专利名称：熊果酸作为抗结肠肿瘤药物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及熊果酸的应用，尤其是作为抗结肠肿瘤药物的应用。
背景技术：
结肠癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，在我国随着生活水平的提高发病率 逐年上升。结肠癌的治疗目前采取的是一种包括手术、放疗、化疗，靶向治疗以及生物、免疫 治疗等在内的综合治疗，但不管采用哪种手段，肠道癌的总体治愈率仍徘徊在50%左右，长 期生存率和生活质量仍不理想。EGFR/MAPK信号通路已证明与结肠癌的增殖，分化，血管形成等密切相关。通过阻 断EGFR信号通路治疗结肠癌的单克隆抗体西妥昔单抗已经在临床上广为应用并取得了很 大的进展，但西妥昔单抗只适用于K-RAS基因野生型的患者，还有约30-40% K-RAS基因突 变型的患者需要有更好的治疗药物；而且临床结肠癌标准的一线化疗方案中的奥沙利钼有 剂量限制性外周感觉神经毒性从而影响了继续使用。熊果酸广泛存在于自然界中，熊果酸(Ursolic acid)又名乌索酸、乌苏酸，分子 式C30H4803，分子量456. 68 ；文献报道它们具有抗炎，保护肝功能，免疫增强等作用，但 其确切的作用机制仍未阐明。在本发明被公布之前，尚未有任何专利公开或报道过本专利 申请中提及的熊果酸通过EGFR/MAPK信号通路发挥抗结肠癌肿瘤的作用及与奥沙利钼的 协同作用的相关报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供熊果酸作为抗结肠肿瘤药物的应用。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是熊果酸作为抗结肠肿瘤药物的应用。1.熊果酸在抗结肠癌中的作用熊果酸具有抑制结肠癌肿瘤细胞增殖作用及诱 导凋亡作用。熊果酸性能非常稳定。2.在裸鼠体内实验中，熊果酸能有效抑制结肠癌移植瘤的增殖，抑制瘤体血管生 成，而且对小鼠本身无明显毒副作用。3.熊果酸具有抑制结肠癌细胞EGFR/MAPK信号通路磷酸化的作用，其中抑制 ERK1/2蛋白磷酸化是其作用的关键靶点。4.熊果酸与结肠癌临床一线化疗药奥沙利钼协同作用，疗效更好。5.熊果酸对K-RAS基因突变的结肠癌细胞有更好的增殖抑制作用。本发明的有益效果是基于熊果酸抗结肠癌的作用机制，其能有效阻断EGFR信号 通路，可作为抗结肠癌的药物，对于治疗结肠肿瘤提供了新的思路，有助于寻找有效的作用 靶点和治疗药物的开发。
图1是熊果酸抑制四种大肠癌细胞株的增殖呈时间和剂量依赖性；图2是熊果酸对四种大肠癌细胞株的IC50值；图3是AV+PI检测显示熊果酸诱导四种大肠癌细胞株凋亡；图4是Western blot显示熊果酸促进Caspase家族激活从而促进凋亡；图5是Western blot显示熊果酸抑制BcL酶的表达；图6是熊果酸对SW620细胞相关信号通路的基因表达谱改变；图7是熊果酸对SW620细胞RAS/RAF/MEK/ERK1/2信号通路蛋白磷酸化的改变；图8是熊果酸对SW620细胞MAPK信号通路蛋白磷酸化的改变；图9是熊果酸下调SW620结肠癌细胞NF- κ B蛋白水平的表达；图10是熊果酸抑制ERK1/2和IKK α的磷酸化水平；图11是熊果酸和奥沙利钼联用诱导凋亡亚二倍体峰增加；图12是熊果酸和奥沙利钼合用后引起线粒体膜电位改变；图13是熊果酸和奥沙利钼合用后下调ERK1/2，AKT, IKK α蛋白磷酸化表达；图14是各组裸鼠实验结束时移植瘤重量比较；图15是各组裸鼠肝功能的改变；图16是各组移植瘤蛋白提取物的相关蛋白表达的改变；
