血管内皮生长因子(vegf)受体的抑制剂及其使用方法

专利名称：血管内皮生长因子(vegf)受体的抑制剂及其使用方法
血管内皮生长因子(VEGF)受体的抑制剂及其使用方法对相关申请的交叉引用本申请涉及并要求2009年12月29日提交的美国临时申请序列号61/290，789的优先权，其全部内容通过引用特此引入本文。关于政府赞助研究或开发的声明 本发明是利用由国家卫生研究院以合同号ROl-AR 051448,ROl-AR 051886和P50AR054086资助的政府支持而完成的。政府可以拥有本发明的某些权利。
背景技术：
血管内皮生长因子(VEGF)通过结合并激活受体酪氨酸激酶(RTK)的VEGF受体(VEGFR)家族的三名成员来调节血管和淋巴管的发育和内环境稳定性(Olsson等人，Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. ,7(5) :359-371 (2006))。VEGFRl (Fltl)、VEGFR2 (KDR/FlkI)和VEGFR3 (Flt4)是V型RTK的成员；V型RTK是包含由7个Ig-样结构域(D1-D7)组成的大的细胞外区域、单一的跨膜(TM)螺旋和具有酪氨酸激酶活性的胞质区域以及另外的调控序列的家族。VEGFR的胞外域的第二和第三Ig-样结构域，例如D2和D3，起到细胞因子的VEGF家族的五个成员(即，VEGF-A、B、C、D和胎盘生长因子(PLGF))的结合位点的作用(Barleon 等人，J. Biol. Chem.，272 (16) 10382-10388 (1997)；和 Shinkai 等人，J. Biol.Chem.，273 (47) :31283-31288 (1998))。这些生长因子是共价连接的同型二聚体。各原体是由在名为半胱氨酸结(cysteine-knot)生长因子的结构中以反向平行的方式排列的四链^折叠片构成的(Weismann等人，Cell,91(5) :695-704(1997))。细胞因子的半胱氨酸结家族的其他成员包括神经生长因子(NGF)和血小板源生长因子(TOGF)。但是，RTlU^roGFR家族(III型)的胞外域由5个Ig-样重复序列构成，其中Dl、D2和D3起到TOGFR和家族的其他成员(即KIT、CSFlR和Flt3)的配体结合区域的作用。结构和生化实验已经表明，SCF结合细胞外区域诱导KIT 二聚化，该步骤随后是邻近的KIT分子的两个近膜Ig-样结构域D4和D5之间的同型接触(Yuzawa等人，Cell，130 (2) :323-334 (2007))。野生型和致癌KIT突变体的生化研究已经表明，同型D4和D5接触对于KIT 二聚体在胞质区中以有利于反式自磷酸化、激酶活化和细胞信号传导的距离和方向来定位起到关键作用。然而，有必要更好地表征VEGF受体的结构。这种表征将会导致可以作为药物、药品或其他生物药剂靶向的区域的有意鉴定。发明概述本发明提供了结合血管内皮生长因子受体(VEGF受体)例如，VEGFRl(Fltl),VEGFR2 (KDR/Flkl)和VEGFR3 (Flt4)的胞外域的成分(moiety)，例如，抗体或其抗原结合部分、小分子、肽类分子、适体和adnectin。本发明的成分可以锁定VEGF受体的胞外域处于非活性状态，从而抑制VEGF受体的活性。在本发明的一个实施方案中，该成分锁定VEGF受体的胞外域为单体状态。在本发明的另一个实施方案中，该成分允许VEGF受体的胞外域二聚化，但影响两个单体的Ig-样结构域(例如，VEGF受体的D7-D7结构域)之间的定位、定向和/或距离，从而抑制VEGF受体的活性。换句话说，该成分可以允许配体诱导的VEGF受体胞外域的二聚化，但影响两个胞外域在细胞表面界面处的定位或改变或阻止VEGF受体中的构象变化，从而抑制VEGF受体的活性(例如，抑制受体内化和/或抑制受体的酪氨酸自磷酸化和/或抑制受体激活下游信号传导途径的能力)。本发明至少部分地基于VEGF2受体胞外域部分的晶体结构的解译。这种晶体结构的解译使得能够鉴别本发明的成分可以靶向的表位，例如，构象表位。
本发明还至少部分地基于发现邻近受体之间的同型D7相互作用不是在受体二聚化中起作用，而是两个受体的近膜区以能够实现导致酪氨酸激酶激活的胞质域之间的相互作用的距离和定向精确定位所必需的。因此，一方面，本发明提供了一种结合人血管内皮生长因子受体(VEGF受体)的胞外域的成分，其中该成分锁定VEGF受体的胞外域于非活性状态，从而拮抗VEGF受体的活性。在一个实施方案中，该成分结合人VEGF受体的Ig-样结构域。在一个实施方案中，该Ig-样结构域不负责配体与VEGF受体的结合。在另一个实施方案中，该Ig-样结构域负责配体与VEGF受体的结合。在一个实施方案中，该成分不阻断VEGF受体和VEGF受体配体之间的相互作用。在另一个实施方案中，该成分阻断VEGF受体和VEGF受体配体之间的相互作用。在一个实施方案中，该成分不阻止VEGF受体的二聚化。在另一个实施方案中，该成分阻止VEGF受体的二聚化。在一个实施方案中，该成分阻止VEGF受体各原体的胞外域的近膜区之间的相互作用。在另一个实施方案中，该相互作用是同型的。而在另一个实施方案中，该相互作用是异型的。在一个实施方案中，胞外域的近膜区是VEGF受体的第七Ig-样结构域(D7)。在另一个实施方案中，该成分结合到VEGF受体的D7结构域的下列共有序列IVIX1 R O X2 X3X4 D/E X5 G (SEQ ID NO :158)，其中L是亮氨酸，I是异亮氨酸，R是精氨酸，O是疏水性氨基酸，D是天冬氨酸，E是谷氨酸，G是甘氨酸以及Xi、X2、X3、X4和X5是任何氨基酸。在具体的实施方案中，O是缬氨酸A1选自于精氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸和天冬氨酸；X2选自于精氨酸、赖氨酸和苏氨酸；X3选自于赖氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和缬氨酸；X4选自于谷氨酸和缬氨酸；以及X5选自于谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸和谷氨酰胺。在另一个实施方案中，该成分引起VEGF受体各原体的胞外域的近膜区以约16人、17 A、18 A, 19 A或者20 A的距离间隔。在一个实施方案中，该成分锁定VEGF受体的胞外域于非活性状态。在一个实施方案中，VEGF受体是VEGFRl (Fltl)。在另一个实施方案中，VEGF受体是VEGFR2 (KDR/Flkl)。在另一个实施方案中，VEGF受体是VEGFR3 (Flt4)。在另一个实施方案中，该成分结合VEGFR2的氨基酸残基Arg726。在另一个实施方案中，该成分结合VEGFR2的氨基酸残基Asp731。在另一个实施方案中，该成分结合VEGFR2的氨基酸残基Arg726和Asp731。在再另一个实施方案中，该成分结合选自于包括VEGFR2的氨基酸残基724、725、726、727、728、729、730、731、732和733的组中的一个或多个氨基酸残基。该成分可以结合在任何上述氨基酸残基的IA、2A、3A、4A或5A内。在一个实施方案中，该成分结合VEGFRl的氨基酸残基Arg720。在另一个实施方案中，该成分结合VEGFRl的氨基酸残基Asp725。在另一个实施方案中，该成分结合VEGFRl的氨基酸残基Arg720和Asp725。在另一个实施方案中，该成分结合选自于包括VEGFRl的氨基酸残基718、719、720、721、722、723、724、725、726和727的组中的一个或多个氨基酸残基。该成分可以在结合上述任何氨基酸残基的IA、2A、3人、4A或5A内。在 一个实施方案中，该成分结合VEGFR3的氨基酸残基Arg737。在另一个实施方案中，该成分结合VEGFR3的氨基酸残基Asp742。在另一个实施方案中，该成分结合VEGFR3的氨基酸残基Arg737和Asp742。在再另一个实施方案中，该成分结合选自于包括VEGFR3的氨基酸残基735、736、737、738、739、740、741、742、743和744的组中的一个或多个氨基酸残基。该成分可以结合在上述任何氨基酸残基的IA、2A> 3A、4人或5A内。在一个实施方案中，该成分结合VEGF受体胞外域上的构象表位。在一个实施方案中，该构象表位由VEGF受体的D7结构域中的两个或更多个残基构成。在再另一个实施方案中，构象表位包含或由氨基酸残基Arg726和Asp731 ;Arg 720和Asp 725;或者Arg737
和Asp742组成。在某些实施方案中，该成分结合在上述构象表位的IA、2A、3人、
或5 A内。在另一个实施方案中，该成分结合VEGF受体上的连续表位。在一个实施方案中，连续表位由VEGF受体D7结构域中的两个或更多个残基组成。在另一个实施方案中，连续表位是选自于 VEGFRl 的 672VAISSS6'VEGFRl 的 678ITLDCHA684、VEGFRl 的 685NGVPEPQ691、VEGFRl的 700KIQQEPg706, VEGFRl 的 707IILG710' VEGFRl 的 711PGS713' VEGFRl 的 714STLFI718' VEGFRl 的719ERVTEEDEGV728、VEGFR3 的 689VNVSDS694、VEGFR3 的 695LEMQCLV7CI1、VEGFR3 的 7ci2AGAHAPS708、VEGFR3 的 717LLEEKSg723、VEGFR3 的 724VDLA72' VEGFR3 的 728DSN730' VEGFR3 的 731QKLSI735 和vegfr3 的 736Qrvreedagr745、vegfr2 的 678Tsiges683, vegfr2 的 684Ievscta690, vegfr2 的691SGNPPPq697, VEGFR2 的 7ci6TLVEDSG712、VEGFR2 的 mIVLK716、VEGFR2 的 mDGN719、VEGFR2 的720RNLTI724和VEGFR2的725RRVRKEDEGL734的表位。在一些实施方案中，该成分可以结合在任何上述表位的I人、2A、3A、4人或5人内。在一个实施方案中，该成分阻断配体诱导的VEGF受体酪氨酸自磷酸化作用。在另一个实施方案中，该成分阻断配体诱导的VEGF受体的内化。在一个实施方案中，结合VEGF受体胞外域的成分是分离的抗体或其抗原结合部分。在另一个实施方案中，该抗体或其抗原结合选自于人抗体、人源化抗体、双特异性抗体和嵌合抗体。在另一个实施方案中，该抗体或其抗原结合部分包含选自于IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE恒定区的重链恒定区。在一个实施方案中，该抗体重链恒定区是IgGl。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分选自于包括Fab片段、F(AB' )2片段、单链Fv片段、SMIP、亲和体(affibody)、亲和性多聚体(avimer)、纳米抗体(nanobody)以及单域抗体的组。在再另一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分以选自于包括Ix KT7M或更小、更优选地5x 10_8M或更小、更优选地Ix 10_8M或更小、更优选地5x 10_9M或更小的KD结合受体酪氨酸激酶的Ig-样结构域。一方面，本发明提供了产生结合本文所描述的VEGF受体胞外域的抗体或其抗原结合部分的杂交瘤。在一个实施方案中，结合VEGF受体胞外域的部分是小分子。在另一个实施方案中，该小分子结合VEGFR2的氨基酸残基Arg726或Asp731中的至少一个。在另一个实施方案中，该小分子结合VEGFRl的氨基酸残基Arg720或Asp725中的至少一个。在另一个实施方案中，该小分子结合VEGFR3的氨基酸残基Arg737或Asp742中的至少一个。
在另一个实施方案中，结合VEGF受体胞外域的成分是一种肽类分子。在一个实施方案中，该肽类分子是基于VEGF受体的Ig-样结构域设计的。在另一个实施方案中，该肽类分子是基于人VEGF受体的D7结构域设计的。在一个实施方案中，肽类分子包含结构-XJI X1 R O X2 X3 X4 D/E X5 G (SEQ ID NO : 158)，其中L是亮氨酸，I是异亮氨酸，R为精氨酸，O是疏水性氨基酸，D是天冬氨酸，E是谷氨酸，G是甘氨酸以及Xp X2、X3、X4和X5是任何氨基酸。在具体的实施方案中，O是缬氨酸；X1选自于精氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸和天冬氨酸；X2选自于精氨酸、赖氨酸和苏氨酸；X3选自于赖氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和缬氨酸；X4选自于谷氨酸和缬氨酸；且X5选自于谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸和谷氨酰胺。
在另一个实施方案中，肽类分子包含与人VEGFR2的氨基酸残基724-733、678-683、684-690、691-697、706-712、713-716、717-719、720-724 或 725-734 至少 8085^^90%或95%相同的结构。在另一个实施方案中，肽类分子包含与人VEGFRl的氨基酸残基 718-727、672-677、678-684、685-691、700-706、707-710、711-713、714-718 或 719-728至少80%、85%、90%或95%相同的结构。在另一个实施方案中，肽类分子包含与人￥￡6卩1 3的氨基酸残基 735-744、689-694、695-701、702-708、717-723、724-727、728-730、731-735或736-745至少80%、85%、90%或95%相同的结构。在另一个实施方案中，肽类分子包含至少一个D-氨基酸残基。在一个实施方案中，结合VEGF受体胞外域的成分是adnectin。在另一个方面，本发明提供了结合人类VEGF受体的D7结构域上的构象表位并拮抗人VEGF受体的活性的成分，其中所述的构象表位包含VEGFR2的残基Arg726和Asp731 ；VEGFRl 的残基 Arg720 和 Asp725 ;或 VEGFR3 的残基 Arg737 和 Asp742。在另一个方面，本发明提供结合VEGFR2的氨基酸残基Arg726和Asp731 ；VEGFRl的氨基酸残基Arg720和Asp725 ;或VEGFR3的氨基酸残基Arg737和Asp742，从而拮抗人VEGF受体的活性的成分。在另一个方面，发明提供了包含如本文所述的结合VEGF受体的胞外域的成分和药学上可接受的载体的药物组合物。在另一个方面，本发明提供了一种治疗或预防受试者中VEGF受体相关疾病的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本发明的成分，从而治疗或预防该疾病。在一个实施方案中，VEGF受体酪氨酸激酶相关疾病选自于癌症、年龄相关性黄斑变性(AMD)、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、糖尿病性视网膜病、淋巴系统的疾病和疼痛相关疾病。在一个实施方案中，癌症选自于GIST、AML、SCLC、肾癌、结肠癌、乳腺癌、淋巴癌和其生长由基质支持的癌症。在一个方面，本发明提供了用于鉴定结合VEGF受体的胞外域，如Ig-样结构域的成分的方法，该方法包括将VEGF受体与候选成分接触；同时地或相继地将VEGF受体与VEGF受体的配体接触；和测定该成分是否影响配体诱导的二聚VEGF受体的Ig-样结构域之间的定位、定方和/或距离，从而鉴定结合VEGF受体的胞外域，如Ig-样结构域的成分。在一个实施方案中，该成分锁定VEGF受体的胞外域于非活性状态。在另一个实施方案中，该成分结合VEGF受体的第七Ig-样结构域(D7)。在另一个方面，本发明提供了一种结合人VEGF受体的D7结构域上的构象表位的分离的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体或其抗原结合部分拮抗人VEGF受体的活性，并且其中所述构象表位包含VEGFR2的残基Arg726和Asp731残基。在另一个方面，本发明提供了一种结合人VEGF受体的D7结构域上的构象表位的分离的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体或其抗原结合部分拮抗人VEGF受体的活性，并且其中所述构象表位包含VEGFRl的残基Arg720和Asp725。在另一个方面，本发明提供了一种结合人VEGF受体的D7结构域上的构象表位的分离的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体或其抗原结合部分拮抗人VEGF受体的活性，并且其中所述构象表位包含VEGFR3的残基Arg737和Asp742。在另一个方面，本发明提供了一种结合VEGFR2的氨基酸残基724-733，从而拮抗VEGFR2的活性的分离的抗体或其抗原结合部分。在一个方面，本发明提供了一种结合VEGFRl的氨基酸残基718-727，从而拮抗VEGFRl的活性的分离的抗体或其抗原结合部分。在另一个方面，本发明提供了一种结合VEGFR3的氨基酸残基735-744，从而拮抗VEGFR3的活性的分离的抗体或其抗原结合部分。

在一个方面，本发明提供了一种结合选自于人VEGFR2的Arg726和Asp731的至少一个氨基酸残基，从而拮抗人VEGFR2的活性的分离的抗体或其抗原结合部分。在另一个方面，本发明提供了一种结合选自于人VEGFRl的Arg720和Asp725的至少一个氨基酸残基，从而拮抗人类VEGFRl的活性的分离的抗体或其抗原结合部分。在另一个方面，本发明提供了一种结合选自于人类VEGFR3的Arg737和Asp742的至少一个氨基酸残基,从而拮抗人VEGFR3的活性的分离的抗体或其抗原结合部分。在另一个方面，本发明提供了结合人受体酪氨酸激酶的胞外域，例如，Ig-样结构域或铰链区的成分，其中该成分锁定受体酪氨酸激酶的胞外域于非活性状态，从而拮抗受体酪氨酸激酶的活性。在一个实施方案中，该Ig-样结构域可以负责或不负责配体与受体酪氨酸激酶的结合。在另一个实施方案中，该成分可以阻断或不阻断受体酪氨酸激酶和受体酪氨酸激酶的配体之间的相互作用。在再另一个实施方案中，本发明的成分可以阻止或不阻止受体酪氨酸激酶的二聚化。在进一步的实施方案中，本发明的成分可以不阻止配体诱导的受体二聚化，但会阻止受体酪氨酸激酶活化所需的近膜区之间的同型或异型相互作用。在一些实施方案中，本发明的成分阻止受体酪氨酸激酶各原体的胞外域的近膜区之间的同型或异型相互作用。例如，本发明的成分可以导致受体酪氨酸激酶各原体的胞外域末端(胞外域最接近于细胞膜的端部)以大于约15 A、约20A、约25 A、约30A、约35 A或约40A的距离间隔。在优选的实施方案中，受体酪氨酸激酶是III型受体酪氨酸激酶，如KU、PDGFRa、PDGFRP、CSF1R、Fms、Flt3 或 Flk2。在其他的实施方案中，被本发明的成分结合的Ig-样结构域是III型受体酪氨酸激酶的D4结构域。在一个具体的实施方案中，该成分结合D4相互作用位点的以下共有序列=LX1RX2X3X4X5X6X7G,其中L为亮氨酸，R为精氨酸，G是甘氨酸，且m X4、X5、X6和X7是任何氨基酸。在具体的实施方案中，X1选自于苏氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、天冬酰胺或赖氨酸；X2选自于亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸和甲硫氨酸；X3选自于赖氨酸、组氨酸、天冬酰胺和精氨酸；X4选自于甘氨酸、缬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸；X5选自于苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸；X6选自于谷氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺；以及X7选自于甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和苏氨酸。
在另 一个实施方案中，被本发明的成分结合的Ig-样结构域是III型受体酪氨酸激酶的D5结构域，如人Kit的氨基酸残基309-413或410-519。在具体的实施方案中，本发明的成分可以结合到D5相互作用位点的保守氨基酸的共有序列。在另一个实施方案中，本发明的成分结合III型受体酪氨酸激酶D4或D5结构域的突变体或结合V型受体酪氨酸激酶D7结构域的突变体。在具体的实施方案中，该成分结合在人Kit的突变D5结构域中的点突变，其中该突变选自于Thr417、Tyr418、Asp419、Leu421、Arg420、Tyr503 和 Ala502。在一些实施方案中，III型受体酪氨酸激酶是人Kit和本发明的成分结合从下面表4所示的那些氨基酸残基组成的组中选择的I个或多个氨基酸残基，如2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、11个或更多、12个或更多、13个或更多、14个或更多、15个或更多、16个或更多、17个或更多或18个或更多个氨基酸残基。例如，本发明的成分可以结合以下的一个或多个残基Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206、P206、F208、K127、A207、V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268、Y269、T295、L222、L222、L223、E306、V308、R224、V308、K310、K218、A219、S220、K218、A220、Y221、A339、D327、D398、E338、E368、E386、F312、F324、F340、F355、G311、G384、G387、G388、I371、K342、K358、L382、L379、N326、N367、N370、N410、P341、S369、T385、V325、V407、V409、Y373、Y350、Y408、T380、T390、R381、R353、T411、K412、E414、K471、F433、G470、L472、V497、F469、A431或G432。在具体的实施方案中，本发明的成分结合选自于 K218、S220、Y221、L222、F340、P341、K342、N367、E368、S369、N370、1371 和Y373中的Kit受体的至少一个氨基酸残基，或选自于Y350、R353、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386和T390中的Kit受体的至少一个氨基酸残基。本发明的成分可以结合形成表4中确定的口袋或空腔的所有残基或者他们可以结合形成口袋或空腔的残基的亚集。本领域的技术人员可以理解，在一些实施方案中，本发明的成分可以很容易地靶向其他III型RTK中与以上列出的那些残基对应的残基，例如，那些形成类似的口袋或空腔的残基或者通过结构比对或序列比对处于相同位置的残基。在另一个实施方案中，本发明的成分结合人Kit的氨基酸残基381Arg和386Glu15在再另一个实施方案中，本发明的成分结合人Kit的氨基酸残基418Tyr和/或505Asiu在进一步的实施方案中，本发明的成分结合I3DGFRa或TOGFRP受体。在类似的实施方案中，本发明的成分结合人I3DGFRP的氨基酸残基385Arg和/或39°G1u，或TOGFRa中的相应残基。在再另一个实施方案中，本发明的成分结合III型RTK的构象表位。在具体的实施方案中，该构象表位由III型RTK，例如人Kit受体或TOGF受体，的D3、D4或D5结构域或铰链区中的两个或更多个残基构成。在进一步的具体实施方案中，本发明的成分可以结合由选自于表4中列出的那些氨基酸残基中的两个或更多个残基，如2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、11个或更多、12个或更多、13个或更多、14个或更多、15个或更多、16个或更多、17个或更多或18个或更多个氨基酸残基构成的人Kit受体中的构象表位。在特定的实施方案中，本发明的成分结合由选自于 Y125、H180、R181、K203、V204、R205、P206、V238、S239、S240、H263、G265、D266、F267、N268和Y269的2个或更多个氨基酸组成的构象表位。在类似的实施方案中，本发明的成分结合由选自于下组的氨基酸的2个或更多个氨基酸组成的构象表位P206、F208、V238 和 S239 ;K127、A207、F208 和 T295 ;L222、A339、F340、K342、E368、S369、N370、1371 和 Y373 ;L222、L223、E306、V308、F312、E338、F340 和 1371 ;R224、V308、K310、G311、F340、P341和 D398 ;K218、A219、S220、N367、E368 和 S369 ;K218、A220、E368 和 S369；G384、T385、T411、K412、E414和 K471;Y408、F433、G470、K471和 L472;F324、V325、N326 和N410 ;D327、N410、T411、K412 和 V497 ;G384、G387、V409 和 K471 ;L382、G387、V407 和 V409 ；Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206、F208、V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268 和 Y269 ;P206、F208、V238 和 S239 ;K218、S220、Y221、L222、F340、P341、K342、N367、E368、S369、N370、I371和 Y373 ;G384、G387、G388、Y408、V409、T411、F433、F469、G470 和 K471 ;D327、T411、K412、E414、A431、G432 和 K471 ;Y350、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386和T390 ;Y350、R353和F355。如上所述，本发明的成分可以结合形成表4中确定的口袋或空腔的所有残基或者他们可以结合形成口袋或空腔的残基的亚集。在进一步的实施方案中，本发明的成分结合构象表位，其中该构象表位是由选自 于表5中列出的肽中的两个或更多个氨基酸残基组成的。在具体的实施方案中，该构象表位是由选自于第一肽的一个或多个氨基酸残基和选自于第二肽的一个或多个氨基酸残基组成的，其中该第一和第二肽选自于表5中所列的肽。因此，本发明的成分可以结合其中第一和第二肽组如下的构象表位Ala219-Leu222 和 Thr304_Val308 ；Asp309-Gly311 和Arg224-Gly226 ；Thr303-Glu306 和 Ala219_Leu222 ;Asn367_Asn370 和 Ser217-Tyr221 ；Ala339-Pro343 和 Asn396_Val399 ；Ala339-Pro343 和 Glu368_Arg372 ；Lys358-Tyr362 和Val374-His378 ;Asp357_Glu360 和 Leu377-Thr380 ;Met351_Glu360 和 His378-Thr389 ；His378-Thr389 和 Val323_Asp332 ；Val409-Ile415 和 Ala493-Thr500 ；Val409-Ile415 和Ala431-Thr437 ；Val409-Ile415 和 Phe469_Val473 ；Val409-Ile415 和 Val325-Asn330 ；Val409-Ile415 和 Arg381-Gly387 ；Gly466-Leu472 和 Gly384-gly388 ；Val325-Glu329 和Tyr494-Lys499 ；Thr411-Leu416 和 Val497_Ala502 ;Ile415_Leu421 和 Ala502_Ala507 ；Ala502-Ala507 和 Lys484_Thr488 ；以及 Ala502_Ala507 和 Gly445_Cys450。本发明的成分可以结合形成上述的第一和第二肽组的所有氨基酸残基，或他们可以结合形成上述的第一和第二肽组的残基的亚集。在其他实施方案中，本发明的成分结合作为VEGF受体家族(V型受体酪氨酸激酶)成员的受体酪氨酸激酶，例如，VEGFR-I (Fltl)、VEGFR-2 (Flkl)和VEGFR-3 (Flt4)。在一些实施方案中，本发明的成分所结合的Ig-样结构域可以是VEGF受体家族成员的D7结构域。在具体的实施方案中，该成分结合VEGF受体家族成员的D7结构域的以下共有序列IX1RVX2X3EDX4G，其中I是异亮氨酸，R是精氨酸，E是谷氨酸，D是天冬氨酸，G是甘氨酸；且父1、&、\和乂4是任何氨基酸。