专利名称：间隙连接蛋白及其编码基因在制备逆转肿瘤干细胞恶性表型的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及间隙连接蛋白及其编码基因在制备逆转肿瘤干细胞恶性表型的药物 中的应用，属于生物医药领域。
背景技术：
恶性肿瘤是严重危害人类健康的高发病率和高致死率疾病。传统肿瘤治疗都是针 对所有的肿瘤细胞，而且认为肿瘤细胞具有功能同质性。近年来，随着肿瘤干细胞(Tumour stem cells,TSC)相继在不同的肿瘤组织中分离成功，有力的证明了肿瘤干细胞的存在，为 深入探讨肿瘤的发生、发展及评价预后等提供了新的理论依据，也为肿瘤治疗带来了新的 思路。越来越多的证据表明，肿瘤细胞具有功能异质性，在肿瘤细胞群体中，只有肿瘤干细 胞亚群才有自我更新、多向分化及成瘤能力，是肿瘤发生、进展和复发的根源。只有杀灭肿 瘤干细胞，才能达到根治肿瘤的目的。因此，肿瘤治疗的关键应是针对肿瘤干细胞的治疗。间隙连接(gap junction, GJ)是细胞间连接方式的一种，由间隙连接蛋白 (connexin, Cx)构成。相邻细胞间通过间隙连接介导的间隙连接通讯(gap junction intercelluar communication,GJIC)进行信息、能量和物质的交换，对细胞的新陈代谢、内 环境稳定、增殖和分化等生理过程起重要的调控作用。在间隙连接蛋白家族中，间隙连接蛋 白43(Cx43)表达最为广泛，对于保持正常的间隙连接通讯功能至关重要。大量研究表明，间隙连接通讯功能缺陷与多种肿瘤的发生和转移密切相关。在肿 瘤形成过程中，间隙连接通讯功能的抑制或缺失使前肿瘤细胞或转化细胞与周围正常细胞 之间的信息传递受阻，失去周围正常细胞的调控而获得自主性生长，进而发展成肿瘤细胞。 肿瘤细胞之间同型间隙连接通讯被破坏在导致肿瘤细胞异质性增加的同时可导致细胞之 间解离，从而促进肿瘤转移，转移能力与间隙连接通讯呈负相关。而间隙连接通讯功能缺陷 与间隙连接蛋白的表达降低或消失密切相关。许多肿瘤细胞如胶质瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌、 前列腺癌细胞等均显示相应的间隙连接蛋白表达降低或缺失。应用间隙连接蛋白基因转 染肿瘤细胞，可见间隙连接蛋白表达升高，间隙连接通讯功能恢复，肿瘤生长和转化表型抑 制。因此，间隙连接蛋白及其基因是良好的抗肿瘤药物靶标。但是，上述研究结果均是以肿 瘤细胞为研究对象，而肿瘤干细胞中，间隙连接通讯的功能状态、间隙连接蛋白的表达情况 以及其同肿瘤干细胞特殊的生物学特性之间的关系尚不清楚。
发明内容
有鉴于此，为克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供间隙连接蛋白及其编 码基因在制备逆转肿瘤干细胞恶性表型的药物中的应用。为达到此目的，在本发明的第一方面，提供了间隙连接蛋白在制备逆转肿瘤干细 胞恶性表型的药物中的应用。进一步，所述肿瘤干细胞为胶质瘤干细胞；
进一步，所述药物包括间隙连接蛋白和药学上可接受的载体；进一步，所述间隙连接蛋白为间隙连接蛋白43。在本发明的第二方面，提供了间隙连接蛋白编码基因在制备逆转肿瘤干细胞恶性 表型的药物中的应用。进一步，所述肿瘤干细胞为胶质瘤干细胞；进一步，所述药物包括间隙连接蛋白编码基因重组表达载体和药学上可接受的载 体；进一步，所述间隙连接蛋白编码基因为间隙连接蛋白43的编码基因GJAl ；进一步，所述间隙连接蛋白编码基因重组表达载体为GJAl基因重组腺病毒，所述 GJAl基因重组腺病毒是将人GJA7基因表达盒插入El区缺失的复制缺陷型腺病毒载体的 El区缺失位置而得到；进一步，所述人GJAl基因表达盒包括启动子、人GJAl基因cDNA和终止子，所述启 动子为CMV，所述终止子为PloyA。本发明的有益效果在于本发明考察了肿瘤干细胞中间隙连接通讯的功能状态、 间隙连接蛋白的表达情况以及其同肿瘤干细胞特殊的生物学特性之间的关系。