专利名称：一种抗病毒融合蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗病毒融合蛋白一细胞穿膜肽-病毒巨噬细胞炎症蛋白 (CPP-vMIP)及其在制备抗人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiency virus, HIV)的药物中的应用。
背景技术：
人类免疫缺陷病毒1型(HIV-I)是艾滋病(AIDS)的病原体，HIV/AIDS是人类面临最严重的全球性公共卫生问题之一。由于HIV-I病毒的高度变异、HIV直接攻击宿主免疫系统等原因，至今仍然没有有效的防治方法，尚没有有效的疫苗问世。在艾滋病的治疗方面利用逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂(“鸡尾酒”疗法)具有强有力的拮抗病毒增殖的效果。“鸡尾酒”疗法能短暂降低体内病毒水平。此疗法虽可推迟艾滋病发病，但副作用很大，费用较高，患者难以坚持终身用药。对病毒研究的进展发现了一些能够在HIV病毒复制的不同环节起抑制作用的基因，这些基因可以抑制病毒粘附宿主细胞、抑制病毒逆转录、复制和组装、释放等过程。最近的一些研究显示，胞嘧啶脱氨酶载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白 3G(apolipoprotein B mRNA-editingcatalytic polypeptide 3G, AP0BEC3G)禾口 AP0BEC3F 是体内最重要的内源性抗HIV因子。APOBEC家族均含有胞嘧啶脱氨酶活性结构域。A3G通过致使HIV发生突变抑制HIV的复制，在逆转录时使负链胞嘧啶(C)脱氨突变为尿嘧啶(U)。 含有过多的U单链易于被尿嘧啶DNA糖苷酶识别并降解；过多的U也可以干扰正链合成的起始。负链中大量C —U的突变还可致正链DNA鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)，使之不能编码有功能的病毒蛋白产物或提前终止产生截短的无功能蛋白。AP0BEC3G主要通过抑制HBV 前基因组RNA的包装和核衣壳化等方式来抑制HBV感染。CC类趋化因子配体5 (CC chemokine Iigand 5，CCL5)，又被称为正常T细胞表达和分泌活性因子(RANTEQ是HIV主要辅助受体CCR5的天然配体，能够与HIV竞争结合 CCR5，抑制HIV-I粘附入侵宿主细胞。细胞穿透肽(cell penetrating ρ印tides，CPP)是近年来发现的一类能介导大分子物质跨膜转导的小分子肽段，CPP进入细胞能力不依赖经典的胞吞作用。人类已经发现了多种天然的CPP，同时根据细胞穿膜肽均为带有正电荷的长短不等的多肽片段，其中富含精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸残基，二级结构皆具有α -螺旋的空间构象等一些共有特性， 目前已人工合成了穿透力更强、效率更高的穿膜肽PEP-1等。中国专利申请，200810030223，公开了将包含细胞穿膜肽和APOBEC家族胞嘧啶脱氨酶结构域的融合蛋白及其在治疗HIV和HBV感染方面的应用。中国专利申请，99116^3. 8 和00114299. 2，公开了利用KSHV编码的νΜΙΡ及其衍生物在防治艾滋病药物中的应用。νΜΙΡ 具有结合CCR5的功能，能够竞争抑制HIV利用该受体入侵宿主细胞，这两项专利均利用了 νΜΙΡ的这一特点。目前还未有vMIP-II调控宿主免疫基因表达的报道。
发明内容
本发明目的是提供一种新型的融合蛋白，该融合蛋白能够以一种非受体、非能量依赖的方式进入细胞，有效提高细胞内抗病毒免疫基因表达水平，最终抑制HIV及HBV等病毒的感染。本发明采用的技术方案是一种抗病毒融合蛋白，主要包括细胞穿膜肽结构域和病毒巨噬细胞炎症蛋白 (vMIP)，所述细胞穿膜肽(CPP)结构域和病毒巨噬细胞炎症蛋白形成串联结构，所述病毒巨噬细胞炎症蛋白为下列之一或其中两种以上的组合(1) VMIP-I:MAPVHVLCCVSVLLATFYLTPTESAGSLVSYTPNSCCYGFQQHPPPVQILKEWYPTSPA CPKPGVILLTKRGRQICADP SKNWVRQLMQRLPAIA ；(2) vMIP-II:MDTKGILLVAVLTALLCLQS⑶TLGASWHRPDKCCLGYQKRPLPQVLLSSWYPTSQLC SKPGVIFLTKRGRQVCADKSKDWVKKLMQQLPVTAR ；(3)vMIP-III MWSMCWVLRAHLGLLFffVAVIELCAASGPATIMASDCCENSLSSARLPPDKLICGWYWTSTVYCRQKAV IFVTHSGRKVCGSPAKRRTRLLMEKHTEIPLAKRVALRAGKGLCP。