在具体的实施方案中，X1选自于谷氨酸、精氨酸和谷氨酰胺；父2选自于精氨酸和苏氨酸；X3选自于谷氨酸和赖氨酸；且\选自于谷氨酸和丙氨酸(SEQ IDNO :1)。在一些实施方案中，本发明的成分是分离的抗体或其抗原结合部分。该抗体或其抗原结合部分可以是人抗体、人源化抗体、双特异性抗体或嵌合抗体。在一些实施方案中，该抗体或其抗原结合部分包含选自于IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE恒定区的重链恒定区。在优选的实施方案中，该抗体重链恒定区是IgGl。此外，本发明的成分可以是抗体或其抗原结合部分，其中该抗体或其抗原结合部分选自于Fab片段、F (ab' ) 2片段、单链Fv片段、SMIP、亲和体、亲和性多聚体、纳米抗体以及单域抗体。在特定的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合部分以Ix 10_7M或更小、更优选地5x 10_8M或更小、更优选地Ix10_8M或更小、更优选地5x 10_9M或更小的KD结合受体酪氨酸激酶的Ig-样结构域。在一些实施方案中，本发明的分离的抗体或其抗原结合部分结合人Kit的氨基酸残基309-413或410-519，从而使人Kit的胞外域锁定于非活性状态并拮抗人Kit的活性。在进一步的实施方案中，本发明包括产生本发明的抗体或其抗原结合部分的杂交瘤。在另一优选的实施方案中，本发明的成分是小分子。 在一些优选的实施方案中，本发明的小分子结合选自于表4所示的那些氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基。例如，本发明的小分子可以与下面的一个或多个残基结合Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206、P206、F208、K127、A207、V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268、Y269、T295、L222、L222、L223、E306、V308、R224、V308、K310、K218、A219、S220、K218、A220、Y221、A339、D327、D398、E338、E368、E386、F312、F324、F340、F355、G311、G384、G387、G388、I371、K342、K358、L382、L379、N326、N367、N370、N410、P341、S369、T385、V325、V407、V409、Y373、Y350、Y408、T380、T390、R381、R353、T411、K412、E414、K471、F433、G470、L472、V497、F469、A431 或 G432。在具体的实施方案中，本发明的小分子结合选自于〖218、5220、￥221儿222、卩340、？341、1(342州367、￡368、5369、吧70、1371和Y373的Kit受体中的至少一个氨基酸残基。在相关的实施方案中，本发明的小分子结合选自于 Y350、R353、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386 和 T390 的 Kit 受体中的至少一个氨基酸残基。本领域的技术人员可以理解，在一些实施方案中，本发明的小分子可以很 容易地靶向其他的III型RTK中与上述所列出的那些残基对应的残基，例如，那些形成类似的口袋或空腔的残基或那些通过结构比对或序列比对处于相同位置的残基。在进一步的实施方案中，本发明的成分是肽类分子。在一些实施方案中，该肽类分子是基于受体酪氨酸激酶的Ig-样结构域设计的。在具体的实施方案中，本发明的肽类分子是基于Kit的D4结构域设计的。本发明的肽类分子可以包含保守的D4相互作用位点，例如，如上所述的D4共有序列(LX1RX2X3X4X5X6X7G)，或通过比对或比较III型受体酪氨酸激酶的D4结构域所产生的其他序列。在另外的实施方案中，本发明的肽类分子包含与人Kit的氨基酸残基309-413至少80%相同的结构，或与人Kit的氨基酸残基410-519至少80%相同的结构。该肽类成分也可以基于Kit的D5结构域而设计，且在进一步的优选实施方案中，可以包含通过比对或比较III型受体酪氨酸激酶的D5结构域产生的共有序列。在可选的实施方案中，肽类分子可以基于突变的D5结构域的序列或共有序列而设计。本发明的肽类成分可以是包含或由本文所确认的任何氨基酸序列组成的肽(例如，SEQ ID NO :1-89、92、93 和 105-157)。在一些实施方案中,本发明的肽类分子包含至少一个D-氨基酸残基。在另一优选的实施方案中，本发明的成分是adnectin。此外，在一些实施方案中，本发明的小分子和肽类分子结合靶RTK中的构象表位。在其他实施方案中，本发明的小分子和肽类分子结合到靶RTK中作为非构象构象表位的表位。
在另一个方面，本发明提供了包含本发明的任何成分以及药学上可接受的载体的药物组合物。在其他方面，本发明提供了治疗或预防受试者中受体酪氨酸激酶相关疾病的方法。该方法包括向受试者施用有效量的本发明的成分(例如，结合III型受体酪氨酸激酶的D4或D5结构域或V型受体酪氨酸激酶的D7结构域的成分)，从而治疗或预防该疾病。在优选的实施方案中，受体酪氨酸激酶相关疾病是淋巴疾病或癌症，如GIST、AML、SCLC、黑色素瘤、肾癌、结肠癌、乳腺癌、淋巴癌及其他癌症。在另一个方面，本发明提供了治疗或预防受试者中受体酪氨酸激酶相关疾病的方法，该方法通过向受试者施用有效量的结合人III型受体酪氨酸激酶的D3-D4和/或D4-D5铰链区的成分从而治疗或预防该疾病。在具体的实施方案中，该受体酪氨酸激酶相关疾病是癌症，如GIST、AML、SCLC、黑色素瘤、肾癌、结肠癌、乳腺癌、淋巴癌及其他癌症。在另一个方面，本发明提供了用于鉴定结合受体酪氨酸激酶的Ig-样结构域和使受体酪氨酸激酶的胞外域锁定于非活性状态的成分的方法。该方法包括将受体酪氨酸激酶与候选成分接触；同时地或相继地将受体酪氨酸激酶与受体酪氨酸激酶的配体接触；和测定该成分是否影响配体诱导的二聚受体酪氨酸激酶的Ig-样结构域之间的定位、定向和/或距离，从而鉴定结合受体酪氨酸激酶的Ig-样结构域和使受体酪氨酸激酶的胞外域锁定于非活性状态的成分。在进一步的方面，本发明提供了用于鉴定将III型受体酪氨酸激酶的胞外域锁定于非活性状态的成分的方法。该方法包括将III型受体酪氨酸激酶与候选成分接触；同时地或相继地将受体酪氨酸激酶与受体酪氨酸激酶的配体接触；和测定该成分是否影响配体诱导的二聚受体酪氨酸激酶的D4-D4或D5-D5结构域之间的定位、定向和/或距离，从而鉴定将III型受体酪氨酸激酶的胞外域锁定于非活性状态的成分。从下面的详细描述和权利要求能够清楚本发明的其他特征和优势。附图简要说明该专利或申请案包含至少一个以彩色完成的附图。带有彩色附图的本专利或专利申请公开文本将根据要求和缴纳必要费用后由专利局提供。图IA-E描绘了 Kit胞外域的晶体结构。图IA显示了 Kit胞外域单体的带状栅图(ribbon diagram)(左)和表面不意图(surface representation)(右)。右图显不的是左图中显示的视图沿垂直轴旋转了 90°后的视图。Dl标为蓝色、D2标为绿色、D3标为黄色、D4标为橙色和D5标为粉色，标记了 N和C末端。Dl和D5中的二硫键用球-棍表示，使硫原子标为橙色。天冬酰胺连接的糖以棍模型显示。图IB-E提供了 D1-D2(B)、D2-D3(C)、D3-D4(D)和D4-D5(E)界面的详细视图。颜色编码与图IA相同。参与结构域-结构域相互作用的氨基酸被标记，并且氢键用黄色虚线画出。根据IgSF命名法命名二级结构元件。图2A-B描绘了 SCF-Kit胞外域2:2复合体的晶体结构。图2A显示了 SCF-Kit 2:2复合体的带状栅图。Dl到D5的颜色编码与图I相同，并且SCF标为红紫色。标记了 Kit以及SCF的N和C末端。Dl和D5中的二硫键用球-棍表示，使硫原子标为橙色。天冬酰胺连接的糖显示为棍模型。箭头标记SCF-Kit 2:2复合体中大的空腔。图2B显示了 SCF-Kit胞外域2:2复合体的表面不意图。该图显不了俯视图(顶图)、正视图(中左图)、侧视图(中右图)和仰视图(下图)。颜色编码与图A相同。视图显示SCF 二聚体与两个相应的、Kit胞外域的D1、D2和D3对称地相互作用。此外，Kit胞外域通过两个相邻受体的D4(橙色)之间和D5(粉红色)之间的侧向接触形成同型相互作用。图3A-E描绘了 Kit的SCF识别。图3A显示了 SCF-Kit界面的视图。通过拉开两个分子使SCF和Kit胞外域的包埋的表面中的氨基酸可视化。该图显示了 Kit Dl-D2-D3(左图)和SCF(右图)的分子表面。酸性氨基酸用红色表示，碱性氨基酸用蓝色表示，极性氨基酸用橙色表示和疏水性氨基酸用黄色表示。Kit上的SCF结合位点-I、位点-II和位点-III被圈起来。图3B描绘了在配体-受体界面中静电势的互补性。右图显示了沿左图呈现的静电表面的垂直轴旋转180°后的视图。D1-D2-D3的静电表面电位叠加在具有以标为绿色的结合SCF的草图印记的分子表面上。右图描绘了 SCF-结合Kit的静电表面电位，标为蓝色(正)和红色(负)。Kit以蓝绿色的带状栅图形式表示。图3C-E显示SCF-Kit界面的位点-I (C)、位点-II⑶和位点-III (E)的近视图。SCF标为绿色和Kit标为蓝绿色。标 记了相互作用的氨基酸，用黄色虚线画出氢键和用色和条标记二级结构元件。图4A-C描绘了 SCF结合Kit时的构象变化。图4A显示当Kit结合时两个SCF原体之间的角度发生了改变。该视图显示了游离的SCF(绿色)和结合Kit的SCF(红紫色)的草图。一个SCF原体(左)的叠加揭示了第二个原体(右)大约5°的角移动，正如对aC螺旋所测量的。标记了螺旋并用圆柱体表示。图4B描绘了当Kit结合时SCF的N-末端的构象变化。Kit的位点-III显示为分子表面(灰色)、游离SCF的N-末端显示为绿色和结合Kit的SCF的N-末端为红紫色。Cys4’和Cys89’之间的二硫键显示为黄色球。标记了关键氨基酸并显示为棍模型。图4C描绘了当结合Kit的位点-I时SCF的a C-P 2环的构象变化。颜色编码与图B相同。图5A-B描绘了 SCF结合时Kit D4和D5的重构。图5A显示了 SCF-Kit复合体中D4和D5的重构。Kit单体的D3与结合SCF的Kit的D3 (都标为蓝色)的叠加显示，结合形式的D4(红色)相对于游离形式的D4(绿色)的位置移动了 22°。两种形式的D4(都为蓝色)的叠加(右图)表明SCF结合形式的D5 (红色)相对于游离形式的D5 (绿色)的位置移动了 27°。两幅底图显示了单体(绿色)和同型二聚体(红色)形式的D3-D4和D4-D5界面的铰链区的近视图。图5B显示了 SCF占据的Kit的D4和D5的表面示意图(顶图)，以与图2相同的方向观察。黑色轮廓显示通过结合到配体结合区域的SCF桥接的Kit胞外域单体的D4和D5的位置。D4和D5的重构导致了两个相邻的胞外域的C-末端彼此之间的75人到15人的移动。下图显示SCF-Kit复合体的细胞膜的视图(仰视图)。注意沿X轴的90°的旋转。Dl到D5的颜色编码同图I。图6A-D描绘了 D4-D4和D5-D5界面的视图。图6A(顶图)显示了呈现D4-D4界面的I. I O水平下勾画的2Fo-Fc电子密度图。Kit原体的骨架分别呈现为粉红色和黄色管。两个相邻胞外域的D4-D4界面的近视图(下图)。在两个相邻D4的Arg381和Glu386之间形成的链间氢键标为黄色。标记了关键氨基酸并用棍模型显示。根据IgSF命名法标记二级结构元件。图6B描绘了 III型和V型RTK家族的成员间的D4-D4 二聚化基序的保守性。人 Kit 残基 370-398 (AAC50969. I) (SEQ ID NO 94)与小鼠(AAH75716. I) (SEQID NO :95)、鸡(NP_989692. I) (SEQ ID NO :96)、爪蟾(AAH61947) (SEQ ID N0:97)、真螈(AAS91161. I) (SEQ ID NO 98)和斑马鱼(A 型(SEQ ID NO 99)和 B 型(SEQ ID NO :100)(NP_571128，XP_691901)同源物的序列比对。也显示了人CSF1R(P07333) (SEQ ID N0:101)、小鼠(P09581) (SEQ ID NO :102)及河豚(torafugu)A 型(SEQ ID NO :103)和 B 型(SEQ IDNO :104) (P79750、Q8UVR8)的氨基酸序列以及人 PDGFR a 和 PDGFR P (分别为 SEQ ID NO:105 和 107) (P16234、P09619)及小鼠(分别为 SEQ ID NO :106 和 108) (NP_035188, P05622)的序列。也显示了人VEGFR 1-3型的V型RTK的氨基酸序列(以出现先后为序分别为SEQID NO =109-111)(第七Ig样结构域)(P17948、P35968和P35916)。在序列比对的顶部标记Kit 的二级结构元件。保守残基 Arg381 和 Lys383、Leu382 和 Leu379、Glu386 和 Gly388 分别标为蓝色、黄色、红色和绿色。图6C描绘了 D5-D5界面的带状栅图。两个邻近Kit原体的A链和G链参与了 D5-D5界面的形成。D5-D5界面可能是通过离子或水分子由两个相邻受体的Tyr418和Asn505之间的侧向相互作用维持的。图6D描绘了 Kit的D4和D5的静电势表面。图中显示了 D4-D4相互作用表面的正视图(右图)和沿垂直轴旋转90°后的视图(左图)。圈出了酸性补丁和D4-D4界面的位置并标记了相互作用残基Arg381和Glu386。图7A-C描绘了涉及到癌症和其他疾病以及Kit和其它RTK激活的机理的Kit胞外域突变。图7A描绘了在左图中显示的导致花斑性状的功能缺失突变。Dl (蓝色)、D2(绿色)和D3(黄色)的带状栅图和SCF(灰色)的表面示意图。突变的氨基酸标为红色。右图 显示导致GIST、SCLC和AML的功能获得突变。同型二聚体形式的D4和D5的表面示意图以灰色显示。在GIST中加倍的Ala502和Tyr503标为蓝色且接近Asp419的缺失和插入突变(AML和NCLL)标为绿色。注意，激活的Kit突变局限于D5-D5界面。图7B显示，Kit活化被D4-D4界面中的点突变减弱。正如所标明的(左上图)，瞬时表达野生型Kit (WT)、D4中的R381A或E386A点突变的HEK293细胞用10ng/ml的SCF在37°C下刺激6分钟。未刺激的或SCF刺激的细胞的裂解液用抗-Kit抗体进行免疫沉淀(IP)，然后进行SDS-PAGE和用抗-Kit抗体或抗磷酸酪氨酸(p-Tyr)抗体进行免疫印迹(IB)。抗-p_Tyr-免疫印迹的Kit酪氨酸自磷酸化的密度定量(右上图)。用不同浓度的SCF处理稳定表达野生型Kit(WT)或R381A突变体的3T3细胞。来自未刺激的或SCF刺激的细胞的裂解液用抗-Kit抗体进行免疫沉淀，然后进行SDS-PAGE并用抗-Kit抗体或抗-p-Tyr抗体进行免疫印迹(左下图)。用天然SCF进行的细胞结合125I-SCF的置换分析。存在渐增浓度的天然的SCF情况下用 125I-SCF 处理表达 WT ( ■ )、R381A( ▼ )、R381A/E386A( )或激酶阴性 Kit(A)的3T3细胞。SCF对于WT Kit的EC50 (置换50%的结合c-Kit的SCF的配体浓度)(I. InM)与 SCF 对于 R381A(1. OnM)、R381A/E386A(0. 8nM)或激酶阴性 Kit 突变体(I. 4nM)的 EC50相当。图7C显示了由可溶性的(左图)或在相邻细胞的细胞表面上表达的膜锚定的(右图)SCF分子驱动的Kit和其它RTK的活化的模型。SCF结合D1-D2-D3配体结合模块使得两个结合的Kit胞外域单体的C-末端彼此相距75人以外。D3-D4和D4-D5铰链的灵活性使得能够实现使两个相邻胞外域的C-末端彼此在15人以内的横向D4-D4和D5-D5相互作用。因此，增加的接近性和Kit胞质域的局部浓度提高导致激酶结构域中调控性酪氨酸残基的自磷酸化，从而导致PTK活化。(注意PTK活化未在模型中画出)。胞质域中关键酪氨酸的磷酸化后，将进行细胞信号传导分子的补体的募集和活化。该模型是基于游离SCF的结构、无配体Kit、SCF-Kit复合体和Kit PTK结构(PDB项目1QZJ、1R01和1T45)。对结构还未确定的区域用二级结构预测进行建模(绿色螺旋和黑色环)。SCF标为紫红色、Kit胞外域标为蓝色和kit PTK标为淡蓝色。图8描绘了 III型RTK的基于结构的序列比对，基于Kit胞外域的结构，和基于结构的III型家族RTK的配体的比对。各排显示单个Ig样结构域的比对。基于IgSF折叠特征手动比对氨基酸序列，如由(Harpaz等人.(1994) J Mol Biol 238 =528-539)确定的，并且与Jpred(Cuff等人.(1998)Bioinformatics 14:892-893)计算的家族成员的二级结构预测相一致。红色标记的氨基酸代表IgSF折叠决定氨基酸。在序列上方用箭头标记P链和用弹簧标记a -螺旋，以及人Kit和人SCF的编号。用星号标记配体结合时表现出溶剂可达性降低的配体结合位点的残基。位点-I标为黑色、位点-II标为红色和位点-III标为绿色。相同的颜色编码被用于标记SCF中的相 互作用的氨基酸残基。用蓝绿色的方框圈出负责D4-D4相互作用的D4EF环。用于比对的序列是人Kit (AAC50969)、Kit小鼠(AAH75716)、CSFRl 人(P07333) ,PDGFRa 人(P16234) ,PDGFR^ 人(P09619)和 Flt3 人(P36888)。对于配体结构比对，用 Lsqman (Kleywegt 和 Jones，1995)对 SCF (IEXZ) XSF(IHMC)、Flt3L (IETE)的PDB项进行叠加，并用ClustalW比对小鼠SCF的序列(NP_038626)和人SCF。图分别按出现的先后顺序显示了 SEQ ID NO :112-147。图9提供了 2:2SCF_Kit复合体的结构的立体视图。2:2SCF_Kit复合体的带模型以立体示意图显示。视图和颜色编码与图2A相同。图IOA-B描绘了 SCF-Kit复合体表面的氨基酸保守性。图IOA显示彩色编码的SCF-Kit晶体结构复合体的保守性模式。蓝绿色至栗色用来标记从可变氨基酸到保守氨基酸。图IOB显示了通过将两个分子彼此拉开而得到的SCF和Kit可视化。圈出了位点I、位点II和位点III以及D4-D4相互作用区域(D4-D4界面)。图IlA-B描绘了 SCF-Kit界面的电子密度。图IlA显示了具有以2 o水平在Kit周围绘出的电子密度图的2:2 SCF-Kit复合体的位点II的局部视图。除标记的侧链外，用黄色管绘出Kit主链。图IlB描绘了 SCF-Kit界面的电子密度，显示了具有以1.5 0水平在Kit周围绘出的实验图的游离Kit的局部视图。方向和颜色编码与

图12A相同。图12A-D描绘了游离的和SCF结合的Kit的Ig样结构域的叠加对的视图。游离的和SCF结合的Kit的单独D1、D2、D3和D4叠加在一起。显示的是Ig样结构域(A)Dl和D2、⑶D2和D3、(C)D3和D4以及(D)D4和D5对的结构，其中各对中叠加的Ig样结构域标为蓝色且第二(未叠加)Ig样结构域对于游离的胞外域标为绿色和对于SCF结合的胞外域标为红色。这些图显示，当SCF结合时五个单独Kit Ig样结构域的各结构域的结构实际上没发生变化，且D1-D2-D3作为准备用于SCF结合的配体结合单元发挥作用。相反，在SCF结合的Kit中D3-D4和D4-D5界面发生大的重排。图13A-B描绘了 SCF-Kit复合体结构的静电表面电位。图13A具体地显示了SCF-Kit 2:2复合体。图13B描绘了 SCF-Kit复合体结构的静电表面电位，具体地说在SCF被从SCF-Kit 2:2复合体中拉开后，Kit的静电表面电位的可视化。带正和负电荷的表面分别标为蓝色和红色。圈出了 SCF结合区域和D4-D4界面。图14描绘了抗Kit_D5抗体抑制SCF诱导的Kit激活。表达Kit的3T3细胞用渐增浓度的抗Kit-D5(针对Kit的第五Ig样结构域)孵育或作为对照用抗-SCF(针对SCF配体)或抗-Kit胞外域(针对整个Kit胞外域)孵育。图15描绘了用重组Kit D4抑制SCF诱导的Kit激活。表达Kit的3T3细胞用渐增浓度的重组Kit-D4室温下孵育10分钟,然后SCF刺激10分钟。图16A显示D4中的点突变阻止I3DGF诱导的I3DGFR激活。对表达WT PDGFR或D4突变体(R385A和E390A)的roGFR-/_MEF血清饥饿过夜并用注明浓度的TOGF BB刺激5分钟。细胞裂解液用抗-PDGFR抗体进行免疫沉淀，然后进行SDS-PAGE和用抗-磷酸酪氨酸抗体4G10进行免疫印迹。膜剥离，并用抗-flag标签抗体再印迹分析以确定总TOGFR水平。图16B表明D4中的点突变阻止经由I3DGFR的信号传导。对表达WT PDGFR和D4突变体(R385A和E390A)的roGFR-/_MEF血清饥饿过夜，并用注明浓度的TOGF BB在23°C下刺激5分钟。等量的总细胞裂解液(TCL)进行SDS-PAGE和分别用抗-磷酸_MAPK、MAPK、磷酸-Akt和Akt进行免疫印迹。这个实验表明，D4中的点突变阻止了 MAPK反应和Akt活化。图16C表明阻止TOGFR激活的D4点突变不干扰I3DGF诱导的TOGFR二聚化。对表达WT或E390A突变体的roGFR-/-MEF血清饥饿过夜，随后用含有注明量的I3DGF的DMEM/50mMHEPES缓冲液(pH7. 4)在4°C孵育90分钟。去除未结合的配体后，细胞用PBS中的0. 5mM 的辛二酸二琥珀酰亚胺(DSS)孵育30分钟。用抗-PDGFR抗体对未刺激的或刺激的细胞的裂解液进行免疫沉淀，然后进行SDS-PAGE分析和用抗-flag抗体(左图)或抗-pTyr抗体(右图)进行免疫印迹。图17显示D3-D4铰链区中的空腔。几个空腔散布在胞外域单体结构的D3-D4界面上。参与限定空腔的氨基酸总结于表4(如下)中。当两个Kit受体之间形成同型相互作用时，D3-D4铰链区发生改变导致形成由下列残基形成的浅空腔D3的K218、S220、Y221、L222 和 D4 的 F340、P341、K342、N367、E368、S369、N370、1371、Y373。图 17 显示了未占据的单体(A)和SCF-结合的二聚体(B)的D3-D4铰链区的带状栅图和D3-D4 口袋的网格示意图。图18显示了 D4-D5铰链区中的空腔。小空腔由Kit单体的D4的AB环和EF环、连接D4-D5的接头和D5的部分DE环和FG环形成。限定空腔的残基总结于表4(如下)中。在Kit胞外域二聚体结构中空腔的形状和大小是改变的。由D4的EF环和G链、D4-D5接头和D5的B链和DE环形成的主要空腔位于D4的EF环之下，D4同型界面形成的关键区域。注意，如未结合的和占据的Kit结构的电子密度的较低质量所揭示的，靠近空腔定位的D5的DE环可具有更高的灵活性。图18显示了未占据的单体(A)和SCF-二聚体(B)的带状栅图和D4-D5铰链区周围的浅空腔的网格示意图。图19显示了介导D4同型相互作用的区域处的空腔。Kit D4的⑶环和EF环形成的凹面位于D4同型界面正上方。D4的残基Y350、R353、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386和T390为胞外域二聚结构中的凹面提供了大约130A2的表面积。在D4同型界面中起着重要作用的Glu386的侧链向表面的中心突出。凹面的特征性结构是由带电的残基(Glu386和Lys358)围绕的小的疏水补丁。当同型D4:D4相互作用时该表面的大小和可接近性发生改变，CD环的构象中发生朝向结构域顶部折叠的变化。参与形成凹面的残基总结于表4(如下)中。下图中图A显示了覆盖在配体-占据的Kit D4(未示出)上的未占据的Kit D4结构域(金色)的带状栅图，配体-占据(绿色)和未占据的胞外域结构(红色)之间的CD环和EF环的构象不同。D4:D4相互作用的关键残基以棍模型形式表示。图B和C显示了未占据的Kit (图19B)和SCF-占据的Kit结构(图19C)的带状栅图和D4同型界面之上的浅空腔的网格示意图。图20显示了配体-结合的D2和D3区域处的凹面。浅凹面位于D2和D3的部分配体结合表面。包括于小口袋中的残基是D2的Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206 和 F208 以及 D3 的 V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268 和 Y269。口袋是通过由亲水性残基包围的小疏水补丁形成的。未占据的和SCF-占据的Kit结构之间没有大的变化，整体包埋的表面积约为500A2。图A和图B显示了未占据的Kit(A)和SCF-结合的Kit (B)的带状栅图和D2-D3 口袋的网格示意图。图21描绘了 TOGF受体近膜区的基于结构的序列分析和同源性建模。图21A描绘7 PDGFRa ,PDGFR^和Kit的D4的氨基酸序列(按出现顺序分别为SEQ ID NO =148-157)的比对。人Kit结构D4的IgSF折叠的关键残基和Ig折叠的核心残基的氨基酸相应地标为红色和绿色。负责D4同型相互作用的两个关键碱性和酸性残基分别用蓝色和红色框出。对应于在Ig样结构域(B5和F5)上保守的二硫键形成半胱氨酸残基的位置用星号标记。在Kit序列下面用箭头标记P -链。根据IgSF命名法标记二级结构元件。图21B描绘了 TOGFR胞外结构域的近膜域模型。TOGFRP胞外域的近膜区域标为白色并且显示为具有透明的分子表面的带(D4标为橙色和D5标为粉色；左图)。两个相邻的I3DGFRP分子的D4-D4界面的放大图(右图)表明，D4之间的相互作用是由从两个邻近的EF环伸出的残基Arg385和Glu390介导的。标记了关键氨基酸并以棍模型表示。 图22描绘了证明I3DGF诱导的I3DGFR激活被D4中的突变影响的实验结果。图22A显示了表明I3DGF诱导的TOGFRP的酪氨酸自磷酸化在表达I3DGFRP的E390A、R385A、RE/AA和RKE/AAA突变体的细胞中受到强烈影响的实验结果。图22B是显示了野生型和突变体PDGFR^的置换曲线的曲线图。用Prism4通过曲线拟合确定IC50值。图22C描绘了免疫印迹的结果，其证明R385A、E390A或RE/AA突变体不影响I3DGFR的固有酪氨酸激酶活性。图23描绘了免疫沉淀实验的结果，其表明^)6 -刺激的04结构域突变的^^卩1^ 在细胞表面上以非活性的二聚体形式表达。细胞裂解液用抗-PDGFR抗体进行免疫沉淀，并通过SDS-PAGE分析免疫沉淀物和分别用抗-flag抗体(左图)和抗磷酸酪氨酸抗体(右图)进行免疫印迹。图24描绘了免疫沉淀实验的结果，其表明TOGF诱导的细胞反应受TOGFRP D4突变体中突变的影响。图25描绘表明在表达TOGFR D4突变体的MEF中，肌动蛋白环形成的TOGF刺激受到影响的实验结果。大约83%的表达WT I3DGFR的MEF表现出环形肌动蛋白环形成，但只有5%的TOGFR D4突变体细胞在用50ng/ml的TOGF刺激2分钟后表现出相似的环形肌动蛋白环形成。此外，在I3DGF刺激后2-5分钟在表达WT PDGFR的MEF中达到峰值的瞬时环形肌动蛋白环形成在表达R385A、E390A或RE/AA的TOGFR突变体的细胞中微弱地检测到。图26描绘了表明TOGFR D4中的突变影响I3DGFR内化和泛素介导的I3DGFR的降解的实验结果。图26A是表明与表达WT PDGFR的MEF结合的125I标记TOGF的内化动力学要比与表达E390A、R385A或RE/AAPDGFR的细胞结合的125I标记I3DGF的内化动力学快得多的曲线图。图26B表明，R385A、E390A或RE/AA I3DGFR突变体的降解动力学大大减弱；虽然一半的WT PDGFR在TOGF刺激的I. 5小时之内降解，但是I3DGFR D4突变体的半衰期延长到大约4至6小时。26C图描绘了显示在相同条件下与WT TOGFR相比，PDGF诱导的E390APDGFR的泛素化也大大降低的实验。图27描绘了表明D4界面的破坏阻断了 KIT中的致癌突变的实验结果。野生型Kit的SCF刺激导致了由KIT的酪氨酸自磷酸化的增强显示的KIT活化的增强。实验进一步表明，KIT的致癌性D5重复突变体是组成型酪氨酸自磷酸化的。相反，D5-重复/E386A突变体阻断了由致癌的D5-重复突变介导的KIT的组成型酪氨酸自磷酸化。图28描绘了免疫印迹实验的结果，其表明抗对应于KIT-D4的同型相互作用基序的肽的抗体识别全长KIT受体。图29A描绘了来自不同物种的VEGFRl和VEGFR2的D7的预测EF环区域的基于结构的多序列比对。I-群Ig框中的关键氨基酸用绿色突出显示，以及EF环中的保守Arg/Asp对用红色突出显示。图29B描绘了 VEGFR的D4及KIT、CSFlR和I3DGFR(III型RTK)的D4的预测EF环区域的比较。I-群Ig框中的关键氨基酸以绿色突出显示，并且EF环中的保守Arg/Asp或Glu对以红色突出显示。EF环中带相反电荷的非保守氨基酸以蓝色突出显示。保守的Y-conner基序用*标记。
