专利名称：一种多肽复合物、药物组合物、其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及糖尿病相关的药物领域，具体而言，本发明涉及一种多肽复合物，该复合物具有延长的胰高血糖素样肽类的体内半衰期。本发明还涉及该多肽复合物的制备方法及其应用。
背景技术：
本发明涉及的GLP-I (glucagon-lik印印tide-Ι，以下简称GLP_1)是主要由小肠 L细胞分泌的一种37个氨基酸组成的多肽，其活性形式为GLP-I (7-37) OH和GLP-I (7-36) NH2 (Mojsov S, J Clin Invest. 1987Feb ；79 (2) :616-9)。GLP-I 明显减低人用餐后的血糖， 能刺激胰岛素的产生，同时还能起到一定减肥效应，并且不会引起低血糖症(Drucker D J， Diabetes. 1998Feb ；47 (2) :159-69)。近期研究还表明 GLP-1 有胰腺再生作用(Drucker D J,2003Dec ； 144 (12) :5145-8)。此外，因为GLP-I为完全人源化多肽，作为临床药物在安全上具有较大优势。然而，GLP-I (7-37)的血清半衰期仅仅为3-5分钟，每天多次注射给药在临床使用中非常不方便。目前已经有不少研究采用GLP-I类似物融合蛋白技术解决GLP-I类似物在体内的存留时间(CN90101167. 3、CN200710018734. 2、CN200410054397. 9、CN01820232. 2、 CN200380110152. 7、CN200510039265. 3、CN200610127237. 1、CN200910009642. 7)，然而，现
有的技术与临床理想的目标还有很大距离，普遍都还没有达到临床标准，最近Novo Norisk 生产的利拉鲁肽为GLP-I类似物，其对GLP-I进行了棕榈酸的修饰，并于2009年于美国上市。但是利拉鲁肽也存在半衰期短的问题，其剂型仍需每日注射。因此，目前存在对解决GLP-I体内半衰期短的方法的需求。
发明内容
本发明的一个目的是针对临床上GLP-I类似物在体内存留时间较短，需要每天注射给药的缺限，提供了一种半衰期较长的包含载体多肽与GLP-I的多肽复合物。本发明的另一个目的是提供上述多肽复合物的制备方法，此外，还提供上述多肽复合物在制备治疗糖尿病和肥胖症的药物中的应用。本发明的又一个目的是提供一种以GLP-I与载体多肽的多肽复合物作为有效成分的药用组合物。用于实现上述目的的技术方案如下一方面，本发明提供一种多肽复合物，其包含GLP-I和载体多肽。其中，所述载体多肽优选为如序列SEQ ID NO 1所示的载体多肽A或如序列SEQ ID NO 2所示的载体多肽B。在所述多肽复合物中，GLP-I和载体多肽的摩尔比为10 1-1 50，优选 1:1-1: 50，进一步优选 1 2.5-1 25，更优选 1 10-1 25。另一方面，本发明提供上述多肽复合物的制备方法，该方法包括按照摩尔比例，分别称取GLP-I和载体多肽A或B，溶于适量的生理盐水、纯水或PBS缓冲液中，在0_5°C温度下，超声混合1-15分钟，或者搅拌1-3小时，或者放置过夜。再一方面，本发明还提供上述多肽复合物在制备治疗糖尿病的药物中的应用，以及该多肽复合物在制备治疗和/或预防肥胖症的药物中的应用。又一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含上述多肽复合物。其中，所述的药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的辅料，并且，所述药物组合物优选为注射剂，进一步优选为冻干粉针或溶液注射剂。现结合本发明的目的对本发明逐一加以描述。