 粒pShuttle中，得到载体A。具体方法如下
1、利用重叠PCR的方法扩增出PA-Ioxp片段。引物序列为PAloxp 1 =ATT gCg gCC gCg ACT CTA gAT CAT AAT C, PAloxp2 :TAA TgT ATg CTA TACgAA gTT ATT TAA gAT ACA TTg ATg AgT Τ, PAloxp3 :CAC ggT ACC ATA ACTTCg TAT AAT gTA TgC TAT ACg AAg TT0 划线部分分别为NotI和KpnI的酶切位点。反应条件以载体PIRES2-EGFP为模板，以上述 PAloxpl和ΡΑ1οχρ2为引物，进行第一次PCR反应，扩增出PA序列。采用IOOyL体系，具体
如下IOXPCR Buffer (含 Mg2+L 5mM) 10 μ L4 X dNTP (1 OmM/mL)8 μ LPAloxpl4μ LΡΑ1οχρ24 μ L模板4 μ LPyrobest DNA 聚合酶0· 6 μ L_灭菌去离子水补足到100 μ L反应条件为94°C变性 5minute ；94°C变性 30seconds，60°C退火 30seconds, 72°C延 伸Iminute ；72°C延伸7minute，共25个循环。PCR产物用Takara的小片段DNA回收试剂 盒回收后，用此回收产物作为模板，用PAloxpl和ΡΑ1οχρ3引物再次扩增，方法同上，得到的 PCR产物再次胶回收即为PAloxp片段。2、将片段PAloxp插入pShuttle，形成载体A。pShuttle载体为本室保存。将 PShuttle载体及上述PAloxp片段分别用NotI和KpnI双酶切，分别胶回收后用Takara T4 连接酶进行连接反应，连接反应按试剂盒要求进行。取连接产物5ul，转化以氯化钙方法制 备的大肠杆菌(DH5 α)感受态，将感受态细菌涂布于含有卡那霉素的固体LB平板上。12小 时后挑取单菌落并送测序公司测序鉴定。测序结果及酶切鉴定(见图1)均证实，34bp的 Ioxp及PA序列被成功的引入了 pShuttle载体。二、含Ioxpattb序列载体的构建1、可独立表达红色荧光蛋白的载体的构建首先，利用PCR的方法，以 pAdtrack-CMV (本室保存)为模板，将PAPCMV序列克隆到载体pIRES2_EGFP中，替换其中的 IRES2片段。引物分别为PAPCMV1 =ATA rrATCC Tgg AgT TCg TgA CCg CC gCCg g,PAPCMV2 ATA ￡^_Ig^JI^JggCCggTAgCgCTAgCggATCTg，划线部分分别为 BamHI 和 BstXI 的酶切位 点。将回收后的PCR产物及pIRES2-EGFP载体分别用BamHI和BstXI双酶切，分别胶回收 后用Takara T4连接酶进行连接反应，连接反应按试剂盒要求进行。取连接产物5ul，转化 以氯化钙方法制备的大肠杆菌(DH5ci)感受态，将感受态细菌涂布于含有卡那霉素的固体 LB平板上。12小时后挑取单菌落并送测序公司测序鉴定。测序结果及酶切鉴定(见图2) 均证实载体构建成功，如前所述，此载体命名为载体C。然后，将该载体中绿色荧光蛋白编 码部分替换为红色荧光蛋白编码序列。克隆引物分别为DsRedl =CgC CAC CATggC CTC CTC CgA gAA C，DsRed2 =ATA rCr rCC rCC TAC Agg AAC Agg TggTgg Cgg，下划线部分为 NotI 的酶切位点，模板为pDsRed2-Cl (本室保存)。PCR产物经胶回收后经NotI单酶切，回收后 备用。载体C先经BstXI单酶切，回收后用Takara公司的T4DNA聚合酶按说明书要求将粘 末端削平，在经NotI但酶切，回收后与上述处理的DsRed片段进行连接。取连接产物5ul，转化以氯化钙方法制备的大肠杆菌(DH5ci)感受态，将感受态细菌涂布于含有卡那霉素的 固体LB平板上。12小时后挑取单菌落并送测序公司测序鉴定。测序结果证实载体D构建 成功。2、Ioxpattb的合成并插入载体利用重叠PCR的方法合成Ioxpattb片段。引物 序列为 loxpattbl =CgC ATT AAT gTC gAC gTC CAA ACT CAT CAATgT ATC Τ, loxpattb2 Mg ggC ACg CCC Tgg CAC CAT AAC TTC gTA TAATgT ATg C, loxpattb3 :ACA AgA TCT CgC gCC Cgg ggA gCC CAA ggg CACgCC CTg gCA CC0 划线部分分别为 Asel，Sail 和 BglII 的 酶切位点。反应条件以载体A为模板，以上述loxpattbl和loXpattb2为引物，进行第 一次PCR反应，扩增出Ioxp及部分attb序列。