结果显示， 同分化肿瘤细胞相比，肿瘤干细胞中存在间隙连接通讯障碍，细胞间未见明显间隙连接样 结构，多种间隙连接蛋白表达下调，尤其是间隙连接蛋白43 ；间隙连接蛋白43的表达下调， 与其编码基因GJAl启动子甲基化以及microRNA的表达相关；恢复间隙连接蛋白43在肿 瘤干细胞中的表达，能够显著降低肿瘤干细胞的自我更新和成瘤能力，同时明显降低肿瘤 干细胞的侵袭能力，这与间隙连接通讯功能的部分恢复、E-钙粘素(E-Cadherin)表达上调 以及SDF-1/CXCR4下游信号通路(AKT和ERK1/2)失活有关。因此，间隙连接蛋白及其编码 基因可用于制备逆转肿瘤干细胞恶性表型的药物，在肿瘤治疗领域具有良好的潜在应用前
旦
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为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进 一步的详细描述，其中图1显示了 6例人原代恶性胶质瘤标本Pl P6的切片HE染色结果；其中P1为 男性，45岁，右侧额叶，星形细胞瘤，II级；P2为女性，37岁，左侧颞叶，星形细胞瘤，II级； P3为男性，45岁，右侧额叶，多形性胶质母细胞瘤，IV级；P4为男性，55岁，左侧额叶和颞 叶，多形性胶质母细胞瘤，IV级；P5为男性，55岁，右侧额叶，多形性胶质母细胞瘤，IV级； P6为男性，60岁，左侧顶叶和颞叶，多形性胶质母细胞瘤，IV级。图2显示了肿瘤干细胞及其分化细胞形态的显微鉴定结果；其中A I为不同来 源的肿瘤干细胞球A来源于恶性胶质瘤U87细胞系，B来源于乳腺癌MCF-7细胞系，C来源 于结肠癌HCT116细胞系，D I来源于Pl P6 J 0为不同来源的肿瘤干细胞球的分化 细胞J来源于U87，K来源于MCF-7，L来源于HCTl 16，M 0来源于Pl P3，箭头所指处 为肿瘤干细胞球；光学显微镜放大倍数为200倍。图3显示了肿瘤干细胞标志物的免疫荧光染色鉴定结果；其中A为来源于U87的 肿瘤干细胞球鉴定巢蛋白(nestin)，红色荧光，标尺为20 μ m ;B D为来源于Pl P3的肿瘤干细胞球鉴定nestin，红色荧光，标尺依次为50、30和70 μ m ；E为来源于U87的肿瘤干 细胞球鉴定⑶133，红色荧光，标尺为75 μ m ;F H为来源于Pl P3的肿瘤干细胞球鉴定 ⑶133，红色荧光，标尺依次为50、25和50μπι;Ι为来源于U87的肿瘤干细胞球鉴定八聚体 结合蛋白_4 (0ct4)，绿色荧光，标尺为100 μ m ； J为来源于U87的肿瘤干细胞球鉴定⑶44s， 红色荧光，标尺为25 μ m ;K为来源于MCF-7的肿瘤干细胞球鉴定⑶44s，红色荧光，标尺为 25 μ m ;L为来源于HCTl 16的肿瘤干细胞球鉴定⑶133，红色荧光，标尺为50 μ m ；细胞核为 蓝色荧光。图4显示了肿瘤干细胞分化标志物的免疫荧光染色鉴定结果；其中A E为 来源于U87的肿瘤干细胞球的分化细胞:A鉴定胶质纤维酸性蛋白(GFAP)，红色荧光，标 尺为75 μ m;B鉴定髓鞘碱性蛋白(MBP)，红色荧光，标尺为75ym;C鉴定β-微管蛋白 III ( β -tubulin III)，绿色荧光，标尺为75 μ m ;D鉴定nestin,红色荧光，标尺为10 μ m ； E鉴定⑶133，红色荧光，标尺为25 μ m ;F J为来源于Pl的肿瘤干细胞球的分化细胞F 和G鉴定GFAP，绿色荧光，F标尺为500 μ m, G标尺为75 μ m ;H鉴定MBP，绿色荧光，标尺为 50 μ m ;1鉴定β -tubulinlll，绿色荧光，标尺为50 μ m J鉴定nestin，绿色荧光，标尺为 75 μ m ；细胞核为蓝色荧光；箭头所指处为肿瘤干细胞球。