⑴载体多肽本发明所述的载体多肽的序列如下序列A或B :序列A (SEQ ID NO 1) GLffffKAffffKAffffKSLffffRKRKRKA序列B (SEQ ID NO 2) GLffffKVffffKLffffKSLffffRKRLRKA(2) GLP-IGLP-I为天然产物，序列为SEQ ID NO 9 HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGR(3) GLP-I与载体多肽的复合物GLP-I与载体多肽的比例GLP-1(MW 3299)能与载体多肽A (MW :3329)或载体多肽B(MW :3384)形成的不同比例的复合物，以摩尔计算，从10 1到1 100，不同的比例得到的复合物具有不同的释放特性，从1 1到1 50之间的比例形成的复合物具有更强的作为药用的实用性，更优先的范围为1 2.5到1 25。本发明的复合物的制备方法按照摩尔比例，称取适量的GLP-I冻干粉，溶于适量的生理盐水、纯水或PBS缓冲液中，称取适量的载体多肽A或B，溶于适量的生理盐水(或 PBSdK)中，在0-5°C温度下，超声混合1-15分钟，或者搅拌1-3小时，或者放置过夜。所制备得到的溶液可以直接加辅料做成制剂，也可以冷冻干燥后再与其他辅料一起制成制剂。 注PBS为磷酸盐。(4)本发明的药用组合物本发明的含有GLP-I及载体多肽的复合物可以与一种或多种药学上可接受的辅料共同制成药用组合物，这些辅料包括水溶性填充剂、PH调节剂、稳定剂、注射用水、渗透压调节剂等等。本发明所述的水溶性填充剂辅料为选自以下的一种或几种甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖、半乳糖等。PH调节剂为选自以下的一种或几种枸橼酸、磷酸、乳酸、酒石酸、盐酸等非挥发性的酸以及氢氧化钾、氢氧化钠或氢氧化钾或氢氧化铵、碳酸钠或碳酸钾或碳酸铵盐、碳酸氢钠或碳酸氢钾或碳酸氢铵盐等生理可接受的有机或无机酸和碱及盐等。稳定剂为选自以下的一种或几种EDTA_2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、 磷酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸钠、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、十二烷基硫酸钠或三羟甲基氨基甲烷等。优选焦亚硫酸钠、磷酸氢二钾、精氨酸、聚乙二醇6000、三羟甲基氨基甲烷。渗透压调节剂是氯化钠、氯化钾的一种或两种的组合。
(5)注射剂的制备方法本发明的药用组合物可以通过肌肉、静脉内、皮下注射途经进行给药，优选的剂型为冻干粉或溶液注射剂。冷冻干燥注射剂的制备方法取GLP-I和载体多肽溶液适量，加入水溶性填充剂、 稳定剂、渗透压调节剂等，加入注射用水适量，调节PH值至4-8使其溶解，加水稀释至适当浓度，加入0. 1-0. 5%活性炭，在0-10°C下搅拌10-20分钟，脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌， 滤液进行分装，采用冷冻干燥法，制得白色疏松块状物，封口即得，每个规格含有GLP-I在 5μ g至Ij Img之间。注射液的制备方法取GLP-I和载体多肽溶液或冻干粉适量，加入水溶性填充剂、 稳定剂、渗透压调节剂等，加入注射用水适量，调节PH值至4-8使其溶解，加水稀释至适当浓度，加入0. 1-0. 5%活性炭，在0-10°C下搅拌10-20分钟，脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌， 滤液进行分装，封口即得，每个规格含有GLP-I在5 μ g到Img之间。(6)药用组合物的用途本发明的药用组合物可以用在制备糖尿病治疗药物方面。具体地，本发明的组合物可以静脉、肌肉或皮下注射剂形式给药。虽然剂量依治疗对象、给药方式、症状及其它因素而改变，本发明的组合物在相当宽的剂量范围内是有效的。在成人的治疗中，剂量范围在 5μ g/人一Img/人，每日一次或每几日一次给药。实际剂量应该由医生根据有关的情况来决定，这些情况包括被治疗者的身体状态、给药途径、年龄、体重、患者对药物的个体反应， 患者症状的严重程度等等，因此上述剂量范围并不是以任何方式限制本发明的范围。本发明采用多肽组合药物技术克服了 GLP-I半衰期短的问题，所提供的多肽复合物中，由于载体多肽的存在使得GLP-I在体内的半衰期可达到34小时以上，较单独给药的 GLP-I的半衰期(半衰期仅为3-5分钟)明显延长，极大地便利了 GLP-I的临床推广和应用。
