专利名称：抗肿瘤多肽及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗肿瘤药物研发与应用领域，具体涉及多种抗肿瘤多肽及其用途。
背景技术：
固体肿瘤是一个缺氧的环境，而且这样的环境使肿瘤的治疗更加困难(Hoeckel M etal. , Vaupel P.Association between tumor hypoxia and mal ignant progression in advancedcancer of the uterine cervix. Cancer Research, 1996 ;56 :4509_15.),这是因 为肿瘤细胞对缺氧环境的反应在肿瘤的恶化和演进过程中扮演着重要角色，其结果表现于 肿瘤细胞永生化、基因组不稳定、肿瘤新生血管生成、肿瘤细胞能量代谢、肿瘤自分泌生长 因子信号转导、肿瘤侵袭转移等各方面(Hong SS et al. HIF-lalpha :a valid therapeutic target fortumor therapy.Cancer Research and Treatment.2004Dec ；36 (6) 343-53.)，而且还会降低现有治疗方法的作用，例如使肿瘤有耐药性以及对放射治疗反 应迟纯(Comerford KM et al.，Colgan SP. Hypoxia-inducible factor-l-dependent regulation of the multidrugresistance(MDRl) gene. Cancer Research. 2002Jun 15 ； 62 (12) 3387-94. ；Moeller BJ etal. HIF-Iand tumour radiosensitivity.British Journal of Cancer. 2006Jul 3 ；95 (1) )。肿瘤细胞对缺氧环境的反应是通过低氧诱导因子-la基因介导，由美国约 翰霍普金斯大学(John Hopkins University)的 Semenza 教授等发现(Semenza GL et al.Transcriptionalregulation of genes encoding glycolytic enzymes by hypoxia-inducible factor 1.TheJournal of Biological Chemistry. 1994Sep 23 ； 269(38) :23757-63.)。该基因产生的低氧诱导因子_la蛋白是个转录因子，诱导了上述一 系列的肿瘤恶化和演进过程。所以低氧诱导因子-Ia已被列为肿瘤分子靶向治疗的重要目 标蛋白之一。目前国际上已经有数个抗肿瘤药物在研发中，例如美国Biomira公司的 PX-478(Koh MY etal. Molecular mechanisms for the activity of PX-478, an antitumor inhibitor of thehypoxia-inducible factor-lalpha. Molecular Cancer Therapeutics. 2008Jan ；7(1) :90_100·)，哈佛大学(Harvard University)的聚酰 胺(Olenyuk BZ et al. Inhibitionof vascular endothelial growth factor with a sequence-specific hypoxia responseelement antagonist. Proceedings of the National Academy of Science USA. 2004Nov30 ； 101(48) : 16768-73.)，英国的 DJ12、DJ15
DJ30 (Dylan T et al. Identification of novel small-molecule inhibitors of hypoxia-inducible factor-ltransactivation and DNA binding. Molecular Cancer Therapeutics. 2006S印；5 (9) :2193_202·)，韩国的 YC-1 (Yeo EJ et al. YC-I :a potential anticancer drugtargeting hypoxia-inducible factor 1.Journal of the National Cancer Institute. 2003Apr 2 ；95 (7) :516_25·)，日本的 ΤΧ-1845 和 TX-1846 (Nagasawa H et al. ,Design ofhypoxia-targeting drugs as new cancer chemotherapeutics. Biological&PharmaceuticalBulletin. 2006Dec ；29 (12) :2335_42.)，以上都是小分子化学合成药 物。