图5显示了肿瘤干细胞成瘤能力鉴定结果；其中A为皮下接种IX IO5个来源于 U87的肿瘤干细胞8周，B为原位接种IX IO4个来源于U87的肿瘤干细胞6周，C为原位接 种5X IO3来源于P3的肿瘤干细胞6周；箭头所指处为肿瘤。图6显示了肿瘤干细胞的荧光漂白恢复实验结果；各组数据之间进行单因素方 差分析和 t 检验:a :F = 30. 24，P = O. 000 < 0. 01 ；b :P = 0. 005 < 0. 01 ；c :P = 0. 013 < 0. 05 ；d :P = 0. 889 > 0. 05 ；e :t = -2. 805，P = O. 038 < 0. 05 ；f :t = -4. 514，P = 0. 010 < 0. 05 ；g :t = -4. 930，P = O. 003 < 0. 01 ；h :t = _1· 414，P = O. 207 > 0. 05。图7显示了肿瘤干细胞间隙连接样结构的显微检测结果；其中A为来源于U87的 肿瘤干细胞球的扫描电子显微图，标尺为1(^!11出为来源于现7的肿瘤干细胞球的透射电 子显微图，标尺为10(^!11;(为来源于现7的肿瘤干细胞球的分化细胞的透射电子显微图， 标尺为200 μ m;方框区为细胞连接区，箭头所指处为间隙连接样结构。图8显示了肿瘤细胞干细胞中间隙连接蛋白基因表达的RT-PCR检测结果；其中 1泳道为来源于U87的贴壁未成球肿瘤细胞，2泳道为来源于U87的肿瘤干细胞球。图9显示了肿瘤干细胞中间隙连接蛋白基因表达的实时定量RT-PCR检测结果。图10显示了肿瘤干细胞中间隙连接蛋白43表达的Western-blot检测结果；其 中1泳道为来源于U87的贴壁未成球肿瘤细胞，2泳道为来源于U87的肿瘤干细胞球。图11显示了肿瘤干细胞中间隙连接蛋白43表达的流式细胞术检测结果；其中 无阴影曲线为来源于U87的肿瘤干细胞球，有阴影曲线为阴性对照。图12显示了肿瘤干细胞中间隙连接蛋白43表达的免疫荧光染色检测结果；其中 A F为不同来源的肿瘤干细胞球，A来源于U87，B D来源于Pl P3，E来源于MCF_7，F 来源于HCT116 ；G和I L为不同来源的贴壁未成球肿瘤细胞，G来源于U87，I来源于P2， J来源于P3，K来源于MCF-7，L来源于HCTl 16 ；H为来源于U87的肿瘤干细胞球的分化细 胞；A和C的标尺为100 μ m，B禾口 D的标尺为50 μ m，E L的标尺为25 μ m。图13显示了肿瘤干细胞中干细胞标志物与间隙连接蛋白43的免疫荧光双重染色
5检测结果；其中一所指处为干细胞标志物，绿色荧光；>所指处为间隙连接蛋白43，红色 荧光，细胞核为蓝色荧光。图14显示了肿瘤干细胞中干细胞标志物与间隙连接蛋白43的免疫组织化学双重 染色检测结果；其中间隙连接蛋白43为深红色颗粒，干细胞标志物
为深棕色颗粒(箭头所指处和圆圈内)；光学显微镜放大倍数 为200倍。图15显示了肿瘤干细胞中GJAl基因启动子甲基化水平的检测结果；其中A为高 频声波处理染色质结果，其中M泳道为DNA分子量标准，+为经高频声波处理，-为未经高频 声波处理，1泳道为来源于U87的贴壁未成球肿瘤细胞，2泳道为来源于U87的肿瘤干细胞 球的分化细胞，3泳道为来源于U87的肿瘤干细胞球；B为实时定量PCR扩增GJAl基因启动 子区域1和区域2的示意图；C和D分别为GJAl基因启动子区域1和区域2的扩增结果， 其中1为来源于U87的贴壁未成球肿瘤细胞，2为来源于U87的肿瘤干细胞球的分化细胞， 3为来源于U87的肿瘤干细胞球。图16显示了肿瘤干细胞中以GJAl基因转录本为靶点的microRNA表达情况；其 中1为来源于U87的肿瘤干细胞球，2为来源于U87的贴壁未成球肿瘤细胞。图17显示了 GJAl基因重组腺病毒的滴度测定结果；其中A为阴性对照，B为GJAl 基因重组腺病毒Ad-Cx43，C为GFP基因对照腺病毒Ad-GFP ；光学显微镜放大倍数为100倍。图18显示了转染GJAl基因重组腺病毒后，肿瘤干细胞形态的显微检测结果；其 中，A为荧光显微镜鉴定结果，B为倒置相差显微镜鉴定结果。