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中图1为实施例18中含GLP-I和载体多肽的多肽复合物的降血糖实验，其中GLP-I 天然 GLP-I ；GLP-1+2. 5A =GLP-I与载体多肽A以摩尔比例1 2. 5的复合物；GLP-1+5A =GLP-I与载体多肽A以摩尔比例1 5的复合物；GLP-1+10A =GLP-I与载体多肽A以摩尔比例1 10的复合物；GLP-1+25A =GLP-I与载体多肽A以摩尔比例1 25的复合物；GLP-1+2. 5B =GLP-I与载体多肽B以摩尔比例1 2. 5的复合物；GLP-1+5B :GLP_1与载体多肽B以摩尔比例1 5的复合物；GLP-1+10B :GLP_1与载体多肽B以摩尔比例1 10的复合物;GLP-1+25B =GLP-I与载体多肽B以摩尔比例1 25的复合物。图2为GLP-I与不同比例的载体多肽复合物的液相分离结果，其中图2A为GLP-I，图2B为载体多肽A，图2C为载体多肽B，图2D为GLP-I+载体多肽 A，图2E为GLP-I+载体多肽B。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。实施例1 载体多肽A的制备按照大肠杆菌的优选密码子(但不限于优选密码子)，利用全基因合成的方法合成含有多肽A的碱基序列，DNA序列如下SEQ ID NO 3 5tatgattgaaggccgtggcctgtggtggaaagcgtggtggaaagcgtggtggaaatccctgtggtggc gtaaacgtaaacgtaaagcgtaataag3SEQ ID NO 4 5gatccttattacgctttacgtttacgtttacgccaccacagggatttccaccacgctttccaccacgc
tttccaccacaggccacggccttcaat3将DNA序列3及序列4进行粘合，分别加入同等摩尔量的SEQ ID N03及SEQ ID NO 4，95°C水浴孵育5分钟，然后缓慢冷却至室温。此双链DNA可以与被Ndel/BamHI双酶切后的大肠杆菌表达载体PETMb进行连接。如下所示，上述方法合成的双链DNA含有5’ NdeI 及3’ BamHI的尖性末端，另含有factor fe的酶切位点用于去除N端的氨基酸残基。
Fa ctor XaBamhI
TATCiVTTt^ GGC CGTlSGCC TGT GGT GGAAftGCGTGGTGGAAA GCGTGGTGGAAATCCCTGTGGTGGCGTAAACGT AAACGT AAAGCGT AAT AAG ^ f TAACTTCCGGCi CCGGACACCACCT TTCGCACCACCTTTCGCACCACCTTTAGGGACACCACCGCATTTGCTVTTTGCATTTCGCATTATTCCTAG NdeI本发明中的酶切技术及连接技术均为本领域内大家熟知的技术。将构建所得质粒转化B121 (DE3)感受态细胞，质粒转化及感受态细胞的制备均为本领域众所周知的技术。采用通用的大肠杆菌蛋白表达方法(IPTG引导)对本发明中涉及的多肽进行表达，菌液经离心后收集沉降物。将沉降物用超声波细胞破碎法进行破碎，离心后收集上清液并使用镍柱对本发明中的多肽进行纯化。