以生物工程物质为基础开发的有Enzon公司RNA拮抗剂EZN-2968 (Greenberger LM etal. A RNA antagonist of hypoxia-inducible factor-lalpha,EZN-2968, inhibits tumorcel 1 growth. Molecular Cancer Therapeutics. 2008Nov ；7 (11) :3598_608·)禾口中 国专利ZL200510116615. 1公开的14肽。现有技术存在的问题(1)上述已有物质ΡΧ-478、聚酰胺、YC-1、TX-1845、TX-1846 和RNA拮抗剂EZN-2968的问题是非天然的人工合成药物；(2)中国专利ZL200510116615. 1 公开的14肽抗癌活性非常低。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明从低氧诱导因子-Ia蛋白序列中鉴定出了一 系列多肽片段，更接近于天然；这些多肽片段在缺氧的情况下具有抑制肿瘤细胞生长作用， 能够有效抑制多种肿瘤细胞的生长和存活，比中国专利ZL200510116615. 1公开的14肽活 性更强。本发明提供如下技术方案抗肿瘤多肽，其特征在于选自SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列从C末端连续减少 0个、1个或多个氨基酸而形成的、至少由15个氨基酸组成的多肽。更近一步是选自SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列从C末端连续减少0个、1个或 多个氨基酸而形成的、至少由25个氨基酸组成的多肽。所述肿瘤优选为肺癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌或大肠癌。上述抗肿瘤多肽进一步具体为如SEQ ID N0:1-30任一序列所示的多肽。优选含 有55-65个氨基酸。更优选的是如SEQ ID NO :6或7所示的多肽。为了增强上述抗肿瘤多肽的活性，在其C末端可添加氨基酸序列 GlnArgLysArgLysMet。本发明进一步提供上述抗肿瘤多肽的用途，优选用于抗肺癌、肝癌、卵巢癌、乳腺 癌、胃癌禾口大肠癌。有益效果本发明的系列多肽，易于制造，而且该多肽物质具有广谱抗癌效果。并且其抗癌效 果比已知同类专利多肽的抗癌效果显著。为了便于理解，以下将通过具体的附图、实施例对本发明进行详细地描述。需要特 别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书 的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明 引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行 参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
图1多肽对肺肿瘤细胞SHP-77的生长抑制作用图1(上)图中X轴为多肽的种类(浓度15uM)；对照为现有技术中的14肽(下同)，“25肽”至“65肽”表示本发明提出的多肽-J轴为肺肿瘤细胞SHP-77的成活率(％ )。
图1(下)图中X轴为多肽浓度(uM) ；Y轴为肺肿瘤细胞SHP-77的成活率(％ )。 “方块”表示对照多肽；“三角”表示65肽。
图2抑制肝肿瘤细胞H印3b生长效果图2(上)图中X轴为多肽的种类(浓度15uM)；对照，“25肽”至“65肽”表示本 发明提出的多肽；Y轴为肝肿瘤细胞Hep3b的成活率(％ )。图2(下)图中X轴为多肽浓度(uM) ；Y轴为肝肿瘤细胞!fep3b的成活率(％ )。 “方块”表示对照多肽；“三角”表示65肽。图3多肽对卵巢肿瘤细胞OvCar-3生长的抑制效果 图3(上)图中X轴为多肽的种类(浓度15uM)；对照，“25肽”至“65肽”表示本 发明提出的多肽；Y轴为卵巢肿瘤细胞OvCar-3的成活率(％ )。图3(下)图中X轴为多肽浓度(uM) ；Y轴为卵巢肿瘤细胞OvCar-3的成活率 (% )。“方块”表示对照多肽；“三角”表示65肽。图4抑制乳腺肿瘤细胞MDA-MB-468生长作用图4(上)图中X轴为多肽的种类(浓度15uM)；对照，“25肽”至“65肽”表示本 发明提出的多肽；Y轴为乳腺肿瘤细胞MDA-MB-468的成活率(％ )。图4 (下)图中X轴为多肽浓度(uM) ；Y轴为乳腺肿瘤细胞MDA-MB-468的成活率 (% )。“方块”表示对照多肽；“三角”表示65肽。图5抑制胃肿瘤细胞SGC-7901生长作用图5(上)图中X轴为多肽的种类(浓度15uM)；对照，“25肽”至“65肽”表示本 发明提出的多肽；Y轴为胃肿瘤细胞SGC-7901的成活率(％ )。图5(下)图中X轴为多肽浓度(uM) ；Y轴为胃肿瘤细胞SGC-7901的成活率(％)。 “方块”表示对照多肽；“三角”表示65肽。图6抑制大肠肿瘤细胞SW480生长的效果图6(上)图中X轴为多肽的种类(浓度15uM)；对照，“25肽”至“65肽”表示本 发明提出的多肽；Y轴为大肠肿瘤细胞SW480的成活率(％ )。图6(下)图中X轴为多肽浓度(uM) ；Y轴为大肠肿瘤细胞SW480的成活率(％ )。 “方块”表示对照多肽；“三角”表示65肽。