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件，例如Sambrook等人编著的《分子克隆实验手册》中所述的实验条件，或按照试剂或试 剂盒制造商提供的实验条件。实施例1熊果酸对结肠癌细胞增殖抑制作用(1)在96孔细胞培养板内无菌接种人结肠癌细胞HT-29，SW620, SW480, LoVo, RKO 每孔接种0. Iml含1 X IO6细胞完全细胞培养液1640或L-15培养液。(2)每孔加入 0. Iml 含不同浓度(10 μ Μ，20 μ Μ，30 μ Μ，40 μ Μ，60 μ Μ，80 μ Μ)熊果 酸的完全细胞培养液，与细胞混勻后，将细胞放入37°C细胞培养箱内(含5%C02)培养48 小时。(3)终止细胞培养，用MTT法测定培养细胞活力。(4)结果发现细胞增殖抑制有明显的量效关系，其中对K-RAS基因突变的细胞株 有更好的增殖抑制作用。(见图1、图2)实施例2熊果酸促进人结肠癌细胞凋亡的作用(1)在6孔细胞培养板内无菌接种人肠道癌细胞SW620，SW480, LoVo, RK0,每孔接 种2ml含1 X IO6细胞完全细胞培养液L-15。(2)每孔加入不同浓度熊果酸(SW620细胞为15 μ M，30 μ M，60 μ M)，与细胞混勻 后，将细胞放入37°C细胞培养箱内(含5%C02)培养48小时。
(3)终止细胞培养，收取细胞送流式细胞学检测，结果提示熊果酸作用后凋亡比率 与细胞类型相关。(见图3、图4)。(4)同时收取熊果酸处理后的细胞行免疫印迹检测，观察到细胞caspase蛋白表 达增加与BcL-2蛋白家族表达下降与熊果酸呈显著的量效关系。(见图5)。实施例3熊果酸对人肠道癌细胞EGFR/MAPK信号通路的抑制作用(1)在6孔细胞培养板内无菌接种人肠道癌细胞SW620，每孔接种2ml含IX IO6细 胞完全细胞培养液L-15。(2)每孔加入不同浓度熊果酸(15 μ M，30 μ M，60 μ M)，与细胞混勻后，将细胞放入 37°C细胞培养箱内(含5%C02)培养48小时，收细胞提取蛋白。(3)用real-time PCR，免疫印迹方法观察EGFR/MAPK信号通路蛋白磷酸化水平的变化。(4)结果发现经上述浓度熊果酸处理可见EGFR/MAPK信号通路基因水平和蛋白 磷酸化水平明显下降，且具有剂量依赖关系，其中ERK1/2基因和蛋白磷酸化水平的下降是 其关键作用靶点。(见图6、图7、图8、图9、图10)。实施例4熊果酸与结肠癌一线临床化疗药奥沙利钼的协同作用(1)在6孔细胞培养板内无菌接种人肠道癌细胞SW620，每孔接种2ml含IX IO6细 胞完全细胞培养液L-15。(2)每孔加入不同浓度的熊果酸与奥沙利钼联用(10 μ M，15 μ M，30 μ M熊果酸或 单用，联用0. 64 μ Μ，1. 02 μ M的奥沙利钼)，与细胞混勻后，将细胞放入37°C细胞培养箱内 (含5% C02)培养48小时。(3)终止细胞培养，采用MTT方法计算出联合应用指数，结果见表1，由表可见熊果 酸与结肠癌临床化疗一线药物奥沙利钼有协同作用(4)同时收集上述方法培养和熊果酸单用或联用奥沙利钼处理的细胞，用流式细 胞术，线粒体膜电位，Western-blot方法观察细胞增殖，促进凋亡，EGFR/MAPK信号通路蛋 白水平的变化。(5)结果发现低于IC50的熊果酸与结肠癌临床化疗一线药物奥沙利钼在体外显 示有协同作用。(见图11、图12、图13)。表IMTT方法计算出联合应用指数
权利要求
熊果酸作为抗结肠肿瘤药物的应用。
全文摘要
本发明涉及熊果酸作为抗结肠肿瘤药物的应用。熊果酸具有抑制结肠癌肿瘤细胞增殖作用及诱导凋亡作用。在裸鼠体内实验中，熊果酸能有效抑制结肠癌移植瘤的增殖，抑制瘤体血管生成，而且对小鼠本身无明显毒副作用。熊果酸具有抑制结肠癌细胞EGFR/MAPK信号通路磷酸化的作用，其中抑制ERK1/2蛋白磷酸化是其作用的关键靶点。熊果酸与结肠癌临床一线化疗药奥沙利铂协同作用，疗效更好。熊果酸对K-RAS基因突变的结肠癌细胞有更好的增殖抑制作用。本发明提出的熊果酸作为抗结肠肿瘤药物的应用，为治疗结肠肿瘤提供了新的思路。
文档编号A61P35/00GK101991579SQ201010558050
公开日2011年3月30日 申请日期2010年11月23日 优先权日2010年11月23日
发明者单建贞, 张苏展 申请人:浙江大学