本申请发明人发现由卡波氏肉瘤相关病毒(Kaposi，ssarcoma-associated herpesvirus，KSHV)编码的病毒巨噬细胞炎症蛋白(viral macrophage inflammatory proteins, νΜΙΡ)具有显著增加包括AP0BEC3G、AP0BEC3F和CCL5等抗病毒基因表达的功能。 νΜΙΡ 是指由卡波氏肉瘤相关病毒(Kaposi， s sarcoma-associated herpesvirus, KSHV) 编码的病毒巨噬细胞炎症蛋白(viral microphage inflammatory protein，νΜΙΡ)，包括 vMIP-I, vMIP-II, vMIP-III。νΜΙΡ可激活宿主自身APOBEC家族特别是AP0BEC3G和AP0BEC3F基因表达，这些宿主自身蛋白没有免疫原性，表达后直接在细胞内发挥作用。但是，由于受细胞膜的屏障作用，νΜΙΡ并不能进入细胞发挥调控基因表达的功能。为了使νΜΙΡ发挥更全面而强大的抗病毒功能，需要将其导入到细胞内。因此本发明将CPP的穿透细胞膜屏障的功能和νΜΙΡ在细胞内激活宿主自身抗病毒基因表达功能有机结合，提供一种新的CPP-vMIP融合蛋白，该融合蛋白能够以一种非受体、非能量依赖的方式进入细胞，有效提高细胞内抗病毒免疫基因表达水平，最终抑制HIV及HBV等病毒的感染。所述CPP结构域可为本领域已知具有穿膜活性的多肽，所述细胞穿膜肽为下列之一或其中两种以上的组合(I)PEP-I KETffffETffffTEffSQPKKKRKV ；(2)HIV-I Tat :GRKKRRQRRRPPQ ；(3)penetratin(Antp) =RQIKIffFQNRRMKffKK ； (4)transportan=GffTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL ；(5)TPlO :AGYLLGKINLKALAALAKKIL ；(6)Oligoarginine(R8) :RRRRRRRR ；(7) MAP :KLALKLALKALKAALKLA ；(8) MPG GALFLGFLGAAGSTMGAffSQPKKKRKV ；(9)MPG α GALFLAFLAAALSLMGLffSQPKKKRKV
构成上述融合蛋白的穿膜肽结构可以发生合理的不影响其穿膜功能的改变，包括某些氨基酸残基的缺失、插入、替换，或几种穿膜肽的组合等。为了利于制备时对抗病毒蛋白的纯化以及对方便观察蛋白应用后的分布，所述融合蛋白中还可含有蛋白质纯化标签。该标签可以是任何一种商业化的标签，包含但不限于如6XHis (由6个组氨酸His构成的序列HHHHHH)或者是GST(谷胱甘肽巯基转移酶)等标签。蛋白质纯化标签可以位于该抗病毒蛋白的N端或C端，或N端和C端各有一个。优选的，所述融合蛋白氨基酸序列如下KETWWETWWTEWSQPKKKRKVMDTKGILLVAVLTALLCLQS⑶TLGASWHRPDKCCLGYQKRPLPQVLL SSWYPTSQLCSKPGVIFLTKRGRQVCADKSKDWVKKLMQQLPVTAR。CPP-vMIP融合蛋白质可以用原核表达系统、酵母表达系统或昆虫表达系统进行表达，也可以将编码基因连入慢病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体或疱疹病毒载体在体内获得表达，也可以通过将其编码基因通过脂质体转染、基因枪等方式介导进入体内获得表达。本发明还涉及所述的抗病毒融合蛋白在制备抗艾滋病的药物中的应用。具体的， 所述药物为上调宿主抗HIV-I基因表达的药物，或者直接对病毒进行攻击达到治疗效果的药物。所述抗HIV-I 基因为下列之一 CCL5、AP0BEC3F、AP0BEC3G、MX1、MX2。已有研究报道AP0BEC3G也具有抗HBV的作用，而本发明抗病毒融合蛋白可上调 AP0BEC3G基因的表达，因此本发明抗病毒融合蛋白也可应用于制备抗乙型肝炎的药物。本发明中涉及的具有抗病毒作用的融合蛋白中，穿膜肽结构使该蛋白具有穿膜能力，能够以一种非受体、非能量依赖的方式进入细胞内。