专利名称：抗trka抗体及其衍生物的制作方法
抗TRKA抗体及其衍生物本发明涉及抗体及其衍生物，特别是人源化抗体及其衍生物。神经生长因子(NGF)通过两种膜受体进行作用。一种是相对低亲和力的p75受体， 另一种是称为TrkA的140KDa高亲和力受体。NGF在多种病症的治疗中有潜在用途，所述病症例如多种神经退行性病症(包括 阿尔茨海默氏病)、糖尿病和麻风病。然而NGF可能具有多种不期望的激动剂特性。这包括疼痛敏感性的增加。 NGF-TrkA系统提供了疼痛治疗的潜在靶点。已经生产了多种抗TrkA抗体。一种这样的抗体是在WO 97/21732 (McGill University)中称为5C3的单克隆抗体。然而，发现这是TrkA激动剂，并且因此，对减少疼 痛无用。特别地，该抗体结合TrkA时并不防止其功能性活化。称为MNAC 13 的抗 TrkA 单克隆抗体在 WO 00/73344 (Societa Italiana Per La Ricerca Scientifica)中公开，EP-B-118138 (Lay LineGenomics SpA)来自 WO 00/73344。 据称，该抗体及其多种衍生物在一系列生物系统中有效防止TrkA的功能性活化。在标准伤 害感受中使用MNAC 13单克隆抗体，发现其提供了显著的痛觉减退。该抗体的单链Fv (ScFv)变体也在WO 00/73344公开，在其中称为MNAC 13 ScFv0 这包含了通过接头多肽结合在一起的更大抗体的可变轻链区和可变重链区，所述接头多肽 将VL区的C端连接到VH区的N端。发现该变体与MNAC 13—样有效结合TrkA。轻链可变 区和重链可变区的序列与WO 97/21732中所描述抗体的相应区域序列进行比较，发现与其 只存在低水平的全序列同一性。WO 06/131952 (Lay Line Genomics SpA)公开了抗TrkA抗体在治疗慢性痛中的医 学用途。它通过使用持续疼痛的模型，特别是慢性缩窄性损伤(CCI)模型，来提供其证据。WO 06/137106 (Lay Line Genomics SpA)公开了将能够抑制NGF和 TrkA 间结合的 抗TrkA抗体与至少一种阿片样止痛剂联合应用于治疗或预防疼痛。据解释，这一联合治疗 允许减少的阿片样物质剂量提供与高得多的剂量相同程度的疼痛缓解。因此，这可用于降 低疼痛治疗中阿片样物质的副作用水平，因为剂量可以降低了。WO 05/061540 (Lay Line Genomics SpA&Scuolo Internazionale Superiore Di Studi Avanzati-Sissa)公开了抗体人源化的方法，其中，使用获得自晶体学研究的结构数 据来进行人源化的第一设计阶段。例如，W005/061540使用如公开于WO 00/73344的抗TrkA 抗体，以及抗NGF抗体作为起点，随后用该方法对它们进行重新设计。尽管在WO 05/061540中公开的人源化抗体有用，仍存在提供额外的人源化抗体 的需要，以扩大有效治疗的可能性。本发明人现提供未在WO 05/061540中公开的一系列抗TrkA抗体及其衍生物。发 明人也提供了指示这些抗体的应用的数据。本发明以前，这些抗体在本领域中只是未知的， 不可能预测到所提供的数据。根据本发明的一个方面，提供了抗TrkA抗体，其包含a)可变重链，其包含选自如图 Ia 所示 BXhVHl (SEQ ID NO 1)，BXhVH2 (SEQ ID NO