图30表明配体诱导的VEGFR2的活化被D7的EF环区域中突变弱化但不受D4的EF环区域中突变的影响。图30A表明用注明量的VEGF在37°C刺激瞬时表达野生型VEGFR2、R726A或E731A VEGFR2突变体的HEK293细胞5分钟。未刺激的或VEGF刺激的细胞的裂解液用抗-VEGFR2抗体进行免疫沉淀，然后与抗-pTyr或与抗-VEGFR2抗体进行免疫印迹(IB)。用SDS-PAGE分析由同一实验得到的总细胞裂解液，然后用抗-磷酸MAPK (pMAPK)或抗-MAPK抗体进行免疫印迹。图30B表明，稳定表达WT VEGFR2-PDGFR嵌合受体或携带D7区域中的突变(R726A、D731A或R726/D731双突变体RD/2A)的嵌合受体的血清饥饿的3T3细胞在37°C下用VEGF刺激5分钟。未刺激的或VEGF刺激的细胞的裂解液用抗嵌合受体的胞质区的抗体进行免疫沉淀，随后分别用抗-PTyr或抗-标签(FLAG)抗体进行免疫印迹。图30C表明，稳定表达WT VEGFR1-PDGFR嵌合受体或携带D7区域中的突变(R721A、D725A或R721D725/2A双突变)的嵌合受体的血清饥饿的3T3细胞在37°C下用VEGF刺激5分钟。未刺激的或VEGF刺激的细胞的裂解液用抗嵌合受体的胞质区的抗体进行免疫沉淀，随后分别用抗-PTyr或抗-标签(FLAG)抗体进行免疫印迹。图30D表明，如图30A中所述的分析了表达WT VEGFR2-PDGFR嵌合受体或携带在D4区中的突变(D392A或D387/R391A双突变)的嵌合受体的3T3细胞。。图31描绘了 VEGFR2胞外域D7 二聚体的结构。图31A描绘了 D7同型二聚体结构的带状栅图和透明分子表面(侧视图)。Asp731和Arg726以棍模型显示。图31B描绘了两个相邻分子(粉色和绿色)的同型D7界面的近视图。由Asp731和Arg726形成的盐桥显示为虚线。图31C描绘了作为表面电位模型的D7 二聚体(侧视图)的电荷分布(左图)。介导同型接触的D7表面的视图(右图)。图31D描绘了以I. Io水平描绘的2Fo-Fc电子密度图，呈现出D7-D7界面的视图。VEGFR D7原体的骨架分别表示为粉色和黄色管。图32描绘了 VEGFR2的D7结构与二聚的KIT-SCF复合体的D4结构的叠加。VEGFRD7结构(PDB ID代码3KVQ)和与SCF的复合体的KIT 二聚体(PDB ID代码2E9W)的覆盖图(左图)。叠加的D7和D4区域的放大图(右图)显示了结构域排列和同型接触的高度相似性。VEGFR D7显示为绿色和EF环为黄色。KIT的D4显示为灰色以及它的EF环为橙色。图33描绘了 VEGFRl和VEGFR2的系统发生分析。图33A描绘了来自各种不同物种的III型和V型RTK的保守EF环的位置。含有保守的EF环基序的Ig样结构域标记为蓝色。图33B描绘了 VEGFR2 D7区域的颜色编码的保守模式。人VEGFR的氨基酸序列作为查询序列使用PSI-BLAST来对非冗余数据库(nr)进行同源序列检索(Altschul等人，J. Mol. Boiol.，215(3) :403-410(1990))。用 ClustalW2 (Thompson 等人，Nucleic Acids Res. ,22(22)4673-4680(1994))进行D7的序列比对，基于对20个关键残基的IgSF折叠限制进行手动调节。氨基酸序列的比对提交到Consurf 3. 0服务器(Landau等人,Nucleic Acids Res.,33 (Web Server号)W299_302 (2005))以产生各个位置的最大似然归一进化速率。蓝绿色至栗色用来标记从可变氨基酸到保守氨基酸。图33C描绘了使用Clustal W2基于邻接法生成的VEGFRl和VEGFR2的系统发生树。在分析中使用的氨基酸序列包括VEGFR2_HUMAN(gi 11321597)、VEGFR2_D0G(gi :114158632)、VEGFR2_H0RSE (gi :194209154)、VEGFR2_CATTLE(gi :158508551)、VEGFR2_RAT(gi :56269800)、VEGFR2_M0USE (gi :27777648)、VEGFR2_CHICK(gi :52138639)、VEGFR2_QUAIL (gi :1718188)、VEGFR2_ZEBRARISH(gi 46401444)、VEGFRl_HUMAN(gi :143811474)、VEGFR1_M0USE (gi :148673892)、VEFGR1_RAT(gi :149034835)、VEFGR1_H0RSE (gi :149730119)、VEGFR1_CHICK (gi :82105132)、VEGFR1_ZEBRAFISH (gi :72535148)、VEGFR_SEAURCHIN (gi :144226988)、VER1_C_ELEGANS (gi :6003694)、VER3_C_ELEGANS (gi :3877967)、VER4_C_ELEGANS (gi :3877968)、PVR_DR0S0PHILA(gi :45552252)、VEGFR_SEASQUIRT(gi :198434052)。 发明详述本发明提供了结合受体酪氨酸激酶，例如VEGF受体如VEGFRl (Fltl)、VEGFR2 (KDR/Flkl)和VEGFR3 (Flt4)，的胞外域，例如Ig样结构域或Ig样结构域之间的铰链，的成分，例如抗体或其抗原结合部分、小分子、肽类分子、适体和Adnectin。本发明的成分可以使VEGF受体的胞外域锁定在非活性状态，从而抑制VEGF受体的活性。在本发明的一个实施方案中，该成分使VEGF受体的胞外域锁定在单体状态。在本发明的另一个实施方案中，该成分允许VEGF受体的胞外域二聚化，但影响两个单体的Ig-样结构域之间的定位、定向和/或距离(例如，VEGF受体的D7-D7结构域)，从而抑制VEGF受体的活性。换句话说，该成分可以允许VEGF受体胞外域的配体诱导的二聚化，但影响两个胞外域在细胞表面界面处的定位或者改变或阻止VEGF受体中的构象变化，从而抑制VEGF受体的活性(例如，抑制受体内化和/或抑制受体的酪氨酸自磷酸化和/或抑制受体激活下游信号传导途径的能力)。本发明至少部分地基于VEGF受体VEGFR2整个胞外域的晶体结构的破译。这种晶体结构的破译使得能够鉴别本发明的成分可以靶向于的表位，例如，构象表位。如本文中所使用，术语“成分”意图包括任何结合受体酪氨酸激酶的胞外域(例如Ig样结构域)的成分，其中所述成分将受体酪氨酸激酶的胞外域锁定在非活性状态，例如单体状态，从而拮抗受体酪氨酸激酶的活性。所述成分可以是分离的抗体或其抗原结合部分；小分子；肽类分子(例如基于受体酪氨酸激酶的Ig样结构域的结构设计的肽类分子)；适体或adnectin。在一些方面,所述成分结合连接受体酪氨酸激酶的Ig样结构域的铰链区(例如III型RTK的D3-D4或D4-D5铰链区)。在一些实施方式中，所述成分将结合人VEGF受体的特定序列，例如，VEGFRl的718-727 残基、VEGFRl 的 Arg720 和 Asp725 残基、VEGFR2 的 724-733 残基、VEGFR2 的 Arg726和Asp731残基、VEGFR3的735-744残基或VEGFR3的Arg737和Asp742残基。所述成分可选地结合人Kit受体的特定序列，例如人Kit的残基309-413、残基410-519、381Arg和386Glu或418Tyr和505Asno残基309-413包含D4结构域，残基410-519包含人Kit的D5结构域，并在本文中表明对于Kit受体二聚化至关重要。残基381Arg和386Glu是Kit的D4结构域中的残基，在本文中表明对于D4结构域的非共价连接是重要的，因此，对于受体的二聚化是重要的。类似地,残基418Tyr和5ci5Asn是Kit的D5结构域中的残基，在本文中表明对于受体的二聚化是重要的。本领域技术人员将理解，特异性结合上述残基的成分可以通过例如阻止两个单体Kit或VEGF受体分子的二聚化而拮抗受体的活性。在另外的实施方案中，所述成分结合人VEGF受体的突变的氨基酸残基，其中该氨基酸残基是至少 VEGFRl 的 Arg720 或 ASP725、VEGFR2 的 Arg726 或 Asp731 或 VEGFR3 的Arg737或Asp742之一。在另外的实施方式中，所述成分结合人Kit中突变的氨基酸残基，其中所述氨基酸残基是 417Thr、418Tyr、419ASp、421LeU、42°Arg、5°3Tyr 或 5tl2Ala 中的至少之一。在优选实施方式中，本发明的成分结合Kit受体中的一或多个残基，这些残基构成在表4 (下文)中所述的小腔或口袋。例如，本发明的成分可以结合Kit受体的D3-D4铰链区中的一个或多个以下残基来自D3结构域的K218、S220、Y221、L222和来自D4结构域 的 F340、P341、K342、N367、E368、S369、N370、I371、Y373。本发明的成分也可以结合一个或多个以下残基，这些残基构成Kit受体的D4结构域中的凹面Y350、R353、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386和T390。在另一实施方式中，本发明的成分结合一个或多个以下残基，这些残基形成Kit受体的D2-D3铰链区中的口袋来自D2结构域的Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206 和 F208,以及来自 D3 结构域的 V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268 和 Y269。因此，在一些实施方式中，本发明的成分可以结合连续的或不连续的氨基酸残基，并起到阻止RTK的近膜区以使酪氨酸激酶能够活化的距离和定向进行定位所需的运动分子楔(molecular wedge)的作用。本发明的成分也可以起到阻止同型或异型的D4或D5受体相互作用或使配体-受体相互作用位点不稳定的作用。在一些优选实施方式，本发明的成分结合Kit受体上的一个或多个以下残基Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206、P206、F208、K127、A207、V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268、Y269、T295、L222、L222、L223、E306、V308、R224、V308、K310、K218、A219、S220、K218、A220、Y221、A339、D327、D398、E338、E368、E386、F312、F324、F340、F355、G311、G384、G387、G388、1371、K342、K358、L382、L379、N326、N367、N370、N410、P341、S369、T385、V325、V407、V409、Y373、Y350、Y408、T380、T390、R381、R353、T411、K412、E414、K471、F433、G470、L472、V497、F469、A431或G432。本领域技术人员将理解，在一些实施方式中，本发明的成分可以容易地靶向于其它III型RTK中的相应残基，例如形成相似的口袋或空腔的那些残基或通过结构比对或序列比对处于相同位置的那些残基。在一种特定实施方式中，本发明的成分结合III型RTK上的构象表位或非连续表位。构象表位或非连续表位可以由来自III型RTK(例如人Kit受体或TOGF受体)的D3、D4和/或D5结构域或者D4-D5或D3-D4铰链区的两个或更多个残基组成。例如，所述构象表位或非连续表位可以由表4中所列的两个或更多个残基组成。在一种具体实施方式
中，本发明的成分结合由2个或多个选自Y125、H180、R181、K203、V204、R205、P206、V238、S239、S240、H263、G265、D266、F267、N268 和 Y269 的氨基酸组成的构象表位。在相似的实施方式中，本发明的成分可以结合由选自以下的氨基酸组之一的2个或多个氨基酸组成的构象表位P206、F208、V238和S239 ;K127、A207、F208和T295 ；L222、A339、F340、K342、E368、S369、N370、I371 和 Y373 ;L222、L223、E306、V308、F312、E338、F340 和 1371;R224、V308、K310、G311、F340、P341和 D398;K218、A219、S220、N367、E368 和S369 ;K218、A220、E368 和 S369 ;G384、T385、T411、K412、E414 和 K471 ;Y408、F433、G470、K471 和 L472 ;F324、V325、N326 和 N410 ;D327、N410、T411、K412 和 V497 ;G384、G387、V409和 K471 ;L382、G387、V407 和 V409 ;Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206、F208、V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268 和 Y269 ;P206、F208、V238 和 S239 ；K218、S220、Y221、L222、F340、P341、K342、N367、E368、S369、N370、I371和 Y373 ;G384、G387、G388、Y408、V409、T411、F433、F469、G470 和 K471 ;D327、T411、K412、E414、A431、G432 和K471 ;Y350、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386 和 T390 ;Y350、R353 和 F355。如以上所指出的，本发明的成分可以结合形成如表4中确定的口袋或空腔的所有氨基酸残基，或者它们可以结合形成口袋或空腔的残基的一部分。应当理解，在特定实施方式中，当提到结合表位例如构象表位的本发明的成分时，意图是所述成分仅结合那些构成该表位(例如表4中确定的口袋或空腔)的那些特定残基，而不是在该受体的线性氨基酸序列中的其它残基。在进一步的实施方式中，本发明的成分结合构象表位，其中所述表位由选自表5中所列的肽的两个或更多个氨基酸残基组成。在一种具体实施方式
中，构象表位由选自第一肽的一个或多个氨基酸残基和选自第二肽的一个或多个氨基酸残基组成，其中第一和第二肽选自表5中所列的肽的组。因而，本发明的成分可以结合构象表位，其中来自表 5 的所述第一和第二肽组如下Ala219-Leu222 和 Thr304_Val308 ；Asp309-Gly311 和Arg224-Gly226 ；Thr303-Glu306 和 Ala219_Leu222 ;Asn367_Asn370 和 Ser217-Tyr221 ；Ala339-Pro343 和 Asn396_Val399 ；Ala339-Pro343 和 Glu368_Arg372 ；Lys358-Tyr362 和Val374-His378 ；Asp357-Glu360 和 Leu377-Thr380 ;Met351_Glu360 和 His378-Thr389 ；His378-Thr389 和 Val323_Asp332 ；Val409-Ile415 和 Ala493-Thr500 ；Val409-Ile415 和Ala431-Thr437 ；Val409-Ile415 和 Phe469_Val473 ；Val409-Ile415 和 Val325_Asn330 ；Val409-Ile415 和 Arg381-Gly387 ；Gly466-Leu472 和 Gly384-Gly388 ；Val325-Glu329 和Tyr494-Lys499 ；Thr411-Leu416 和 Val497_Ala502 ;Ile415_Leu421 和 Ala502_Ala507 ;Ala502-Ala507 和 Lys484_Thr488 ;及 Ala502_Ala507 和 Gly445_Cys450。本发明的成分可以结合形成前述第一和第二肽组的所有氨基酸残基，或者它们可以结合形成第一和第二肽组的残基的一部分。应当理解，在特定实施方式中，当提到结合表位例如构象表位的本发明的成分时，意图是所述成分仅结合那些构成该表位(例如表5中确定的特定肽)的那些特定残基，而不是在该受:体的线性氣基酸序列中的其它残基。 在另一实施方式中，本发明的成分结合由2个或多个选自E33、P34、D72、E76、N77、K78、Q79、K158、D159、N250、S251、Q252、T253、K254、L255、N260、W262、H264、G265、E344、N352、R353、F355、T356、D357、Y362、S365、E366、N367、N370 和 G466 的氨基酸组成的构象表位或非连续表位。在另一个实施方案中，本发明的成分结合VEGF受体的连续表位。在一个实施方案中，连续表位是由VEGF受体D7结构域中的两个或更多个残基组成的。在另一个实施方案中，连续表位是选自于VEGFRl的672VAISSS6' VEGFRl的678TTLDCHA684、VEGFRl的685NGVPEPq691、VEGFRl 的 700KIQQEPG706, VEGFRl 的 707IILG710' VEGFRl 的 711PGS713' VEGFRl 的714STLFI718' VEGFRl 的 719ERVTEEDEGV728、VEGFR3 的 689VNVSDS694, VEGFR3 的 695LEMQCLV701、VEGFR3 的 7CI2AGAHAPS7CI8、VEGFR3 的 717LLEEKSG723、VEGFR3 的 724VDLA72' VEGFR3 的 728DSN7'VEGFR3 的 731QKLSI735 和 VEGFR3 的 736QRVREEDAGR745、VEGFR2 的 678TSIGES683, VEGFR2 的684IEVSCta690, VEGFR2 的 691SGNPPPQ697、VEGFR2 的 7ci6TLVEDSG712、VEGFR2 的 mIVLK716、VEGFR2的 mDGN719、VEGFR2 的 72qRNLTI724 和 VEGFR2 的 725RRVRKEDEGL734 的表位。在另一实施方式中，本发明的成分结合人TOGFRP的氨基酸残基385Arg和39°G1u，或者TOGFRa中的相应残基。AroGFRP的残基385Arg和390Glu与Kit受体的残基381Arg和386Glu类似，并介导TOGFRP的同型D4-D4相互作用。本发明的成分可以通过阻止III型RTK的近膜区之间的关键同型相互作用(例如人I3DGFRP的385Arg和390Glu之间形成的盐桥)而发挥其对受体活化的抑制作用，所述相互作用对于胞质域以对于酪氨酸激酶活化至关重要的距离和定向进行定位是不可或缺的。本文中讨论的实验证明同型D4-D4相互作用对于I3DGFRP 二聚化不是必要的，而I3DGFRP 二聚化对于受体活化是必要的然而并非足够的。因此，本发明的成分可以允许TOGFRP 二聚化而阻止活化。基于结构的序列比对已经表明在KU、PDGFR a、PDGFR^和CSFlR中，EF环的大小以及包含重要氨基酸的D4-D4界面是保守的。因此，在一些实施方式中，本发明的成分可以靶向于III型RTK的D4或D5结构域的保守区。本领域技术人员也会理解，本发明的成分可以结合糖残基，所述糖残基可以出现在RTK的糖基化形式上。本发明的成分也可以结合由氨基酸残基和糖残基两者组成的表位。术语“受体酪氨酸激酶”和“RTK”在本文中可互换地使用以表示公知的使酪氨酸残基磷酸化的膜受体的家族。很多受体酪氨酸激酶在发育或者细胞分裂中起到重要作用。受体酪氨酸激酶具有细胞外配体结合结构域、跨膜结构域和胞内催化结构域。胞外结构域结合细胞因子、生长因子或其它配体，并通常由一或多个可识别的结构基序组成，包括富半胱氨酸区、纤连蛋白III样结构域、免疫球蛋白样结构域、EGF样结构域、钙粘着蛋白样结构域、kringle样结构域、因子VIII样结构域、富甘氨酸区、富亮氨酸区、酸性区和盘状(discoidin)结构域。胞内激酶结构域的活化通过配体结合细胞外结构域实现,这引起受体二聚化。以这种方式活化的受体能够自磷酸化催化结构域外面的酪氨酸残基，从而促进活性受体构象的稳定。磷酸化残基也作为随后在细胞内传导信号的蛋白质的结合位点。RTK的实例包括但不限于Kit受体(亦称干细胞因子受体或SCF受体)、成纤维细胞生长因子(FGF)受体、肝细胞生长因子(HGF)受体、胰岛素受体、胰岛素样生长因子-I (IGF-I)受体、神经生长因子(NGF)受体、血管内皮生长因子(VEGF)受体、PDGF受体-a、H)GF受体-3、CSF-I受体(亦称M-CSF受体或Fms)和Flt3_受体(亦称Flk2)。在本发明的优选实施方式中，RTK是III型RTK。在本发明另一实施方式中，RTK是V型，即VEGF受体家族的成员。如本文中所使用，术语“受体酪氨酸激酶的III型家族”或“III型RTK”意于包括一般地在其胞外域中包含五个免疫球蛋白像结构域或Ig样结构域的受体酪氨酸激酶。III型RTK的实例包括但不限于I3DGF受体、M-CSF受体、FGF受体、Flt3受体(亦称Flk2)和Kit受体。在本发明的优选实施方式中，III型RTK是Kit (在本领域也称为SCF受体)。KU，与其它III型RTK相似，由通过单一跨膜(TM)结构域连接于胞质区糖基化的细胞外配体结合结构、域(胞外域)构成(综述于 Schlessinger (2000)Cell 103:211-225)。III型 RTK，例如 Kit或TOGFR，的另一标志是带有大的激酶插入区的胞质蛋白酪氨酸激酶(PTK)结构域。已知存在至少两种Kit受体的剪切同工型，较短的利用框内的剪接位点。本发明包括Kit以及其它上述RTK的所有同工型。本文中所用的受体酪氨酸激酶(RTK)的“Ig样结构域”意于包括本领域公知的存在于RTK胞外域中的结构域。在III型受体酪氨酸激酶(III型RTK)家族例如Kit的胞外域中，存在5个这样的结构域，已知为D1、D2、D3、D4和D5。III型RTK的D1、D2和D3结构域负责结合 RTK 的配体(综述于 Ullrich 和 Schlessinger (1990) Cell 61 :203-212)。因此，在本发明的一种实施方式中，术语“ Ig样结构域”不意于包括负责配体结合的RTK的结构域。在本发明的优选实施方式中，Ig样结构域是III型RTK的D4和/或05结构域。在VEGF受体家族的胞外域中，存在7个Ig样结构域，已知为Dl、D2、D3、D4、D5、D6和D7。在本发明 的一种优选实施方式中，Ig样结构域是VEGF受体家族的D7结构域。本文使用的术语“血管内皮生长因子受体”、“VEGF受体”或“VEGF受体家族”，亦称V型RTK，包括血管内皮生长因子的RTK受体。如上所述，这些RTK在其胞外域中具有7个Ig样结构域。VEGF家族受体的实例为VEGFR-I (亦称Flt_l)、VEGFR_2 (亦称KDR或Flk-I)和 VEGFR-3(亦称 Flt-4)。术语受体酪氨酸激酶(RTK)的“胞外域”是本领域公知的，并且指RTK的细胞外部分，即在质膜外的RTK的部分。术语受体酪氨酸激酶的胞外域的“近膜区”指的是接近质膜的RTK的细胞外部分，并优选地不直接负责配体与RTK的结合。近膜区的实例包括但不限于III型受体酪氨酸激酶的D4结构域、III型受体酪氨酸激酶的D5结构域、III型受体酪氨酸激酶的D3-D4铰链区、III型受体酪氨酸激酶的D4-D5铰链区和V型受体酪氨酸激酶的D7结构域。本文中所用的术语“同型相互作用”指的是来自两个单体受体的两个相同的近膜区之间的相互作用。本文中所用的术语“异型相互作用”指的是来自两个单体受体的两个不同的近膜区之间的相互作用。异型相互作用可以是两个不同类型的单体受体二聚化的结果，或者同种单体受体的野生型和突变体形式二聚化的结果。例如，本领域公知癌症患者可以携带某一受体的野生型等位基因和突变体等位基因。本文中所用的术语“单体状态”指的是其中RTK分子由单一多肽链组成的RTK的状态，该单一多肽链不与相同或不同类型的第二 RTK多肽结合。RTK二聚化导致自磷酸化和受体活化。因此，单体状态的RTK是非活性状态。单体状态也是其中单一 RTK的D4、D5或D7结构域不与第二 RTK的D4、D5或D7结构域分别结合的状态。本文所使用的，“原体”是寡聚蛋白如RTK的结构单元。原体是可以以确定的化学计量组装以形成低聚物的蛋白质亚基。受体酪氨酸激酶的VEGFR家族是共价连接的二聚体，并且各个VEGFR原体是以名为“半胱氨酸结生长因子”的结构由按反向平行方式排列的四链￠-折叠片组成的。短语“锁定受体酪氨酸激酶的胞外域在非活性状态”指的是本发明的成分抑制受体酪氨酸激酶的活性的能力。换言之，该短语包括本发明的成分将平衡转向形成非活性或抑制性的受体构型的能力。例如，与不存在本发明的成分时受体活性相比，本发明的成分可以抑制受体酪氨酸激酶的活性至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95%。本文中所用的术语“非活性状态”指的是其中RTK分子不能激活下游的信号传导的RTK的状态。非活性状态可以是这样的状态，其中受体酪氨酸激酶的胞外域被允许二聚化，但是两个单体的Ig样结构域(例如III型受体酪氨酸激酶的D4-D4或D5-D5结构域或者V型受体酪氨酸激酶的D7-D7结构域)之间的定位、定向、构象和/或距离发生改变，从而抑制了受体酪氨酸激酶的活性(例如受体内化受抑制和/或受体的酪氨酸自磷酸化受抑制和/或受体激活下游信号传导途径的能力受抑制)。非活性状态也包括如上所述的单体状态。非活性状态也可以是这样的状态，其中受体酪氨酸激酶的胞外域结合于受体配体并二聚化，但是还没有发生允许受体活化的构象变化。实施例22-25进一步讨论了表明存在对于RTK活化至关重要(例如通过介导D4或D5同型相互作用)但是对于受体二聚化不是必要的特定保守氨基酸残基的实验。术语“非活性状态”包括这样的状态，其中与没有本发明的成分时的受体活性相比，本发明的成分可以降低或抑制受体酪氨酸激酶的活性至少 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、 80^^85^^90%或95%。本文中描述的任何功能试验可用于确定本发明的成分抑制受体酪氨酸激酶活性的能力。在一些实施方式中，本发明的成分可以表现出宽的效应，例如当大部分或全部目标RTK灭活时。在其他的实施方式中，本发明的成分可以表现出较窄的效应，例如当部分靶RTK灭活时。在这样的实施方式中，与没有所述成分时的受体相比，至少5%、10% ,15%,20%,25%,30%,35%,40%, 45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85 %、90 %或95 %的受体被锁定在非活性状态。本文中所使用的术语“构象表位”或“非线性表位”或“不连续表位”可互换地使用以指由至少两个不是单蛋白质链中的连续氨基酸的氨基酸组成的表位。例如，构象表位可以是由一段(strech)插入氨基酸分开，但是足够靠近以被本发明的成分作为单一表位识别的两个或更多个氨基酸组成。作为进一步的实例，在单蛋白质链上由插入氨基酸分开的氨基酸或者存在于分离的蛋白质链上的氨基酸可以由于蛋白质结构或复合体的构象形状而拉近，以成为可以被本发明的成分结合的构象表位。特定的不连续表位和构象表位在本文中进行描述(参见例如表4和5)。本领域技术人员将理解，通常，本发明的成分结合的线性表位可以取决于或不取决于RTK的二级、三级或四级结构。例如，在一些实施方式中，本发明的成分可以结合一组氨基酸而无论它们是否以天然的三维蛋白质结构进行折叠。在其他的实施方式中，本发明的成分可能不识别组成该表位的单个氨基酸残基，而是可能需要特别的构象(弯曲、盘旋、转角或折叠)以识别和结合表位。如本文使用的，“邻近表位”或“连续表位”可互换使用，指的是由单肽链中的连续氨基酸的至少两个氨基酸组成的表位。本文中描述了特定的连续表位(见，例如，表8)。在另一个实施方案中，本发明的成分结合VEGF受体上的连续表位。在一个实施方案中，连续表位由VEGF受体D7结构域中的两个或更多个残基组成。在另一个实施方案中，连续表位是选自于 VEGFRl 的 672VAISSS6' VEGFRl 的 678ITLDCHA684、VEGFRl 的 685NGVPEPQ691、VEGFRl的 700KIQQEPg706, VEGFRl 的 707IILG710' VEGFRl 的 711PGS713' VEGFRl 的 714STLFI718' VEGFRl 的719ERVTEEDEGV728、VEGFR3 的 689VNVSDS694、VEGFR3 的 695LEMQCLV7CI1、VEGFR3 的 7ci2AGAHAPS708、VEGFR3 的 717LLEEKSg723、VEGFR3 的 724VDLA72' VEGFR3 的 728DSN730' VEGFR3 的 731QKLSI735 和vegfr3 的 736Qrvreedagr745、vegfr2 的 678Tsiges683, vegfr2 的 684Ievscta690, vegfr2 的691SGNPPPq697, VEGFR2 的 7ci6TLVEDSG712、VEGFR2 的 mIVLK716、VEGFR2 的 mDGN719、VEGFR2 的720RNLTI724 和 VEGFR2 的 725RRVRKEDEGL734 的表位。