图7多肽长度和活性的关系图中X轴为多肽的长度、Y轴为肿瘤细胞的成活率(％ )，所有多肽的浓度为15uM。 “三角”表示肺肿瘤细胞SHP-77 ；“园”表示乳腺肿瘤细胞MBA-MD-23。图865肽两端延伸序列对活性的影响图中X轴为多肽的种类(浓度15uM) ；Y轴为肿瘤细胞(大肠肿瘤SW480) 成活率(％ )。"LysLysLys Il eSerSerGlu-65肽”表示在65肽N末端添加 LysLysLysIleSerSerGlu 序列形成的多肽；“65 肽-GlnArgLysArgLysMet ”表示在 65 肽 C 末 端添加GlnArgLysArgLysMet序列形成的多肽；“65肽”表示65肽。图915肽两端延伸序列对活性的影响图中X轴为多肽的种类(浓度15uM) ；Y轴为肿瘤细胞(大肠肿瘤SW480)成 活率(％ )。"LysLysLys IleSerSerGlu-15 肽”表示在 15 肽 N 末端添加 LysLysLysIleSerSerGlu序列形成的多肽；“15肽-GlnArgLysArgLysMet”表示在15肽C末端添加 GlnArgLysArgLysMet序列形成的多肽；“ 15肽”表示15肽。
具体实施例方式人类低氧诱导因子-Ia蛋白含有826个氨基酸(Semenza GL et al. A nuclear factorinduced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietingene enhancer at a site required for transcriptional activation. Molecular andCellular Biology. 1992Dec ；12(12) 5447-54. ；Semenza GL et al.Structural andfunctional analysis of hypoxia-inducible factor 1. Kidney International. 1997Feb ；51 (2) 553-5.) 0本发明以此蛋白氨基酸序列为基础，筛选获得 具有抑制肿瘤细胞生长作用的多肽。实施例1 本发明首先提供的多肽如SEQ ID NO :1所示，共由85个氨基酸组成。对应人类低 氧诱导因子-Ia 第 17 位 Arg 至第 101 位 Glu (85 肽)，ArgArgLysGluLysSerArgAspAlaAlaA rgSerArgArgSerLysGluSerGluValPheTyrGluLeuAlaHisGlnLeuProLeuProHisAsnValSerSer HisLeuAspLysAlaSerValMetArgLeuThrIleSerTyrLeuArgValArgLysLeuLeuAspAlaGlyAspLe uAsp IIeGluAspAspMetLysAlaGlnMetAsnCysPheTyrLeuLysAlaLeuAspGlyPheValMet,或者 R RKEKSRDAARSRRSKESEVFYELAHQL PLPHNVSSHLDKASVMRLTISYLRVRK LLDAGDLDIEDDMKAQMNCFYLKALDG F V M(SEQ ID NO 1)本发明进一步提供的多肽，是SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列从C末端连续减少 1个或多个氨基酸而形成的、至少由15个氨基酸组成的多肽。例如15肽对应人类低氧诱导因子-Ia第17位Arg至第31位Ser，共由15个氨基酸 组成。ArgArgLysGluLysSerArgAspAlaAlaArgSerArgArgSer，或者 R RKEKSRDAAR SRR S(SEQ ID NO 2)。25肽对应人类低氧诱导因子-Ia第17位Arg至第41位Ala，共由25个氨基酸 组成 ° ArgArgLysGluLysSerArgAspAlaAlaArgSerArgArgSerLysGluSerGluValPheTyrGluLeu Ala,或者 R RKEKSRDAARSRRSKESEVFYEL A(SEQID N0:3)。35肽对应人类低氧诱导因子-Ia第17位Arg至第51位Ser，共由35个氨基酸 组成 ° ArgArgLysGluLysSerArgAspAlaAlaArgSerArgArgSerLysGluSerGluValPheTyrGluLeu AlaHisGlnLeuProLeuProHi sAsnVal Ser，或者 R RKEKSRDAARSR RSKESEVFYELAHQLP LPHNV S (SEQ ID NO :4)。 45肽对应人类低氧诱导因子-Ia第17位Arg至第61位Arg，共由45个氨基酸 组成ο ArgArgLysGluLysSerArgAspAlaAlaArgSerArgArgSerLysGluSerGluValPheTyrGluLe uAlaHi sGlnLeuProLeuProHisAsnValSerSerHisLeuAspLysAlaSerValMetArg,或者 R R K EKSRDAARSRRSKESEVFYELAHQLPL PHNVSSHLDKASVM R (SEQ ID NO :5)。