反应条件为94°C变性5minute ；94°C变性 30seconds，60°C退火 30seconds，72°C延伸 Iminute ；72°C延伸 7minute，共 25 个循环。PCR 产物用Takara的小片段DNA回收试剂盒回收后，用此回收产物作为模板，用loxpattbl和 loxpattb3引物再次扩增，方法同上，得到的PCR产物再次胶回收即为Ioxpattb片段ATA ACTTCG TAT AGC ATA CAT TAT ACG AAG TTA TGG TGC CAG GGC GTG CCC TTG GGC TCC CCG GGCGCG0载体D与Ioxpattb分别用AseI与Bgl II双酶切，分别胶回收后用TakaraT4连 接酶进行连接反应。取连接产物5ul，转化以氯化钙方法制备的大肠杆菌(DH5ci)感受态， 将感受态细菌涂布于含有卡那霉素的固体LB平板上。12小时后挑取单菌落并送测序公司 测序鉴定。测序结果(见图3)证实，Ioxpattb片段成功插入载体D，并替换多克隆位点前 的CMV启动子形成载体E。三、穿梭腺病毒载体的构建1、CMV驱动的hFIX编码序列的引入。为了将CMV驱动的hFIX编码序列加入载体 E的Bgl II和BamHI两酶切位点之间，我们先将带有Bgl II酶切位点的CMV启动子序列插 到 hFIX-pIRES2-EGFP (本室构建)hFIX 之前。克隆 CMV 的引物为 CMVl =ACg ArA TCT CgA CTC gAg TAg TTA TTA ATA gTA ATCAAT TAC g, CMV2 :ACC rAr CTC ggA TCT gAC ggT TCA CTA AAC CAg C，划线部分为Bgl II和SacI酶切位点。扩增片段与载体hFIX_pIRES2_EGFP 分别用Bgl II和SacI双酶切，纯化后连接。取连接产物5ul，转化以氯化钙方法制备的大 肠杆菌(DH5 α)感受态，将感受态细菌涂布于含有卡那霉素的固体LB平板上。12小时后挑 取单菌落用上述两种酶切鉴定(见图4)，载体B构建成功。载体B经Bgl II及BamHI双酶 切，切下CMV-hFIX片段，与载体E相应酶切后的载体片段连接，转化，筛选，挑取单克隆进行 酶切鉴定，证明载体F构建成功。2、载体F与上述插入PA-Ioxp的腺病毒穿梭载体A分别用Sal I与NotI双酶切， 将载体F中的loxpattb-CMV-hFIX-PA-CMV-DsRed切下，连入载体A片段中，连接，转化，筛 选，挑取单克隆，提取质粒用Sal I与Not I双酶切鉴定及PCR鉴定(见图5及图6)证实 载体G既为目的穿梭质粒，构建成功，示意图见图7，可下一步重组构建腺病毒载体。四、重组腺病毒载体的构建1、载体G质粒经PmeI酶线性化载体G2 μ gPmeIIUIOXNEB buffer4 5μ L100 X BSA0. 5 μ L
_补足去离子水至总体积50 μ L，37°C水浴4小时，95度水浴10分钟，Takara胶回 收试剂盒纯化回收。2、线性化质粒的去磷酸化线性化的载体GIUg10XCIAP buffer 5μ LCTAPIU_补足去离子水至总体积50 μ L，37°C水浴4小时，65度水浴30分钟灭活CIAP，博大
泰克小量胶回收试剂盒浓缩回收。3、BJ5183 pAdEasier_l氯化钙法感受态细胞的制备E. coli BJ5183甘油菌复苏，常规氯化钙方法制备BJ5183感受态细胞。取IyL pAdEasier-Ι质粒转化BJ5183感受态细胞，铺链霉素/氨苄青霉素双抗性LB平板(浓度均 为50g/mL)，置37°C孵箱培养。12_16h后，挑取数个克隆，接种于链霉素/氨苄青霉素双抗 性LB培养基，37°C振荡过夜。次日晨收菌，将含有pAdEasier-Ι质粒的BJ5183菌按照常规 氯化钙的方法制备BJ5183pAdEasier-l感受态细胞。4、细菌内同源重组及鉴定以回收的CIAP处理的线性化载体G质粒转化常规氯化钙方法制备的 BJ5183pAdEasier-l感受态细胞，铺卡那霉素抗性的LB平板，37°C孵箱倒置培养14 16小 时。挑选数个体积最小的卡那霉素抗性菌落，接种于3mL含有50 μ g/mL卡那霉素的LB培 养基内，37 °C中速振荡培养过夜。用博大泰克质粒抽提试剂盒小量抽提质粒DNA，0. 8 %琼脂 糖凝胶电泳根据质粒大小初步鉴定。选取近40Kb大小的质粒，用PCR及PacI酶切的方法 鉴定重组子。PacI酶切反应条件如下候选质粒1 μ gPacIIU10XNEB buffer 15 μ L100 X BSA0. 5 μ L_补足去离子水至总体积50μ L，37°C水浴4小时，0. 8%琼脂糖凝胶电泳分析酶切 结果。