专利名称：产薯蓣皂甙元的枯草芽孢杆菌swb8的制作方法
技术领域：
本发明涉及应用微生物技术领域，具体涉及一株能合成分泌薯蓣皂甙元的内生 型的枯草芽孢杆菌 SWB8 {Bacillus subtil is SWB8)。
背景技术：
薯蓣皂甙元(Diosgenin，又名皂素)是薯蓣皂甙的水解产物，主要用作合成甾体 类药物的原材料，已广泛应用于化妆、保健、避孕镇痛、麻醉、降低胆固醇和治疗糖尿病等类 药物。目前，薯蓣皂甙元主要来源于薯蓣属O^xscorea)、葫芦巴属(Jrigonella)和闭鞘姜 属(Cb1Sto1S)植物。盾叶薯蓣(々ioscorea zingiberensis C. H. Wright)，又名黄姜，系多 年生草质藤本植物，其地下茎含有45 50%淀粉、40 50%纤维素及2 3%薯蓣皂甙元。 在中国黄姜是提取薯蓣皂甙元的主要来源，高峰时种植面积达180万亩，年产皂素近1000 吨，主要用于出口。国内主要应用强酸水解法等技术从黄姜植物中提取薯蓣皂甙元，但工艺 落后，统计数据显示，传统强酸水解法加工鲜黄姜140吨，可生产皂素1吨，产生废水400 500吨，COD 30000mg/L,B0D 8000mg/L，氨氮300 mg/L和10吨的废渣(沈康荣等，黄姜开发 与种植技术，湖北科学技术出版社)，对环境造成严重的污染。1993 年，Strobel 等(Science, 1993，260 (5105) 2142216)首次从短叶红豆 杉植物中分离出一株能合成抗癌物质紫杉醇的内生真菌，证明内生菌具有合成与宿主植 物相同或相似的活性成分的功能。这一发现为解决某些药用植物生长缓慢、资源紧缺等引 起的药源匮乏和生态破坏问题提供了新的思路。
发明内容
鉴于薯蓣皂甙元的药用价值及通过植物提取对环境的污染影响，本发明申请人开 展了寻求新资源来源的研究，首次成功地从黄姜植物中分离出能产薯蓣皂甙元的微生物。本发明的目的在于提供一株能合成分泌薯蓣皂甙元的枯草芽孢杆菌SWB8 {Bacillus subtil is SWB8)。本发明从黄姜植物地下茎的内部组织中，分离出一株产薯蓣皂甙元的枯草芽孢杆 菌SWBSMaci/^As subtil is SWB8)。该菌株已于2010年10月21日保藏在中国典型培养 物保藏中心，其简称CCTCC，保藏编号为CCTCC M 2010271。菌株接种于普通牛肉膏蛋白胨固体培养基，32 °C培养Mh，培养基上出现直径3 4mm、边缘粗糙、表面呈网格状突起的乳白色菌落。显微镜观察，菌体杆状，单个或成串排列， 大小为1 1.5X3 5丨Uil，革兰 氏阳性，形成内生孢子。培养48h，菌落扁平、边缘不规则、黄褐色，呈快速扩散蔓延生长；见 子实体，内充满卵圆形孢子，大小为0. 5 0. 8X 1 2 I Uii。液体培养形成菌膜、沉淀，泡沫
丰富。菌株需氧或兼性需氧生长，能够利用硝酸盐或亚硝酸盐，生长温度区间10 50°C，生 长适温30 ;35°C，pH6. 0 9. 0，可耐受9. 0%NaCl。菌株产薯蓣皂甙元、α -淀粉酶、α -葡萄糖苷酶、α -半乳糖苷酶、β -1，3-1，4-葡聚糖酶和脂肪酶等；可利用D-甘露醇、D-麦芽 糖、D-葡萄糖和支链淀粉等，菌株可生长于察氏培养基或高氏1号培养基。16S rDNA核心 序列1542bp (GenBank登录号HM210636)。根据形态学、生物化学特征和16S rDNA核心序 列比对结果，SWB8被鉴定为属于枯草芽孢杆菌类的菌株。本发明获得的枯草芽孢杆菌SWB8 (.Bacillus subtil is SWB8) CCTCC M 2010271 的分离、纯化和保种方法选取新鲜两年生黄姜植物地下茎的内部组织，切成薄片贴在含有 黄姜组织干粉的分离培养基上培养，挑取培养物在纯化培养基上纯化培养，纯化菌株转接 到不含黄姜干粉的保种培养基上适应性培养，并进行斜面保种。