上述方法纯化后的多肽进Si^ctor Xa酶切用于除去6XHisTag及其他氨基酸残基。纯化后的多肽经过紫外灭菌、DNA去除这些领域内熟知的技术进行再次纯化以满足药用需求。本发明中所述的蛋白纯化，酶切及冷冻干燥的方法为本领域众所周知的知识及技术。本专利同样适用于使用其它的多肽制备方法，例如多肽化学合成，酵母表达体系及哺乳动物表达体系。实施例2 载体多肽B的制备按照大肠杆菌的优选密码子(但不限于优选密码子)，利用全基因合成的方法合成多肽B的DNA序列如下SEQ ID NO 5 5tatgattgaaggccgtggcctgtggtggaaagtgtggtggaaactgtggtggaaaagcctgtggtggc gcaaacgcctgcgcaaagcgtaataag3SEQ ID NO 6 5gatccttattacgctttgcgcaggcgtttgcgccaccacaggcttttccaccacagtttccaccacac
tttccaccacaggccacggccttcaat3
将DNA序列5及序列6进行粘合，分别加入同等摩尔量的SEQ ID N03及SEQ ID NO 4，95°C水浴5分钟，然后缓慢冷却至室温。此双链DNA可以与被Ndel/BamHI双酶切后的大肠杆菌表达载体PETMb进行连接。如下所示，上述方法合成的双链DNA含有5’ NdeI 及3’ BamHI的尖性末端，另含有factor fe的酶切位点用于去除N端的氨基酸残基。
Factor XaBamhI
TATGfcTTGAAGGCCGTCGCCTGTGGTGGAAAGTGTGGTGGAAACTGTGGTGGAAAAGCCTGTGGTGGCGCAAACGCTGCGCAAAGCGTAATAAG | 个 TAACTTCCGGCaCCGGACACCACCTTTCACACCACCTTTGACACCACCTTTTCGGACACCACCGCGTTTGCGACGCGTTTCGCATTATTCCTAG NdeI将构建所得质粒转化B121 (DE3)感受态细胞，质粒转化及感受态细胞的制备均为本领域众所周知的技术。采用通用的大肠杆菌蛋白表达方法(IPTG引导)对本发明中涉及的多肽进行表达，菌液经离心后收集沉降物。将沉降物用超声波细胞破碎法进行破碎，离心后收集上清液并使用M-NTA镍柱对本发明中的多肽进行纯化。上述方法纯化后的多肽进 Ri^ctor fe酶切用于除去6XHis Tag及其他氨基酸残基。纯化后的多肽经过紫外灭菌、 DNA去除这些领域内熟知的技术进行再次纯化以满足药用需求。本发明中所述的蛋白纯化， 酶切及冷冻干燥的方法为本领域众所周知的知识及技术。本专利同样适用于使用其它多肽制备方法，例如多肽化学合成，酵母表达体系及哺乳动物表达体系。实施例3 重组glp-i的制备及纯化技术GLP-I为天然产物，不存在专利限制。本发明中采用生物方法进行GLP-I的制备， 本专利同样适用于使用其它多肽制备方法，例如多肽化学合成。SEQ ID NO 9 =HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGR根据GLP-I的氨基酸序列(SEQ ID NO 9)进行编码DNA的合成及制备，两条互补的DNA单链由上海生工进行合成，见序列7，序列8。并参照实施例1所述，制备编码GLP-I 的双链DNA，此双链DNA具有与载体(pET15b)连接的酶切位点(NdeI/BamHI)。参照实施例 1的内容，构建GLP-I的表达质粒。重组GLP-I参照实施例1中描述的蛋白表达、纯化、干燥方法进行制备。纯化后的多肽经过紫外灭菌、去除DNA这些领域内熟知的技术进行再次纯化以满足药用需求。seq id no 7 5tatgattgaaggccgtcatgcggaaggcacctttaccagcgatgtgagcagctatctggaaggccagg
cggcgaaagaatttattgcgtggctggtgaaaggccgctaataag3SEQ ID NO 8 5gatccttattagcggcctttcaccagccacgcaataaattctttcgccgcctggccttccagaiagct