图19显示了 GJAl基因重组腺病毒转染效率的流式细胞术检测结果；其中深色 部分为阴性对照，浅色部分为GJAl基因重组腺病毒Ad-Cx43。图20显示了转染GJAl基因重组腺病毒后，肿瘤干细胞中GJAl基因表达的实时定 量RT-PCR检测结果。图21显示了转染GJAl基因重组腺病毒后，肿瘤干细胞中间隙连接蛋白43表达的 免疫荧光染色检测结果。图22显示了转染GJAl基因重组腺病毒后，肿瘤干细胞的荧光漂白恢复实验结果； 各组数据之间进行单因素方差分析a :t = -2. 350，P = 0. 05 ；b :t = -1. 276，P = O. 249。图23显示了转染GJAl基因重组腺病毒后，第1代肿瘤干细胞球生长情况检测结 果；各组数据之间进行单因素方差分析a =F = 61. 82，P = 0. 000 < 0. 01 ；b =P = 0. 934 > 0. 05 ；c :P = 0. 000 < 0. 01 ；d :P = 0. 000 < 0. 01。图24显示了转染GJAl基因重组腺病毒后，肿瘤干细胞的分化生长曲线。图25显示了皮下接种GJAl基因重组腺病毒转染的肿瘤干细胞后，裸鼠的肿瘤生 长曲线。图26显示了皮下接种GJAl基因重组腺病毒转染的肿瘤干细胞后，裸鼠的肿瘤组 织切片HE染色结果；光学显微镜放大倍数为200倍。图27显示了原位接种GJAl基因重组腺病毒转染的肿瘤干细胞后，裸鼠的肿瘤生 长情况和肿瘤组织切片HE染色结果；其中箭头所指处为肿瘤，光学显微镜放大倍数为200 倍；右下角小图为裸鼠脑组织。图28显示了转染GJAl基因重组腺病毒后，U87细胞分化标志物GFAP和干细胞标
6志物⑶133的实时定量RT-PCR检测结果。图29显示了转染GJAl基因重组腺病毒后，肿瘤干细胞的侵袭能力检测结果[以 胎牛血清(FBS)为招引物]；各组数据之间进行单因素方差分析a =F = 22. 480,P = 0. 000
<0. 01 ；b :P = 0. 975 > 0. 05 ；c :P = 0. 000 < 0. 01 ；d :P = 0. 009 < 0. 01。图30显示了转染GJAl基因重组腺病毒后，肿瘤干细胞的侵袭能力检测结果[以 基质细胞衍生因子1 α (SDF-1 α )为招引物]；各组数据之间进行单因素方差分析a =F = 16. 860，P = O. 000 < 0. 01 ；b :P = 0. 783 > 0. 05 ；c :P = 0. 004 < 0. 01 ；d :P = 0. 016
<0. 05。图31显示了转染GJAl基因重组腺病毒后，肿瘤干细胞中E-Cadherin表达的 Western-blot 检测结果。图32显示了转染GJAl基因重组腺病毒后，肿瘤干细胞中E-Cadherin表达的免疫 荧光染色检测结果；其中Ad-Cx43转染组的标尺为10 μ m, Ad-GFP转染组的标尺为50 μ m。图33显示了转染GJAl基因重组腺病毒的肿瘤干细胞接受SDF-I α刺激后，磷酸 化AKT和ERK1/2表达的Western-blot检测结果。
具体实施例方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中的主要试剂碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)购自Upstate公司， 表皮细胞生长因子(EGF)和胰岛素(insulin)购自Sigma公司，自血病抑制因子(LIF) 购自Chemicon公司，B27添加剂购自Gibco公司；小鼠抗人nestin单克隆抗体、兔抗人 MBP多克隆抗体、小鼠抗人β-tubulin III单克隆抗体、小鼠抗人Sox2单克隆抗体和小 鼠抗人01 igo2单克隆抗体购自Chemicon公司，小鼠抗人CD133单克隆抗体购自Abcam公 司，兔抗人0ct4多克隆抗体购自BioVision公司，小鼠抗人⑶44s单克隆抗体购自Neo