专利名称：表达v5表位标签的重组猪圆环病毒2型毒株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株重组病毒，尤其涉及一株表达V5表位标签的重组猪圆环病毒2 型毒株及其构建方法，本发明还涉及该重组毒株在鉴别或诊断猪圆环病毒2型毒株中的应 用，属于重组猪圆环病毒2型毒株领域。
背景技术：
1991年，加拿大首次报道了一种新的称为断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的 病症，该病可发生于健康状况良好的猪场，以5 12周龄的猪发病率较高，临床主要表现 为生长迟缓、进行性消瘦、呼吸困难、贫血、黄疸和腹泻等。急性暴发猪群的死亡率可达 10%，个别情况可高达50%，经鉴定猪圆环病毒2型(PCM)是该病的致病原(Meehan B M， McNeilly F, Todd D, et al. Characterization of novelcircovirus DNAs associated with wasting syndromes in pigs [J], J GenVirol，1998，79 :2171-2179.)。PCV2 不但是 PMWS的病原体，而且还与其它几种病症有关，如猪皮炎与肾炎综合症(PDNS)、猪繁殖障碍、 猪呼吸道疾病综合症(PRDC)、坏死性淋巴结炎、肉芽肿性肠炎和渗出性表皮炎等。现将与 PCV2 有关的疾病统称为猪圆环病毒病(PCVD) (Chae C. A review of porcine circovirus 2-associatedsyndromes and diseases[J]. Vet J，2005，169(3) :326-336.)。猪圆环病毒2型属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)的成 员。它是一种无囊膜、20面体对称的病毒，直径只有17nm，其基因组由闭合环状单链DNA组 成，全长1766 1768nt，主要包含两个开放阅读框架(ORF)，ORFl编码病毒复制酶相关蛋白 (R印和R印’)，参与病毒的复制；0RF2编码病毒的衣壳蛋白(Cap)，参与病毒的组装、感染和 免疫等过程。由于PCV2基因组太小，因此对于基因组的操作仅局限于碱基的替换，Fenaux 等(Fenaux M,Opriessning T,Halbur P G,et al. Immunogenicity andpathogenicity of chimeric infectious DNA clones of pathogenic porcinecircovirus type 2 (PCV2)and nonpathogenic PCVl in weanling pigs [J]. JVirol, 2003, 77 (20) :11232-11243)成功构 建了 PCV1/PCV2-0RF2和PCV2/PCV1-0RF2嵌合型病毒，并对这2个嵌合型病毒的免疫原性 和致病性进行了 一系列研究，研究结果表明以PCVl为骨架，用PCV2-0RF2替换PCVl相应基 因所拯救的嵌合病毒能够诱导猪产生针对PCV2-Cap蛋白特异性抗体，且致病性大大降低。 Lekcharoensuk ^ (Lekcharoensuk P, Morozov I，Paul P S, et al. Epitope mapping of themajor capsid protein of type 2 porcine circovirus(PCV2)by usingchimeric PCVl and PCV2 [J]. J Virol, 2004, 78 (15) :8135-8145.)用 PCV1-0RF2 相应序列替换 PCV2-0RF2 缺失序列构建和拯救一系列的PCV1/PCV2-0RF2嵌合病毒，利用7株单克隆抗体绘制了 PCV2-Cap 蛋白的表位图谱；Liu 等(Changming L, Yanwu W, Caofan Z，et al. Construction and characterization of porcine circovirus type 2 carrying agenetic marker strain [J], Virus Res，2007，127 :95-99)在 PCV2 基因组 ORFl 编码区末端替换 2 个碱基， 形成了一个Ml I限制性内切酶序列，拯救了一株具有分子标记的毒株。病毒样颗粒(VLPs)是近些年研究较热的一种表位展示载体，因具有自组装的特性，使展示在其表面的表位获得近似天然的三维构象，VLPs上的天然免疫活性部位也在增 强表位免疫原性方面发挥重要作用。以往研究表明，细小病毒VLP、乳头瘤病毒VLP、肉瘤 病毒 VLP 等都是有效的表位展示载体(Amexis G, Young N. ParvovirusB19 empty capsid as antigen carriers for presentation of antigenicdeterminants of dengue 2 virus. J Infect Dis,2006,194 :790-794 ；Dale C, Liu X, Rose R, et al. Chimeric human papilloma virus-simian/humanimmunodeficiency virus-like-particle vaccines immunogenicity andprotective efficacy in macaques[J]. Virology,2002,301 176-187 ；Doan L,Li Μ,Chen C,et al. Virus-like particles as HIV-Ivaccines[J]. Rev Med Virol, 2005,15 :75-88 ；Takahashi R, Kanesashi S, Inoue Τ, etal. Presentation of function peptides on the surface of SV40 virus-likeparticles. Biotechnol, 2008, 135:385-392.)