vMIP结构进入细胞后，该蛋白在细胞内具有调控基因表达，特别是上调抗HIV-I基因表达的能力。本发明的有益效果主要体现在1、为艾滋病的预防和治疗提供了一种全新的思路和方法。利用CPP将具有激活多种抗病毒基因表达的vMIP制成融合蛋白，能够直接进入宿主细胞发挥功能。这些被激活的宿主抗HIV-I基因表达产物可以在病毒黏附、逆转录、复制、释放等多个环节抑制其感染。 这种抑制作用不受HIV-I病毒变异的影响。2、本发明利用病毒基因激活表达的是宿主自身的抗HIV-I基因表达，这些蛋白是宿主自身蛋白，不具有免疫原性。3、本发明的实用前景好，利用本发明的HHV8病毒基因的慢病毒表达载体转染宿主细胞，即可刺激宿主细胞的强大的抗HIV-I免疫反应。4、由于本产品能够穿透皮肤、粘膜等生理屏障，可以采用皮肤涂抹等无痛给药方式。
图1为融合蛋白质原核表达载体构建过程示意图；图2为融合蛋白质的表达纯化结果示意图；1 代表分子量蛋白预然Marker，2 IPTG诱导加上穿膜肽的CPP-vMIP融合蛋白组，3 IPTG未诱导加穿膜肽的CPP-vMIP融合蛋白组，4 =IPTG诱导未加穿膜肽的vMIP蛋白组，5 :IPTG未诱导未加穿膜肽的νΜΙΡ蛋白组；图3为融合蛋白质W^festern Blot鉴定结果；1 :IPTG未诱导的pET-Mb质粒，6 IPTG诱导的pET-Mb质粒，3 IPTG诱导未加穿膜肽的νΜΙΡ蛋白组，4 IPTG未诱导未加穿膜肽的vMIP蛋白组，5 =IPTG未诱导加穿膜肽的CPP-vMIP融合蛋白组，6 :IPTG诱导加上穿膜肽的CPP-vMIP融合蛋白组，7 分子量蛋白预然Marker，8 =IPTG未诱导未加穿膜肽的νΜΙΡ 蛋白组，9 :IPTG诱导加上穿膜肽的CPP-vMIP融合蛋白组，10 分子量蛋白预然Marker ；图4为融合蛋白质穿透细胞膜功能的共聚焦检测结果；1 加入PBS的对照组；2 加入PEP-vMIP融合蛋白后0. 5小时；3 加入PEP-vMIP后1小时；4 加入PEP-vMIP融合蛋白后2小时；图5为融合蛋白质上调抗HIV-I基因表达示意图(融合蛋白PEP-vMIP作用HMEC-I 细胞M小时后各条抗HIV-I基因表达情况)。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1 一.蛋白质制备方法1.基因克隆构建目的蛋白表达载体1. lpET-15b-PEP-l 质粒的构建化学合成PEPl (KETffffETffffTEffSQPKKKRKV) 21个氨基酸的两条寡核苷酸链，根据选择的pET-Mb表达载体的特点，在两端加入NdeI (CATATG)和BioI (CTCGAG)酶切位点序列。 序列如下序列1 5’ -NdelTATGAAAGAAACCTGGTGGGAAACCTGGTGGACCGAATGGTCTCAGCCGAAAAAAAAACGTA AAGTGC-3‘ (68bp)序列2 3 ’ -ACTTTCTTTGGACCACCCTTTGGACCACCTGGCTTACCAGAGTCGGCTTTTTTTTTGCATTTCACG AGCT-5‘ Xhol (70bp)取出两管干粉片段，3000rpm离心lmin，用STE buffer (pH8. 0)等摩尔混合两个片段，94°C保温7min，关掉水浴锅，使其缓慢冷却至室温复性，形成编码PEP-I的DNA双链。低于30°C后，从水浴锅中取出，分装后于-20°C保存。将质粒pET_15b (复旦大学遗传学国家重点实验室提供)转化大肠杆菌Ecoli DH5a，挑单克隆扩菌，大量抽提质粒。用NdeI和BioI双酶切pET_Mb质粒，琼脂糖电泳检测酶切产物，回收大片段。T4连接酶将复性的PEPl连接到回收的大片段上，构建 pET-15b-PEP-l载体，筛选阳性克隆酶切鉴定。1. 2T-A 克隆 vMIPs，构建 pET_15b_vMIPs 质粒用含10% FBS的1640培养基培养BCBL-I细胞，抽提DNA。以特异引物(引物两端分别加上BamHI和XhoI酶切位点序列)扩增vMIPs ORF。vMIP-II的引物为正向引物5，-Xho1CATCTCGAGATGGACACCAAGGGCAT-3，反向引物3，-GTCAGTGACGAGCGACTCCTAGGTACBamHl-5'以BCBL-I细胞所抽提的DNA为模板，扩增出两端带有酶切位点的vMIP-II基因。扩增反应体系为10 XPfu Buffer with MgSO4 2. 