本文所用的短语“疏水氨基酸”是指包含疏水性能的氨基酸，如丙氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、脯氨酸和本文列出的其他氨基酸。本发明的各个方面将在以下小节中进一步详细描述I.结合人受体酪氨酸激酶胞外域的抗体在本发明的一个方面，结合人受体酪氨酸激酶的胞外域例如Ig样结构域或铰链区的成分是抗体或其抗原结合片段。 在本文中所指的“抗体”包括整个的抗体和任何抗原结合片段(即抗原结合部分”)或其单链。抗体”指包含通过二硫键相互连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。各个重链由重链可变区(在这里缩写为Vh)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域组成，CH1、CH2和CH3。各个轻链由轻链可变区(在这里缩写为VJ和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域，Q，组成。V1^P'区可以进一步细分成称为互补决定区(CDR)的超变区，其间交替散布着更加保守的称为构架区(FR)的区域。各个Vh和\由三个⑶R和四个FR组成，按以下顺序从氨基端至羧基端排列FR1，⑶Rl，FR2，⑶R2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一成分(Clq))的结合。本文中所用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗体部分”)指的是保留特异性结合抗原(例如Kit的D4或D5结构域或VEGF受体的D7结构域)能力的抗体的一个或多个片段。已经表明，全长抗体的片段可以执行抗体的抗原结合功能。包含在术语抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由\、VH、Cl和ChI结构域构成的单价片段；(ii)F(ab' )2片段，包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fab’片段，主要是带有部分铰链区的Fab (参见，FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul编著，第三版1993) ； (iv)由Vh和ChI结构域构成的Fd片段；(v)由抗体单臂的\和Vh结构域构成的Fv片段，(vi)dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341 :544-546),其由Vh结构域构成；(vii)分离的互补决定区(CDR);以及(viii)纳米体,含有单一的可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。而且，尽管Fv片段的两个结构域'和Vh由独立的基因编码，但是它们可以使用重组方法通过使得它们能够形成单蛋白质链的合成接头连接的，其中'和Vh区配对以形成单价分子(已知为单链Fv(scFv);参见例如Bird等(1988) Science 242 423-426 ;和 Huston 等(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-5883) 这样的单链抗体也意于包括在术语抗体的“抗原结合部分”中。这些抗体片段使用本领域技术人员已知的常规方法获得，并且片段以与完整抗体同样的方法进行用途筛选。本文中所用的“分离的抗体”意于指基本上没有具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如特异性结合RTK的Ig样结构域的分离的抗体基本上没有特异性结合除了 RTK的Ig样结构域之外的抗原的抗体)。而且，分离的抗体可以是基本上没有其它的细胞物质和/或化学物质。但是，“分离的抗体”可以包括全都特异性结合例如RTK的Ig样结构域的多克隆抗体。本文中所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组成”指的是单分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组成显示对特定表位的单一结合特异性和亲合性。本文中所用的术语“人抗体”意于包括具有其中框架区和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。而且，如果抗体含有恒定区，该恒定区也源自于人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如体外随机或定点诱变或者体内体细胞突变引入的突变)。然而，本文中所用的术语“人抗体”不意于包括其中来自另一哺乳动物种(例如小鼠)的种系的CDR序列嫁接于人框架序列的抗体。术语“人单克隆抗体”是指具有其中框架区和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列的可变区的显示单一结合特异性的单克隆抗体。在一种实施方式中，人单克隆抗体由包括由非人类转基因动物例如转基因小鼠获得的B细胞的杂交瘤产生，所述非人类转基因动 物具有融入无限增殖细胞的包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。本文中所用的术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、创造或分离的所有人抗体，例如(a)从对于人免疫球蛋白基因进行转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤分离的抗体(以下进一步描述)，(b)从经转化以表达人抗体的宿主细胞分离的抗体，例如从转染瘤的抗体，(C)从重组、组合的人抗体文库分离的抗体，和(d)通过包括将人免疫球蛋白基因序列与其它DNA序列剪接的任何其它方法制备、表达、创造或分离的抗体。这样的重组人抗体具有其中框架区和⑶R区域源自于人种系免疫球蛋白序列的可变区。然而，在某些实施方式中，这样的重组人抗体可以进行体外诱变(或在使用人Ig序列转基因的动物时，进行体内体细胞诱变)，从而尽管重组抗体的％和'区的氨基酸序列源自人种系Vh和\序列和与之相关，但它们可以并不是天然存在于体内人抗体种系库内。本文中所用的“同种型”指的是由重链恒定区基因编码的抗体类(例如IgM或IgGl)。短语“识别抗原的抗体”和“抗原特异性的抗体”在本文中与术语“特异性结合抗原的抗体”互换地使用。术语“人抗体衍生物”指的是人抗体的任何修饰形式，例如抗体和另一种物质或抗体的缀合物。术语“人源化抗体”意于表示其中源自另一哺乳动物种例如小鼠的CDR序列嫁接于人框架序列上的抗体。可以在人框架序列内进行另外的构架区修饰。本领域技术人员将理解，当序列“源自于”特定的种时，所述序列可以是蛋白质序列，例如当可变区氨基酸取自鼠抗体时，或者所述序列可以是DNA序列，例如当编码可变区的核酸取自鼠DNA时。也可以基于人和非人(例如鼠或兔)抗体来设计人源化抗体。所述设计的抗体(可能结合了人的和非人的残基)可以是化学合成的。所述序列也可以在DNA水平合成，并在体外或体内表达以产生人源化抗体。术语“嵌合抗体”意于指其中可变区序列源自于一个种而恒定区序列源自于另一个种的抗体，例如其中可变区序列源自于小鼠抗体，而恒定区序列源自于人抗体的抗体。术语“抗体模拟物”或“抗体类似物”意于指的是能够模拟抗体结合抗原的能力的分子，但它不局限于天然的抗体结构。此类抗体模拟物的实例包括但不限于Adnectin(即基于纤连蛋白的结合分子)、亲和体、DARPin、抗运载蛋白(Anticalin)、高亲合性多聚体和Versabody,尽管它们它们模拟传统的抗体结合,它们全部采用通过完全不同的机制产生的结构并通过完全不同的机制发挥作用。当本发明的实施方式涉及抗体或其抗原结合部分时，它们也可以应用于如上所述的抗体模拟物。本文中所用的“特异性结合” RTK的Ig样结构域的抗体意指以1x10_7M或更低、更优选5x 10_8M或更低、更优选Ix 10_8M或更低、更优选5x 10_9M或更低的的Kd结合RTK的Ig样结构域的抗体。本文中所用的术语“基本上不结合”蛋白质或细胞表示不结合或不以高亲和性结合蛋白质或细胞，即以Ix 10_6M或更高、更优选Ix 10_5M或更高、更优选Ix 10_4M或更高、更优选Ix 10_3M或更高、甚至更优选Ix 10_2M或更高的Kd结合蛋白质或细胞。本文中所用的术语"K^"或“Ka”意指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而 本文中所用的术语"Kws"或“Kd”意指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。本文中所用的术语“KD”意指解离常数，其从Kd与Ka的比率(即Kd/Ka)获得，并表示为摩尔浓度(M)。可以使用本领域公认的方法确定抗体的Kd值。测定抗体的Kd的优选方法是使用表面等离子体共振，优选使用生物传感器系统，例如Biacore 系统。本文中所用的术语“高亲和性”在涉及IgG型抗体时，指的是对于RTK的Ig样结构域，抗体具有10_8M或更低、更优选10_9M或更低、甚至更优选KTkiM或更低的Kd。然而，对于其它抗体同种型“高亲和性”结合可能有所改变。例如，IgM同种型的“高亲和性”结合指的是抗体具有10_7M或更低、更优选10_8M或更低、更优选10_9M或更低的Kd。技体本发明的抗体特异性结合RTK的Ig样结构域，例如人受体酪氨酸激酶III型家族的成员。在优选实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分与RTK单体的Ig样结构域的结合将胞外域锁定在非活性状态，例如单体状态，并因此拮抗RTK 二聚化和激活下游信号传导途径的能力。例如，所述抗体可以阻断配体诱导的受体酪氨酸激酶的酪氨酸自磷酸化和/或受体内化。选择或设计本发明的抗体以结合RTK的特定Ig样结构域，例如人Kit的D4结构域或D5结构域或者VEGF受体的D7结构域。在其它实施方式中，选择或设计抗体或其抗原结合部分以结合与RTK(例如Kit受体或VEGF受体)的结构域具有同源性的蛋白质。例如，可以选择或设计抗体以结合与Kit受体的结构域(例如D4或D5结构域)或者VEGF受体的D7结构域具有至少50 %的同一性、至少60 %的同一性、至少70 %的同一性、至少80 %的同一性、至少90 %的同一性、或至少95 %、96 %、97 %、98 %或99 %的同一性的结构域。这样的抗体或其抗原结合部分将能够结合与Kit的D4或D5结构域或者VEGF受体的D7结构域在功能上类似的蛋白质结构域(可能在KU、VEGF受体和其它RTK中)。也可以选择或设计本发明的抗体或其抗原结合部分以结合由RTK(例如人III型RTK)的Ig样结构域衍生的特殊基序或共有序列，从而使抗体或其抗原结合部分特异性结合人RTK III型家族的成员之间以及III型RTK和其它RTK (例如V型RTK)之间共有的表位或结构域。例如，可以通过使用序列比对算法来比对各种RTK的结构域(例如在RTK类型或各物种之间D4结构域的结构域)找到这类线性共有序列(参见图6B)。本领域技术人员可以比对例如来自各种物种(例如人、小鼠、大鼠)的Kit D4结构域的蛋白质序列以确定在被比对的序列的至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %或至少100%中哪些蛋白质残基是保守的。然后，这样的共有序列可以用于产生特异性结合该共有序列的抗体或其它成分，并因此结合Kit RTK的最保守的残基。类似地，人们也可以比对V型RTK的D7结构域的蛋白质序列(参见图6)以获得可以用于产生本发明的成分的共有序列。本领域技术人员应理解，最高度保守的残基是哪些通过进化保留并最可能对于蛋白质功能具有重要性的残基。或者，如果比对在各种不同类的RTK之间进行，对于这样的共有序列产生的抗体将允许抗体结合多种RTK类型中的相似Ig样结构域。在具体实施方式
中，本发明的成分(例如抗体或其抗原结合部分)结合D4相互作用位点的以下共有序列=LX1RX2X3X4X5X6X7G,其中L是亮氨酸，R是精氨酸，G是甘氨酸，和X1'X2> X3> X4, X5, X6和X7是任何氨基酸。在具体的实施方案中，X1选自苏氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、天门冬酰胺或赖氨酸；X2选自亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸和甲硫氨酸；x3选自赖氨 酸、组氨酸、天门冬酰胺和精氨酸；X4选自甘氨酸、缬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸；X5选自苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸；x6选自谷氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺；以及X7选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和苏氨酸。在另一实施方式中，本发明的成分(例如抗体或其抗原结合部分)结合VEGF受体家族成员的D7结构域的以下共有序列=IX1RVX2X3EDX4G，其中I是异亮氨酸，R是精氨酸，E是谷氨酸，D是天冬氨酸，G是甘氨酸；和Xp X2、X3和X4是任何氨基酸。在具体的实施方案中，X1选自谷氨酸、精氨酸和谷氨酰胺；X2选自精氨酸和苏氨酸；X3选自谷氨酸和赖氨酸；以及X4选自谷氨酸和丙氨酸(SEQ ID NO 1)0在另一个实施方案中，本发明的成分(例如，抗体或其抗原结合部分)结合VEGF受体的D7结构域的以下共有序列L/I X1 R O X2 X3 X4 D/E X5 G (SEQ ID NO :158)，其中L是亮氨酸，I是异亮氨酸，R是精氨酸，O是疏水性氨基酸，D是天冬氨酸，E是谷氨酸，G是甘氨酸；以及乂1、&、\34和&是任何氨基酸。在具体的实施方案中，O是缬氨酸；X1选自于精氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸和天冬氨酸；X2选自于精氨酸、赖氨酸和苏氨酸；X3选自于赖氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和缬氨酸-J4选自于谷氨酸和缬氨酸；以及X5选自于谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸和谷氨酰胺。本发明的抗体不结合RTK的配体结合位点，例如Kit受体的SCF结合位点。因此，本文中描述的抗体不拮抗受体结合其目标配体的能力。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分结合人Kit受体的特定序列，例如人Kit 受体的残基 309-413、残基 410-519、381Arg 和 386Glu 或者 418Tyr 和 5°5Asn。在其它实施方式中，抗体或其抗原结合部分结合代表蛋白质中三维结构的蛋白质基序或共有序列。这样的基序或共有序列不代表氨基酸的连续链，而是导致RTK的三维折叠的非连续的氨基酸排列(即“结构基序”或“非线性表位”)。这样的基序的实例是Kit受体的D4-D4或D5-D5结合界面或VEGF受体D7-D7结合界面。在一种实施方式中，本发明的抗体结合例如D4-D4、D5-D5或D7-D7界面中的非线性表位，从而阻止RTK的活化。在优选实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分可以结合构成表4(下文中)中描述的小腔或口袋的Kit受体中的一个或多个残基。例如，本发明的抗体或其抗原结合部分可以结合Kit受体的D3-D4铰链区中的一个或多个以下残基来自D3结构域的K218、S220、Y221、L222 和来自 D4 结构域的 F340、P341、K342、N367、E368、S369、N370、I371、Y373。本发明的抗体或其抗原结合部分也可以结合构成Kit受体的D4结构域中的凹面的一个或多个以下残基:Y350、R353、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386 和 T390。在另一实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分可以结合形成Kit受体的D2-D3铰链区中的口袋的一个或多个以下残基来自D2结构域的Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206和F208 以及来自 D3 结构域的 V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268 和 Y269。因此，在一些实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分可以结合连续的或不连续的氨基酸残基，并起到阻止RTK的近膜区以使酪氨酸激酶能够活化的距离和定向进行定位所需的运动的分子楔的作用。本发明的抗体或其抗原结合部分也可以起到阻止同型D4或D5受体的相互作用或使配体-受体相互作用位点不稳定的作用。在一些优选实施方式，本发明的抗体或其抗原结合部分可以结合Kit受体上的一个或多个以下残基Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206、P206、F208、K127、A207、V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268、Y269、T295、L222、L222、L223、E306、V308、R224、V308、K310、K218、A219、S220、K218、A220、Y221、A339、D327、D398、E338、E368、E386、F312、F324、F340、F355、 G311、G384、G387、G388、1371、K342、K358、L382、L379、N326、N367、N370、N410、P341、S369、T385、V325、V407、V409、Y373、Y350、Y408、T380、T390、R381、R353、T411、K412、E414、K471、F433、G470、L472、V497、F469、A431 或 G432。本领域技术人员将理解，在一些实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分可以容易地靶向于其它III型RTK中的相应残基，例如形成相似的口袋或空腔的那些残基或通过结构比对或序列比对处于相同的位置的那些残基。在一种具体实施方式
中，本发明的抗体或其抗原结合部分结合III型RTK上的构象表位或非连续表位。构象表位或非连续表位可以由来自III型RTK (例如人Kit受体或TOGF受体)的D3、D4或D5结构域或者D4-D5或D3-D4铰链区的两个或更多个残基组成。例如，所述构象表位或非连续表位可以由下面表4中所列的两个或更多个残基组成。在一种特定实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分结合由2个或多个选自Y125、H180、R181、K203、V204、R205、P206、V238、S239、S240、H263、G265、D266、F267、N268和Y269的氨基酸组成的构象表位。在相似的实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分可以结合由选自以下的氨基酸组之一的2个或多个氨基酸组成的构象表位P206、F208、V238 和 S239 ;K127、A207、F208 和 T295 ;L222、A339、F340、K342、E368、S369、N370、1371 和Y373 ;L222、L223、E306、V308、F312、E338、F340 和 1371;R224、V308、K310、G311、F340、P341和 D398 ;K218、A219、S220、N367、E368 和 S369 ;K218、A220、E368 和 S369 ;G384、T385、T411、K412、E414 和 K471 ;Y408、F433、G470、K471和 L472 ;F324、V325、N326 和 N410 ;D327、N410、T41UK412 和 V497 ;G384、G387、V409 和 K471 ;L382、G387、V407 和 V409 ;Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206、F208、V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268和 Y269 ;P206、F208、V238 和 S239 ;K218、S220、Y221、L222、F340、P341、K342、N367、E368、S369、N370、1371 和 Y373 ;G384、G387、G388、Y408、V409、T411、F433、F469、G470 和 K471 ；D327、T411、K412、E414、A431、G432 和 K471 ;Y350、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386和T390 ;Y350、R353和F355。如以上所指出的，本发明的抗体可以结合形成在表4中确定的口袋或空腔的所有氨基酸残基，或者它们可以结合形成口袋或空腔的残基的一部分。应当理解，在某些实施方式中，当说明本发明的抗体结合表位例如构象表位时，意图是抗体仅结合那些构成该表位(例如表4中确定的口袋或空腔)的那些特定残基，而不是在该受体的线性氨基酸序列中的其它残基。在进一步的实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分结合构象表位，其中所述构象表位由选自表5中所列的肽的两个或更多个氨基酸残基组成。在一种具体实施方式
中，构象表位由选自第一肽的一个或多个氨基酸残基和选自第二肽的一个或多个氨基酸残基组成，其中第一和第二肽选自表5中所列的肽的组。因而，本发明的抗体或其抗原结合部分结合构象表位，其中所述第一和第二肽组如下Ala219-Leu222和Thr304-Val308 ；Asp309-Gly31I 和 Arg224-Gly226 ；Thr303-Glu306 和 Ala219_Leu222 ;Asn367-Asn370 和 Ser217-Tyr221 ；Ala339-Pro343 和 Asn396_Val399 ；Ala339-Pro343 和Glu368-Arg372 ；Lys358-Tyr362 和 Val374_His378 ;Asp357_Glu360 和 Leu377-Thr380 ；Met351-Glu360 和 His378-Thr389 ；His378-Thr389 和 Val323_Asp332 ；Val409-Ile415 和Ala493-Thr500 ；Val409-Ile415 和 Ala431-Thr437 ；Val409-Ile415 和 Phe469_Val473 ；Val409-Ile415 和 Val325_Asn330 ；Val409-Ile415 和 Arg381-Gly387 ；Gly466-Leu472 和Gly384-Gly388 ；Val325-Glu329 和 Tyr494-Lys499 ；Thr411-Leu416 和 Val497-Ala502 ； Ile415-Leu421 和 Ala502_Ala507 ；Ala502-Ala507 和 Lys484_Thr488 ；以及 Ala502_Ala507和 Gly445-Cys450。本发明的抗体可以结合形成前述第一和第二肽组的所有氨基酸残基，或者它们可以结合形成第一和第二肽组的残基的一部分。应当理解，在某些实施方式中，当说到本发明的抗体结合表位例如构象表位时，意图是抗体仅结合构成该表位(例如表5中确定的特定肽)的那些特异性残基，而不是在该受体的线性氨基酸序列中的其它残基。在另一实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分结合由选自E33、P34、D72、E76、N77、K78、Q79、K158、D159、N250、S251、Q252、T253、K254、L255、N260、W262、H264、G265、E344、N352、R353、F355、T356、D357、Y362、S365、E366、N367、N370 和 G466 的 2 个或多个氨基酸组成的构象表位或非连续表位。在另一实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分结合人I3DGFRP的氨基酸残基385Arg和390Glu，或者TOGFR a中相应的残基。人TOGFR ^的残基385Arg和390Glu类似于Kit受体的残基381Arg和386Glu,并介导TOGFRP的同型D4-D4相互作用。本发明的抗体或其抗原结合部分可以通过阻止对于胞质结构域以酪氨酸激酶活化必要的距离和定向进行定位所必需的III型RTK的近膜区之间的关键同型相互作用(例如人TOGFRP的385Arg和39°Glu之间形成的盐桥)而发挥其对受体活化的抑制作用。本文中讨论的实验证明同型D4-D4相互作用对于TOGFRP的二聚化不是必要的，而I3DGFRP 二聚化对于受体活化是必要的然而并非足够的。因此，本发明的抗体或其抗原结合部分可以允许TOGFRP 二聚化而阻止活化。基于结构的序列比对已经表明在KU、PDGFR a、PDGFR P和CSFlR中，EF环的大小以及包含重要氨基酸的D4-D4界面是保守的。因此，在一些实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以靶向于III型RTK的D4或D5结构域的保守区。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合部分结合人VEGF受体的特定序列，例如，VEGFRl 的残基 718-727、VEGFRl 的 Arg720 和 Asp725、VEGFR2 的残基 724-733、VEGFR2 的 Arg726 和 Asp731、VEGFR3 的残基 735-744 或 VEGFR3 的残基 Arg737 和 Asp742。
在另一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合部分结合VEGF受体的连续表位。在一个实施方案中，连续表位由VEGF受体D7结构域中的两个或更多个残基组成。在另一个实施方案中，连续表位是选自VEGFRl的672VAISSS6'VEGFRl的678TTLDCHA684、VEGFRI的 685NGVPEPq691、VEGFRl 的 700KIQQEPG706, VEGFRl 的 707IILG710' VEGFRl 的 711PGS713' VEGFRl的 714STLFI718' VEGFRl 的 719ERVTEEDEGV728、VEGFR3 的 689VNVSDS694, VEGFR3 的 695LEMQCLV701、VEGFR3 的 7CI2AGAHAPS7CI8、VEGFR3 的 717LLEEKSG723、VEGFR3 的 724VDLA72' VEGFR3 的 728DSN7'VEGFR3 的 731QKLSI735 和 VEGFR3 的 736QRVREEDAGR745、VEGFR2 的 678TSIGES683, VEGFR2 的684IEVSCta690, VEGFR2 的 691SGNPPPQ697、VEGFR2 的 7ci6TLVEDSG712、VEGFR2 的 mIVLK716、VEGFR2的 mDGN719、VEGFR2 的 72qRNLTI724 和 VEGFR2 的 725RRVRKEDEGL734 的表位。在另外的实施方式中，选择或设计本发明的抗体或其抗原结合部分以特异性结合 突变体RTK。在优选实施方式中，突变体RTK是致瘤的或致癌的突变体。在一种具体实施方式