Markers公司，兔抗人GFAP多克隆抗体购自Dako公司，异硫氰酸荧光素(FITC)标记山羊 抗兔IgG、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记山羊抗兔IgG和Cy3标记山羊抗鼠IgG购 自Molecular Probes公司，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)购自Sigma公司，基质胶 购自 Sigma 公司；试剂盒TaRaKa RNAPCR kit 3. 0 和 SYBR PrimeScript PCR kit 购自 TaRaKa公司，增强型化学发光试剂盒购自ECI公司，EnVision两步法免疫组化试剂盒购自 Dako 公司，Adenovirus titer immunoassay Kit 购自 Cell Biolabs 公司，Cell Counting Kit-8 (CCK-8)购自 Dojindo 公司。优选实施例中的主要仪器KYKY-EM3200型扫描电子显微镜购自北京中科科仪技 术发展有限责任公司，JEM-2000EX型透射电子显微镜购自日立公司，AlphaEase FC凝胶 图像分析软件购自Alpha Innotech公司，Coulter Epics XL型流式细胞仪购自Beckman Coulter公司，MiRCURY 微阵列系统购自Exiqon公司，μ Quant型酶标仪购自Bio-TEK公司。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实 验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或 按照制造厂商所建议的条件。一、肿瘤干细胞的分离与鉴定
1、肿瘤干细胞的分离分别从人恶性胶质瘤细胞系U87、乳腺癌细胞系MCF-7、结肠癌细胞系HCT116以及 6例人原代恶性胶质瘤标本Pl P6(如图1所示)中分离肿瘤干细胞。从U87、MCF-7或HCT116中分离肿瘤干细胞在24孔培养板中，将U87、MCF-7或 HCTl 16细胞以2X IO4/孔的密度接种于500 μ 1含有体积分数为10%的FBS的DMEM培养基 中，在温度为37°C、C02体积分数为5%和饱和湿度的条件下培养；接种后12 18小时，加 入500 μ 1无血清干细胞培养基，之后每隔24小时半量更换新鲜无血清干细胞培养基1次； 5日后，更换为完全无血清干细胞培养基；约1周后，待悬浮生长的肿瘤干细胞球增大至每 球含200个细胞时，收集细胞球，吹打成单细胞悬液，再接种于无血清干细胞培养基中进行 传代。从Pl Ρ6中分离肿瘤干细胞将Pl Ρ6剪成约1 X 1 X Imm大小的碎块，接种 于0. 5ml FBS中，在温度为37°C、C02体积分数为5%和饱和湿度的条件下培养，接种4小时 后，加入3ml含有体积分数为10 %的FBS的DMEM培养基，待单层细胞出现后，用质量分数为 0. 25%的胰酶溶液消化，吹打成单细胞悬液，再接种于无血清干细胞培养基中，约1 2周 后，待悬浮生长的肿瘤干细胞球增大至每球含100个细胞时，收集细胞球，吹打成单细胞悬 液，再接种于无血清干细胞培养基中进行传代。上述无血清干细胞培养基的组成如下DMEM/F12培养基，其中含有浓度为20ng/ ml的bFGF、浓度为20ng/ml的EGF、浓度为10ng/ml的LIF、浓度为4U/L的胰岛素和1 XB27。2、肿瘤干细胞的鉴定(1)肿瘤干细胞及其分化细胞的形态鉴定分别将U87、MCF_7、HCT116和Pl P6细胞接种于无血清干细胞培养基后，绝大多 数细胞呈悬浮状态，极少数细胞贴壁分化，24 48小时后培养基中开始出现悬浮生长的肿 瘤干细胞球，初始细胞球较小，由4 16个细胞组成，细胞呈圆形，大小一致，折光性强，立 体饱满，此后悬浮于培养基中的细胞球逐渐增多，体积逐渐增大，形态更加规则(如图2A I所示)。