枯草芽孢杆菌SWB8 (.Bacillus subtil is SWB8) CCTCC M 2010271 的液体发酵产 物的提取将适量经过活化培养的菌株接种入液体发酵培养基进行发酵，发酵结束后离心 取发酵液的上清液，加入氯仿进行提取，收集有机相部分，减压浓缩挥发氯仿，再加入少许 氯仿提取残余物一次，烘干得发酵提取物。薄层层析、红外光谱和质谱等方法检测枯草芽孢杆菌SWB8(CCTCC M 2010271)、巨 大芽孢杆菌SWB15(由本发明申请人同时分离于黄姜的内生菌)和枯草芽孢杆菌(ATCC6633) 标准菌株的发酵提取物枯草芽孢杆菌SWB8的发酵液氯仿提取物为薯蓣皂甙元，分子式 C27H42O3,分子量414. 1 ；巨大芽孢杆菌SWB15和枯草芽孢杆菌标准菌株不产薯蓣皂甙元。生物活性检测结果显示枯草芽孢杆菌SWB8发酵所得薯蓣皂甙元抑制数种临床 致病菌株(金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、大肠埃希氏菌、伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏 菌、志贺氏痢疾杆菌)的生长；同时在适当浓度范围内能够诱导人肺腺癌细胞(AM9)凋亡， 而对人骨髓间质干细胞(MSCs)基本上没有毒性。本发明的优点是，菌株经多次传代，产薯蓣皂甙元能力稳定，无减弱。本发明与目 前从黄姜植物提取皂素工艺的最大不同在于，避免了强酸和黄姜副产物造成的环境污染， 不需要黄姜植物作为提取薯蓣皂甙元的来源，释放了土地，保护了有限的土地资源。本发明 提供的微生物可生产薯蓣皂甙元，具有潜在的工业化应用前景。
图 1:枯草芽孢杆菌 SWB8 (.Bacillus subtil is SWB8) CCTCC M 2010271 形态特 征
(a)32°C，培养24h的SWB8菌株在含有黄姜组织干粉的纯化培养基上的菌落；(b)包裹 成单链状子实体的内生孢子，子实体分散存在；(c)子实体以溶解或断裂方式释放内生孢 子；(d)互相粘连的内生孢子(光学显微镜拍摄)；(e)成熟的菌体；(f)互相粘连的内生孢 子(扫描电子显微镜拍摄)。刻度尺代表(a) Icm ； (b), (c)、(d)、(e)10|Lim和(f) 1 jLUll。图 2:枯草芽孢杆菌 SWB8 (.Bacillus subtil is SWB8) CCTCC M 2010271 的系统 进化分析树
选取17株来自土壤、植物根际和植物内部组织的芽孢杆菌的16S rDNA核心序列进行 比对；依据邻接法构建进化树；括弧内为菌株16S rDNA核心序列的序列号。图 3:枯草芽孢杆菌 SWB8 (.Bacillus subtil is SWB8) CCTCC M 2010271 所产的 薯蓣皂甙元的薄层层析分析
显色剂15%磷钼酸。SWB8 枯草芽孢杆菌SWB8 (CCTCC M 2010271)。ATCC6633 枯草芽孢杆菌标准菌株。Diosgenin 标准薯蓣皂甙元。SWB15 巨大芽孢杆菌SWB15 (由本研究 室同时分离于黄姜的内生菌)。图 4:枯草芽孢杆菌 SWB8 (.Bacillus subtil is SWB8) CCTCC M 2010271 所产的 薯蓣皂甙元的质谱(MS)分析
离子源类型ESI。阳离子模式钠离子。图 5 枯草芽孢杆菌 SWB8 (.Bacillus subtil is SWB8)CCTCC M 2010271 所产的薯 蓣皂甙元对A549和MSCs细胞生存能力的影响