中，选择或设计抗体或其抗原结合部分以结合致癌的Kit受体突变体。可以被本发明的抗体靶向的几种Kit受体突变体是具有一个或多个以下氨基酸中的突变的Kit受体Thr417、Tyr418、Asp419、Leu421、Arg420、Tyr503 或 Ala502。本领域技术人员应理解，本发明的方法将可以应用于Kit中的其它突变或其它RTK中的突变。靶向突变体RTK的一个优点是治疗抗体可以仅结合包含突变的细胞上的RTK,从而保持健康细胞大部分或全部不受影响。因此，在突变是致瘤性突变的情况下，仅肿瘤细胞被作为治疗靶标，从而潜在地减少副作用和剂量要求。优选地，抗体以5x 10_8M或更低的Kd、1x 10_8M或更低的Kd、5x 10_9M或更低的Kd，或者Ix KT8M至Ix 10,M之间或更低的Kd结合人RTK的Ig样结构域。本领域已知用于评价抗体对于RTK (例如Kit或VEGF受体)的Ig样结构域的结合能力的标准试验,包括例如ELISA、蛋白质印迹和RIA。抗体的结合动力学(例如结合亲合力)也可以通过本领域已知的标准试验来评定，例如通过ELISA、Scatchard和Biacore分析。工稈化和修饰的抗体根据本发明的方法制备的抗体的Vh和/或\序列可以用作工程化修饰的抗体的起始材料，所述修饰的抗体可以具有从起始抗体发生改变的性质。抗体可以通过修饰一个或两个原始可变区(即Vh和/或内(例如一或多个CDR区和/或一或多个构架区内)的一或多个残基进行工程化。另外地或者可选地，可以通过修饰恒定区内的残基来进行工程化，例如改变抗体的效应子功能。一种可以进行的可变区工程化是⑶R接枝。抗体主要地通过位于6个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。为此，在各抗体之间CDR中的氨基酸序列比CDR外的序列更加多样化。因为CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，可以通过构建表达载体来表达模拟特定的天然存在抗体的性质的重组抗体，所述表达载体包括来自特定的天然存在抗体的CDR序列，这些CDR序列被接枝到来自具有不同性质的不同抗体的框架序列上(参见，例如Riechmann,L.等(1998)Nature 332 :323-327 ；Jones,P.等(1986)Nature 321 :522-525 ；Queen, C.等(1989) Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A 亜10029-10033 ;授予Winter的美国专利No. 5，225，539，以及授予Queen等的美国专利No. 5，530，101 ；5，585，089 ;5，693，762 和 6，180，370)。可以从公共的DNA数据库或包括种系抗体基因序列的发表的参考文献来获得抗体的框架序列。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以从“VBase”人种系序列数据库中找到(可在互联网上在mrc-cpe. cam. ac. uk/vbase网站获得),以及在Kabat,E. A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242 ;Tomlinson,I. M.等(1992)" The Repertoire of Human Germline Vh Sequences Revealsabout Fifty Groups of Vh Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol.Biol. 227 :776-798 和 Cox, J. P. L.等(1994) " A Directory of Human Germ-line VhSegments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. I. Immunol. 24 :827-836 中找到；每一篇文献的内容均通过引用的方式明确并入本文中。作为另一实例，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以从Genbank数据库中找到。使用一种称为Gapped BLAST的序列相似性检索方法相对于编译蛋白质序列数据库比较抗体蛋白质序列(Altschul 等(1997)Nucleic Acids Research 25 :3389-3402),这是本领域技术人员公知的。BLAST是一种探试算法(heuristic algorithm),其中抗体序列和数据库序列之间的统计上显著的比对很可能含有比对字段(aligned word)的高分片段 对(high-scoring segment pair) (HSP)。不能通过延伸或者修剪提高分值的片段对称为命中(hit)。简言之，VBASE 来源的核苷酸序列(vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbasel/list2.Php)被翻译，且FR1-FR3框架区之间和包括上述框架区之间的区域得到保持。数据库序列平均长度为98个残基。去除在蛋白质全长范围内精确匹配的重复序列。使用具有缺省的标准参数(除了被关闭的低复杂性过滤器)的程序blastp和BL0SUM62的替代矩阵进行蛋白质的BLAST检索过滤出产生序列匹配的前5个命中。核苷酸序列在所有6个框架中被翻译，而在数据库序列的匹配片段中没有终止密码子的框架被认为是潜在的命中。这随后使用BLAST程序tblastx进行证实，其在所有6个框架中翻译抗体序列，并将那些翻译与在所有6个框架中动态地翻译的VBASE核苷酸序列进行比较。可以如上所述类似地对VBASE进行其它人种系序列数据库，例如可从IMGT(http://imgt. cines. fr)获得的那些的检索。同一性是在全长序列上抗体序列和蛋白质数据库之间的精确的氨基酸匹配。阳性结果(同一性+置换匹配)不是相同的，但是氨基酸置换由BL0SUM62替代矩阵指导。如果抗体序列以相同的同一性与两个数据库序列相匹配，那么具有最多阳性结果的命中将被确定为匹配序列命中。确认的Vh⑶R1XDR2和⑶R3序列以&Vk⑶R1XDR2和⑶R3序列可以接枝到构架区上，所述框架区具有与框架序列所来源的种系免疫球蛋白基因中发现的那些序列相同的序列，或者CDR序列可以接枝到与种系序列相比含有一或多个突变的构架区上。例如，已经发现在某些情况下，在构架区内的突变残基对于维持或提高抗体的抗原结合能力是有益的(参见例如授予 Queen 等的美国专利 No. 5，530，101 ;5，585,089 ;5，693，762 和 6，180，370)。另一类型的可变区修饰是突变V1^P/或Vk CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基，从而改进目的抗体的一种或多种结合性质(例如亲合性)。可以进行定点诱变或PCR介导的诱变来引入突变，并且可以在本领域已知的体外或体内试验中评价对抗体结合的影响或其它感兴趣的功能性质。例如，可以突变本发明的抗体来产生文库，然后可以就与RTK的Ig样结构域，例如人Kit RTK的D4或D5结构域或VEGF受体的D7结构域，的结合对文库进行筛选。优选地，引入保守修饰(如以上讨论的)。突变可以是氨基酸置换、添加或缺失，但优选是置换。而且，一般⑶R区内不超过一个、两个、三个、四个或五个残基被改变。另一种类型的框架修饰包括突变构架区内、或者甚至一个或多个⑶R区内的一个或多个残基以去除T细胞表位，从而降低抗体潜在的免疫原性。该方法也称为“脱免疫(deimmunization) ”,并在Carr等人的美国专利公开No. 20030153043中更加详细地进行了描述。在框架或CDR区内进行的修饰之外或者替代以上修饰，本发明的抗体可以工程化以包含Fe区内的修饰，从而通常改变抗体的一种或多种功能性质，例如血清半衰期、补体结合、Fe受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。而且，本发明的抗体可以进行化学修饰(例如一个或多个化学部分可以附着于抗体)或者进行修饰以改变它的糖基化作用，而再改变抗体的一种或多种功能性质。在下文中更加详细地描述这些实施方式中的每一个。Fe区中 残基的编号是Kabat的EU索引的编号。在一种实施方式中，修饰CHl的铰链区从而改变(例如增加或减少)铰链区中半胱氨酸残基的数量。该方法在Bodmer等人的美国专利No. 5，677，425中进一步描述。改变CHl铰链区中半胱氨酸残基的数目例如以帮助轻链和重链的组装或者提高或降低抗体的稳定性。在另一实施方式中，使抗体的Fe铰链区突变以降低抗体的生物半衰期。更具体地说，将一个或多个氨基酸突变引入Fe铰链片段的CH2-CH3结构域界面区，使得抗体相对于天然的Fe铰链结构域的葡萄球菌A蛋白(SpA)结合具有受损的SpA结合。该方法在Ward等人的美国专利No. 6，165，745中进一步描述。在另一实施方式中，抗体经修饰以增加其生物半衰期。多种方法均可行。例如，如授予Ward的美国专利No. 6，277，375中描述的，可以引入一个或多个以下突变T252L、T254S、T256F。或者，为了提高生物半衰期，如在Presta等人的美国专利No. 5，869，046和6，121，022中所述，可以在CHl或CL区内改变抗体以包含从IgG的Fe区CH2结构域的两个环获得的补救受体(salvage receptor)结合表位。只要抗体与RTK的Ig样结构域的结合不受损，这些策略将是有效的。在再其它实施方式中，通过以不同的氨基酸残基来置换至少一个氨基酸残基而改变Fe区，以改变抗体的效应子功能。例如，选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸残基取代，从而抗体具有对效应子配体的改变的亲和性，但保持亲本抗体的抗原结合能力。其亲和性发生改变的效应子配体可以是例如Fe受体或补体的Cl成分。该方法在Winter的美国专利No. 5，624，821和5，648，260中有进一步的详细描述。在另一实例中，选自氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸残基置换，从而抗体具有改变的Clq结合和/或降低的或消除的补体依赖性细胞毒性(⑶C)。该方法在Idusogie等人的美国专利No. 6，194，551中进一步详细描述。在另一实例中，改变氨基酸位置231和239内的一个或多个氨基酸残基，从而改变抗体固定补体的能力。该方法在Bodmer等人的PCT公开WO 94/29351中进一步描述。在又一个实例中，通过修饰以下位置的一个或多个氨基酸来修饰Fe区以提高抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或提高抗体对Fe Y受体的亲和力238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438 或 439。该方法在 Presta 的 PCT 公开 WO 00/42072中进一步描述。人IgGl上与Fe Y Rl、Fe Y RH、Fe Y RIII和FcRn的结合位点已经作图，并且具有改进的结合的变异体已经描述(参见Shields，R.L.等(2001) T. Biol. Chem. 276 6591-6604)。位置256、290、298、333、334和339的特定突变显示出提高了对Fe Y RIII的结合。另外，以下结合突变体显示出提高了 Fe y RIII的结合T256A/S298A，S298A/E333A、S298A/K224A 和 S298A/E333A/K334A。在再另一实施方式中，如美国临时申请No. 60/957，271 (通过引用的方式将该专利以其全部内容并入本文)中描述的那样，通过引入半胱氨酸残基来修饰本发明抗体的C-末端。这样的修饰包括但是不局限于在全长重链序列的C-末端或其附近置换现有的氨基酸残基，以及将含有半胱氨酸的延伸段引入全长重链序列的C-末端。在优选实施方式中，含有半胱氨酸的延伸段包括序列丙氨酸-丙氨酸-半胱氨酸(从N-末端至C-末端)。在优选实施方式中，这样的C-末端半胱氨酸修饰的存在提供了结合伴体分子例如治疗剂或标记分子的位置。特别是，由于C-末端半胱氨酸修饰周到反应性硫醇基的存在可如下文详述的用于缀合使用二硫接头的伴体分子。用这样的方式结合抗体与伴体分子能够提高对连接的特定位点的控制。此外，通过在C-末端处或其附近引入连接位点，可以优化结合，从而降低或消除对抗体功能性质的干扰，并能够简化对缀合物制剂的分析和质量控制。在再另一实施方式中，抗体的糖基化作用被修饰。例如，可以产生无糖基化抗体(即抗体缺少糖基化)。可以改变糖基化作用以例如提高抗体对抗原的亲和性。这样的糖修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点而实现。例如，可以进行导致消除一个或多个可变区框架糖基化位点的一个或多个氨基酸置换，从而消除该位点的糖基化。这样的无糖基化可以增加抗体对抗原的亲和性。在授予Co等的美国专利No. 5，714，350和6，350, 861中进一步详细描述了这样的方法。在授予Hanai等人的美国专利7，214，775、授予Presta的美国专利No. 6，737，056、授予Presta的美国公开No. 20070020260、授予Dickey 等的 PCT 公开 No. W0/2007/084926、授予 Zhu 等人的 PCT 公开 No. W0/2006/089294和授予Ravetch的PCT公开No. W0/2007/055916中进一步详细描述了用于改变糖基化的其它方法，上述每一篇文献的全部内容均通过引用的方式并入本文。另外地或可选地，可以产生具有改变的糖基化类型的抗体，例如具有减少量的岩藻糖残基的低岩藻糖化(hypofucosylated)抗体或具有增加的对开(bisecting)GlcNac结构的抗体。已经证明这种改变的糖基化模式提高了抗体的ADCC能力。通过例如在具有改变的糖基化机构的宿主细胞中表达抗体可以实现这种糖修饰。具有改变的糖基化机构的细胞在本领域中有描述，并且可用作表达本发明的重组抗体的宿主细胞，从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺少岩藻糖基转移酶基因，FUT8 ( a (1,6)岩藻糖基转移酶)，从而在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在其糖类化合物上缺少岩藻糖。使用两个置换载体通过靶向破坏CH0/DG44细胞中的FUT8基因来产生Ms704、Ms705和MS709FUT8+细胞系。(参见Yamane等人的美国专利公开No. 20040110704 和 Yamane-Ohnuki 等(2004)Biotechnol Bioeng 87 :614-22) 作为另一、实例，Hanai等的EP I, 176，195描述了具有功能受损的FUT8基因(其编码岩藻糖转移酶)的细胞系，从而在这样的细胞系中表达的抗体通过减少或消除a-1，6键-相关的酶而表现出低岩藻糖化。Hanai等也描述了具有将岩藻糖添加至N-乙酰葡糖胺(其结合抗体的Fe区)的低的酶活性或不具有所述酶活性的细胞系，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL1662)。Presta的PCT公开WO 03/035835描述了变异CHO细胞系、Lecl3细胞，其具有降低的将岩藻糖连接到Asn(297)-连接的糖上的能力，也导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖化(也参见 Shields，R. L.等(2002) J. Biol. Chem. 277 :26733-26740)。 Umana 等的PCT公开WO 99/54342描述了工程化以表达糖蛋白-修饰的糖基转移酶(例如P (I,4)-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得在该工程化细胞系中表达的抗体表现出对开GlcNac结构增加,这引起所述抗体的ADCC活性增加(也参见Umana等(1999)Nat. Biotech. 17 =176-180) 可选地，所述抗体的岩藻糖残基可以使用岩藻糖苷酶切割。例如，岩藻糖苷酶ct-L-岩藻糖苷酶从抗体除去岩藻糖残基。(Tarentino, A. L.等(1975)Biochem. 14 :5516-23)。另外地或可选地，可以制备具有改变类型的糖基化的抗体，其中该改变涉及所述抗体的唾液酸化水平。这样的改变被描述于Dickey等的PCT公开W0/2007/084926号和Ravetch等的PCT公开W0/2007/055916号，两者都通过引用以其全部内容并入本文。例如，可使用利用唾液酸酶(诸如产脲节杆菌(Arthrobacter ureafacens)唾液酸酶)的酶促反应。这种反应的条件被一般地描述于美国专利5，831，077中，其通过引用以其全部内容由此并入。适当的酶的其它非限制性实例是神经氨糖酸苷酶和N-糖苷酶F，如分别在Schloemer 等 J. Virology, 15 (4)，882-893 (1975)中和在 Leibiger 等，Biochem J.，338,529-538(1999)中描述的。去唾液酸化抗体可以通过使用亲和层析进一步纯化。可选地，可使用增加唾液酸化水平的方法，例如通过使用唾液酸转移酶进行。这种反应的条件被一般地描述于 Basset 等，Scandinavian Journal of Immunology, 51 (3), 307-311 (2000)中。在本文中本发明考虑的另一种抗体修饰是聚乙二醇化。例如，抗体可以被聚乙二醇化，以例如增加所述抗体的生物(例如血清)半衰期。为使抗体聚乙二醇化，所述抗体或其片段通常在其中一个或多个PEG基团形成与所述抗体或抗体片段的连接的条件下与聚乙二醇(PEG)(诸如PEG的活性酯或醛衍生物)反应。优选地，聚乙二醇化经由与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行。如本文所使用，术语“聚乙二醇”意图包括已经用于衍生其它蛋白质的任何形式的PEG，诸如单(Cl-ClO)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方式，待乙二醇化的抗体是无糖基化抗体。用于蛋白质聚乙二醇化的方法是本领域已知的并且可以被应用于本发明的抗体。例如，参见Nishimura等的EP 0 154 316和Ishikawa等的EP 0 401 384。同样，这里描述的聚乙二醇化方法也适用如下所述的本发明的肽类分子。抗体片段和抗体模拟物本发明不限于传统的抗 体，而是可以通过利用抗体片段和抗体模拟物进行实施。如下文所详述的，各种抗体片段和抗体模拟物技术现在已经被开发出来并且在本领域中是广为人知的。尽管许多的这些技术，诸如结构域抗体、纳米体和UniBody，使用传统抗体结构的片段或对传统抗体结构的其它修饰，但仍存在采用结合结构的替代的技术，诸如Adnectin、亲和体、DARPin、抗运载蛋白、高亲合性多聚体和Versabody,尽管它们模拟传统的抗体结合，但是通过完全不同的机理产生并经由不同的机理起作用。这些替代结构的一些在 Gill 和 Damle (2006) 17 :653-658 中进行了综述。结构域抗体(dAb)是抗体的最小功能结合单元，相应于人抗体的重(VH)链或轻(VL)链的可变区。结构域抗体具有大约13kDa的分子量。Domantis已经开发出完全人VH和VL dAb的一系列大的和高度功能性的文库(在各文库中超过一百亿不同的序列)，并运用这些文库来选择特异于治疗靶标的dAb。与许多常规抗体相反，结构域抗体在细菌、酵母和哺乳动物细胞系统中良好地表达。通过参考美国专利6，291，158,6, 582，915,6, 593，081、6，172，197,6, 696, 245 ;美国专利申请 No. 2004/0110941 ;欧洲专利申请 No. 1433846 和欧洲专利 0368684 和 0616640 ;TO05/035572、W004/101790、W004/081026, W004/05882UW004/003019和W003/002609可获得结构域抗体和其制备方法的更多细节，上述文献每一篇通过引用以其全部内容并入本文.·纳米体是包含天然存在的重链抗体的独特结构性和功能性特性的源自抗体的治疗性蛋白质。这些重链抗体包含单一可变结构域(VHH)和两个恒定结构域(CH2和CH3)。重要的是，克隆的和分离的VHH结构域是具有原始重链抗体的完全的抗原结合能力的完全稳定的多肽。纳米体与人抗体的VH结构域具有高同源性，并可以被进一步人源化而没有任何活性损失。重要的是，纳米体具有低的致免疫能力，这已经在采用纳米体前导化合物的灵长类动物研究中得到了证实。纳米体将常规抗体的优点和小分子药物的重要特征相结合。像常规抗体一样，纳米体显示出高的靶特异性、对它们的靶的高亲合力和低的固有毒性。然而，如小分子药物一样，它们可以抑制酶并容易地到达受体裂缝(receptor cleft)。而且，纳米体极其稳定，可以通过除了注射之外的方式进行施用(例如，参见WO 04/041867，其通过引用以其全部内容并入本文)并易于制造。纳米体的其它优点包括由于它们的小尺寸而识别不常见的或隐藏的表位，从而以高亲合力、由于独特的三维结构而导致的选择性及药物形式灵活性结合到蛋白质靶的空腔或活性部位，因而调整半衰期和药物开发的容易度和速度。纳米体通过单一基因进行编码并在几乎所有的原核和真核宿主中高效产生，例如大肠杆菌(例如见u. S. 6，765，087，其通过引用以其全部并入本文)、霉菌(例如曲霉属(Aspergillus)或木霉属(Trichoderma))和酵母(例如酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、汉逊酵母属(Hansenula)或毕赤氏酵母属(Pichia))(例如见美国6，838，254，其通过引用以其全部并入本文)。该产生方法可扩大规模并已经产生出数公斤量的纳米体。因为纳米体相比于常规抗体表现出优异的稳定性，所以它们可以被配制成长贮存期的即用溶液。Nanoclone法(例如见WO 06/079372，其通过引用以其全部并入本文)是基于B细胞的自动化高通量选择的，用于产生针对期望靶的纳米体的专用方法，并且可被用于本发明。UniBody是另一种抗体片段技术，然而这个技术是基于去除IgG4抗体的铰链区。该铰链区的缺失产生大小基本上为常规IgG4抗体的一半并具有单价结合区而不是IgG4抗体的二价结合区的分子。也众所周知的是，IgG4抗体是惰性的，因此不与免疫系统相互作用，这对于其中不期望免疫应答的疾病的治疗可能是有利的，并且该优点传递到UniBody。例如，UniBody可起到抑制或沉默而不是杀死它们所结合的细胞的作用。另外，结合癌细胞的UniBody不刺激它们增殖。而且，因为UniBody的大小为常规IgG4抗体大小的一半左右，所以它们可以潜在有利的效力在较大的实体瘤上显示出更好的分布。UniBody以与整个IgG4抗体相似的速率从机体清除，并且能够以与全抗体相似的对抗原的亲合性结合。通过参考专利申请W02007/059782——其通过引用以其全部并入本文，可获得UniBody的更多细节。Adnectin分子是来源于纤连蛋白的一个或多个结构域的工程化结合蛋白。纤连蛋白在人体 内天然存在。它作为不溶性糖蛋白二聚物存在于细胞外基质中并还充当连接蛋白。它还以可溶的形式作为二硫连接的二聚体存在于血浆中。通过肝脏细胞(肝细胞)合成纤连蛋白的血浆形式,而通过软骨细胞、巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞和上皮的一些细胞产生 ECM 形式(见 Ward M.和 Marcey, D. , callutheran.edu/Academic_Programs/Departments/BioDev/omm/fibro/fib ro.htm)。如早先提及，纤连蛋白可天然地作为细胞粘附分子发挥其作用，或者它可通过在细胞外基质中进行接触而介导细胞的相互作用。通常，纤连蛋白由三个不同的蛋白质模块——I型、II型和III型模块——组成。对于纤连蛋白的结构或功能的综述，见 Pankov 和 Yamada (2002) J Cell Sci. ； 115 (Pt 20) =3861-3,Hohenester 和 Engel(2002) 21 :115_128，和 Lucena 等(2007)Invest Clin. 48 :249_262。在优选的实施方式中，adnectin分子通过改变由分布在两个P折叠之间的多个^链组成的天然蛋白质而衍生于纤连蛋白III型结构域。取决于起源的组织，纤连蛋白可包含多个III型结构域，其可以被表示为例如午113、￥113、￥113等。uiFr^结构域包含整联蛋白结合基序，并进一步包含连接所述P链的三个环。这些环可以被认为相当于IgG重链的抗原结合环，并且它们可以通过下文讨论的方法加以改变以特异性结合目标靶，例如RTK的Ig样结构域，诸如人Kit RTK的D4或D5结构域或VEGF受体的D7结构域。优选地，可用于本发明的目的的纤连蛋白III型结构域是表现出与编码纤连蛋白III型分子的结构的序列(其可从 Protein Data Bank (PDB, rcsb. org/pdb/home/home. do)以登录代码lttg获取)具有至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的序列同一性的序列。Adnectin分子还可来源于kiFM相关分子的聚合物，而不是简单的单体uiFr^结构。尽管天然kiFM结构域通常结合整联蛋白，但经改装变成adnectin分子的wFM蛋白被改变以结合目标抗原，例如RTK的Ig样结构域，诸如人Kit的D4或D5结构域。在一个实施方式中，对uiFr^分子的改变包括对P链的至少一个突变。在优选的实施方式中，连接kiFM分子的P链的环区被改变以结合人受体酪氨酸激酶(例如VEGF受体或III型受体酪氨酸激酶，诸如人Kit)的Ig样结构域。10Fn3中的改变可通过本领域已知的任何方法进行，包括但不限于易错PCR、定点诱变、DNA改组或在本文提及的其它类型的重组诱变。在一个实例中，编码wFM序列的DNA的变异体可以直接体外合成，并且之后在体外或体内转录和翻译。可选地，天然kiFM序列可使用标准方法从基因组分离或克隆(如在例如美国专利申请No. 20070082365中进行的)，然后使用本领域已知的诱变方法进行突变。在一个实施方式中，靶蛋白(例如，RTK的Ig样结构域如Kit RTK的D4或D5结构域或VEGF受体的D7结构域)可以固定在固相载体上，例如柱树脂或微孔滴定板中的孔。然后，将靶与潜在结合蛋白的文库接触。该文库可包含通过kiFM序列的诱变/随机化或通过10Fn3环区(不是P链)的诱变/随机化而来源于野生型wFM的wFM克隆或adnectin分子。在优选的实施方式中，所述文库可以是通过Szostak等的美国专利申请No. 09/007, 005和09/247，190、Szostak等的W0989/31700 以及Roberts & Szostak(1997) 94 :12297-12302描述的技术产生的RNA-蛋白质融合文库。所述文库也可以是DNA-蛋白质文库(例如，如描述于Lohse，美国专利申请No. 60/110，549、美国专利申请No. 09/459，190和WO 00/32823)。然后，所述融合文库与固定的靶(例如人Kit RTK的D4或D5结构域或人VEGF受体的D7结构域)一起温育，并洗涤固相载体以除去非特异性结合的成分。然后，在严格条件下洗脱紧密结合物，并且使用PCR来扩增遗传信息或产生结合分子的新的文库，以重复所述过程(有或者没有另外的诱变)。可以重复选择/诱变过程，直到获得对靶具有足够的亲合性的结合物。用于本发明的Adnectin分子可以使用Adnexus (Briston-Myers Squibb公司)采用的PROfusion 技术进行工程化。PROfusion技术是基于上文所述的技术建立的(例如Roberts& Szostak(1997)94 =12297-12302) 产生改变的uiFr^结构域的文库和选择可用于本发明的适当结合物的方法被充分描述于下列美国专利和专利申请文件中并通过引用并入本文美国专利 7，115，396,6, 818，418,6, 537，749,6, 660，473,7, 195，880,6, 416，950、6，214，553、6623926、6，312，927、6，602，685、6，518，018、6，207，446、6，258，558、6，436，665,6, 281，344,7, 270，950,6, 951，725,6, 846，655,7, 078，197,6, 429，300、7， 125，669、6，537，749、6，660，473 号和美国专利申请 20070082365、20050255548、20050038229、20030143616、20020182597、20020177158、20040086980、20040253612、20030022236、20030013160、20030027194、20030013110、20040259155、20020182687、20060270604、20060246059、20030100004、20030143616 和 20020182597 号。纤连蛋白 III型结构域(诸如kiFM)的多样性的产生及随后的选择步骤可以使用本领域已知的其它方法进行，诸如曬菌体展示、核糖体展示或酵母表面展示，例如Lipov§ek等(2007) Journal of Molecular Biology 368 :1024-1041 ；Sergeeva 等(2006)Adv Drug Deliv Rev. 58 1622-1654 ;Petty 等(2007)Trends Biotechnol. 25 :7-15 ;Rothe 等(2006)Expert OpinBiol Ther. 6 :177-187 ;和 Hoogenboom(2005) Nat Biotechnol. 23 :1105_1116。本领域普通技术人员应该理解的是，上文引用的参考文献中的方法可用来从优选的kiFM结构域之外的蛋白质衍生抗体模拟物。可用于经由上述引用的方法产生抗体模拟物的其他分子非限制性地包括人纤连蛋白模块1FnS-9FnS和nFn3_17Fn3以及来自非人类动物和原核生物的相关Fn3模块。此外，也可使用来自与kiFM具有序列同源性的其它蛋白