传代后，肿瘤干细胞球的生长过程及细胞形态与第一代保持一致。分别将来源于U87、MCF_7、HCT116和Pl P3的肿瘤干细胞球用含有质量分数为 10%的FBS的DMEM培养基诱导分化，6小时后球体贴壁，有少数细胞从球体迁出，24小时后 球体变扁，迁出的细胞明显增多，3 5天后大量细胞从球体迁出，紧密围绕在球体周围，分 化成为神经元或胶质细胞样细胞，细胞核大小不一，异质性明显(如图2J O所示)。(2)肿瘤干细胞及其分化细胞的标志物鉴定采用免疫荧光染色鉴定肿瘤干细胞及其分化细胞的标记物mestin、⑶133、0ct4 和CD44s(干细胞标记物)，GFAP(星形胶质细胞标记物)，MBP(少突胶质细胞标记物)， β -tubulinIII (神经元标记物)。分别将来源于U87、MCF-7、HCTl 16和Pl P3的肿瘤干细胞球用PBS漂洗后，用 质量分数为4%的多聚甲醛溶液于室温下固定20分钟制备细胞爬片，或用冷丙酮于4°C固 定20分钟制备冰冻切片，加入一抗小鼠抗人nestin单克隆抗体、小鼠抗人CD133单克隆 抗体、兔抗人0ct4多克隆抗体或小鼠抗人CD44s单克隆抗体，4°C孵育过夜，用PBS漂洗后， 再加入相应的二抗FITC(绿色荧光)标记山羊抗兔IgG、TRITC(红色荧光)标记山羊抗兔 IgG或Cy3 (红色荧光)标记山羊抗鼠IgG，37°C孵育1小时，用PBS漂洗后，再用DAPI (蓝色荧光)标记细胞核，置激光共聚焦显微镜下观察。结果如图3所示，可见来源于U87的肿 瘤干细胞球nestin、CD133、0ct4和CD44s表达呈阳性，来源于MCF-7和HCTl 16的肿瘤干细 胞球⑶44s表达呈阳性；来源于Pl P3的肿瘤干细胞球nestin和⑶133表达呈阳性。分别将来源于U87和Pl的肿瘤干细胞球用含有质量分数为10%的FBS的DMEM培 养基诱导分化2周，用PBS漂洗后，用质量分数为4%的多聚甲醛溶液于室温下固定20分钟 制备细胞爬片，或用冷丙酮于4°C固定20分钟制备冰冻切片，加入一抗兔抗人GFAP多克 隆抗体、兔抗人MBP多克隆抗体、小鼠抗人β-tubulin III单克隆抗体、小鼠抗人nestin单 克隆抗体或小鼠抗人CD133单克隆抗体，4°C孵育过夜，用PBS漂洗后，再加入相应的二抗 FITC(绿色荧光)标记山羊抗兔IgG、TRITC(红色荧光)标记山羊抗兔IgG或Cy3 (红色荧 光)标记山羊抗鼠IgG，37°C孵育1小时，用PBS漂洗后，再用DAPI (蓝色荧光)标记细胞 核，置激光共聚焦显微镜下观察。结果如图4所示，可见来源于U87和Pl的肿瘤干细胞球的 分化细胞DFAP、MBP和β-tubulin III表达呈阳性，同时还有散在的细胞nestin和⑶133 表达呈阳性，提示来源于U87和Pl的肿瘤干细胞具有多向分化潜能，同时，在含血清培养基 中，仍有少量细胞保持其干细胞状态。(3)肿瘤干细胞的成瘤能力鉴定取4周龄雌性裸鼠，于皮下或原位接种来源于U87或P3的肿瘤干细胞，接种6 8周后，取肿瘤组织，用含有质量分数为4%的多聚甲醛的饱和蔗糖溶液固定，8 μ m切片，HE 染色，置光学显微镜下观察。结果如图5所示，可见由来源于U87和P3的肿瘤干细胞形成的 肿瘤具备人多形性胶质母细胞瘤的病理学特征①坏死；②病理性核分裂相；③血管丰富， 密度高；④多形性；⑤蟹爪样侵袭，肿瘤边界不清。二、肿瘤干细胞中间隙连接通讯的功能状态及间隙连接蛋白的表达情况1、肿瘤干细胞存在间隙连接通讯障碍采用荧光漂白恢复(Fluorescence Recovery after Photobleaching，FRAP)实验 评估肿瘤干细胞间的间隙连接通讯情况。分别将来源于U87、MCF-7、HCTl 16和P2 P3的肿瘤细胞(肿瘤干细胞球、贴壁 未成球肿瘤细胞、肿瘤干细胞球的分化细胞)接种于盖玻片上，用含有浓度为1.25mmol/l 的CaCl2和浓度为0. 