gctcacatcgctggtaaaggtgccttccgcatgacggccttcaat3实施例4 =GLP-I与载体多肽A的1 10复合物按照GLP-I与载体多肽A摩尔比例(以下比例没有注明同为摩尔比)1 10，称取Img的GLP-I (MW 3299)冻干粉，溶于Iml生理盐水，充分混勻后，称取10. Img载体多肽 A(MW 3329)溶于上述含GLP-I的生理盐水中，充分混勻后，在0_10°C温度下，得到复合物溶液，如果立即制备制剂，可以直接往下操作不需要冻干。实施例5 =GLP-I与载体多肽A的10 1复合物称取4. 2mg的GLP-1冻干粉，溶于Iml生理盐水，充分混勻后，称取0. 41mg载体多肽A冻干粉溶于上述GLP-I生理盐水中，充分混勻后，在0-10°C温度下，搅拌3小时，冷冻干CN 102532323 A燥得到复合物固体粉末。实施例6 =GLP-I与载体多肽A的1 2. 5复合物称取2. Img的GLP-1冻干粉，溶于Iml纯水，充分混勻后，称取5. 24mg载体多肽A 冻干粉溶于上述GLP-I水溶液中，充分混勻后，在0-5°C温度下，搅拌3小时，冷冻干燥得到复合物固体粉末。实施例7 =GLP-I与载体多肽A的1 25复合物称取0. 2Img的GLP-1冻干粉，溶于Iml纯水，充分混勻后，称取5. 24mg载体多肽 A冻干粉溶于上述GLP-I水溶液中，充分混勻后，在0-5°C温度下，搅拌3小时，冷冻干燥得到复合物固体粉末。t施例8:GLP_1与载体多fltB的1 1复合物称取0. 42mg的GLP-1冻干粉，溶于Iml PBS缓冲液，充分混勻后，称取0. 43mg载体多肽B (MW 3384)冻干粉溶于上述含GLP-I的PBS缓冲液中，充分混勻后，在0_5°C温度下，放置过夜，冷冻干燥得到复合物固体粉末。实施例9 :GLP_1与载体多肽B的1 10复合物称取0. 42mg的GLP-1冻干粉，溶于Iml纯水中，充分混勻后，称取4. 3mg载体多肽 B冻干粉溶于上述含GLP-I的溶液中，充分混勻后，在0-5°C温度下，放置过夜，冷冻干燥得到复合物固体粉末。实施例10 =GLP-I与载体多肽B的1 25复合物称取0. 2Img的GLP-1冻干粉，溶于Iml PBS缓冲液，充分混勻后，称取5. 38mg载体多肽B冻干粉溶于上述含GLP-I的PBS缓冲液中，充分混勻后，在0-10°C温度下，搅拌1 小时，冷冻干燥得到复合物固体粉末。实施例11 =GLP-I与载体多肽B的1 50复合物称取0. 2Img的GLP-1冻干粉，溶于Iml PBS缓冲液，充分混勻后，称取10. 75mg载体多肽B冻干粉溶于上述含GLP-I的PBS缓冲液中，充分混勻后，在0°C左右超声混合5分钟，0°C左右放置，备用，1-3小时内用于制备注射剂。实施例12 =GLP-I与载体多肽BWl: 100复合物称取0. 2Img的GLP-I冻干粉，溶于2ml生理盐水，充分混勻后，称取21. 5mg载体多肽B冻干粉溶于上述含GLP-I的生理盐水中，充分混勻后，在0-10°C温度下，放置过夜，冷冻干燥得到复合物固体粉末。实施例13 冻干粉型药物组合物的制备取适量的容器加泊洛沙姆0.05g、甘露醇0.2g、乳糖0. lg、注射用水:3ml，搅拌使溶解，加lmol/L的枸橼酸或氢氧化钠调节PH至6. 0，冷却至5°C，取实施例4方法制备的复合物溶液5ml (含GLP-15mg+50. 5mg载体多肽A)加入其中，继续调补PH至6. 0，加水至IOml。 加入20mg活性碳，在5°C下搅拌20分钟，脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液按每支0. 