72)，BXhVH3 (SEQ ID NO 3)，BXhVH4 (SEQ ID N04)，BXhVH5 (SEQ ID NO 5)，或 HuVHWOv (SEQ ID NO 6)任意一种的序列，或选自任一所述序列变体的序列；禾口/ 或b)可变轻链，其包含选自如图 Ib 所示 BXhVLl (SEQ ID NO 7)，BXhVL2 (SEQ ID NO 8),BXhVL3(SEQ ID NO 9),BXhVL4(SEQ ID N010),BXhVL5(SEQ ID NO 11),BXhVL6(SEQ ID NO 12)，BXhVL7 (SEQID NO 13)或 BXhVL8 (SEQ ID NO 14)任意一种的序列，或选自任一所 述序列变体的序列。也提供了所述抗体的衍生物，其中衍生物能够结合TrkA。更优选地，抗体同时包含上面a)中描述的可变重链和b)中描述的可变轻链，即， 其包含轻链和重链的下列组合之一BXhVHlVLl, BXhVHlVL2, BXhVHlVL3, BXhVHlVL4, BXhVHlVL5, BXhVHlVL6, BXhVHlVL7, BXhVHlVL8,BXhVH2VLl, BXhVH2VL2, BXhVH2VL3, BXhVH2VL4, BXhVH2VL5, BXhVH2VL6, BXhVH2VL7, BXhVH2VL8,BXhVH3VLl, BXhVH3VL2, BXhVH3VL3, BXhVH3VL4, BXhVH3VL5, BXhVH3VL6, BXhVH3VL7, BXhVH3VL8,BXhVH4VLl, BXhVH4VL2, BXhVH4VL3, BXhVH4VL4, BXhVH4VL5, BXhVH4VL6, BXhVH4VL7, BXhVH4VL8,BXhVH5VLl, BXhVH5VL2, BXhVH5VL3, BXhVH5VL4, BXhVH5VL5, BXhVH5VL6, BXhVH5VL7, BXhVH5VL8,或HuVHWOv/HuVLWO。期望抗体衍生物具有至少一个⑶R区，所述⑶R区选自图Ia和Ib中对每个序列 加下划线的区域，或选自其变体，所述变体在每个加下划线的区域有不多于两个氨基酸的 变化(优选不多于一个氨基酸的变化)。更期望地，抗体衍生物具有多个⑶R区，所述⑶R区选自图Ia和Ib中对每个序列 加下划线的区域，或选自其变体，所述变体在每个加下划线的区域有不多于两个氨基酸的 变化(优选不多于一个氨基酸的变化)。因此，其可以包含一、二、三、四、五或六个这样的⑶R区(任选地，与一个或多个其 他⑶R区组合)。其优选地至少包含重链的第三⑶R区，更优选地，至少包含重链和轻链的 第三个⑶R区。然而最期望地，其具有六个⑶R区，所述⑶R区与图Ia和Ib中对每个序列加下划 线的六个CDR区相对应，或者与其变体相对应，所述变体在每个加下划线的区域有不多于 两个氨基酸的变化。实际上，在大多数情况下，优选CDR序列发生极少变化或不发生变化。因此，六个 ⑶R区的一、二、三、四、五个或全部六个可能具有与图Ia和Ib中所示相同的氨基酸序列。现谈及构架区，优选衍生物具有至少一个构架区，所述构架区选自图Ia和Ib中 所示不加下划线的序列，或选自其变体，所述变体与其具有至少75%的氨基酸序列同一性 (例如，与其具有至少80 %，至少85 %，至少90 %，至少95 %或至少98 %的序列同一性)。氨基酸序列同一性的程度可通过序列的简单比对(无空位)和序列差别的测定来