A549和MSCs细胞和不同浓度的菌株发酵所得薯蓣皂甙元(2. 54,7. 62,12. 7,17. 78、
22. 86和25. 4 IilI )共同孵育Mh，用MTT法计算细胞的抑制率。图 6:枯草芽孢杆菌 SWB8 (.Bacillus subtil is SWB8) CCTCC M 2010271 所产的 薯蓣皂甙元诱导A549和MSCs细胞凋亡和死亡的能力
(a)正常A549细胞；(e)正常MSCs细胞；(b)、(c)和(d)为分别经2. M、7.62和
12.7 JlS Hli薯蓣皂甙元诱导的A549细胞；(f)、(g)和(h)为分别经2. 54、7. 62和 12. 7 μ2 Illl薯蓣皂甙元诱导的MSCs细胞。应用Annexin V -FITC/PI试剂盒检测。坐标 图右上区代表死亡细胞数，右下区代表凋亡细胞数。
具体实施例方式实施例一.枯草芽孢杆菌SWB8 (.Bacillus subtil is SWB8) CCTCC M 2010271 的 分离和鉴定
1.菌株的分离与纯化
(1)分离。培养基0. 3%牛肉膏；1%蛋白胨；0. 5%NaCl ；2%琼脂；1%黄姜干粉(黄姜去褐 色皮后干燥粉碎成粉末状)；蒸馏水；PH7.0。选取新鲜两年生黄姜植物的地下茎，洗净，95% 酒精烧灼，无菌条件下削去褐色皮，70%酒精浸泡lOmin，无菌蒸馏水洗净，再削去2 3mm 厚的外层组织，内部组织被切成2 3mm厚的薄片贴在培养基上，32°C，恒温培养。(2 )纯化。牛肉膏蛋白胨培养基0. 3%牛肉膏；1%蛋白胨；0. 5%NaCl ； 2%琼脂；1% 黄姜干粉；蒸馏水；PH7. 0。察氏(Czapek)改良培养基0. 2%NaN03或NaNO2 ；0. 1%K2HP04 ； 0. 05%KC1 ；0. 05%MgS04 ；0. 001%FeS04 ；2%蔗糖；洲琼脂；1%黄姜干粉；蒸馏水；pH7. 0。高氏 (Gause) 1 号改良培养基0. 1%KN03 ；0. 05%K2HP04 ；0. 05%NaCl ；0. 05%MgS04 ；0. 001%FeS04 ； 洲可溶性淀粉；洲琼脂；1%黄姜干粉；蒸馏水；PH7. 0。挑取培养物，用生理盐水稀释，在上 述三种培养基上划线接种菌株，320C，恒温培养。(3)保种。培养基0. 3%牛肉膏；1%蛋白胨；0. 5%NaCI ；2%琼脂；蒸馏水；pH7. 0。2.菌株的形态学和生物化学特征
(1)将菌株接种于纯化培养基培养，连续7 记录菌落、菌体形态和结构特征。菌 株形态结构特征见图1所示培养24h后，培养基上出现直径3 4 mm、边缘粗糙、表面呈 网格状突起的乳白色菌落；显微镜观察，菌体杆状，单个或成串排列，大小为1 1. 5X3
5 μιη,革兰氏阳性，形成内生孢子；培养4 后，菌落扁平、边缘不规则、黄褐色，呈快速扩 散蔓延生长，见单链状充满卵圆形孢子的子实体，内生孢子大小为0. 5 0. 8X 1 2 MiIi。液体培养易形成菌膜、沉淀，菌液淡黄色，泡沫丰富。菌株需氧或兼性需氧生长，能够利用 硝酸盐或亚硝酸盐，生长温度区间10 50°C，生长适温30 35°C，pH6. 0 9. 0，可耐受 9.0%NaCI。菌株可生长于察氏培养基或高氏1号培养基。 (2)应用法国生物梅里埃公司的VITEK 2 GP卡检测菌株的生物化学特性(见表1)
表 1.枯草芽孢杆菌 SWB8 {Bacillus subtil is SWB8) CCTCC M 2010271 的生化反应
结果
权利要求