55肽对应人类低 氧诱导因子-Ia第17位Arg至第71位Lys，共由55个氨基 酸组成° ArgArgLysGluLysSerArgAspAlaAlaArgSerArgArgSerLysGluSerGluValPheTyrGl uLeuAlaHisGlnLeuProLeuProHisAsnValSerSerHisLeuAspLysAlaSerValMetArgLeuThrIIe SerTyrLeuArgValArgLys,或者 R RKEKSRDAARSRRSKES EVFYELAHQLPLPHNVSSHLDKASVMR L T I S Y L R V RK(SEQ ID NO 6)。65肽对应人类低氧诱导因子-Ia第17位Arg至第81位Glu，共由65个氨基酸 组成ο ArgArgLysGluLysSerArgAspAlaAlaArgSerArgArgSerLysGluSerGluValPheTyrGluLe uAlaHisGlnLeuProLeuProHisAsnValSerSerHisLeuAspLysAlaSerValMetArgLeuThrIIeSerT yrLeuArgValArgLysLeuLeuAspAlaGlyAspLeuAspIleGlu,或者 R RKEKSRDA ARSRRSKESEVFYELAHQLPLPHNVSS HLDKASVMRLTISYLRVRKLLDAGDLDI E (SEQ ID NO 7)。75肽对应人类低氧诱导因子-Ia第17位Arg至第91位Glu，共由75个氨基酸 组成 ° ArgArgLysGluLysSerArgAspAlaAlaArgSerArgArgSerLysGluSerGluValPheTyrGluLeu AlaHisGlnLeuProLeuProHisAsnValSerSerHisLeuAspLysAlaSerValMetArgLeuThrlleSerTy rLeuArgValArgLysLeuLeuAspAlaGlyAspLeuAspIIeGluAspAspMetLysAlaGlnMetAsnCysPhe, 或者 RRKEKSRDAARSRRSKESEVFYELA HQLPLPHNVSSHLDKASVMRLTISYLR V RK L LDAGD LD I E D DMKA QMNC F(SEQ ID NO 8)。± $ 月太 ffi 胃夫1 白勺 Fmoc Tj^ ^ S^1 (Meienhofer J. Hormonal Proteins and Peptides. Academic Press,New York. 1973. Schroder G. Lupke K. The Peptides. Acacemic Press, New York. 1965.)。N端乙酰化，C末端酰胺化。1、实验方法以中国专利ZL200510116615. 1中的多肽对照，其对应于人类低氧诱导因子-Ia蛋 白的第 17 位 Arg 至第 30 位 Arg,序列为 ArgArgLysGluLysSerArgAspAlaAlaArgSerArgArg, 共由14个氨基酸组成。实验用肿瘤细胞选用SHP-77肺肿瘤细胞株、Ifep3b肝肿瘤细胞株、OvCar-3卵巢肿 瘤细胞株、MDA-MB-468乳腺肿瘤细胞株、SGC-7901胃肿瘤细胞株、SW480大肠肿瘤细胞株。 上述细胞株购买自美国微生物保藏中心(ATCC)，也可用其他肿瘤细胞进行实验，上述肿瘤 细胞株不构成对本发明的限制。按照美国微生物保藏中心(ATCC)的推荐方法配制肿瘤细胞培养基，培养基购自 美国英杰生命技术有限公司(Irwitrogen)。SHP-77肺肿瘤细胞的培养基组成是90% (ν/ v)RPMI-1640和10% (ν/ν)热灭活胎牛血清。热灭活条件是56°C 30分钟。Hep3b肝肿瘤细胞培养基是90% (v/v) EMEM培养基和10% (ν/ν)热灭活胎牛血清。0vCar-3卵巢肿瘤细胞培养基是80% (v/v) RPMI-1640培养基和20% (ν/ν)热灭 活胎牛血清，另外加终浓度为0. 01mg/ml牛胰岛素。MDA-MB-468乳腺肿瘤细胞培养基是90% (v/v) Leibovitz，s L-15培养基和10%(ν/ν)热灭活胎牛血清。SGC-7901胃肿瘤细胞培养基是90% (v/v) RPMI-1640培养基和10% (ν/ν)热灭活 胎牛血清。SW480大肠肿瘤细胞培养基是90% (v/v) Leibovitz，s L-15培养基和10% (ν/ν) 热灭活胎牛血清。用直径3. 5cm培养皿种植1. 5x10s个细胞，培养基体积2ml。首先在常规含氧培 养箱(美国热电公司Thermo Flectron，型号3111)中37°C培养6小时。更换含多肽的相 同培养基在常规含氧箱中37°C培养3个小时，之后将培养皿移动到缺氧培养箱(美国热电 公司ThermoFlectron，型号3141)中(含氧1 % ) 37°C连续培养18小时。更换含质量体积 比0. 5%噻唑蓝(MTT)的培养基Iml在37°C保温2小时，PBS洗2次后加0. 5ml酸化异丙 醇(按体积，异丙醇IN盐酸=24 1配制)。