。PCV2只有一个结构蛋白(Cap)，该蛋白组装成20面体对称的病毒衣壳 包裹着病毒基因组，Cap蛋白具有很强的免疫原性，可以诱导机体产生持久的体液免疫和 细胞免疫° Yuna 等(Yuna K, Jinhyun K, Kyoungsoo K, et al. Characterization of the recombinant proteins of porcine circovirus type 2field isolate expressed in the baculovirus system [J], J Vet Sci，2002，3 (1) :19-23)在昆虫杆状病毒表达系统中， Cap蛋白可以自主装成VLP，其物理形态和免疫原性与完整的病毒粒子无显著差异，已作为 PCV2亚单位疫苗使用。因此PCV2 Cap蛋白从理论上来讲具备一种表位展示载体的基本特 征，如自主装特性和天然免疫活性部位，目前需要解决的关键问题是PCV2-Cap蛋白是否能 够允许在某个位点插入外源表位而不影响其自主装的能力。
发明内容
本发明目的之一是提供一株表达V5表位标签的重组猪圆环病毒2型毒株；本发明目的之二是将上述重组猪圆环病毒2型毒株应用于猪圆环病毒分子标记 疫苗和鉴别诊断；本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的猪圆环病毒2型(PCV2)是引发PMWS的主要病原。本发明为了研究PCV2作为 表达载体的可行性，构建了以PCV2基因组为骨架、在0RF2编码Cap蛋白的C末端插入了 源自副流感病毒(Simianvirus 5，SV5)5型的一个含14氨基酸序列的V5表位标签，用构 建感染性分子克隆重组质粒转染细胞，拯救出一株表达V5表位标签的重组毒株，命名为 recPCV2/CL-V5，其微生物保藏号是CGMCCNo. 4310。分类命名是猪圆环病毒2型(Porcine circovirustype 2)；保藏时间是2010年11月10日；保藏单位是中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心；保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微 生物研究所。本发明采用免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、血清中和试验(SNA)、捕获ELISA 及免疫电镜对重组毒株进行了鉴定。鉴定结果表明在recPCV2/CL-V5株感染细胞中检出 PCV2和V5表位抗原；PCV2阳性血清和中和性单克隆抗体(1拟)能够完全中和recPCV2/ CL-V5株的细胞感染性；recPCV2/CL-V5株在繁殖动力学和形态学上与亲本病毒基本一致。 鉴于recPCV2/CL-V5株插入了一个V5表位，可以采用PCR、IPMA和捕获ELISA方法与亲 本毒株相鉴别。recPCV2/CL-V5株经细胞连续传10代，体外培养增殖性能稳定，毒价可达106_25TCID50/mLo拯救的带有V5表位标签的重组PCV2毒株，为深入研究该病毒复制理、抗原 表位展示及分子标记疫苗和鉴别诊断等开创了新的平台。PCV2是迄今为止人类发现的最小的哺乳动物病毒之一，它不仅可以诱导猪 产生多种复杂的疾病，而且基因组非常经济节约，只包含一些必要的分子元件。由于 PCV2基因组太小，对于基因组的操作仅局限于碱基的替换(Fenaux M，Opriessning T， Halbur P G, et al. Immunogenicity and pathogenicity of chimeric infectious DNA clones ofpathogenic porcine circovirus type 2(PCV2)and nonpathogenic PCVl inweanling pigs[J], J Virol,2003,77(20) :11232-11243 ；Lekcharoensuk P,Morozov I， Paul P S, et al. Epitope mapping of the major capsid proteinof type 2 porcine circovirus(PCV2)by using chimeric PCVl and PCV2[J].J Virol,2004,78 (15) 8135-8145 ；Changming L,Yanwu W,CaofanZ,et al. Construction and characterization of porcine circovirus type 2carrying a genetic marker strain[J]. Virus Res,2007, 127:95-99.)。Cap蛋白是PCV2的主要结构蛋白，也是主要的抗原性决定因子。本发明将 PCV2-Cap作为主要的研究目标，成功地将V5抗原表位插入到Cap蛋白中，并作为衣壳蛋白 的一部分组装在重组病毒中，建立了 PCV2作为活载体的技术平台。