8确定。可根据Kabat的编号方案比对序列，由此确定序列同一性。(见Kabat，Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda MD，1987&1991.)在 WO 05/061540 中讨论了这一编号方案。(也可参考 Chothia&Lesk， J. MoI. Biol,196,901(1987)和 Chothia et al, Nature,342,878(1989).)比较不优选地，允许存在一个或多个空位(例如一个或多个氨基酸插入/缺失)， 且随后可指定空位罚分。可用如BLASTN 或 BLASTP (可在 www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/ 得到)等序列分 析软件来确定序列同一性。通过BLASTN(对核苷酸序列)比较两个序列(将两个序列互相 “Blast”)的缺省参数是匹配得分=1，不匹配罚分=2，开放空位=5，延伸空位=2。对 蛋白质序列使用BLASTP时，缺省参数是匹配得分=0，错配罚分=0，开放空位=11，且延 伸空位=1。]更优选地，存在多个构架区，并且这些区域选自图Ia和Ib所示不加下划线的序 列，或选自其变体，所述变体与其具有至少75 %的氨基酸序列同一性(例如，至少80 %，至 少85%，至少90%，至少95%或至少98%的序列同一性)。图Ia和Ib中所示的每条链具有四个构架区。因此优选存在至少两个、至少三个 或四个这样的区域或其变体。最优选地，存在全部四个构架区或其变体。存在一个或多个变体构架区时，通常优选这些区域不包括氨基酸替换，所述替换 会导致在鼠类序列中相应位置上存在的氨基酸发生变化。可用于比较的相关鼠类氨基酸分别显示在图Ia和Ib的mVHEP和mVLEP中，除去以 下例外，为了这一讨论的目的，认为mVHEP和mVLEP中所示少数斜体的氨基酸不是鼠类的。 在下表，按斜体残基出现在图中的顺序，给出在这些位置上被认为是鼠类的残基。
权利要求
抗TrkA抗体，其包含a)可变重链，其包含选自如
图1a所示BXhVH1、BXhVH2、BXhVH3、BXhVH4、BXhVH5或HuVHWOv任意一种，或选自所述序列任一种的变体的序列，和/或b)可变轻链，其包含选自BXhVL1、BXhVL2、BXhVL3、BXhVL4、BXhVL5、BXhVL6、BXhVL7或BXhVL8任意一种，或选自所述序列任一种的变体的序列；或所述抗体的衍生物；其中该衍生物能够结合TrkA。
2.根据权利要求1的抗体或衍生物，其中该抗体包含轻链和重链的以下组合之一BXhVHlVLl, BXhVHlVL2, BXhVHlVL3, BXhVHlVL4, BXhVHlVL5, BXhVHlVL6, BXhVHlVL7,BXhVHlVL8,BXhVH2VLl, BXhVH2VL2, BXhVH2VL3, BXhVH2VL4, BXhVH2VL5, BXhVH2VL6, BXhVH2VL7, BXhVH2VL8,BXhVH3VLl, BXhVH3VL2, BXhVH3VL3, BXhVH3VL4, BXhVH3VL5, BXhVH3VL6, BXhVH3VL7, BXhVH3VL8,BXhVH4VLl, BXhVH4VL2, BXhVH4VL3, BXhVH4VL4, BXhVH4VL5, BXhVH4VL6, BXhVH4VL7, BXhVH4VL8,BXhVH5VLl, BXhVH5VL2, BXhVH5VL3, BXhVH5VL4, BXhVH5VL5, BXhVH5VL6, BXhVH5VL7, BXhVH5VL8,或 HuV冊0v/HuVLW0 ；或所述抗体的衍生物，其中该衍生物能够结合TrkA。
3.根据权利要求1或权利要求2的抗体或衍生物，其包含一个或多个CDR区，所述CDR 区选自图Ia和图Ib中加下划线的区域或选自其变体，所述变体在每个加下划线的区域有 至多两个氨基酸改变。
4.根据前述权利要求任意一项的抗体或衍生物，其包含六个CDR区。
5.根据前述权利要求任意一项的抗体或衍生物，其具有多个构架区，所述构架区选自 图Ia和/或Ib中显示的不加下划线的序列或选自其变体，所述变体与不加下划线的区域 有至少75%的序列同一性。