2ml 进行分装，预冻2小时后，冷冻下减压干燥12小时，至样品温度到5°C后，再干燥2小时，制得白色疏松块状物，封口即得GLP-I多肽复合物的药物组合物，置于预充式的注射器中，规格为100 μ g/支，4°C以下保存，注射前以200 μ 1注射用水溶解后给药。实施例14 溶液注射剂型药物组合物的制备取适量的容器加山梨醇0. lg、乳糖0. lg、NaCl 20mg，枸橼酸10mg、注射用水7ml，搅拌使溶解，加lmol/L的枸橼酸或氢氧化钠调节PH至6. 5，冷却至0°C，取以实施例6的方法制得的复合物粉末适量(含GLP-15mg+12. 48mg载体多肽Α)加入其中，继续搅拌溶解， 调补PH至6. 5，加水至10ml。加入IOmg活性碳，在0_4°C下搅拌20分钟，脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液按每支100 μ 1分装入预充式注射器，样品温度到5°C以下保存，规格为 50 μ g/支。实施例15 冻干粉型药物组合物的制备取适量的容器加山梨醇0.05g、乳糖0.06g和注射用水5ml，搅拌使溶解，加lmol/L 的盐酸或氢氧化钠调节PH至7. 5，冷却至5°C，取实施例7方法制备的复合物适量(含GLP-I 5mg+124. 8mg载体多肽Α)加入其中，继续调补PH至6. 0，加水至10ml。加入IOmg活性碳， 在5°C下搅拌20分钟，脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液按每支Iml进行分装，预冻2小时后，冷冻下减压干燥12小时，至样品温度到5°C后，再干燥5小时，制得白色疏松块状物，封口即得GLP-I多肽药物复合物冻干粉针，规格为500 μ g/支。实施例16 溶液沣射剂型药物组合物的制备取适量的容器加NaCl 40mg,注射用水7ml，搅拌使溶解，加lmol/L的枸橼酸或氢氧化钠调节PH至6. 5，冷却至0°C，取以实施例9的方法制得的复合物粉末适量(含GLP-I 5mg+51. 2mg载体多肽B)加入其中，继续搅拌溶解，调补PH至6. 5，加水至10ml。加入IOmg 活性碳，在0-4°C下搅拌20分钟，脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液按每支200 μ 1分装入预充式注射器，样品温度到5°C以下保存，规格为100 μ g/支。实施例17 冻干粉型药物组合物的制备取适量的容器加NaCl 20mg和注射用水5ml，搅拌使溶解，加lmol/L的盐酸或氢氧化钠调节PH至7. 5，冷却至5°C，取实施例10方法制备的复合物适量(以GLP-I重量计算为5mg)(含GLP-I 5mg+128. Img载体多肽B)加入其中，继续调补PH至6. 0，加水至10ml。 加入IOmg活性碳，在5°C下搅拌20分钟，脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液按每支0. 5ml 进行分装，预冻2小时后，冷冻下减压干燥12小时，至样品温度到5°C后，再干燥5小时，制得白色疏松块状物，封口即得GLP-I多肽药物复合物冻干粉针，规格为250 μ g/支。^MM 18 多jfeg合4勿在小薩/本内的降血能实骑给小鼠静脉注射不同比例的复合物(以GLP-I计算剂量为100 μ g/kg，混合比例分别为1 2.5，1 5，1 10，1 25，以上混合比例均为GLP-I与载体多肽的比例)，分别于给药后0. 5、4、6、8、12、对和48小时注射葡萄糖(3g/kg)，测定注射后半小时的血糖含量， 结果表明GLP-I在半小时后完全丧失其降血糖功能，但是复合物却在给药48小时后依然存在降血糖功能，结果显示GLP-I与载体多肽形成复合物后不仅有效保持了天然GLP-I的降血糖功能，而且这些复合物的形成能够大大有效的提高了 GLP-I降血糖功能的时间，结果见图1。图2显示了 GLP-I与不同比例的载体多肽混合的液相色谱结果，结果显示了 GLP-I 与载体多肽复合物在液相中被确定为复合物(20分钟的峰)。 ^mm 19 大鼠注射GLP-I及其分别与多肽A、多肽B的复合物(折合GLP-I为1000 μ g/kg， 混合比例分别为1 2.5，1 5，1 10，1 25，以上混合比例均为GLP-I与载体多肽的摩尔比例)，分别于注射前及注射后0. 5、1、3、6、9、12、24、36和48小时后于眼丛静脉取血约 ο. ani，制备血清备用。