5 μ 1,2. 5mMdNTP Mixture 2μ 1，10μΜ上下游引物各2 μ 1，DNA模板3 μ 1，Taq DNAPolymerase 0. 25 μ 1。反应条件为95°C预变性 7min，95°C变性 30s，56_63°C退火 30s，72°C延伸 2min，30 个循环，72°C延伸 lOmin，4°C保存。 扩增的目的片段vMIP-II长度约^7bp，琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物。将PCR扩增获得的片段vMIP-II与pGEM_T easy载体由T4DNA连接酶4°C连接过夜。连接产物转化感受态细胞E. coli DH5a，用LB/氨苄/IPTG/X_Gal平板进行蓝白斑筛选，挑取白色克隆菌小量培养，质粒抽提试剂盒提取质粒PGEM-T easy-vMIP-IL· BamHI和 XhoI双酶切鉴定，若出现约条带，说明目的基因已成功插入到载体pGEM-T easy中。用BamHI和XhoI双酶切pGEM-T easy-vMIP-II和pET_15b质粒，琼脂糖凝胶电泳鉴定分别回收vMIP-II和pET-15b的大片段，T4连接酶将两者4°C连接过夜后，转化感受态细胞E. coli DH5a，用含100mg/ml氨苄青霉素的LB培养基进行筛选，挑单克隆进行BamHI 和XhoI双酶切鉴定质粒pET-15b-vMIP-II，并送上海生工测序。1. 3 构建融合表达载体 pET-15b-PEP-l-vMIP_II用BamHI 和 XhoI 双酶切 pET_15b_PEP-l 质粒和 pET_15b_vMIPs，电泳，分别切胶纯化回收大小片段，T4连接酶将两者4°C连接过夜后，转化感受态细胞E. coli DH5a，用含100mg/ml氨苄青霉素的LB培养基进行筛选，NdeI和BioI双酶切鉴定质粒 pET-15b-PEP-l-vMIP-II，并送上海生工测序。二.蛋白质表达、纯化、鉴定1.诱导蛋白表达及鉴定选择测序完全正确的质粒pET-Mb-PEP-l-vMIP-II和pET-Mb-vMIP-II，转化感受态的E. coli BL21(DE;3)plysS，形成稳定高表达的菌株；挑单克隆菌落到含氨苄的培养基中培养，至菌液浑浊(OD ^ 0. 5)时，加入IPTG诱导培养，收集菌体，提取总蛋白，SDS-PAGE 电泳观察目的蛋白的表达，优化培养温度，诱导时间等条件。蛋白质的表达纯化结果如图2 所示。在观1，0.4讓01/1 IPTG条件下培养8-10h，收集菌体，提取总蛋白，以vMII^s单克隆抗体为一抗，western-blot鉴定目的蛋白；目的蛋白的鉴定结果如图3所示。2.目的蛋白的纯化放大培养转化了质粒 pET-15b-PEP-l-vMIP-II 和 pET-15b-vMIP_II 的菌种至 250ml,当细菌生长至对数生长期时加入IPTG至0. 4mmol/L IPTG诱导目的蛋白的表达，
培养8 10h。4°C 4500rpm离心20min收集菌体，加入菌体裂解液重悬菌体，室温裂解10 30min，4°C 13200rpm离心20min取上清，用0. 45 μ m的滤器过滤上清，将上清液上 Ni2+-金属螯合树脂亲和层析柱，纯化目的蛋白。将洗脱液装入已处理好的透析袋，PBS4°C 透析Mh，冷冻干燥法浓缩蛋白，BCA法测定蛋白含量，于-80°C分装保存。三.重组融合蛋白质的细胞膜穿透功能和上调抗HIV-I基因表达的功能1.激光共聚焦检测细胞膜穿透功能将纯化后的融合蛋白以10 μ g/ml的浓度加入到单层生长的Hela细胞爬片中作为实验组，分别以加入vMII^s和生理盐水组作为阴性对照和空白对照。分别在加入融合蛋白 0. 5h，Ih和2h后，用4%多聚甲醛室温下固定细胞lOmin，然后浓度为0. 2%的"Triton-XlOO 对细胞透化打孔15min，蘸洗干净后在盖玻片上滴加vMII^s小鼠的单抗作为一抗，4°C过夜。 次日，再次蘸洗盖玻片，滴加DYLight594标记山羊抗小鼠IgG，室温孵育lh，封片。采用激光共聚焦技术，在488nm激光激发荧光，观察细胞内融合蛋白的有无、相对量的多少及细胞内的分布，判断Pvs融合蛋白穿透细胞膜的能力和所需时间。结果如图4所示，随着时间的推移进入细胞内的融合蛋白量越来越多。证明CPP-vMII^s融合蛋白具有穿透细胞膜的功能。2.实时定量PCR检测上调抗HIV-I基因表达的功能融合蛋白以10 μ g/ml的浓度加入到人微血管内皮细胞系HM C-I细胞后Mh，消化、离心收集细胞，抽提细胞总RNA，逆转录成cDNA。然后采用STOR Green染料进行实时定量 PCR 技术，检测 5 条抗 HIV-I 感染基因 AP0BEC3G (A3G)，AP0BEC3F (A3F)，RANTES (CCL5)， MX1(ISG15)，MX2(ISG20)的表达情况。5条抗HIV-I感染基因的引物设计为:
权利要求
1.一种抗病毒融合蛋白，主要包括细胞穿膜肽结构域和病毒巨噬细胞炎症蛋白 (vMIP)，所述细胞穿膜肽结构域和病毒巨噬细胞炎症蛋白形成串联结构，所述病毒巨噬细胞炎症蛋白为下列之一或其中两种以上的组合(1)vMIP-I:MAPVHVLCCVSVLLATFYLTPTESAGSLVSYTPNSCCYGFQQHPPPVQILKEWYPTSPACPKP GVILLTKRGRQICADPSKNWVRQLMQRLPAIA ；(2)vMIP-II:MDTKGILLVAVLTALLCLQS⑶TLGASWHRPDKCCLGYQKRPLPQVLLSSWYPTSQLCSKPG VlFLTKRGRQVCADKSKDffVKKLMQQLPVTAR ；(3)vMIP-I11:MWSMCWVLRAHLGLLFffVAVIELCAASGPATIMASDCCENSLSSARLPPDKLICGWYffTST VYCRQKAVIFVTHSGRKVCGSPAKRRTRLLMEKHTEIPLAKRVALRAGKGLCP。
2.如权利要求1所述的抗病毒融合蛋白，其特征在于所述细胞穿膜肽为下列之一或其中两种以上的组合(1)PEP-I=KETffffETffffTEffSQPKKKRKV ；(2)HIV-ITat :GRKKRRQRRRPPQ ；(3)penetratin(Antp)=RQIKIffFQNRRMKffKK ；(4)transportan=GffTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL ；(5)TPlO:AGYLLGKINLKALAALAKKIL ；(6)Oligoarginine(R8) :RRRRRRRR ；(7)MAP:KLALKLALKALKAALKLA ；(8)MPG=GALFLGFLGAAGSTMGAffSQPKKKRKV ；(9)MPGα :GALFLAFLAAALSLMGLWSQPKKKRKV。
3.如权利要求1或2所述的抗病毒融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白中还含有蛋白质纯化标签。
4.如权利要求3所述的抗病毒融合蛋白，其特征在于所述蛋白质纯化标签为6XHis或 GST标签。
5.如权利要求1所述的抗病毒融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白氨基酸序列如下K ETWWETffffTEffSQPKKKRKVMDTKGILLVAVLTALLCLQSGDTLGASffHRPDKCCLGYQKRPLPQVLLSSffYPTSQL CSKPGVIFLTKRGRQVCADKSKDWVKKLMQQLPVTARo
6.如权利要求1 5之一所述的抗病毒融合蛋白在制备抗艾滋病的药物中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述药物为上调宿主抗HIV-I基因表达的药物。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述抗HIV-I基因为下列之一CCL5、 AP0BEC3F、AP0BEC3G、MXl、MX2。
9.如权利要求1 5之一所述的抗病毒融合蛋白在制备抗乙型肝炎的药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种抗病毒融合蛋白及其应用，所述融合蛋白主要包括细胞穿膜肽(CPP)结构域和病毒巨噬细胞炎症蛋白(vMIP)，所述细胞穿膜肽结构域和病毒巨噬细胞炎症蛋白形成串联结构。该融合蛋白能够以一种非受体、非能量依赖的方式进入细胞，有效提高细胞内抗病毒免疫基因表达水平，最终抑制HIV及HBV等病毒的感染，为艾滋病的预防和治疗提供了一种全新的思路和方法。
文档编号A61P31/20GK102311500SQ20101021633
公开日2012年1月11日 申请日期2010年7月2日 优先权日2010年7月2日
发明者杨磊, 狄春红, 王小波, 罗燕, 谭晓华 申请人:杭州师范大学