打勻，5000rpm离心，取上清置分光光度计 570nm比色，酸化异丙醇调零点，吸光度和细胞成活率成正比，没有添加任何抗癌药物的细 胞生长最好、吸光度最大，作为成活率100%的基准。添加抗癌药物组的细胞成活率用以下 公式计算[药物添加组的吸光度/没有添加任何药物组的吸光度]X 100。多肽的浓度梯 度是2uM，5uM，15uM，45uM和90uM，每个浓度用三个培养皿重复，吸光度是三个培养皿数据 的平均。2、抑制肿瘤细胞的生长状况实验结果对肺肿瘤细胞的作用在缺氧条件下测量不同多肽对SHP-77肺肿瘤细胞株的抑 制作用。随着多肽长度的增加活性增加，65肽和55肽作用最强，其半抑制浓度为3uM，而相 同条件下对照肽的半抑制浓度大约为80uM(图1)。抑制肝肿瘤细胞生长采用Hep3b肝肿瘤细胞株，测量不同多肽在缺氧条件下对 肿瘤细胞生长抑制作用。随着多肽长度的增加活性增加，对照肽的半抑制浓度大于lOOuM， 而相同条件下65肽、55肽的半抑制率为12uM，其抗肿瘤作用明显优于对照(图2)。对卵巢肿瘤细胞生长的抑制效果在缺氧条件下，测量不同多肽对OvCar-3卵巢 肿瘤细胞生长的抑制作用。随着多肽长度的增加活性增加，65肽和55肽的半抑制浓度为 4. 5uM，对照肽的半抑制浓度为60uM(图3)。抑制乳腺肿瘤细胞生长在缺氧条件下，测试MBA-MD-23乳腺细胞株的生长状况。 随着多肽长度的增加活性增加，65肽和55肽的半抑制浓度为2. 5uM，而相同条件下对照肽 的半抑制浓度为55uM (图4)。抑制胃肿瘤细胞生长测试SGC-7901胃细胞株在缺氧条件下的生长状况。随着多 肽长度的增加活性增加，65肽和55肽的半抑制浓度为10uM，而相同条件下对照肽的半抑制 浓度大于IOOuM (图5)。抑制大肠肿瘤细胞生长在缺氧条件下，测试SW480大肠肿瘤细胞株的生长状况。 随着多肽长度的增加活性增加，65肽和55肽的半抑制浓度为17uM，而相同条件下对照肽的 半抑制浓度大于200uM (图6)。以上试验显示，15肽至45肽、75肽至85肽对肺肿瘤、肝肿瘤、卵巢肿瘤的抑制作 用在不同程度上优于对照肽，65肽和55肽对六种肿瘤细胞有显著的生长抑制效果，尤其是 对肺肿瘤、卵巢肿瘤和乳腺肿瘤细胞的作用相当显著。 实施例2
通常为了降低多肽的制造成本，在保持相对强的生物活性的前提下尽量选择制造 比较短的多肽。根据以上结果，得知65肽比45肽的抑制肿瘤细胞生长效果显著。65肽和45肽的区别是65肽C末端比45肽多出序列LeuThrIleSerTyrLeuArgV alArgLysLeuLeuAspAlaGlyAspLeuAspIleGlu，这个序列的长度是20个氨基酸，正是这段序 列大幅增加了抗肿瘤效果。为了从上 述这20个氨基酸序列中识别最短的有效长度，以上述45肽(SEQ ID NO 5)为基本结构，在C末端增加1-20个不等数量的氨基酸，合成了如下多肽46 肽ArgArgLysGluLysSerArgAspAlaAlaArgSerArgArgSerLysGluSerGluValPheTyrGlu LeuAlaHi sGlnLeuProLeuProHisAsnValSerSerHisLeuAspLysAlaSerValMetArg-Leu,或者 R RKEKSRDAARSRRSKESEVFYELAHQL P LPHNVS SHLDKA SVM R-L(SEQ ID NO 9)47 肽ArgArgLysGluLysSerArgAspAlaAlaArgSerArgArgSerLysGluSerGluValPheTyrGlu LeuAlaHi sGlnLeuProLeuProHisAsnValSerSerHisLeuAspLysAlaSerValMetArg-LeuThr,或 #RRKEKSRDAARSRRSKESEVFYELAH QLPLPHNVSSHLDKASVMR-L T (SEQ ID NO 10)48 肽ArgArgLysGluLysSerArgAspAlaAlaArgSerArgArgSerLysGluSerGluValPheTyrGlu LeuAlaHi sGlnLeuProLeuProHisAsnValSerSerHisLeuAspLysAlaSerValMetArg-LeuThrll e，或者 R RKEKSRDAARSRRSKESEVFYEL A H QL PLPHNVS SHLDKASVMR-LT I (SEQ ID NO 11)49 肽ArgArgLysGluLysSerArgAspAlaAlaArgSerArgArgSerLysGluSerGluValPheTyrGlu LeuAlaHi sGlnLeuProLeuProHisAsnValSerSerHisLeuAspLysAlaSerValMetArg-LeuThrIIe Ser，或者 R RKEKSRDAARSRRSKESEVFYEL A H QL PLPHNVS SHLDKASVMR-LTI S(SEQ ID NO 12)50 肽ArgArgLysGluLysSerArgAspAlaAlaArgSerArgArgSerLysGluSerGluValPheTyrGlu LeuAlaHi sGlnLeuProLeuProHisAsnValSerSerHisLeuAspLysAlaSerValMetArg-LeuThrlle SerTyr，或者 R RKEKSRDAARSRRSKESEVFYELA HQLPLPHNVSSHLDKASVMR-LTIS Y (SEQ ID NO 13)51 肽ArgArgLysGluLysSerArgAspAlaAlaArgSerArgArgSerLysGluSerGluValPheTyrGl uLeuAlaHisGlnLeuProLeuProHisAsnValSerSerHisLeuAspLysAlaSerValMetArg-LeuThrIl eSerTyrLeu，或者 R RKEKSRDAARSRRSKESEVFY ELAH QL PLPHNVSSHLDKASVM R-L TISY L (SEQ IDNO 14)52 肽