6.根据权利要求5的抗体或衍生物，其中所述序列同一性为至少85%。
7.根据权利要求5的抗体或衍生物，其中所述序列同一性为至少95%。
8.根据权利要求5的抗体或衍生物，其中变体在构架区中的鼠类残基的百分比不高于 图Ia和/或Ib所示相应的不加下划线区域中存在的鼠类残基百分比。
9.根据前述权利要求任意一项的抗体或衍生物，其中一个或多个重链CDR区具有与图 Ia中BXhVHl、BXhVH2、BXhVH3、BXhVH4、BXhVH5或HuV冊Ov相应的加下划线CDR区序列相同 的序列。
10.根据权利要求9的抗体或衍生物，其中所有所述重链⑶R区与图Ia中BXhVHl、 BXhVH2、BXhVH3、BXhVH4、BXhVH5.或 HuV冊Ov 相应的加下划线 CDR 区相同。
11.根据前述权利要求任意一项的抗体或衍生物，其中一个或多个轻链CDR区与图Ib 中 BXhVL 1、BXhVL2、BXhVL3、BXhVL4、BXhVL5、BXhVL6、BXhVL7 或 BXhVL8 的加下划线的相应 CDR区相同。
12.根据权利要求11的抗体或衍生物，其中所有所述轻链CDR区与图Ib中BXhVLl、 BXhVL2、BXhVL3、BXhVL4、BXhVL5、BXhVL6、BXhVL7 或 BXhVL8 相应的加下划线 CDR 区相同。
13.根据前述权利要求任意一项的抗体或衍生物，其与TrkA结合的亲和力大于与Trk B结合的亲和力。
14.根据前述权利要求任意一项的抗体或衍生物，其中对TrkA的结合亲和力为对Trk B的结合亲和力的至少两倍。
15.根据前述权利要求任意一项的抗体或衍生物，其中对TrkA的结合亲和力为对Trk B的结合亲和力的至少四倍。
16.根据前述权利要求任意一项的抗体或衍生物，其中对TrkA的结合亲和力为对Trk B的结合亲和力的至少六倍。
17.根据前述权利要求任意一项的抗体或衍生物，其能够阻断或减少NGF和TrkA受体 的结合。
18.根据前述权利要求任意一项的抗体或衍生物，其能够阻断或减少一种或多种生物 活性，所述生物活性否则将被NGF和TrkA受体的结合所诱导。
19.根据前述权利要求任意一项的抗体或衍生物，其包含来自非啮齿类动物的恒定区。
20.抗体或其衍生物，其包含人类恒定区，或与人类恒定区有至少75%序列同一性的 恒定区。
21.抗体或其衍生物，其包含人IgG恒定区，或与其有至少75%序列同一性的恒定区。
22.抗体或其衍生物，其包含恒定区，该恒定区包含a)图6中重链所示的序列，该序列以加下划线的A开始并且以最后的K结束，或与该序 列有至少75%序列同一性的序列；和/或b)如图6中轻链所示的序列，该序列以加下划线的R开始并且以最后的C结束，或与该 序列有至少75%序列同一性的序列。
23.抗体或其衍生物，其包含恒定区，该恒定区包含a)如图6中重链所示序列，该序列以加下划线的A开始并且以最后的K结束，和/或b)如图6中轻链所示的序列，该序列以加下划线的R开始并且以最后的C结束，或与该 序列有至少75%序列同一性的序列。
24.抗体或其衍生物，其包含权利要求22或权利要求23的a)和b)两者。
25.根据前述权利要求任意一项的衍生物，其包含恒定区，该恒定区相对于人免疫球蛋 白恒定区有一个或多个氨基酸改变，所述改变避免/减少以下一项或多项a)补体的活化；b)补体介导的裂解；c)T细胞的活化；d)与Fc受体的结合。
26.根据前述权利要求任意一项的抗体或衍生物，其在图2所示的TrkA-IgG结合测定 中提供高于0. 1的0D450/630nm值。