GLP-I浓度测定方法采用酶联免疫吸附方法(ELISA)检测大鼠血清中多肽复合物的浓度，操作如下4°C离心分离血浆。用GLP-IEIA试剂盒(Phoenix Pharmaceuticals, INC)对鼠血浆中的GLP-I的浓度进行测定。将稀释后的鼠血浆样品加入96孔板(50 μ 1)， 加入25μ1 GLP-I的羊抗鼠一抗后，37°C孵育2小时。使用洗液清洗96孔板4次，加入 100 μ 1 SA-HRP后孵育1小时。同样的方法对96孔板进行清洗，然后加入100 μ 1 TMB, 37°C 孵育1小时。用2Ν盐酸中止反应后20分钟内测定0D450值，并与标准浓度的GLP-I进行比对及根据ELISA结果计算药代动力学参数。GLP-I及其复合物的体内药代动力学结果见表1，结果显示本发明的GLP-I复合物在体内的半衰期较单独的GLP-I明显延长，具有长效特性。表1GLP-1及其复合物在大鼠体内的半衰期
样品来源半衰期(小时)
GLP-I< 0. 5
GLP-1+多肽 A(1 2.5) < 0. 5 GLP-1+多肽 A(1 5)IH
GLP-1+多肽 A(1 10) 2l~5 GLP-1+多肽 A(1 25) 34~0 GLP-1+多肽 B(1 2.5) < 0. 5 GLP-1+多肽 B(1 5) Γ8
GLP-1+多肽 B(1 10) 208 GLP-1+多肽 B(1 25) 3 Τ权利要求
1.一种多肽复合物，其中，所述多肽复合物包含GLP-I和载体多肽。
2.如权利要求1所述的多肽复合物，其中，所述载体多肽为如序列SEQIDNO 1所示的载体多肽A或如序列SEQ ID NO 2所示的载体多肽B。
3.如权利要求1或2所述的多肽复合物，其中，所述GLP-I和载体多肽的摩尔比为 10 1-1 50，优选 1 1-1 50，进一步优选 1 2.5-1 25，更优选 1 10-1 25。
4.如权利要求1-3任一项所述的多肽复合物的制备方法，其中，所述方法包括按照摩尔比例，分别称取GLP-I和载体多肽A或B，溶于适量的生理盐水、纯水或PBS缓冲液中，在 0_5°C温度下，超声混合1-15分钟，或者搅拌1-3小时，或者放置过夜。
5.如权利要求1-3任一项所述的多肽复合物在制备治疗糖尿病的药物中的应用。
6.如权利要求1-3任一项所述的多肽复合物在制备治疗和/或预防肥胖症的药物中的应用。
7.—种药物组合物，其包含如权利要求1-3任一项所述的多肽复合物。
8.如权利要求7所述的药物组合物，其中，所述药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的辅料。
9.如权利要求7或8所述的药物组合物，其中，所述药物组合物为注射剂。
10.如权利要求7-9中任一项所述的药物组合物，其中，所述药物组合物为冻干粉针或溶液注射剂。
全文摘要
本发明公开了一种多肽复合物，其包含GLP-1和载体多肽。所述载体多肽能够有效延长GLP-1的血液半衰期，克服其因为半衰期短而无法在临床上使用的现状，在糖尿病、肥胖症治疗药物领域较有应用前景。本发明还公开了所述多肽复合物的制备方法及其应用。此外，本发明进一步公开了包含所述多肽复合物的药物组合物。
文档编号A61K38/17GK102532323SQ20101058132
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月9日 优先权日2010年12月9日
发明者付刚, 任晓文, 徐为人, 李心, 汤立达, 王玉丽, 郑学敏, 龚珉 申请人:天津药物研究院