ArgArgLysGluLysSerArgAspAlaAlaArgSerArgArgSerLysGluSerGluValPheTyrGlu LeuAlaHi sGlnLeuProLeuProHisAsnValSerSerHisLeuAspLysAlaSerValMetArg-LeuThrIIe SerTyrLeuArg,或者 R RKEKSRDAARSRRSKESEVF YELAH QL PLPHNVSSHLDKASVM R-L TIS Y L R(SEQID NO: 15)53 肽ArgArgLysGluLysSerArgAspAlaAlaArgSerArgArgSerLysGluSerGluValPheTyrGlu LeuAlaHi sGlnLeuProLeuProHisAsnValSerSerHisLeuAspLysAlaSerValMetArg-LeuThrlle SerTyrLeuArgVal,或者 R RKEKSRDAARSRRSKESEV FYELAH QL PLPHNVSSHLDKASVM R-L TI SYLR V(SEQID NO 16)54 肽ArgArgLysGluLysSerArgAspAlaAlaArgSerArgArgSerLysGluSerGluValPheTyrGlu LeuAlaHi sGlnLeuProLeuProHisAsnValSerSerHisLeuAspLysAlaSerValMetArg-LeuThrlle SerTyrLeuArgValArg,或者 R RKEKSRDAARSRRSKESE VFYELAH QL PLPHNVSSHLDKASVM R-L T ISYLRV R(SEQ ID NO : 17)55 肽ArgArgLysGluLysSerArgAspAlaAlaArgSerArgArgSerLysGluSerGluValPheTyrGl uLeuAlaHisGlnLeuProLeuProHisAsnValSerSerHisLeuAspLysAlaSerValMetArg-LeuThrIl eSerTyrLeuArgValArgLys，或者 R RKEKSRDAARSRRSKE SEVFYELAH QL PLPHNVSSHLDKASVM R-L T I S Y L R V RK (SEQ ID NO 6)56 肽ArgArgLysGluLysSerArgAspAlaAlaArgSerArgArgSerLysGluSerGluValPheTyrGl uLeuAlaHisGlnLeuProLeuProHisAsnValSerSerHisLeuAspLysAlaSerValMetArg-LeuThrIl eSerTyrLeuArgValArgLysLeu，或者 R RKEKSRDAARSRRSK ESEVFYELAHQLPLPHNVSSHLDKASV M R-L T I S Y L R V RK L (SEQ ID NO : 18)57 肽ArgArgLysGluLysSerArgAspAlaAlaArgSerArgArgSerLysGluSerGluValPheTyrGlu LeuAlaHi sGlnLeuProLeuProHisAsnValSerSerHisLeuAspLysAlaSerValMetArg-LeuThrIIe SerTyrLeuArgValArgLysLeuLeu,或者 R RKEKSRDAARSRRSK ESEVFYELAHQLPLPHNVSSHLDKASV M R-L T I S Y L R V RK L L(SEQ ID NO: 19)58 肽ArgArgLysGluLysSerArgAspAlaAlaArgSerArgArgSerLysGluSerGluValPheTyrGlu LeuAlaHi sGlnLeuProLeuProHisAsnValSerSerHisLeuAspLysAlaSerValMetArg-LeuThrIIe SerTyrLeuArgValArgLysLeuLeuAsp，或者 R RKEKSRDAARSRRSKESEVFYELAHQLPLPHNVSSHLDKAS VM R-L TISYLRV RK L L D (SEQ ID NO : 20)59 肽ArgArgLysGluLysSerArgAspAlaAlaArgSerArgArgSerLysGluSerGluValPheTyrGlu LeuAlaHi sGlnLeuProLeuProHisAsnValSerSerHisLeuAspLysAlaSerValMetArg-LeuThrIIe