27.根据前述权利要求任意一项的抗体或衍生物，其在图2所示的测定中提供高于0.2的 0D450/630nm 值。
28.根据前述权利要求任意一项的抗体或衍生物，其在图2所示的TrkA-IgG结合测定 中提供高于0. 3的0D450/630nm值。
29.根据前述权利要求任意一项的抗体或衍生物，其在图2所示的测定中提供高于0.3 的 0D450/630nm 值。
30.根据前述权利要求任意一项的抗体或衍生物，其在实施例描述的基于FACS的测定 中提供TFl细胞的FACS染色的增加，所述增加是1. 0倍以上的增加。
31.根据权利要求30的抗体或衍生物，其中所述增加为至少1.5倍，至少2. 0倍，至少 2. 5倍或至少3. 0倍。
32.根据前述权利要求任意一项的抗体或衍生物，其在实施例描述的测定中在 TrkA-IgG结合方面具有小于4. 18x1 O^8M的Kd值。
33.根据权利要求32的抗体或衍生物，其中所述Kd值小于2.48x10_9M。
34.根据权利要求33的抗体或衍生物，其中所述Kd值小于1x10_9M。
35.根据前述权利要求任意一项的抗体或衍生物，在它的至少一条链的可变区的全部 构架区(不包括相关的⑶R区)测量时，该抗体或衍生物有至少85%的人源化。
36.根据前述权利要求任意一项的抗体或衍生物，在至少一条链的可变区的全部构架 区(不包括相关的CDR区)测量时，该抗体或衍生物有至少90%的人源化。
37.根据前述权利要求任意一项的抗体或衍生物，在至少一条链的可变区的全部构架 区(不包括相关的CDR区)测量时，该抗体或衍生物有至少95%的人源化。
38.根据权利要求35到38任意一项的抗体或衍生物，其在轻链和重链两者的构架区方 面，至少具有所述权利要求任意一项给定的人源化百分比。
39.根据前述权利要求任意一项的抗体的衍生物，其中衍生物是a)所述抗体的片段；b)片段多聚体；c)所述抗体、片段或片段多聚体与另一部分的融合产物；d)所述抗体、片段、片段多聚物或融合产物的与其具有至少75%序列同一性的变体。
40.根据权利要求39的衍生物，其中该衍生物是融合产物，并且所述另一部分选自以 下物质诊断剂、治疗剂、标记剂、延长衍生物在人类宿主中的半衰期和/或减少其免疫原 性的物质。
41.根据权利要求40的衍生物，其中所述治疗剂是细胞毒素。
42.根据前述权利要求任意一项的抗体或衍生物，其是PEG化的。
43.根据前述权利要求任意一项的抗体或衍生物，其是基本分离的形式。
44.根据前述权利要求任意一项的抗体或衍生物，其是基本纯化的形式。
45.根据前述权利要求任意一项的抗体或衍生物，其是固定化形式。
46.根据权利要求1-45任意一项的抗体或衍生物，用于药物。
47.根据权利要求1-45任意一项的抗体或衍生物，用于治疗疼痛。
48.根据权利要求1-45任意一项的抗体或衍生物，用于治疗慢性痛。
49.根据权利要求1-45任意一项的抗体或衍生物，用于治疗急性痛。
50.根据权利要求1-45任意一项的抗体或衍生物，用于治疗与以下一种或多种疾病相关的疼痛胰腺炎、肾结石、子宫内膜异位症、IBD、克隆病、术后粘连、胆囊结石、头痛、痛经、 肌肉骨骼痛、扭伤、内脏痛、卵巢囊肿、前列腺炎、膀胱炎、间质性膀胱炎、手术后疼痛、偏头 痛、三叉神经痛、烧伤和/或创口痛、与创伤相关的疼痛、神经性疼痛、与肌骨骼疾病相关的 疼痛、类风湿性关节炎、骨关节炎、强直性脊柱炎、关节周围病变、肿瘤痛、来自骨转移的疼 痛、HIV感染。
51.根据权利要求1-45任意一项的抗体或衍生物，用于治疗癌症。
52.根据权利要求1-45任意一项的抗体或衍生物，用于涉及ADCC的治疗。
53.根据权利要求1-45任意一项的抗体或衍生物，用于治疗神经元病症(例如神经退 行性病症)。