质-诸如腱生蛋白(tenascin)和粗纤维调节素(undulin)-的Fn3模块。具有免疫球
蛋白样折叠(但是具有与Vh结构域无关的序列)的其它示例性蛋白质包括N-钙粘蛋白、ICAM-2、肌联蛋白(titin)、GCSF受体、细胞因子受体、糖苷酶抑制剂、E-钙粘蛋白和抗生素色蛋白。具有相关结构的其它结构域可以来源于髓磷脂膜粘附分子P0、CD8、CD4、CD2、I类MHC、T细胞抗原受体、⑶I、VCAM-I的C2和I-组结构域、肌球蛋白-结合蛋白C的I-组免疫球蛋白折叠、肌球蛋白-结合蛋白H的I-组免疫球蛋白折叠、端蛋白(telokin)的I-组免疫球蛋白折叠、telikin、NCAM、twitchin、神经胶质蛋白、生长激素受体、红细胞生成素受体、催乳素受体、GC-SF受体、干扰素-Y受体、^ -半乳糖苷酶/葡糖苷酸酶、^ -葡糖苷酸酶和转谷氨酰胺酶。可选地，包括一个或多个免疫球蛋白样折叠的任何其他的蛋白质可以用于产生adnectin样结合成分。这样的蛋白质可以例如使用程序SCOP加以确定(Murzin等，J. Mol. Biol. 247 :536(1995) ；Lo Conte 等，Nucleic Acids Res. 25 :257 (2000)。适体是本发明包括的另一种类型的抗体模拟物。适体通常是小的核苷酸聚合物，其结合特定的分子靶。适体可以是单链或双链核酸分子(DNA或RNA)，尽管DNA基适体最通常是双链的。对于适体核酸没有限定的长度；然而，适体分子最常见具有在15和40个核苷酸之间的长度。适体经常形成复合三维结构，其决定它们对靶分子的亲合性。适体相比于简单的抗体可以提供许多优势，主要是因为它们可以几乎完全在体外被工程化和被扩增。而且，适体通常很少或不诱导免疫应答。适体可以使用各种技术产生，但最初使用体外选择(Ellington和Szostak.(1990)Nature. 346 (6287) :818-22)和SELEX法(通过指数富集导致系统性配体进化)(Schneider等1992. J Mol Biol. 228(3) :862-9)——其内容通过引用并入本文——进行开发。制备和使用适体的其它方法已经公开，包括Klussmann. The Aptamer Handbook Functional Oligonucleotides and Their Applications. ISBN :978-3-527-31059-3 ；Ulrich 等 2006. Comb Chem High Throughput Screen 9(8) :619-32 ;Cerchia 和 deFranciscis. 2007. Methods Mol Biol. 361 :187-200 ;Ireson 和 Kelland. 2006. Mol CancerTher. 2006 5(12) :2957-62 ;美国专利 5582981 ；5840867 ；5756291 ；6261783；6458559 ；5792613 ；6111095 号；以及美国专利申请 11/482，671 ；11/102, 428 ；11/291, 610 ；和10/627，543号，其都通过引用并入本文。SELEX法明显是最流行的并且以三个基本步骤进行。首先，针对与特定分子靶的结合对候选核酸分子的文库进行挑选。其次，从非结合物分离出对于所述靶具有足够亲合性的核酸。第三，扩增结合的核酸，形成第二文库，并且重复该过程。在各次重复时，选择对于靶分子具有越来越高的亲合性的适体。SELEX法被更充分描述于通过引用并入本文的下列出版物中=Bugaut 等 2006. 4(22) :4082-8 ；Stoltenburg 等 2007 Biomol Eng. 200724(4)381-403 ;和 Gopinath. 2007. Anal Bioanal Chem. 2007. 387(1) :171_82。本发明的“适体”也包括由肽而不是核苷酸制成的适体。肽适体与核苷酸适体具有一些共同的性质(例如，小的尺寸和以高亲合性结合靶分子的能力)并且它们可以通过与用于产生核苷酸适体的选择法具有相似原理的选择法产生，例如Baines和Colas. 2006.Drug DiscovToday. 11(7-8) :334-41 ;和 Bickle 等 2006. Nat Protoc. I (3) :1066_91，其通过引用并入本文。亲和体分子表示来源于葡萄球菌蛋白A的IgG结合结构域之一的基于58个氨基酸残基蛋白质结构域的一类新的亲合性蛋白质。这一种三螺旋束结构域已经用作构建组合噬菌粒文库的支架，可使用噬菌体展示技术从该文库选择靶向于期望分子的亲和体变体(Nord K, Gunneriusson E, Ringdahl J, Stahl S, Uhlen M, Nygren PA,Binding proteinsselected from combinatorial libraries of an a -helical bacterial receptordomain, Nat Biotechnol 1997 ； 15 :772-7. Ronmark J, Gronlund H, Uhlen M, Nygren PA,Human immunoglobulin A(IgA)-specific ligands from combinatorial engineering ofprotein A, Eur J Biochem 2002;269:2647-55)。与它们的低分子量(6kDa)结合，亲和体分子的简单、稳定的结构使得它们适于各式各样的应用，例如作为检测试剂(Ronmark J，Hansson M,Nguyen T^,Construction and characterization of affibody-Fc chimerasproduced in Escherichia coli, J Immunol Methods 2002 ；261 :199-211),以及用于抑制受体相互作用(Sandstorm K, Xu Z, Forsberg G, Nygren PA, Inhibition of theCD28-CD80 co-stimulation signal by a CD28_binding Affibody ligand developed bycombinatorial protein engineering,Protein Eng 2003 ; 16 :691-7)。通过参考美国专利No. 5，831，012 (其通过引用以其全部并入本文)可获得亲和体和其制备方法的更多细节。 DARPin(设计的锚蛋白重复序列蛋白质)是抗体模拟DRP(设计的重复序列蛋白质)技术的一个实例，该技术已经被开发为利用非抗体多肽的结合能力。重复序列蛋白质如锚蛋白或富亮氨酸重复序列蛋白质是遍在的结合分子，其在细胞内和细胞外存在，这与抗体不同。它们的独特的模块结构的特征在于重复结构单元(重复序列)，其堆叠在一起以形成显示出可变的和模块的靶-结合表面的细长重复序列结构域。基于该模块性，具有高度多样化结合特异性的多肽的组合文库可以被产生。该策略包括展示可变表面残基的自相容性重复序列的共有设计以及它们随机装配成重复序列结构域。DARPin可以在细菌表达系统中以很闻的广量广生并且它们属于已知的最稳定的蛋白质。对宽范围的靶蛋白质一包括人受体、细胞因子、激酶、人蛋白酶、病毒和膜蛋白质——具有高度特异性、高亲合性的DARPin已经被选择。可以获得具有单数位纳摩尔至皮摩尔范围内的亲合性的DARPin。DARPin已经用于各种各样的应用，包括ELISA、夹心ELISA、流式细胞术分析(FACS)、免疫组织化学(IHC)、芯片应用、亲和纯化或蛋白质印迹。DARPin也已证明在细胞内空间具有高度的活性，例如作为融合于绿色荧光蛋白(GFP)的胞内标记蛋白。DARPin被进一步用于以PM范围内IC50抑制病毒进入。DARPin不仅对于阻断蛋白质相互作用是理想的，而且对于抑制酶也是理想的。蛋白酶、激酶和转运蛋白已经被成功抑制，最经常变构性抑制模式。在肿瘤上的极快和特异性富集以及非常有利的肿瘤-血液比率使得DARPin很适于体内诊断或治疗方法。关于DARPin及其他DRP技术的其它信息可发现于美国专利申请公开No. 2004/0132028和国际专利申请公开No. WO 02/20565，两者都通过弓I用以其全部内容并入本文。抗运载蛋白是另外的抗体模拟技术，然而，在这种情况下，结合特异性源自于脂钙蛋白(Iipocalin)——在人组织和体液中天然存在且大量表达的低分子量蛋白质家族。月旨钙蛋白已进化为执行与化学上敏感的或不溶性的化合物的生理运输和储存有关的许多体内功能。脂钙蛋白具有稳固的内在结构，其包含高度保存的P桶，该P桶在所述蛋白质一个末端支持四个环。这些环形成结合袋的入口，并且在所述分子的这个部分的构象差异造成在各个脂钙蛋白之间结合特异性的变化。尽管由保守P折叠框架支持的超变环的整体结构类似于免疫球蛋白，但是脂钙蛋白与抗体在大小、由160-180个氨基酸(其比单一免疫球蛋白结构域稍大)的单一多肽链组成方面显著不同。脂钙蛋白被克隆并且它们的环进行工程化以产生抗运载蛋白。结构上多样的抗运载蛋白的文库已经被产生，并且抗运载蛋白展示允许对结合功能进行选择和筛选，之后在原核或真核系统中表达和产生用于进一步分析的可溶性蛋白质。研究已经成功地证明，可以开发对于几乎任何可以被分离的人靶蛋白特异性的抗运载蛋白，并且可以获得在纳摩尔或以上的范围内的结合亲合性。抗运载蛋白还可以被设计成双革巴向蛋白质,所谓的Duocalin。Duocalin结合在使用标准制造方法容易产生的一个单体蛋白质中的两个独立的治疗靶标上，同时保持靶特异性和亲合性，而无论它的两个结合结构域的结构取向如何。通过单一分子对多个靶的调节在已知涉及一种以上病因的疾病中是特别有利的。而且，二价或多价结合形式如Duocalin在祀向疾病中的细胞表面分子、介导对信号转导途径的激动效应或诱导经由细胞表面受体的结合和成簇而增强的内化效应方面具有显著的能力。而且,Duocalin的高内在稳定性与单体抗运载蛋白相当，从而为Duocalin提供灵活的制刘和输送可能。关于抗运载蛋白的其它信息可发现于美国专利7，250，297和国际专利申请公布No. WO 99/16873中，两者都通过引用以其全部内容并入本文。可用于本发明的另一个抗体模拟技术是高亲合性多聚体。高亲合性多聚体是通过体外外显子改组和噬菌体展示从人的细胞外受体结构域的大家族发展而来，从而产生具有结合和抑制性质的多结构域蛋白。连接多个独立的结合结构域已经表明产生亲合力(avidity),并且相比于常规的单一表位结合蛋白质,引起亲合性和特异性的改善。其它潜在优点包括在大肠杆菌中多靶特异性分子的简单和有效的产生、热稳定性改善和蛋白酶抗性。已经获得针对各种靶的、具有亚纳摩尔亲合性的高亲合性多聚体。关于高亲合性多聚体的其它信息可发现于美国专利申请公开2006/0286603、2006/0234299、2006/0223 114、2006/0 17783 I、2006/0008844、2005/022 1384、2005/0164301、2005/0089932、2005/0053973、2005/0048512、2004/0175756 号，其全部都通过引用以其全部内容并入于此。Versabody是可用于本发明的另一个抗体模拟技术。Versabody是具有> 15%的半胱氨酸的3_5kDa的小蛋白质，其形成高二硫化密度的骨架，取代典型蛋白质具有的疏水核心。用少量二硫化物置换大量疏水性氨基酸(包括疏水核心)产生较小、更亲水(较少聚集和非特异性结合)、更耐蛋白酶和更耐热的蛋白质，并且所述蛋白质具有较低密度的T细胞表位，因为对MHC呈递贡献最大的残基是疏水性的。这四个性质已知全部影响免疫原性，并且预期它们一起引起大的免疫原性降低。Versabody的灵感来自通过水蛭、蛇、蜘蛛、蝎子、蜗牛和海葵产生的天然可注射生物药物，其已知出乎意料地表现出低免疫原性。从选择的天然蛋白质家族开始，通过设计和通过筛选尺寸、疏水性、蛋白水解抗原加工和表位密度得以最小化至远低于天然可注射蛋白质的平均水平。给定Versabody的结构，这些抗体模拟物提供多种多样的形式，包括多价、多特异性、半衰期机理的多样性、组织祀向模块和抗体Fe区的缺失。而且,Versabody在大肠杆菌中以高产率制造，并且因为它们的亲水性和小尺寸，Versabody高度可溶并可以配制成高浓度。Versabody是异常耐热的(它们可以被煮沸)，因而提供延长的贮存期。关于Versabody的其它信息可发现于美国专利申请公开No. 2007/0191272，其通过引用以其全部内容由此并入。
SMIP (Small Modular ImmunoPharmaceuticals-Trubion Pharmaceuticals)被工程化以保持并优化靶结合、效应子功能、体内半衰期和表达水平。SMIPS由三个不同的模块结构域组成。首先，它们包含可以由赋予特异性的任何蛋白质(例如细胞表面受体、单链抗体、可溶蛋白质等等)组成的结合结构域。其次，它们包含在结合结构域和效应子结构域之间充当柔性接头，以及帮助控制SMIP药物的多聚化的铰链结构域。最后，SMIP包含可以来源于各种分子的效应子结构域，包括Fe结构域或其它特别地设计的蛋白质。所述设计的模块化(其允许采用各种不同的结合、铰链和效应子结构域简单地构建SMIP)提供了快速和个性化的药物设计。关于SMIP的更多信息，包括如何设计它们的实例，可以发现于Zhao等(2007)Blood 110 :2569-77 和下列美国专利申请 20050238646、20050202534、20050202028、20050202023,20050202012,20050186216,20050180970 和 20050175614 号。
上文提供的抗体片段和抗体模拟物技术的详细描述不意图是可被用于本说明书的全部技术的完全列表。例如，并且非限制性地，各种另外的技术，包括可选的基于多肽的技术，诸如在 Qui 等，Nature Biotechnology, 25 (8) 921-929 (2007)(通过引用以其全部内容由此并入)中概述的互补决定区的融合，以及基于核酸的技术，如描述于美国专利 5，789，157,5, 864，026,5, 712，375,5, 763，566,6, 013，443,6, 376，474,6, 613，526、6，114，120、6，261，774和6，387,620(全部通过引用由此并入)中的RNA适体技术，可用于本发明中。杭体的物理件质本发明的抗体，其结合RTK的Ig样结构域，可以进一步通过各种物理特性加以表征。基于这些物理特性，各种测定方法可用来检测和/或区别不同类的抗体。在一些实施方式中，本发明的抗体可以在轻链或重链可变区中包含一个或多个糖基化位点。一个或多个糖基化位点在可变区中的存在可以导致抗体的免疫原性增加或由于抗原结合改变而引起抗体的pK改变(Marshall等(1972) Annu Rev Biochem 41 :673-702 ；Gala FA和Morrison SL(2004) J Immunol 172 5489-94 ;Wallick等(1988) J Exp Medl68 1099-109 ；Spiro RG(2002)Glycobiology U:43R_56R ;Parekh 等(1985)Nature 316 452-7 ;Mimura 等(2000) Mol Immunol 37 :697-706) 已知糖基化在包含 N-X-S/T 序列的基序上发生。使用Glycoblot测定可检测可变区糖基化，该测定切割抗体以产生Fab，然后使用测量高碘酸盐氧化和希夫碱形成的测定方法检测糖基化。可选地，可以使用Dionex薄层色谱(Dionex-LC)检测可变区糖基化，其从Fab切割糖以成为单糖并分析各种糖含量。在一些情况下，可优选具有不包含可变区糖基化的抗体。这可以通过选择在可变区不包含糖基化基序的抗体或者通过使用本领域熟知的标准技术在糖基化基序内使残基突变加以实现。各抗体具有独特的等电点(pi)，但是通常抗体将落在6和9. 5之间的pH范围内。IgGl抗体的pi通常落入7-9. 5的pH范围内，而IgG4抗体的pi通常落入6-8的pH范围内。抗体可具有在该范围之外的Pi。尽管效应通常是未知的，但推测具有在正常范围之外的Pl的抗体可能在体内条件下产生一些展开和不稳定性。可以使用毛细管等电聚焦分析检测等电点，所述测定建立PH梯度并可利用激光聚焦以提高准确度(Janini等(2002)Electrophoresis 23 :1605-11 ;Ma 等(2001) Chromatographia 53 S75-89 ;Hunt 等(1998)J Chromatogr A _ :355-67)。在一些情况下，优选具有包含落于正常范围内的pi值的抗体。这可以通过选择具有在正常范围内的Pl的抗体或者通过使用本领域熟知的标准技术突变带电表面残基加以实现。
各抗体具有作为热稳定性指标的解链温度(Krishnamurthy R和ManningMC(2002)Curr Pharm Biotechnol 2:361-71)。较高的热稳定性表示体内总体抗体稳定性更高。使用诸如差示扫描量热法的技术可以测量抗体的熔点(Chen等(2003)Pharm Res迪1952-60 ;Ghirlando 等(1999) Immunol Lett 68 :47-52) Tmi 表示抗体最初展开的温度。Tm2表示抗体完全展开的温度。通常，优选的是，本发明的抗体的Tmi大于60°C、优选大于65°C、甚至更优选大于70°C。可选地，可以使用圆二色性测量抗体的热稳定性(Murray等(2002)J. Chromatogr Sci 40 :343-9)。在优选的实施方式，可以期望不迅速地降解的抗体。可以使用毛细管电泳(CE)和MALDI-MS测量抗体的断裂，如本领域充分了解的(Alexander AJ和Hughes DE (1995) AnalChem 67 :3626-32)。在另一个优选的实施方式中，选择具有最小聚集效应的抗体。聚集可能导致引发不需要的免疫应答和/或导致改变的或不利的药物代谢动力学性质。通常，具有25%或以下的聚集的抗体是可接受的，优选20%或以下，甚至更优选15%或以下，甚至更优选10%或以下并且甚至更优选5%或以下。可以通过本领域熟知的几种技术测量聚集，包括尺寸排阻柱(SEC)高效液相色谱法(HPLC)和光散射以鉴定单体、二聚体、三聚物或多聚体。本发明多克隆抗体的制备本发明的多克隆抗体可以通过本领域熟知的多种技术产生。多克隆抗体源自于不同的B细胞系，因此可识别同一抗原上的多个表位。通常通过用目标抗原(例如RTK的Ig样结构域，诸如人Kit的D4或D5结构域或人VEGF的D7结构域)免疫适当的哺乳动物产生多克隆抗体。经常被用来产生多克隆抗体的动物是鸡、山羊、豚鼠、仓鼠、马、小鼠、大鼠、绵羊和最常用的兔子。在下文的实施例14中，通过用Kit的第四(D4)或第五(D5)Ig样结构域或Kit的完整胞外域免疫兔子产生多克隆抗Kit抗体。产生多克隆抗体的标准方法是本领域广泛熟知的，并可以与本发明的方法结合(例如research, cm. utexas. edu/bkitto/Kittolabpage/Protocols/Immunology/PAb. html ；美国专利 4，719，290、6，335，163、5，789，208,2, 520，076,2, 543，215和3，597，409号，其完整内容通过引用并入本文)。本发明的单克隆抗体的制备本发明的单克隆抗体(mAb)可以通过多种技术产生，包括常规单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein (1975) Nature 256 :495的标准体细胞杂交技术。尽管体细胞杂交法是优选的，但原则上，其它产生单克隆抗体的技术可以被使用，例如B淋巴细胞的病毒性或致癌性转化。应该注意到，抗体(单克隆或多克隆)或其抗原结合部分可以针对RTK的Ig样结构域、更优选人Kit RTK的D4或D5结构域或VEGF受体的D7结构域上的任何表位而产生，或者针对在本文论述的共有序列而产生，或者针对在本文描述的任何构象、非连续或线性表位而产生。本领域已知的几种方法可用于特异性选择特异性结合目标非连续表位的抗体或其抗原结合片段。例如，在通过引用并入本文的美国公开No. 2005/0169925中公开的技术允许选择结合蛋白质序列内两个不同的肽的抗体。这样的方法可根据本发明用于特异性靶向于在本文公开的构象和非连续表位。如果构象表位是蛋白质二级结构，这样的结构通常很容易在较小的肽(例如<50个氨基酸)中形成。因此，用较小的肽免疫动物可以捕获一些构象表位。可选地，包含构象表位的两个小肽(例如表5中确定的肽)可以经由柔性、接头(例如，聚乙二醇或一段极性的、不带电的氨基酸)连接。所述接头允许肽试探各种相互作用取向。采用这种构建体进行免疫，继之以适当的筛选，可允许鉴定针对构象表位的抗体。在优选的实施方式中，通过用RTK的特定结构域(例如，Kit胞外域的结构域4或结构域5或VEGF受体的D7结构域)免疫动物，接着筛选结合目标表位的抗体，可以产生针对特定构象或线性表位的肽。在一个实施方式中，冷冻电镜术(Jiang等(2008)Nature451,1130-1134 Joachim(2006) Oxford University Press ISBN :0195182189)可用来鉴定由本发明的抗体或抗原结合片段结合的表位。在另一个实施方案中，RTK或其结构域可以与结合的抗体或其抗原结合片段一起结晶并通过X-射线晶体衍射法分析，以确定被结合的精确表位。此外，可以通过用来自小鼠或另一个物种的相应序列替换RTK序列的部分对表位进行作图。针对目标表位的抗体选择性地结合人序列区，因此，有可能对靶表位进行顺序作图。该基于嵌合体的表位作图技术已经成功地用于鉴定各种情况下的表位(参见Henriksson 和 Pettersson(1997)Journal of Autoimmunity. 10(6) :559-568 ;Netzer 等(1999)J Biol Chem. 1999 Apr 16 ；274(16) :11267-74 ;Hsia等(1996)Mol. Microbiol. 19，53-63，其完整内容通过引用并入本文)。
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据认为，靶RTK(例如Kit RTK或VEGF受体)中的目标表位未被糖基化。然而，如果目标RTK被糖基化，抗体或其抗原结合部分(及本发明的其他成分)可被产生以使得它们结合有关的氨基酸和/或糖残基。例如，本领域已知Kit蛋白质具有最少10个潜在的 N-连接糖基化位点。(Morstyn, Foote, Lieschke (2004)Hematopoietic GrowthFactors in Oncology Basic Science and Clinical Therapeutics. Humana Press. ISBN 1588293025)。进一步认为，Kit可表现出0-连接糖基化以及与唾液酸残基的连接(WypychJ等(1995) Blood. 85 (I) :66-73)。因此，本发明考虑，抗体或其抗原结合部分(及本发明的其他成分)可被产生以使得它们也结合可以连接于在本文鉴定的任何表位的糖残基。出于该目的，可以在动物细胞中产生抗原性目标肽以使得它被适当糖基化，并且然后糖基化的抗原肽可用于免疫动物。产生糖基化肽的适当的细胞和技术是本领域已知的并在下文进一步描述(参见例如，可从 GlycoFi, Inc.，Lebanon, NH and Bioffa ；Princeton, NJ 获得的技术)。可使用任何标准方法诸如等电点聚焦(IEF)、酸水解(以确定单糖组成)、化学或酶促裂解和质谱法(MS)鉴定聚糖而检测肽的适当糖基化。也可使用由Procognia(procognia.com)提供的技术——其使用基于植物凝血素的阵列来加速聚糖分析。特别地，可以使用如还原性碱性裂解或“ P -消除”、肽作图、液相色谱和质谱或这些技术的任何组合的技术检测0-糖基化。用于制备杂交瘤的优选的动物系统是鼠系统。在小鼠中产生杂交瘤是非常完善的方法。免疫方案和分离用于融合的免疫脾细胞的技术是本领域已知的。融合伴体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合方法也是已知的。本发明的嵌合或人源化抗体可以基于如上所述制备的鼠单克隆抗体的序列进行制备。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以使用标准分子生物学技术从感兴趣的的鼠杂交瘤获得并工程化以包含非鼠(例如人)的免疫球蛋白序列。例如，为产生嵌合抗体，可以使用本领域已知的方法(例如见Cabilly等的美国专利No. 4,816, 567)将鼠可变区连接到人恒定区。为产生人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入人框架中(例如，见Winter的美国专利5，225，539和Queen等的美国专利5，530，101,5, 585,089、5，693，762和6，180, 370)。可选地，在已知人和非人序列的情况下，可以在DNA或蛋白水平设计人源化抗体。这样的抗体可以直接进行化学合成，或者DNA可以被合成并进行体外或体内表达以产生人源化抗体。在优选的实施方式中，本发明的抗体是人单克隆抗体。可以使用携带部分人免疫系统而不是小鼠系统的转基因或转染色体小鼠产生针对RTK的Ig样结构域(例如Kit的D4或D5结构域或VEGF受体的D7结构域)的这类人单克隆抗体。这些转基因和转染色体小鼠包括在本文被分别称为HuMAb小鼠和KM mice 的小鼠，并且在本文被统称为“人Ig小鼠”。HuMAb mouse (Medarex, Inc.)包含编码未重排的人重链(U和Y )和k轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座(miniloci)，连同灭活内源性ii和K链基因座的靶向突变(见例如Lonberg等(1994)Nature 368(6474) :856-859)。因此，所 述小鼠表现出小鼠IgM或K的表达减少，并且响应于免疫时引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生高亲合性人IgGK单克隆(Lonberg，N.等(1994)，同上；在 Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113 :49-101 中综述；Lonberg, N.和 Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13 :65-93,以及 Harding, F.和Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 7M :536-546)。HuMab 小鼠的制备和使用以及这样的小鼠携带的基因组修饰被进一步描述在Taylor, L.等(1992)Nucleic Acids Research20 :6287-6295 ；Chen, J.等(1993)International Immunology & :647-656 ;Tuaillon 等(1993)Proc.Natl. Acad. Sci. USA 90 :3720-3724 ；Choi 等(1993)Nature Genetics 4 117-123 ；Chen, J.等(1993)EMBO J. U:821-830 ;Tuaillon 等(1994)I. Immunol. 152 2912-2920 ；Taylor, L.等(1994) International Immunology 6 :579-591 ；和 Fishwild，D.等(1996) Nature Biotechnology 14 :845-851中，其全部内容都通过引用明确地由此并入。进一步参见美国专利 5，545，806 ;5，569，825 ;5，625，126 ;5，633，425 ;5，789，650 ；5，877，397 ;5，661，016 ;5，814，318 ;5，874，299 ;和 5，770，429，其全部授予 Lonberg 和 Kay ；授予 Surani 等的美国专利 5，545，807 ;PCT 公开 WO 92/03918,WO 93/12227,WO 94/25585、WO 97/13852,WO 98/24884 和 WO 99/45962，其全部授予 Lonberg 和 Kay ;和授予 Korman 等的 PCT 公开 WO 01/14424。在另一个实施方式中，可以使用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠(如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠)产生本发明的人抗体。这类小鼠，在本文称为“KM mice ”，被详细描述于授予Ishida等的PCT公开WO 02/43478中。更进一步，可选择的表达人免疫球蛋白基因的转基因动物系统在本领域中是可获得的，并可用于产生本发明的抗体。例如,称为Xenomouse (Abgenix, Inc.)的可选转基因系统可被使用；这样的小鼠被描述于例如授予Kucherlapati的美国专利5，939，598、6,075，181,6, 114，598,6, 150，584 和 6，162,963 中。而且，可选择的表达人免疫球蛋白基因的转染色体动物系统在本领域中是可获得的，并可用于产生本发明的抗体。例如，携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠，称为“TC小鼠”，可以被使用；这类小鼠被描述于Tomizuka等(2000)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 97 :722-727中。而且，携带人重链和轻链转染色体的母牛已经在本领域中进行了描述(Kuroiwa 等(2002)Nature Biotechnology 20 :889-894)并且可用于产生本发明的抗体。