正确的重组子命名为pAd-attb-hFIX-DsRed(Ioxp)(见图8)。此外还用PCR的方法 对其中的DsRed, PA-CMV, hFIX进行了鉴定(见图9)。四、pAd-attb-hFIX-DsRed (Ioxp)载体在体外表达红色荧光蛋白及phFIX将构建好的pAd-attb-hFIX-DsRed (Ioxp)及阴性对照载体pAdtrack-CMV采用脂 质体Lipofectamine2000 (Invitrogen公司)方法分别转染293A细胞系，24小时后，在荧 光显微镜下观察，可见表达红色荧光蛋白的细胞；分别收集pAd-attb-hFIX-DsRed (Ioxp) 转染的细胞及对照细胞，以Iml Trizol (Invitrogen公司)裂解细胞后，通过氯仿，异丙醇 抽提得到RNA，经过紫外分光光度计检测RNA的纯度，取2ugRNA，用逆转录试剂盒(Promega 公司)将其逆转录为cDNA，以cDNA为模板，hFIX的特异检测引物进行PCR检测。PCR产物
8进行琼脂糖凝胶电泳，可见pAd-attb-hFIX-DsRed (Ioxp)转然的细胞有hFIX的表达(见图 10)。本发明中的腺病毒载体除其自身的优点外，能够整合到宿主基因组，且安全性比 逆转录载体高，兼有上述三种载体的优点，又能克服它们的不足。Loxp是重组酶Cre的识别位点。如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向 相同，Cre重组酶能将两个LoxP位点间的序列以环化的形式切出。attB原是细菌基因组中 的附着点。链霉菌cpC31噬菌体整合酶((pC31-int)是一种位点特异性重组酶，该酶能识别 噬菌体附着位点(attp)和宿主基因组上的attB，介导二者同源序列之间的位点特异性重 组。在人或小鼠细胞中表达的cpC31-int能够识别基因组中的假attp位点(pseudo-attp) 和外源载体中的attB位点，将环形的带有目的片段的载体位点特异性的整合到基因组中。 cpC31位点特异性整合酶系统在完成有效的基因转移过程中安全性高，由于是定点整合而 非随机整合，引起畸形、癌变的机率几乎为零，而且pseudo-attP位点周围不存在功能基 因，重组不会引起新的变异，也不影响外源基因的表达。综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可 以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发 明的范围之内。
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权利要求
一种用于血友病B基因治疗的腺病毒载体，其特征在于，该载体能同时表达hFIX与红色荧光蛋白；在hFIX与红色荧光蛋白串联基因表达框两侧各有一个方向相同的Cre整合酶作用位点loxp位点，在表达框内部有位点特异性整合酶PhiC31的作用位点attB。
2.根据权利要求1所述的用于血友病B基因治疗的腺病毒载体，其特征在于，在其中一 个Loxp位点与目的基因启动子之间存在一个attB位点，使其能在Phic31整合酶存在的情 况被整合到宿主基因组中。
3.根据权利要求2所述的用于血友病B基因治疗的腺病毒载体，其特征在于，所述目的 基因表达框5，端的Ioxp与attB相邻，形成Ioxpattb片段。
4.根据权利1所述的用于血友病B基因治疗的腺病毒载体，其特征在于，能表达红色荧 光蛋白，能作为腺病毒包装时的示踪蛋白，并且与传统绿色荧光蛋白的腺病毒载体相区分， 当两种腺病毒共同作用与宿主细胞能进行区分与示踪。
5.根据权利1所述的腺病毒载体，其特征在于，能表达人凝血因子FIX。
6.根据权利要求3、4、5中任一项所述的腺病毒载体或其体外包装的腺病毒颗粒在治 疗血友病B药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种用于血友病B基因治疗的腺病毒载体及其用途，该载体能同时表达hFIX与红色荧光蛋白；在hFIX与红色荧光蛋白串联基因表达框两侧各有一个方向相同的Cre整合酶作用位点loxp位点，在表达框内部有位点特异性整合酶PhiC31的作用位点attB。本发明得到由红色荧光蛋白标记的DNA可以环化的重组腺病毒载体，并为该载体进一步经由attb序列整合入宿主基因组中发挥持久治疗血友病B打下基础。所述的腺病毒载体或其体外包装的腺病毒颗粒在治疗血友病B药物中的应用。
文档编号A61P7/04GK101935674SQ20091006951
公开日2011年1月5日 申请日期2009年6月30日 优先权日2009年6月30日
发明者张磊, 杜伟廷, 杨仁池, 薛峰, 顾东生 申请人:中国医学科学院血液学研究所