1.一株可产薯蓣皂甙元的枯草芽孢杆菌SWB8 {Bacillus subtil is SWB8)，其特征在 于，保藏号CCTCC M 2010271,2010年10月21日在中国典型培养物保藏中心保藏。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌SWB8{Bacillus subtil is SWB8) CCTCC M 2010271，其特征在于，分离自一种药用植物盾叶薯蓣OVo1Scorea zingiberensis C. H. Wright，又名黄姜)的地下茎内部组织。
3.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌SWB8{Bacillus subtil is SWB8) CCTCC M 2010271， 其特征在于菌体1 1.5X3 5Jim,呈杆状，形成单链状充满卵圆形孢子的子实体，破溃或断裂方式释放相互粘连的内生孢子，菌落粗糙、网格状突起，液体发酵形成菌膜、沉淀、泡沫丰富，需氧或兼性需氧生长，能 够利用硝酸盐或亚硝酸盐和支链淀粉等，生长温度区间10 50°C，生长适温30 35°C， pH6. 0 9. 0，可耐受 9. 0%NaCl，16S rDNA 1542bp, Genbank 序列号 HM210636。
4.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌SWB8{Bacillus subtil is SWB8) CCTCC M 2010271发酵液中薯蓣皂甙元的提取方法是菌株发酵培养48 60h后，发酵液4 200C，4000 6000 r/min,离心4 5min，吸取上清液，在上清液中加入体积的氯仿进 行提取。
5.摇动5 lOmin，静置20 40min，移出有机相部分，同样方法再用氯仿提取水相部 分一次。
6.合并有机相，在旋转蒸发仪中40 45°C挥发干氯仿。
7.在40 45°C干燥箱中烘干残余物，再加入少许氯仿提取一次，烘干即获得薯蓣皂甙兀。
8.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌SWB8{Bacillus subtil is SWB8) CCTCC M 2010271产的薯蓣皂甙元在抑制病原菌中的应用。
9.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌SWB8{Bacillus subtil is SWB8) CCTCC M 2010271产的薯蓣皂甙元在抗肿瘤细胞中的应用。
全文摘要
本发明公开了一株可产薯蓣皂甙元的枯草芽孢杆菌SWB8(Bacillus subtilis SWB8)，属于应用微生物技术领域。该菌株分离于药用植物盾叶薯蓣地下茎的内部组织，能合成分泌宿主植物的代谢产物薯蓣皂甙元，保藏号CCTCC NO:M2010271，菌体杆状，大小为1～1.5×3～5μm，形成单链状的子实体，内生孢子，菌落粗糙、网格状突起，液体发酵形成菌膜，泡沫丰富，可利用支链淀粉，生长适温30～35℃，pH6.0～9.0，可耐受9.0%NaCl，16SrDNA核心序列1542bp，序列号HM210636。该菌株液体普通培养基发酵48～60h后，发酵液的氯仿提取物即为薯蓣皂甙元，具有抑制病原菌和抗肿瘤细胞的活性。本发明提供的菌株可产薯蓣皂甙元，与目前从黄姜植物中提取工艺相比，避免了强酸和黄姜副产物对环境的污染，具有潜在的工业化应用前景。
文档编号A61K31/58GK102061280SQ201010564169
公开日2011年5月18日 申请日期2010年11月29日 优先权日2010年11月29日
发明者万永继, 冯伟, 周围, 张冉, 汪静杰, 王晓强, 金志雄, 高红 申请人:西南大学