本发明的人单克隆抗体还可以使用用于筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法加以制备。用于分离人抗体的这类噬菌体展示方法在本领域中被建立。例如，参见授予Ladner等的美国专利5，223，409,5, 403，484和5，571，698号；授予Dower等的美国专利 5，427，908 和 5，580，717 号；授予 McCafferty 等的美国专利 5，969，108 和 6，172，197号；以及授予 Griffiths 等的美国专利 5,885, 793,6, 521,404,6, 544，731,6, 555，313、6，582，915 和 6，593，081 号。本发明的人单克隆抗体还可以使用SCID小鼠进行制备，其中人免疫细胞已经被重构以使得在免疫时可以产生人抗体应答。这样的小鼠被描述在例如授予Wilson等的美国专利 5，476，996 和 5， 698，767 中。在另一个实施方式中，本发明的抗体可以使用熟知的噬菌体展示技术产生，如描述于 Marks，J. D.等((1991) J. Mol. Biol. 222，581)，Nissim，A.等((1994) EMBO J. 13，692)以及美国专利 6，794，132、6562341、6057098、5821047 和 6512097 中。在进一步的实施方式中，本发明的抗体可使用酵母细胞表面展示技术进行寻找，如在例如美国专利6，423，538,6, 300，065,6, 696，251,6, 699，658号中所描述的。制备本发明人类单克隆抗体的杂交瘤的产生为产生制备本发明的人单克隆抗体的杂交瘤，来自免疫小鼠的脾细胞和/或淋巴结细胞可以被分离并且融合到适当的无限增殖化细胞系，如小鼠骨髓瘤细胞系。可以对得到的杂交瘤进行抗原特异性抗体产生的筛选。例如，可以采用50% PEG将来自免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬液融合于六分之一数目的P3X63-Ag8. 653非分泌性小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1580)。可选地，可以使用基于电场的电融合法，使用CytoPulse大室细胞融合电感受器(CytoPulse Sciences, Inc. , Glen Burnie Maryland)对来自免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬液进行融合。在平底微孔滴定板上以大约2x IO5接种细胞，接下来在含有20%胎儿克隆血清、18% “653”条件培养基、5% origen(IGEN)、4mML-谷氨酰胺、ImM丙酮酸钠、5mM HEPES、0. 055mM 2-巯基乙醇、50单位/ml青霉素、50mg/ml链霉素、50mg/ml庆大霉素和IX HAT (Sigma; HAT在融合之后24小时添加)的选择培养基中培养两周。在大约两周之后，可以在HAT被替换为HT的培养基中培养细胞。然后，可以通过ELISA对各细胞进行人单克隆IgM和IgG抗体筛选。一旦大规模的杂交瘤生长发生，则通常可以在10-14天之后观察培养基。分泌抗体的杂交瘤可以被重新接种，再次筛选，并且如果仍然是人IgG阳性的，则单克隆抗体可以通过有限稀释进行至少两次分种。然后，体外培养稳定的亚克隆，以在组织培养基中产生少量的用于鉴定的抗体。为纯化人单克隆抗体，可以将选择的杂交瘤在两升旋转烧瓶中培养以用于单克隆抗体纯化。在用蛋白A-琼脂糖(Pharmacia,Piscataway,N. J.)进行亲和层析之前,可以过滤并浓缩上清液。洗脱的IgG可以通过凝胶电泳和高效液相色谱进行检验以确保纯度。缓冲溶液可以被替换成PBS，并且可以使用1.43的消光系数通过OD■确定浓度。单克隆抗体可以被等分并且储存在_80°C。制备本发明单克隆抗体的转染瘤的产生也可以使用例如本领域所熟知的重组DNA技术和基因转染方法的组合(例如Morrison, S. (1985) Science 229 :1202)在宿主细胞转染瘤(杂交瘤的一种类型)中产生本发明的抗体。
例如，为表达所述抗体或其抗体片段，编码部分或全长轻链和重链的DNA可以通过标准分子生物学技术(例如，PCR扩增或使用表达目标抗体的杂交瘤进行cDNA克隆)获得并且所述DNA可以被插入表达载体中以使得基因被可操作地连接于转录和翻译调控序列。在本文中，术语“可操作地连接”意图指抗体基因被接合入载体以使得在所述载体内的转录和翻译调控序列发挥它们调节所述抗体基因的转录和翻译的预期功能。选择表达载体和表达调控序列以与所使用的表达宿主细胞相容。抗体轻链基因和抗体重链基因可以被插入独立的载体中，或者更通常地，两种基因被插入同一表达载体中。所述抗体基因通过标准方法(例如在抗体基因片段和载体上的互补限制性位点的接合，或者如果不存在限制性位点的话通过平端连接)被插入所述表达载体中。所描述的抗体的轻链和重链可变区可用于通过将它们插入已经编码需要的同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中以使得Vh片段被可操作地连接于所述载体内的Ch片段，而Vk片段被可操作地连接于所述载体内的Q片段而产生任何抗体同种型的全长抗体基因。另外地或替代地，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。抗体链基因可以被克隆入所述载体以使得信号肽在框架内(in-frame)被连接到抗体链基因的氨基端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异 源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。除了所述抗体链基因之外，本发明的重组表达载体携带调控序列，其调控所述抗体链基因在宿主细胞中的表达。术语“调控序列”意图包括启动子、增强子及其他控制抗体链基因的转录或翻译的表达调控元件(例如多腺苷酸化信号)。这样的调控序列被描述在例如 Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, AcademicPress, San Diego, CA (1990))中。本领域普通技术人员将理解,表达载体的设计,包括调控序列的选择，可取决于如待转化宿主细胞的选择、期望的蛋白质表达水平等因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调控序列包括指导哺乳动物细胞中高水平的蛋白质表达的病毒元件，如来源于巨细胞病毒(CMV)、猴病毒40 (SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。可选地，可以使用非病毒调控序列，如遍在启动子或￠-球蛋白启动子。更进一步，由来自不同来源的序列组成的调控元件，如SRa启动子系统，其包含来自SV40早期启动子和人T细胞白血病毒I型的长末端重复序列的序列(Takebe, Y.等(1988)Mol. Cell. Biol. 8 :466-472) 除了抗体链基因和调控序列之外，本发明的重组表达载体可携带另外的序列，诸如调节载体在宿主细胞中的复制的序列(例如复制起点)和选择性标记基因。选择性标记基因帮助选择所述载体已经被引入的宿主细胞(参见例如Axel等的美国专利4，399，216、4，634，665和5，179，017)。例如，通常，选择性标记基因赋予所述载体已经被引入的宿主细胞对药物诸如G418、潮霉素或氨甲喋呤的抗性。优选的选择性标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于以氨甲喋呤进行选择/扩增的dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。为了表达轻链和重链，编码重链和轻链的表达载体通过标准技术转染到宿主细胞中。术语“转染”的各种形式意图包括常用来将外源性DNA引入真核或原核宿主细胞的各种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等等。尽管理论上在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体是可能的，但是在真核细胞中表达抗体是最优选的，并且最优选哺乳动物宿主细胞，因为这类真核细胞、特别是哺乳动物细胞比原核细胞更可能装配和分泌适当折叠的免疫活性抗体。已经报告，抗体基因的原核生物表达对于以高产量产生活性抗体是无效的。(Boss,M.A.和 Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6 12-13) 表达本发明的重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CH0细胞)(包括 dhfr-CHO 细胞，其描述于 Urlaub 和 Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 77 =4216-4220中，与DHFR选择性标记一起使用，如描述于R. J. Kaufman和P. A. Sharp (1982)Mol. Biol. 159 :601-621)中)、NS0 骨髓瘤细胞、COS 细胞和 SP2 细胞。特别地，对于采用NSO骨髓瘤细胞，另一个优选的表达系统是GS基因表达系统，其公开于WO87/04462、W0 89/01036和EP 338，841中。当编码抗体基因的重组表达载体被引入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞一段足以允许所述抗体在宿主细胞中表达或更优选所述抗体分泌入宿主细胞在其中生长的培养基中的一段时间产生所述抗体。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基回收抗体。结合RTK的Igr样结构域的抗体的表征通过例如标准ELISA，可以检测本发明的抗体与胞外域例如RTK的Ig样结构域 (或任何选择的区域，如在本文论述的共有序列)的结合。简言之，用在PBS中的0. 25 ii g/ml纯化的Ig样结构域(或优选的受体结构域)包被微孔滴定板，然后用在PBS中的5%牛血清白蛋白封闭。抗体的稀释物(例如，来自免疫小鼠——例如用人Kit的D4或D5结构域免疫的小鼠——的血浆的稀释物)被添加至每一孔并在37°C温育1-2小时。用PBS/Tween洗涤所述板，然后与偶联于碱性磷酸酶的第二试剂(例如对于人抗体，为山羊抗人IgG Fe特异性多克隆试剂)在37°C温育I小时。在洗涤之后，用pNPP底物(lmg/ml)对所述板进行显色，并在405-650的OD下分析。优选地，显示出最高滴度的小鼠将用于融合。如上所述的ELISA测定还可以用来筛选显示出与免疫原的阳性反应性的杂交瘤。以高亲合力结合例如RTK的Ig样结构域的杂交瘤被分种并进一步进行鉴定。来自各杂交瘤的一个克隆(其保持亲本细胞的反应性(通过ELISA))可以被选择来用于制备储存于_140°C的5-10小瓶细胞库和用于抗体纯化。为纯化抗RTK抗体，可以使选择的杂交瘤在两升旋转烧瓶中培养用于单克隆抗体纯化。在用蛋白A-琼脂糖(Pharmacia,Piscataway,NJ)进行亲和层析之前,可以过滤并浓缩上清液。洗脱的IgG可以通过凝胶电泳和高效液相色谱进行检验以确保纯度。缓冲溶液可以被替换成PBS，并且可以使用I. 43消光系数通过OD■测定浓度。单克隆抗体可以被等分并且储存在_80°C。为确定所选择的单克隆抗体是否结合独特表位，可以使用市售试剂(Pierce，Rockford, IL)生物素化各抗体。可以使用如上所述以RTK的Ig样结构域(例如Kit_D4结构域、Kit-D5结构域或VEGF受体D7结构域)包被的RTK包被ELISA板进行使用未标记的单克隆抗体和生物素化单克隆抗体的竞争研究。生物素化mAb结合可以采用链霉-抗生物素蛋白-碱性磷酸酶探针进行检测。为确定纯化抗体的同种型，可以使用对于具有特定同种型的抗体具有特异性的试剂进行同种型ELISA。例如，为确定人单克隆抗体的同种型，可以用lug/ml的抗人免疫球蛋白在4°C包被微孔滴定板的孔过夜。在用1% BSA封闭之后，所述板与liig/ml或更低的测试单克隆抗体或纯化的同种型对照在环境温度反应一至两个小时。然后，所述孔与人IgGl或人IgM-特异性碱性磷酸酶偶联的探针反应。如上所述对板进行显色和分析。
可以通过蛋白质印迹法进一步测试抗RTK人IgG与RTK的Ig样结构域或在本文给出的共有序列的反应性。简言之，RTK的Ig样结构域，如Kit RTK的D4或D5结构域或者VEGF受体的D7结构域，可以被制备并进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。在电泳之后，将分离的抗原转移到硝酸纤维素膜、用10%胎牛血清封闭、并用待测试的单克隆抗体探测。可以使用抗人IgG碱性磷酸酶检测人IgG结合，并用BCIP/NBT底物片(Sigma Chem.Co. , St. Louis, Mo.)进行显色。表位作图可用来确定本发明的抗体或其抗原结合片段的结合位点。可获得进一步允许构象表位作图的几种方法。例如，可以使用公开于Timmerman等(MolDivers. 2004 ；8 (2) :61-77)的方法。Timmerman 等能够使用两种新的技术 Domain Scan和Matrix Scan成功地对非连续/构象表位作图。也可以使用公开于Ansong等(JThromb Haemost. 2006. 4(4) :842-7) 中的技术。Ansong 等使用亲合性定向质谱(affinitydirected mass spectrometry)来对抗体R8B12识别的非连续表位进行作图。此外,成像技术如Protein Tomography可用于使革E RTK的抗体或肽结合成像。Protein Tomography先前已经用于观察分子相互作用，并用来显示抑制性抗体通过结合EGFR的结构域III起作用，从而将EGFR锁定为非柔性和非活性的构象(Lammerts等Proc Natl Acad Sci U SA. 2008. 105(16) :6109-14)。更多的传统方法诸如定点诱变也可被用于对非连续表位作图。据认为参与非连续表位的氨基酸区可以被选择性突变并分析其与本发明的抗体或其抗原结合片段的结合。当任一个区被突变时，所述抗体丧失结合能力可表明所述结合取决于两个氨基酸片段。如上所述，一些线性表位的特征在于为了结合本发明的成分必须存在的特定三维结构。当RTK处于其天然或折叠状态时以及再次当RTK变性时，这样的表位可以通过分析所述抗体(或另一成分)的结合发现。结合仅仅在折叠状态发生这一观察结果表明所述表位或者是特征在于特定折叠结构的线性表位或者是仅仅存在于折叠蛋白质中的非连续表位。除了在本文描述的活性分析之外,Protein Tomography还可用来确定本发明的抗体或其抗原结合片段是否能结合和灭活受体酪氨酸激酶。结合相互作用的可视化可表明，所述抗体的结合可影响两个胞外域在细胞表面界面的定位或者改变或阻止在所述受体酪氨酸激酶中的构象变化。II.结合人受体酪氨酸激酶的Ig样结构域或铰链区的小分子在本发明的另一个方面，结合人受体酪氨酸激酶的胞外域例如Ig样结构域或铰链区的成分是小分子。本发明的小分子的特征在于特定功能特征或性质。例如，所述小分子结合RTK的Ig样结构域，例如Kit RTK的D4或D5结构域或者VEGF受体的D7结构域，或者RTK的铰链区，例如Kit RTK的D3-D4或D4-D5铰链区。在优选的实施方式，小分子抑制剂与D3-D4或D4-D5铰链区的结合将阻止使得近膜D4和D5结构域能够处于允许酪氨酸激酶结构域的反式自磷酸化和活化，随后是下游信号传导通路的募集和活化的距离和取向(位置)的运动。在一些实施方式中，小分子结合可允许受体酪氨酸激酶的胞外域二聚化，但影响在两个单体的Ig样结构域(例如，III型受体酪氨酸激酶的D4-D4或D5-D5结构域或者V型受体酪氨酸激酶的D7-D7结构域)之间的定位、取向和/或距离，从而抑制受体酪氨酸激酶的活性。换句话说，所述成分或小分子可允许配体诱导的受体酪氨酸激酶胞外域的二聚化，但影响两个胞外域在细胞表面界面的定位，从而抑制受体酪氨酸激酶的活性(例如，抑制受体内化作用和/或抑制所述受体的酪氨酸自磷酸化和/或抑制所述受体激活下游信号传导通路的能力)。术语“小分子化合物”、“小分子药物”、“小分子”或“小分子抑制剂”在本文可互换使用以用来指对其对RTK的影响和它们抑制RTK (例如Kit RTK或VEGF受体)的二聚化或活性的能力进行筛选的本发明的化合物。这些化合物可包含在PubChem数据库(pubchem.ncbi. nlm. nih. gov/) > Molecular Libraries Screening Center Network(MLSCN)数据库中的化合物、相关数据库中的化合物、或者它们的衍生物和/或功能类似物。如本文所使用，“类似物”或“功能类似物”是指化合物或小分子抑制剂，其在结构上类似于母体化合物，但在组成上稍微不同(例如，一个或多个原子或功能团被添加、除去或改变)。相比于初始化合物，类似物可具有或不具有不同的化学或物理特性，并可具有或不具有改善的生物学和/或化学活性。例如，与母体化合物相比，类似物可以是更疏水性的或者它可具有改变的活性(增加、降低或与母体化合物相同)。所述类似物可以是初始化合物的天然或非天然发生(例如重组)的变体。其它类型的类似物包括化合物的异构体(对映异构体、非对映异构体等等)和其它类型的化合物手性变体，以及结构异构体。所述类似·物可以是线性化合物的分支或环状变体。例如，线性化合物可具有支化的或另外取代以赋予某些期望的性质(例如改善的亲水性或生物利用度)的类似物。如本文所使用，“衍生物”是指化合物或小分子抑制剂的化学上或生物学上的改良形式，其结构上类似于母体化合物并且(实际上或理论上)可衍生于该母体化合物。“衍生物”与“类似物”或“功能类似物”的区别在于母体化合物可以是产生“衍生物”的起始物质，而母体化合物不是必须被用作产生“类似物”或“功能类似物”的起始物质。衍生物可以具有或不具有与所述母体化合物不同的化学或物理特性。例如，与母体化合物相比，衍生物可以是更亲水性的或者它可具有改变的反应性。衍生化(即，通过化学或其它手段修饰)可包括在分子内一个或多个部分的取代(例如，官能团的改变)。例如，氢可以用卤素如氟或氯取代，或者羟基(一0H)可以用羧酸部分(一C00H)取代。术语“衍生物”也包括偶联物和母体化合物的前药(即化学修饰衍生物，其在生理条件下可转化为原始化合物)。例如，前药可以是活性剂的无活性形式。在生理条件下，前药可以转化为所述化合物的活性形式。例如，可以通过用酰基基团(酰基前药)或氨基甲酸酯基团(氨基甲酸酯前药)置换氮原子上的一个或两个氢原子形成前药。关于前药的更多详细信息可例如发现于Fleisher等，Advanced Drug Delivery Reviews 19 (1996) 115 ；Design of Prodrugs, H. Bundgaard (编辑)，Elsevier, 1985 ;和 H. Bundgaard, Drugs of the Future 16(1991)443。术语“衍生物”也用于描述全部溶剂合物，例如水合物或加合物(例如与醇的加合物)、活性代谢物和母体化合物的盐。可以制备的盐的类型取决于在化合物内的部分的性质。例如，酸性基团如羧酸基团可以形成碱金属盐或碱土金属盐(例如钠盐、钾盐、镁盐、钙盐)和与生理上可容许的季铵离子的盐以及与氨水和生理上可容许的有机胺如三乙胺、乙醇胺或三(2-羟乙基)胺)的酸加成盐。碱性基团可以例如与无机酸如盐酸(“HC1”)、硫酸或磷酸形成酸加成盐，或者与有机羧酸和磺酸如乙酸、柠檬酸、苯甲酸、马来酸、富马酸、酒石酸、甲磺酸或对甲苯磺酸形成酸加成盐。除了碱性氮原子之外同时包含碱性基团和酸性基团(如羧基)的化合物可以作为两性离子存在。可以通过本领域普通技术人员已知的惯用方法获得盐，例如通过在溶剂或稀释剂中结合化合物和无机或有机酸或碱，或者通过阳离子交换或阴离子交换从其它盐获得所述盐。小分子已知具有1200或以下、1000或以下、900或以下、800或以下、700或以下、600或以下、500或以下、400或以下、300或以下、200或以下、100或以下、50或以下、25或
以下或者10或以下的分子量。本发明的小分子抑制剂被选择或设计来结合RTK的胞外域，例如Ig样结构域或铰链区。在一些实施方式中，小分子抑制剂被选择或设计来结合人KU、人VEGF受体或TOGFR的Ig样结构域或铰链区，例如人Kit受体的D4或D5结构域、或D3-D4和/或D4-D5铰链区，从而拮抗受体二聚化和转变成活性形式的能力，例如自磷酸化和活化细胞内信号传导途径。在其它实施方式中，小分子抑制剂被选择来结合与Kit受体或VEGF受体的结构域具有同源性的结构域。例如，本发明的小分子可以针对与RTK的Ig样结构域(例如Kit的D4或D5结构域或VEGF受体的D7结构域)、RTK的铰链区(例如Kit或TOGFR受体的D3-D4或D4-D5铰链区)具有至少50%同一性、至少60%同一性、至少70%同一性、至少80%同一性、至少90%同一性、或至少95%或99%同一性的结构域。这样的小分子将能够结合在功能上类似于例如Kit或TOGF受体的D4、D5或D7结构域或D3-D4和/或D4-D5铰链区的蛋白结构域——可能在KU、VEGF受体和其它RTK中本发明的小分子抑制剂也可结合来源于RTK(例如人VEGF受体或人III型RTK)的Ig样结构域或铰链区的特定基序或共有序列，这允许所述小分子抑制剂特异性结合RTK家族的成员(例如人RTK的III型家族的成员)中共有的结构域。在一种具体实施方式
中，本发明的小分子结合D4相互作用位点的以下共有序列LX1RX2X3X4X5X6X7G,其中L是亮氨酸，R是精氨酸，G是甘氨酸，和X”\、X3> X4, X5, X6和X7是任何氨基酸。在一种具体实施方式
中，X1选自苏氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、天门冬酰胺或赖氨酸；X2选自亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸和甲硫氨酸；X3选自赖氨酸、组氨酸、天门冬酰胺和精氨酸；X4选自甘氨酸、缬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸；X5选自苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸；X6选自谷氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺；以及X7选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和苏氨酸。在另一实施方式中，本发明的小分子结合VEGF受体家族成员的D7结构域的以下共有序列=IX1RVX2X3EDX4G，其中I是异亮氨酸，R是精氨酸，E是谷氨酸，D是天冬氨酸，G是甘氨酸；和X1、X2、X3和X4是任何氨基酸。在一个具体的实施方案中，X1选自谷氨酸、精氨酸 和谷氨酰胺；X2选自精氨酸和苏氨酸；X3选自谷氨酸和赖氨酸；以及X4选自谷氨酸和丙氨酸(SEQ ID NO :1)。在另一个实施方案中，本发明的成分(例如，小分子)结合VEGF受体的D7结构域的以下共有序列L/I X1 R O X2 X3 X4 D/E X5 G (SEQ ID NO : 158)，其中L是亮氨酸，I是异亮氨酸，R是精氨酸，O是疏水性氨基酸，D是天冬氨酸，E是谷氨酸，G是甘氨酸；以及Xp&、\、乂4和X5是任何氨基酸。在一个具体的实施方案中，O是缬氨酸A1选自于精氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸和天冬氨酸；X2选自于精氨酸、赖氨酸和苏氨酸；X3选自于赖氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和缬氨酸；X4选自于谷氨酸和缬氨酸；以及X5选自于谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸和谷氨酰胺。在其它实施方式中，小分子抑制剂结合代表蛋白质的三维结构的蛋白质基序或共有序列。这样的基序或共有序列不表示氨基酸的连续链，而是产生于RTK的三维折叠的非线性的氨基酸排列(即“结构基序”)。这样的基序的实例是基于Kit受体的D3-D4和/或D4-D5铰链区设计的基序。这样的基序和共有序列可以根据关于抗体的章节I中论述的方法设计。重要的是，本发明的小分子抑制剂不结合RTK的配体结合位点，例如Kit受体的SCF结合位点。换言之，小分子抑制剂不结合负责配体结合的RTK的Ig样结构域。在另一个实施方案中，本发明的小分子抑制剂结合VEGF受体的连续表位。在一个实施方案中，连续表位由VEGF受体D7结构域中的两个或更多个残基组成。在另一个实施方案中，连续表位是选自VEGFRl的672VAISSS6' VEGFRl的678TTLDCHA684、VEGFRl的685NGVPEPq691、VEGFRl 的 700KIQQEPG706, VEGFRl 的 707IILG710' VEGFRl 的 711PGS713' VEGFRl 的714STLFI718, VEGFRl 的 719ERVTEEDEGV728、VEGFR3 的 689VNVSDS694, VEGFR3 的 695LEMQCLV701、VEGFR3 的 7CI2AGAHAPS7CI8、VEGFR3 的 717LLEEKSG723、VEGFR3 的 724VDLA72' VEGFR3 的 728DSN7'VEGFR3 的 731QKLSI735 和 VEGFR3 的 736QRVREEDAGR745、VEGFR2 的 678TSIGES683, VEGFR2 的684IEVSCta690, VEGFR2 的 691SGNPPPQ697、VEGFR2 的 7ci6TLVEDSG712、VEGFR2 的 mIVLK716、VEGFR2的 mDGN719、VEGFR2 的 72qRNLTI724 和 VEGFR2 的 725RRVRKEDEGL734 的表位。在另外的实施方式中，选择或设计本发明的小分子抑制剂来特异性结合RTK的突变胞外域，例如突变Ig样结构域或突变铰链区。在优选实施方式中，突变体RTK是致瘤的或致癌的突变体。在一种具体实施方式
中，选择或设计小分子抑制剂来结合致癌的Kit受体突变体。可以被本发明的小分子靶向的Kit受体突变体具有一个或多个以下氨基酸中的突变的 Kit 受体Thr417、Tyr418、Asp419、Leu421、Arg420、Tyr503 或 Ala502。本领域技术人员应理解，本发明的方法可以应用于Kit中的其它突变或其它RTK中的突变。靶向于突变体RTK的一个优点是治疗性小分子可以仅结合包含突变的细胞上的RTK，而使得健康细胞大部分或全部不受影响。因此，在突变是致瘤性突变的情况下，仅肿瘤细胞将被用作治疗靶标，潜在地减少副作用和剂量要求。在一些实施方式中，所述小分子结合人Kit受体的特定序列，例如人Kit受体的残基309-413、残基410-519、381Arg和386Glu或418Tyr和5°5Asn。在一些实施方案中，本发明的小分子可以结合人VEGF受体的特定序列，例如，VEGFRl的残基718-727、VEGFRl的Arg720和 Asp725、VEGFR2 的残基 724-733、VEGFR2 的 Arg726 和 Asp731、VEGFR3 的残基 735-744 或VEGFR3 的残基 Arg737 和 Asp742。在优选实施方式中，本发明的小分子可以结合Kit受体中构成在表4(下文中)中所描述的小腔或口袋的一个或多个残基。例如，本发明的小分子可以结合Kit受体的D3-D4铰链区中的一个或多个以下残基来自D3结构域的K218、S220、Y221、L222和来自D4结构域的 F340、P341、K342、N367、E368、S369、N370、1371、Y373。本发明的小分子也可以结合构成Kit受体的D4结构域中的凹面的一个或多个以下残基Y350、R353、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386和T390。在另一实施方式中，本发明的小分子可以结合形成Kit受体的D2-D3铰链区中的口袋的一个或多个以下残基来自D2结构域的Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206 和 F208 以及来自 D3 结构域的 V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268 和 Y269。因此，在一些实施方式中，本发明的小分子可以结合连续的或不连续的氨基酸残、基，并起到阻止RTK的近膜区以使酪氨酸激酶能够活化的距离和定向来定位所需的运动的分子楔的作用。本发明的小分子也可以起到阻止同型D4或D5受体相互作用或使配体-受体相互作用位点不稳定的作用。在一些优选实施方式中，本发明的小分子可以结合Kit受体上的的一个或多个以下残基Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206、P206、F208、K127、A207、V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268、Y269、T295、L222、L222、L223、E306、V308、R224、V308、K310、K218、A219、S220、K218、A220、Y221、A339、D327、D398、E338、E368、E386、F312、F324、F340、F355、G311、G384、G387、G388、1371、K342、K358、L382、L379、N326、N367、N370、N410、P341、S369、T385、V325、V407、V409、Y373、Y350、Y408、T380、T390、R381、R353、T411、K412、E414、K471、F433、G470、L472、V497、F469、A431 或 G432。本领域技术人员将理解，在一些实施方式中，本发明的小分子可以容易地被靶向于其它III型RTK中的相应残基，例如形成相似的口袋或空腔的那些残基或通过结构比对或序列比对处于相同的位置的那些残基。在一种具体实施方式