本发明的研究结果表 明，在Cap蛋白C-端可以插入外源V5表位，并将该表位展示在病毒表面，不影响病毒的组 装和复制。PCV2 Cap蛋白N端富含碱性氨基酸，该区域与绑定病毒DNA有关。此外，Cap蛋白 的核定位信号也位于N端，病毒蛋白在细胞质中合成后进入细胞核，可能是支持病毒的转 录或影响细胞周期。基于以上两点，本发明没有选择将V5表位插入到Cap蛋白的N端，而 是C-端。拯救的重组病毒株可以在体外细胞中稳定传代，其繁殖动力学与亲本病毒相近， 证明在Cap蛋白C-端插入V5对病毒复制没有影响，推测C-端插入短片段不影响病毒的复 制和组装。重组毒株和亲本病毒与PCV2抗体具有良好反应活性，无明显差异，由此推测V5 表位插入后对亲本病毒Cap蛋白的自然抗原特性，尤其是中和活性没有明显影响。采用单 抗捕获ELISA，anti-V5-HRP抗体可用于检测细胞培养物中的重组标记病毒，证实V5表位展 示在病毒的表面。本发明成功地构建和拯救了一株带有V5表位标签的重组PCV2株，为深入阐明该 病毒结构与功能、抗原表位展示、活载体表位疫苗以及分子鉴别诊断技术的研究开辟了新 的技术平台。
图1V5表位插入PCV2 Cap蛋白C-末端示意图。图2PCV2重组克隆质粒酶切及全基因组环化反应鉴定1 空载体；2 用Ml I酶切 的PCV2重组质粒；3 :PCV2的基因组；4 :PCV2基因组的自连接；M :DL5000 DNA Marker。图3recPCV2/CL-V5株免疫电镜形态学观察。图4recPCV2/CL-V5重组毒株与亲本毒株的PCR鉴别；1 :recPCV2/CL_V5重组毒 株；2 亲本毒株；3 :mock-infected PK_15cells ；M :DL2000 Marker。图5IPMA鉴定重组recPCV2/CL_V5株与亲本毒株。图6重组recPCV2/CL-V5株与亲本毒株的单抗捕获ELISA鉴别。
图7重组recPCV2/CL-V5株与亲本毒株的增殖动力学；A 不同代次的病毒滴度； B 不同时间的繁殖动力学曲线。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1材料和方法1. 1病毒、细胞、抗体、载体、菌株及试剂PCV2亲本毒株(PCV2/CL)从临床表现为PMWS的病猪分离获得，采用感染性克隆构 建的毒株为recPCV2/CL株；PK-15细胞经鉴定无PCVl和PCV2污染，培养液为含10%胎牛 血清的MEM，在含5% CO2条件下于37°C培养；PCV2标准阳性血清的抗体效价达1观00倍，抗 PCV2-Cap单克隆抗体1D2由本发明人实验室制备(黄立平，刘长明，危艳武，等.抗猪圆环 病毒2型Cap蛋白中和性单克隆抗体的制备及鉴定[J].中国预防兽医学报，2009,31 ) 132-136.)，anti-V5-HRP抗体购自hvitrogen公司，以上抗体用于病毒抗原检测；pMD18/ PCV2-CL由本发明人实验室构建保存；感受态大肠杆菌ToplO、限制性内切酶Ml I、T4连接 酶、Lipofectamine2000购自TaKaRa公司；K0D_plus_PCR扩增试剂盒购自jToYoBo公司；质 粒提取试剂盒购自QianGen公司。1. 2重组病毒质粒的构建按照KOD-plus-PCR试剂盒说明书，用表1中引物Al和A2将pMD18/PCV2_CL模板 线性化，反应条件为预变性94°C 2min，30个循环[94°C 15s，55°C 30s, 68°C 4min30s]，延伸 反应68°C 7min。PCR反应产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。目的条带经凝胶纯化后作为 融合PCR模板，用表1中引物Bl和B2进行融合PCR扩增，将V5表位基因融合到PCV2 0RF2 末端，反应条件为预变性94°C 2min，13个循环[94°C 15s，55°C 30s, 68°C %iin30s]，延伸反 应68°C，7min，重组策略见图1。取10 μ L融合PCR产物转化感受态大肠杆菌ToplO，含有 V5基因的全长基因组质粒被命名为pMD18/PCV2-CL-V5。表1构建及鉴定重组毒株所用PCR引物
权利要求
1.一株表达V5表位标签的重组毒株reCPCV2/CL-V5，其微生物保藏号是CGMCC No.4310。
2.权利要求1所述的重组毒株recPCV2/CL-V5在制备预防由猪圆环病毒2型所引起疾 病的药物中的用途。
3.权利要求1所述的重组毒株recPCV2/CL-V5在制备鉴别猪圆环病毒2型毒株试剂中 的用途。
全文摘要
本发明公开了表达V5表位标签的重组猪圆环病毒2型毒株及其应用。本发明以PCV2基因组为骨架，在ORF2编码Cap蛋白的C末端插入了源自副流感病毒5型的一个含14氨基酸序列的V5表位标签，用构建感染性分子克隆重组质粒转染细胞，拯救出一株表达V5表位标签的重组毒株，其微生物保藏号是CGMCC No.4310。本发明重组毒株在繁殖动力学和形态学上与亲本病毒基本一致，可以采用PCR、IPMA和捕获ELISA方法将其与亲本毒株相鉴别。本发明重组毒株经细胞连续传10代，体外培养增殖性能稳定，毒价可达106.25TCID50/mL。
文档编号A61K39/12GK102120988SQ20101059197
公开日2011年7月13日 申请日期2010年12月10日 优先权日2010年12月10日
发明者刘长明, 危艳武, 陆月华, 黄立平 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所