54.根据权利要求1-45任意一项的抗体或衍生物，用于治疗阿尔茨海默氏病。
55.根据权利要求1-45任意一项的抗体或衍生物，用于治疗糖尿病。
56.根据权利要求1-45任意一项的抗体或衍生物，用于治疗病毒性病症。
57.根据权利要求1-45任意一项的抗体或衍生物，用于治疗HIV介导的病症。
58.根据权利要求1-45任意一项的抗体或衍生物，用于治疗麻风病。
59.根据权利要求1-45任意一项的抗体或衍生物，用于治疗炎症性病症。
60.根据权利要求1到45任意一项的抗体或衍生物与止痛药的组合，用于医学上的同 时、顺序或协调给药。
61.根据权利要求1到45任意一项的抗体或衍生物与NGF的组合，用于医学上的同时、 顺序或协调给药。
62.根据权利要求1到45任意一项的抗体或衍生物与另一抗TrkA抗体或其衍生物的 组合，用于医学上的同时、顺序或协调给药。
63.药物组合物，其包含根据权利要求1到45任意一项的抗体或其衍生物，以及药物学 上可接受的载体或赋形剂。
64.药物组合物，其包含根据权利要求1到45任意一项的抗体以及另一种药物活性剂。
65.根据权利要求64的药物组合物，其中所述另一活性剂是以下一种或多种a)止痛药；b)另一种抗TrkA抗体或其衍生物；c)NGF；d)抗癌剂。
66.根据权利要求1-45任意一项的抗体或其衍生物，用于诊断或预后。
67.抗体或其衍生物，用于疾病的诊断或预后，其中所述疾病涉及TrkA的异常表达或 涉及TrkA的异常活性。
68.抗体或其衍生物，用于权利要求47到59说明的任一种疾病或病症的诊断或预后。
69.方法，其包括获得生物样品并对其施用根据权利要求1到45任意一项的抗体或衍 生物。
70.根据权利要求69的方法，进一步包含将所述抗体或衍生物结合所述样品的结果与 阳性对照或阴性对照样品进行比较。
71.多肽，其由根据权利要求1到45任意一项的抗体或其衍生物的可变轻链组成，或包 含所述可变轻链。
72.多肽，其由权利要求1到45任意一项中描述的抗体或其衍生物的可变重链组成，或 包含所述可变重链。
73.根据权利要求71或权利要求72的多肽，其进一步包含一个或多个人类恒定区。
74.核酸，其编码根据权利要求1到45任意一项的抗体或其衍生物，或编码根据权利要 求71到73任意一项的多肽。
75.载体，其包含根据权利要求74的核酸。
76.表达系统，其表达根据权利要求1到45任意一项的抗体或其衍生物，或根据权利要 求71到73任意一项的多肽，或者可被诱导以提供这种表达
77.非人类转基因哺乳动物，其表达根据权利要求1到45任意一项的抗体或其衍生物， 或根据权利要求71到73任意一项的多肽，或者可被诱导以提供这种表达。
78.基本如前所述，参考附随的实施例和/或附图的本发明。
79.药盒，其包含根据权利要求1到45任意一项的抗体或其衍生物，以及指导受试者将 其用作止痛药的说明书。
全文摘要
提供了抗TrkA抗体，其包含a)可变重链，其包含选自如图(1a)所示BXhVH1、BXhVH2、BXhVH3、BXhVH4、BXhVH5或HuVHWOv任意一种，或选自所述序列任一种的变体的序列；和/或b)可变轻链，其包含选自如图(1b)所示BXhVL1、BXhVL2、BXhVL3、BXhVL4、BXhVL5、BXhVL6、BXhVL7或BXhVL8任意一种，或选自所述序列任一种的变体的序列。也提供了结合TrkA的衍生物。本发明的抗体或衍生物可用于包括疼痛治疗的多种治疗中。
文档编号A61P29/00GK101939337SQ200980104123
公开日2011年1月5日 申请日期2009年2月4日 优先权日2008年2月4日
发明者D·丹布罗西奥, F·贝尼尼 申请人:雷莱恩基因组有限公司