SerTyrLeuArgValArgLysLeuLeuAspAla，或者 R RKEKSRDAARSRR SKESEVFYELAHQLPLPHNVSSHLDKA SVM R-L TISYLRV RK L L D A (SEQ ID NO 21)60 肽ArgArgLysGluLysSerArgAspAlaAlaArgSerArgArgSerLysGluSerGluValPheTyrGlu LeuAlaHi sGlnLeuProLeuProHisAsnValSerSerHisLeuAspLysAlaSerValMetArg-LeuThrIIe SerTyrLeuA rgValArgLysLeuLeuAspAlaGly，或者 R RKEKSRDAARSR RSKESEVFYELAHQLPLPHNVSSHLDK ASVM R-L TISYLRV RK L L D A G (SEQ ID NO 22)61 肽ArgArgLysGluLysSerArgAspAlaAlaArgSerArgArgSerLysGluSerGluValPheTyrGlu LeuAlaHi sGlnLeuProLeuProHisAsnValSerSerHisLeuAspLysAlaSerValMetArg-LeuThrIIe SerTyrLeuArgValArgLy sLeuLeuAspAlaGlyAsp，或者 R RKEKSRDAARS RRSKESEVFYELAHQLPLPHNVSSHLD KASVM R-L TISYLRV RK LLDAG D (SEQ ID NO 23)62 肽ArgArgLysGluLysSerArgAspAlaAlaArgSerArgArgSerLysGluSerGluValPheTyrGlu LeuAlaHi sGlnLeuProLeuProHisAsnValSerSerHisLeuAspLysAlaSerValMetArg-LeuThrll eSerTyrLeuArgValArgLysLeuLeuAspAlaGlyAspLeu，或者 R RKEKSRDAA RSRRSKESEVFYELAHQLPLPHNVSSH LDKASVM R-L TISYLRV RK LLDAGD L (SEQ ID NO 24)63 肽ArgArgLysGluLysSerArgAspAlaAlaArgSerArgArgSerLysGluSerGluValPheTyrGlu LeuAlaHi sGlnLeuProLeuProHisAsnValSerSerHisLeuAspLysAlaSerValMetArg-LeuThrIIe SerTyrLeuArgValArgLysLeuLeuAspAlaGlyAspLeuAsp，或者 R RKEKSRDAA RSRRSKESEVFYELAHQLPLPHNVSSH LDKASVM R-L TISYLRV RK LLDAGDLD (SEQ ID NO 25)64 肽ArgArgLysGluLysSerArgAspAlaAlaArgSerArgArgSerLysGluSerGluValPheTyrGlu LeuAlaHi sGlnLeuProLeuProHisAsnValSerSerHisLeuAspLysAlaSerValMetArg-LeuThrIIe SerTyrLeuArgValArgLysLeuLeuAspAlaGlyAspLeuAspIle，或者 R RKEKSRDA ARSRRSKESEVFYELAHQLPLPHNVSSHLDKASVM R-L TISYLRV RK LLDAGDLD I(SEQ ID NO: 26)65 肽ArgArgLysGluLysSerArgAspAlaAlaArgSerArgArgSerLysGluSerGluValPheTyrGlu LeuAlaHi sGlnLeuProLe uProHisAsnValSerSerHisLeuAspLysAlaSerValMetArg-LeuThrIIe SerTyrLeuArgValArgLysLeuLeuAspAlaGlyAspLeuAspIleGlu，或者 R R K E K S R D AARSRRSKESEVFYELAH QL PLPHNVS SHLDKASVMR-LTISYLRVRKLLDAGDLD I E(SEQ ID NO 7)1、实施方法(同实施例1)2、多肽的长度和活性的关系实验结果使用SHP-77肺肿瘤细胞株测试了以上的多肽，如图7所示当多肽的长度大于或等 于54个氨基酸时活性显著，长度小于51则活性较弱。运用MDA-MB-468乳腺肿瘤细胞株得到了相似的结果，即当多肽的长度大于或等 于55个氨基酸时活性显著，长度小于51则活性较弱。实施例3:为了增强多肽的抗肿瘤活性，以抗肿瘤作用最强的65肽为例，重新合成了如下多 肽。它们是在65肽的基础上分别在N末端和C末端添加序列。