5mmol/l的MgCl2的Hank’ s液漂洗细胞3次，用浓度为10 μ g/ml的 5 (6)-羧基荧光素二乙酸盐[5(6)-CFDA]于37°C孵育15分钟，再用含有浓度为1. 25mmol/l 的CaCl2和浓度为0. 5mmol/l的MgCl2的Hank’ s液漂洗细胞3次，在激光共聚焦显微镜下 选择至少与3个以上细胞相邻的肿瘤细胞作为实验肿瘤细胞，同时选择与其它细胞不相邻 的肿瘤细胞作为对照，将实验肿瘤细胞以激光漂白至初始荧光强度的50 90%，记录4分 钟内胞内荧光强度的恢复情况，按下述公式计算恢复率恢复率％=(恢复后荧光强度-漂 白后荧光强度)/(漂白前荧光强度-漂白后荧光强度)X 100，实验肿瘤细胞漂白前后和恢 复后的荧光强度用对照肿瘤细胞进行校正。结果如图6和表1所示，除了来源于HCT116的 肿瘤干细胞外，来源于U87、MCF-7和P2 P3的肿瘤干细胞的恢复率均明显低于相应的贴 壁未成球肿瘤细胞或肿瘤干细胞球的分化细胞，提示肿瘤干细胞间的间隙连接通讯明显降 低。表1不同来源的肿瘤细胞的荧光漂白恢复率(又±SD%)
9
权利要求
间隙连接蛋白在制备逆转肿瘤干细胞恶性表型的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的间隙连接蛋白的应用，其特征在于所述肿瘤干细胞为胶质 瘤干细胞。
3.根据权利要求1所述的间隙连接蛋白的应用，其特征在于所述药物包括间隙连接 蛋白和药学上可接受的载体。
4.根据权利要求1至3任一权利要求所述的间隙连接蛋白的应用，其特征在于所述 间隙连接蛋白为间隙连接蛋白43。
5.间隙连接蛋白编码基因在制备逆转肿瘤干细胞恶性表型的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的间隙连接蛋白编码基因的应用，其特征在于所述肿瘤干细 胞为胶质瘤干细胞。
7.根据权利要求5所述的间隙连接蛋白编码基因的应用，其特征在于所述药物包括 间隙连接蛋白编码基因重组表达载体和药学上可接受的载体。
8.根据权利要求5至7任一权利要求所述的间隙连接蛋白编码基因的应用，其特征在 于所述间隙连接蛋白编码基因为间隙连接蛋白43的编码基因GJA1。
9.根据权利要求8所述的间隙连接蛋白编码基因的应用，其特征在于所述间隙连接 蛋白编码基因重组表达载体为GJAl基因重组腺病毒，所述GJAl基因重组腺病毒是将人 GJAl基因表达盒插入El区缺失的复制缺陷型腺病毒载体的El区缺失位置而得到。
10.根据权利要求9所述的间隙连接蛋白编码基因的应用，其特征在于所述人GJAl 基因表达盒包括启动子、人GJAl基因cDNA和终止子，所述启动子为CMV，所述终止子为 PloyA0
全文摘要
本发明公开了间隙连接蛋白及其编码基因在制备逆转肿瘤干细胞恶性表型的药物中的应用；本发明考察了肿瘤干细胞中间隙连接通讯的功能状态、间隙连接蛋白的表达情况以及其同肿瘤干细胞特殊生物学特性之间的关系，结果显示，同分化肿瘤细胞相比，肿瘤干细胞中存在间隙连接通讯障碍，细胞间未见明显间隙连接样结构，多种间隙连接蛋白表达下调，尤其是间隙连接蛋白43(Cx43)；Cx43的表达下调与其编码基因GJA1启动子甲基化以及microRNA的表达相关；恢复Cx43在肿瘤干细胞中的表达，能够显著降低肿瘤干细胞的自我更新能力、成瘤能力和侵袭能力，这与间隙连接通讯功能的部分恢复、E-钙粘素表达上调以及SDF-1/CXCR4下游信号通路(AKT和ERK1/2)失活有关；提示间隙连接蛋白及其编码基因可用于制备逆转肿瘤干细胞恶性表型的药物。
文档编号A61K48/00GK101966332SQ20101050806
公开日2011年2月9日 申请日期2010年9月29日 优先权日2009年9月29日
发明者余时沧, 卞修武, 姜建勇, 平轶芳, 王清良, 肖华亮 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院