LysLysLys Il eSerSerGlu-65 肽LysLysLysI leSerSerGlu-ArgArgLysGluLysSerArgAspAlaAlaArgSerArgArgSerL ysGluSerGluValPheTyrGluLeuAlaHisGlnLeuProLeuProHisAsnValSerSerHisLeuAspLysAl aSerValMetArgLeuThrl leSerTyrLeuArgValArgLysLeuLeuAspAlaGlyAspLeuAspIleGlu,或 #KKKISSE-RRKEKSRDAARSRRSKESE VFYELAHQLPLPHNVSSHLDKASVMRL TI SYLRVRKLLDAGD LD I E(SEQ ID NO 27)对应人类低氧诱导因子-Ia蛋白的第10位Lys至16位Glu+65肽(第17位Arg 至第81位Glu)。65肽-GlnArgLysArgLysMet ArgArgLysGluLysSerArgAspAlaAlaArgSerArgArgSerLysGluSerGluValPheTyrGlu LeuAlaHisGlnLeuProLeuProHisAsnValSerSerHisLeuAspLysAlaSerValMetArgLeuThrlIeSe rTyrLeuArgValArgLysLeuLeuAspAlaGlyAspLeuAspI IeGlu-GlnArgLysArgLysMet,或者 R R KEKSRDAARSRRSKESEVFYELAHQLP LPHNVSSHLDKASVMRLTI S YL RV RK LL DAGDLD I E-QRKRK M(SEQ ID NO 28)对应人类低氧诱导因子-la蛋白的65肽(第17位Arg至第81位Glu) +第717 位Gln-至第722位Met。1、实施方法(同实施例1)2、在多肽两端延长序列对活性的影响实验用大肠肿瘤细胞SW480测试，LysLysLysIleSerSerGlu-65肽，和65肽相比较，活性没有明显的差异。所以N末端延长序列不影响活性。在65肽的C末端添加序列，所得的65肽-GlnArgLysArgLysMet,和65肽相比较， 活性有显著提高(图8)。GlnArgLysArgLysMet所对应的第717位Gln-至第722位Met 区域被认为是人类低氧诱导因子-Ia蛋白的核定位信号(nuclear localization signal, NLS)。以抗肿瘤作用较低的15肽为例，得到了相似的结果LysLysLysIleSerSerGlu-15肽 LysLysLysIleSerSerGlu-ArgArgLysGluLysSerArgAspAlaAlaArgSerArgArgSer, 或者KKK I S SE-RRKEK S RDAAR S RR S (SEQ IDNO 29)对应人类低氧诱导因子-Ia蛋白的的第10位Lys至16位Glu+15肽(第17位 Lys 至第 31 位 Ser)。15 肽-GlnArgLysArgLysMet ArgArgLysGluLysSerArgAspAlaAlaArgSerArgArgSer-GlnArgLysArgLysMet,或者RRKEKSRDAARSRR S-Q RKRK M (SEQ ID NO 30)对应人类低氧诱导因子-Ia蛋白的15肽(第17位Arg至第31位Ser) +第717 位Gln-至第722位Met。同样用大肠肿瘤细胞SW480测试，得出N末端延长序列不影响活性。 LysLysLysIleSerSerGlu-15肽，和15肽相比较，活性没有明显的差异。而15 肽-GlnArgLysArgLysMet，和15肽相比较，活性有显著提高(图9)。
权利要求
1.抗肿瘤多肽，其特征在于选自SEQID NO :1所示的氨基酸序列从C末端连续减少0 个、1个或多个氨基酸而形成的、至少由15个氨基酸组成的多肽。
2.如权利要求1所述的抗肿瘤多肽，其特征在于至少由25个氨基酸组成的多肽。
3.如权利要求1所述的抗肿瘤多肽，其特征在于所述的抗肿瘤多肽选自如SEQID NO 1-30任一序列所示的多肽。
4.如权利要求1或2任一所述的抗肿瘤多肽，其特征在于含有55-65个氨基酸的多肽。
5.如权利要求1或2任一所述的抗肿瘤多肽，其特征在于所述的抗肿瘤多肽选自如 SEQID NO :6或7所示的多肽。
6.抗肿瘤多肽，其特征在于权利要求1-5任一所述抗肿瘤多肽的C末端添加氨基酸序 列GlnArgLysArgLysMet所形成的多肽。
7.如权利要求1-6任一所述的抗肿瘤多肽，其特征在于所述肿瘤为肺癌、肝癌、卵巢 癌、乳腺癌、胃癌或大肠癌。
8.权利要求1-7所述抗肿瘤多肽在抗肿瘤药物制备上的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述的肿瘤为肺癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌、胃 癌或大肠癌。
全文摘要
本发明涉及抗肿瘤多肽及其用途。细胞缺氧反应可诱导低氧诱导因子-1a的表达，并引发恶性肿瘤。本发明从低氧诱导因子-1a蛋白序列中鉴定出一系列片段存在于第10位Lys至第101位Glu区间以及第717位Gln-至第722位Met区间，但是这些片段或者多肽反而能够抑制癌细胞的生长和存活。
文档编号A61K38/17GK102127161SQ201010591769
公开日2011年7月20日 申请日期2010年12月16日 优先权日2010年12月16日
发明者何明忠, 鲍丽娟 申请人:何明忠