中，本发明的小分子结合III型RTK或V型RTK上的构象表位或非连续表位。构象表位或非连续表位可以由来自III型RTK (例如人Kit受体或TOGF受体)的D3、D4或D5结构域或者D4-D5或D3-D4铰链区的两个或更多个残基组成，或者由来 自VEGF受体的D7结构域的两个或更多个残基组成。例如，所述构象表位或非连续表位可以由下表4中所列的两个或更多个残基组成。在一种具体实施方式
中，本发明的小分子结合由选自 Y125、H180、R181、K203、V204、R205、P206、V238、S239、S240、H263、G265、D266、F267、N268和Y269的2个或多个氨基酸组成的构象表位。在相似的具体实施方式
中，本发明的小分子可以结合由选自以下氨基酸组之一的2个或多个氨基酸组成的构象表位P206、F208、V238 和 S239 ;K127、A207、F208 和 T295 ;L222、A339、F340、K342、E368、S369、N370、1371 和 Y373 ;L222、L223、E306、V308、F312、E338、F340 和 1371 ;R224、V308、K310、G311、F340、P341和 D398 ;K218、A219、S220、N367、E368 和 S369 ;K218、A220、E368 和 S369 ;G384、T385、T411、K412、E414 和 K471 ;Y408、F433、G470、K471和 L472;F324、V325、N326 和 N410 ；D327、N410、T411、K412和 V497 ;G384、G387、V409 和 K471 ;L382、G387、V407 和 V409 ;Y125、G126、H180、R181、K203、V204、R205、P206、F208、V238、S239、S240、S241、H263、G265、D266、F267、N268 和 Y269 ;P206、F208、V238 和 S239 ;K218、S220、Y221、L222、F340、P341、K342、N367、E368、S369、N370、I371 和 Y373 ;G384、G387、G388、Y408、V409、T411、F433、F469、G470和 K471 ;D327、T411、K412、E414、A431、G432 和 K471;Y350、F355、K358、L379、T380、R381、L382、E386和T390 ;Y350、R353和F355。如以上所指出的，本发明的小分子可以结合形成在表4中确定的口袋或空腔的所有氨基酸残基，或者它们可以结合形成口袋或空腔的残基的一部分。应理解，在某些实施方式中，当涉及结合表位(例如构象表位)的本发明的小分子时，意图是所述小分子仅结合那些构成该表位(例如表4中确定的口袋或空腔)的那些特定残基，而不是在该受体的线性氨基酸序列中的其它残基。在进一步的实施方式中，本发明的小分子结合构象表位，其中所述构象表位由选自表5中所列的肽的两个或更多个氨基酸残基组成。在一种具体实施方式
中，构象表位由选自第一肽的一个或多个氨基酸残基和选自第二肽的一个或多个氨基酸残基组成，其中第一和第二肽选自表5中所列的肽的组。因而，本发明的小分子可以结合其中第一和第二肽组如下的构象表位Ala219-Leu222 和 Thr304_Val308 ；Asp309-Gly311 和 Arg224_Gly226 ；Thr303-Glu306 和 Ala219_Leu222 ;Asn367_Asn370 和 Ser217-Tyr221 ；Ala339-Pro343 和Asn396-Val399 ；Ala339-Pro343 和 Glu368-Arg372 ；Lys358-Tyr362 和 Val374_His378 ；Asp357-Glu360 和 Leu377-Thr380 ;Met351_Glu360 和 His378-Thr389 ；His378-Thr389 和Val323-Asp332 ；Val409-Ile415 和 Ala493-Thr500 ；Val409-Ile415 和 Ala431-Thr437 ；Val409-Ile415 和 Phe469_Val473 ；Val409-Ile415 和 Val325_Asn330 ；Val409-Ile415 和Arg381-Gly387 ；Gly466-Leu472 和 Gly384-Gly388 ；Val325-Glu329 和 Tyr494-Lys499 ；Thr411-Leu416 和 Val497_Ala502 ;Ile415_Leu421 和 Ala502-Ala507 ；Ala502-Ala507 和Lys484-Thr488 ;及Ala502_Ala507和Gly445_Cys450。本发明的小分子可以结合形成上述第一和第二肽组的所有氨基酸残基，或者它们可以结合形成第一和第二肽组的残基的一部分。应理解，在某些实施方式中，当涉及结合表位(例如构象表位)的本发明的小分子时，意图是所述小分子仅结合那些构成该表位(例如表5中确定的特定肽)的那些特定残基，而不是在该受体的线性氨基酸序列中的其它残基。在另一实施方式中，本发明的小分子可以结合由2个或多个选自E33、P34、D72、 E76、N77、K78、Q79、K158、D159、N250、S251、Q252、T253、K254、L255、N260、W262、H264、G265、E344、N352、R353、F355、T356、D357、Y362、S365、E366、N367、N370 和 G466 的氨基酸组成的构象表位或非连续表位。在另一实施方式中，本发明的小分子结合人TOGFRP的氨基酸残基385Arg和39°G1u或TOGFRa中的相应残基。人TOGFRP的残基385Arg和390Glu类似于Kit受体残基381Arg和386Glu并介导TOGFRP的同型D4-D4相互作用。本发明的小分子可以通过阻止III型RTK的近膜区之间的关键同型相互作用(例如人TOGFRP的385Arg和39°Glu之间形成的盐桥)发挥其对受体活化的抑制作用，所述近膜区之间的关键同型相互作用对于将胞质结构域定位在对于酪氨酸激酶活化至关重要的距离和定向是是必要的。本文中论述的实验表明，同型D4-D4相互作用对于TOGFRP 二聚化不是必要的，而I3DGFRP 二聚化对于受体活化是必要的然而并非足够的。因此，本发明的小分子可以允许TOGFRP的二聚化而同时阻止活化。基于结构的序列比对已经表明EF环的大小以及包含关键氨基酸的D4-D4界面在KitJDGFRa、PDGFR^和CSFlR中是保守的。因此，在一些实施方式中，本发明的小分子可以靶向于III型RTK的D4或D5结构域的保守区。在优选实施方式中，本发明的小分子以高亲和性结合Kit的Ig样结构域或铰链区(例如Kit受体的D3-D4和/或D4-D5铰链区或D4-D4和/或D5-D5界面结合位点)，例如Kd为Ix IO-7M或更低、Kd为5x10_8M或更低、Kd为Ix KT8M更低、Kd为5x 10_9M更低、或者Kd为Ix 10_8M和Ix KTkiM之间或更低的亲和性。本发明的小分子抑制剂可以通过本领域已知的几种方法进行制备或选择。筛选方法可用于从文库鉴定结合希望的RTK的Ig样结构域或铰链区(例如人Kit RTK的D4或D5结构域)的小分子。一种方法(Chemetics (Nuevolutions))利用文库中各分子的DNA标签来辅助选择。Chemetics 系统允许筛选用于靶向结合的数百万化合物。涉及基于小分子文库和标签的筛选的专利是美国专利申请20070026397 ；20060292603 ；20060269920 ；20060246450 ；20060234231 ；20060099592 ；20040049008 ;20030143561，将这些专利以其全文通过引用的方式并入本文。其它可以用于从文库鉴定结合希望的RTK的Ig样结构域或铰链区(例如人KitRTK D4或D5结构域或VEGF受体的D7结构域)的小分子的公知方法包括利用其中文库成员以鉴定标记进行标记(即，文库中存在的各个标记与文库中存在的不同化合物结构相关，从而鉴别标记得知标记分子的结构)的文库的方法。标记的文库的一种方法利用寡核苷酸标签，如在例如以下文献中描述PCT公开TO 2005/058479A2 (Direct Select 技术)和美国专利 5，573，905 ;5，708，153 ;5，723，598，6，060，596 号；公开的 PCT 申请 WO 93/06121 ；WO 93/20242 ；W0 94/13623 ；W0 00/23458 ；W0 02/074929 和 WO 02/103008，以及 Brenner和 Lerner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,5381-5383 (1992) ；Nielsen 和 Janda(Methods A Companion to Methods in Enzymology 6,361-371 (1994);以及 Nielsen、Brenner 和Janda (J. Am. Chem. Soc. 115,9812-9813 (1993)),每一篇文献的全部内容均通过引用的方式并入本文中。这样的标签可以使用例如聚合酶链式反应进行扩增，以产生很多标签拷贝并通过测序鉴定所述标签。然后标签的序列确认结合分子的结构，所述结合分子可以纯化形式进行合成并测试活性。
组合化学文库的预备和筛选是本领域技术人员公知的。可用于鉴定本发明的成分的这类组合化学文库包括但不局限于肽文库(参见，例如美国专利No. 5，010，175，Furka,Int. J. Pept. Prot. Res. 37 :487493 (1991)和 Houghton 等，Nature 354:8488(1991))。用于产生化学多样性文库的其它化学物质是本领域公知的并且可以使用。这样的化学物包括但不局限于类肽(例如PCT公开No. WO 91/19735)，编码肽(例如PCT公开WO93/20242)，随机生物寡聚物(例如PCT公开No. WO 92/00091)，苯并二氮草(例如美国专利 No. 5, 288, 514)，diversomer 如乙内酰脲、苯并二氮草和二肽(Hobbs 等，Proc. Nat.Acad. Sci. USA 90:6909 6913 (1993)),插烯多妝(vinylogous polypeptide) (Hagihara等，J. Amer. Chem. Soc. 114 :6568(1992))、具有葡萄糖骨架的非肽类肽模拟物(Hirschmann等，J. Amer. Chem. Soc. 114 :9217 9218 (1992))，小化合物文库的类似有机合成(Chen等，J. Amer. Chem. Soc. 116 :2661 (1994))、寡氛酷(oligocarbamate) (Cho 等，Science 261 1303(1993))和 / 或肽基膦酸酯(Campbell 等，J. Org. Chem. 59 :658 (1994))、核酸文库(参见Ausubel, Berger和Russell & Sambrook,所有同上)、肽核酸文库(参见例如美国专利 No. 5，539，083)、碳水化合物文库(参见例如 Liang 等，Science, 274 :1520 1522(1996)和美国专利No. 5，593，853)、小有机分子文库(参见例如苯并二氮草，Baum C&EN, Jan18，33页(1993);类异戊二烯，美国专利5，569，588号；噻唑烷酮和间噻嗪酮，美国专利5，549,974号；吡咯烷，美国专利5，525，735和5，519，134号；吗啉代化合物，美国专利5，506，337号；苯并二氮草，5，288，514等)。各前述出版物通过引用的方式并入本文。公众数据库也是可利用的，并常用于小分子筛选，例如PubChem(pubchem. ncbi. nlm. nih. gov)，Zinc (Irwin 和 Shoichet (2005) J. Chem. Inf. Model. 45(1) :177-82)和 ChemBank (Seiler 等(2008) Nucleic Acids Res. 36 (数据库发行号):D351_D359)。用于制备组合文库的装置是市场上可买到的(见，例如357 MPS, 390 MPS,Advanced Chem Tech， Louisville Ky. ， Symphony, Rainin， Woburn, Mass. ，433A AppliedBiosystems, Foster City, Calif. ,9050 Plus，Millipore, Bedford, Mass.)。此外，许多组合文库本身是市场上可买到的(见例如，ComGenex, Princeton, N.J.，Tripos，Inc.，St.Louis， Mo. ，3D Pharmaceuticals， Exton, Pa. ， Martek Biosciences, Columbia， Md.，等)。而且，因为筛选方法被非常好地限定，通常与专业公司签订合同以鉴定用于目标靶的特定化合物(例如 BioFocus DPI (biofocus, com)和 Quantum Lead (q-lead. com))。本领域众所周知的并且可应用于本发明的方法的其它选择小分子的方法是Huang和 Stuart L. Schreiber (1997)Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25) 13396-13401 ;Hung 等(2005) Science 310 :670-674 ;Zhang等(2007) Proc Natl Acad Sci 104 :4606-4611 ;或者在Gordon(2007)ACS Chem. Biol. 2 :9-16中综述的任何一种方法，其全部都通过引用以其全部内容并入本文。除了实验筛选法之外，本发明的小分子还可以使用虚拟筛选法加以选择。虚拟筛选技术使用统计分析和蛋白质对接(docking)模拟来预测来自文库的哪些小分子将结合蛋白质或其中的特定表位。最常见地，虚拟筛选方法比较蛋白质的三维结构和文库中小分子的三维结构。使用对蛋白质-分子相互作用进行建模的不同策略，尽管常用的是模 拟在原子之间的结合能——包括氢键、静电力和范德瓦耳斯相互作用——的算法。通常，虚拟筛选方法可以扫描超过一百万个化合物的文库并返回可能是强结合物的小分子的短的名单。对虚拟筛选的若干综述可以获得，其详述了可用来鉴定本发明的小分子的技术(Engel 等(2008) J. Am. Chem. Soc. ,130(15),5115-5123 ；McInnes. (2007). Curr Opin ChemBiol. Oct ；11(5) :494-502 ;Reddy 等(2007) Curr Protein Pept Sci. Aug ；8(4) :329-51;Muegge 和 Oloff. (2006)Drug Discovery Today. 3(4) :405-411 ;Kitchen 等(2004)NatureReviews Drug Discovery 3,935-949)。小分子筛选的进一步的实例可以在美国专利申请2005/0124678中找到，其通过引用并入本文。本发明的小分子可以包含在下表中描绘的骨架结构之一。在该表中引用的参考文献均通过引用的方式以其全文并入本文中。基团&、1 2、1 3和R4的仅限制于它们不应干扰或显者抑制所指出的反应，并且可以包括氢！、烧基、取代烧基、杂烧基、取代杂烧基、环烧基、杂环烧基、取代环烧基、取代杂环烧基、芳基、取代芳基、芳烧基、杂芳烧基、取代芳烧基、取代杂芳烷基、杂方基、取代杂芳基、卤素、烷氧基、芳氧基、氨基、取代氨基和本领域已知的其它基团。适宜的取代基包括但不局限于烧基、烧氧基、硫代烧氧基、硝基、轻基、疏基、芳氧基、芳基-S-、卤素、羧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、氰基、氰酸酯、腈、异氰酸酯、硫氰酸酯、氨基甲酰基和取代氨基甲酰基。
权利要求
1.一种结合人血管内皮生长因子受体(VEGF受体)的胞外域的成分，其中所述成分拮抗VEGF受体的活性。
2.权利要求I的成分，其中所述的成分结合人VEGF受体的Ig-样结构域。
3.权利要求2的成分，其中所述Ig-样结构域不负责配体与所述VEGF受体的结合。
4.权利要求2的成分，其中所述Ig-样结构域负责配体与所述VEGF受体的结合。
5.权利要求I的成分，其中所述成分不阻断所述VEGF受体和VEGF受体配体之间的相互作用。
6.权利要求I的成分，其中所述成分阻断所述VEGF受体和VEGF受体配体之间的相互作用。
7.权利要求I的成分，其中所述成分不阻止所述VEGF受体的二聚化。
8.权利要求I的成分，其中所述成分阻止所述VEGF受体的二聚化。
9.权利要求I的成分，其中所述成分阻止所述胞外域的近膜区与所述VEGF受体的各原体之间的相互作用。
10.权利要求9的成分，其中所述相互作用是同型的。
11.权利要求9的成分，其中所述相互作用是异型的。
12.权利要求9的成分，其中所述胞外域的近膜区是VEGF受体的第七Ig-样结构域(D7)。
13.权利要求12的成分，其中所述成分结合VEGF受体的D7结构域的以下共有序列 L/1 X1 R O X2 X3 X4 D/E X5 G (SEQ ID NO :158)，其中 L 是亮氨酸，I 是异亮氨酸，R是精氨酸，O是疏水性氨基酸，D是天冬氨酸，E是谷氨酸，G是甘氨酸；和Xp X2、X3、X4和X5是任何氨基酸。
14.权利要求13的成分，其中O是缬氨酸A1选自于精氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸和天冬氨酸；X2选自于精氨酸、赖氨酸和苏氨酸；X3选自于赖氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和缬氨酸；X4选自于谷氨酸和缬氨酸；和X5选自于谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸和谷氨酰胺(SEQ ID NO :159)。
15.权利要求9的成分，其中所述成分使得所述胞外域的近膜区与VEGF受体的各原体分隔大于16人的距离。
16.权利要求I的成分，其中所述VEGF受体是VEGFRl。
17.权利要求I的成分，其中所述VEGF受体是VEGFR2。
18.权利要求I的成分，其中所述VEGF受体是VEGFR3。
19.权利要求I的成分，其中所述成分将VEGF受体的胞外域锁定在非活性状态。
20.权利要求I的成分，其中所述成分结合VEGFR2的氨基酸残基Arg726。
21.权利要求I的成分，其中所述成分结合VEGFR2的氨基酸残基Asp731。
22.权利要求I的成分，其中所述成分结合VEGFR2的氨基酸残基Arg726和Asp731。
23.权利要求I的成分，其中所述成分结合选自于VEGFR2的氨基酸残基724、725、726、727、728、729、730、731、732和733的一个或多个氨基酸残基。
24.权利要求I的成分，其中所述成分结合VEGFRl的氨基酸残基Arg720。
25.权利要求I的成分，其中所述成分结合VEGFRl的氨基酸残基Asp725。
26.权利要求I的成分，其中所述成分结合VEGFRl的氨基酸残基Arg720和Asp725。
27.权利要求I的成分，其中所述成分结合选自于VEGFRl的氨基酸残基718、719、720、.721、722、723、724、725、726和727的一个或多个氨基酸残基。
28.权利要求I的成分，其中所述成分结合VEGFR3的氨基酸残基Arg737。
29.权利要求I的成分，其中所述成分结合VEGFR3的氨基酸残基Asp742。
30.权利要求I的成分，其中所述成分结合VEGFR3的氨基酸残基Arg737和Asp742。
31.权利要求I的成分，其中所述成分结合选自于VEGFR3的氨基酸残基735、736、737、.738、739、740、741、742、743和744的一个或多个氨基酸残基。
32.权利要求I的成分,其中所述成分结合VEGF受体上的构象表位。
33.权利要求32的成分，其中所述构象表位由VEGF受体的D7结构域中的两个或更多个残基构成。
34.权利要求32的成分，其中所述构象表位包含氨基酸残基Arg726和Asp731；Arg.720 和 Asp 725 ;或者 Arg737 和 Asp742。
35.权利要求I的成分，其中所述成分阻断配体诱导的VEGF受体酪氨酸自磷酸化。
36.权利要求I的成分，其中所述成分阻碍配体诱导的VEGF受体内化。
37.权利要求I的成分，其中所述成分结合VEGF受体上的连续表位。
38.权利要求37的成分，其中所述连续表位由VEGF受体D7结构域中的两个或更多个残基构成。
39.权利要求38的成分，其中所述连续表位是选自于VEGFRl的672VAISSS6'VEGFRl的.678TTLDCha684,VEGFRl 的 685NGVPEPQ691、VEGFRl 的 7ciciKIQQEPG7'VEGFR I 的 7ci7IILG7'VEGFRl的 711pgs713,vegfri 的 714Stlfi718,vegfri 的 719ervteedegv728、vegfr3 的 689vnvsds69\vegfr3的 695LEMQCLV7ci1、VEGFR3 的 7CI2AGAHAPS7。8、VEGFR3 的 717LLEEKSG723、VEGFR3 的 724VDLA727、VEGFR3的 728DSN730,VEGFR3 的 731QKLSI735 和 VEGFR3 的 736QRVREEDAGR745,VEGFR2 的 678TSIGES683,VEGFR2的 684IEVSCTA_、VEGFR2 的 691SGNPPPQ697、VEGFR2 的 7ci6TLVEDSG712、VEGFR2 的 713IVLK716、VEGFR2的 mDGN719、VEGFR2 的 72qRNLTI724 和 VEGFR2 的 725RRVRKEDEGL734 的表位。
40.权利要求I的成分，其中所述成分是分离的抗体或其抗原结合成分。
41.权利要求40的成分，其中所述抗体或其抗原结合成分选自于人抗体、人源化抗体、双特异性抗体和嵌合抗体。
42.权利要求41的成分，其中所述抗体或其抗原结合成分包含选自于IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE恒定区的重链恒定区。
43.权利要求42的成分，其中所述抗体重链恒定区是IgGl。
44.权利要求40的成分，其中所述抗体或其抗原结合成分选自于Fab片段、F(AB')2片段、单链Fv片段、SMIP、亲和体、亲和性多聚体、纳米抗体以及单域抗体。
45.权利要求40的成分，其中所述抗体或其抗原结合成分以选自于Ix10_7M或更低、更优选地5x 10_8M或更低、更优选地Ix 10_8M或更低、更优选地5x 10_9M或更低的KD结合受体酪氨酸激酶的Ig-样结构域。
46.一种产生权利要求40至45中任一项的抗体或其抗原结合成分的杂交瘤。
47.权利要求I的成分，其中所述成分是小分子。
48.权利要求47的成分，其中所述成分结合选自于氨基酸残基VEGFR2的Arg726、VEGFR2 的 Asp731、VEGFRl 的 Arg720、VEGFRl 的 Asp725、VEGFR3 的 Arg737 和 VEGFR3 的Asp742中的至少一个氨基酸残基。
49.权利要求I的成分，其中所述成分是肽类分子。
50.权利要求49的成分，其中所述肽类分子是基于VEGF受体的Ig-样结构域设计的。
51.权利要求50的成分，其中所述肽类分子是基于人VEGF受体的D7结构域设计的。
52.权利要求51的成分，其中所述肽类分子包含结构L/IX1 R O X2 X3 X4 D/E X5G (SEQ ID NO :158)，其中L是亮氨酸，I是异亮氨酸，R为精氨酸，O是疏水性氨基酸，D是天冬氨酸，E是谷氨酸，G是甘氨酸；以及W X3> X4和X5是任何氨基酸。
53.权利要求52的成分，其中O是缬氨酸A1选自于精氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸和天冬氨酸；X2选自于精氨酸、赖氨酸和苏氨酸；x3选自于赖氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和缬氨酸；x4选自于谷氨酸和缬氨酸；X5选自于谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸和谷氨酰胺(SEQ ID NO:159)。
54.权利要求50的成分，其中所述肽类分子包含与人VEGFR2的氨基酸残基724-733至少80%相同的结构。
55.权利要求50的成分，其中所述肽类分子包含与人VEGFRl的氨基酸残基718-727至少80%相同的结构。
56.权利要求50的成分，其中所述肽类分子包含与人VEGFR3的氨基酸残基735-744至少80%相同的结构。
57.权利要求50的成分，其中所述肽类分子包含至少一个D-氨基酸残基。
58.权利要求I的成分，其中所述成分是adnectin。
59.一种结合人VEGF受体的第7Ig-样结构域上的构象表位的成分，其拮抗人VEGF受体的活性，并且其中所述构象表位包含VEGFR2的残基Arg726和Asp731 ；VEGFRl的残基Arg720 和 Asp725 ;或 VEGFR3 的残基 Arg737 和 Asp742。
60.一种结合VEGFR2的氨基酸残基Arg726和Asp731 ;VEGFR1的氨基酸残基Arg720和Asp725 ;或VEGFR3的氨基酸残基Arg737和Asp742，从而拮抗人VEGF受体的活性的成分。
61.—种包含权利要求I至权利要求60中任一项的成分和药学上可接受的载体的药物组合物。
62.有效量的权利要求I至60中任一项的成分在制备用于治疗或预防受试者中VEGF受体酪氨酸激酶相关疾病的药物中的用途。
63.权利要求62的用途，其中所述VEGF受体酪氨酸激酶相关疾病选自于癌症、年龄相关性黄斑变性(AMD)、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、糖尿病性视网膜病、淋巴疾病和疼痛相关疾病。
64.权利要求63的用途，其中所述癌症选自于GIST、AML、SCLC、肾癌、结肠癌、淋巴癌和乳腺癌。
65.一种用于鉴定结合VEGF受体的Ig-样结构域的成分的方法，该方法包括 将VEGF受体与候选成分接触； 同时地或相继地将所述VEGF受体与VEGF受体的配体接触；和 测定所述成分是否影响配体诱导的二聚VEGF受体的Ig-样结构域之间的定位、定向和/或距离，从而鉴定结合VEGF受体的Ig-样结构域的成分。
66.权利要求65的方法,其中所述成分锁定VEGF受体的胞外域于非活性状态。
67.权利要求65的方法，其中所述成分结合VEGF受体的第七Ig-样结构域(D7)。
68.—种结合人VEGF受体的第7Ig-样结构域上的构象表位的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分拮抗人VEGF受体的活性，并且其中所述构象表位包含 VEGFR2 的残基 Arg726 和 Asp731 残基；VEGFRl 的残基 Arg720 和 Asp725 ;或 VEGFR3 的残基 Arg737 和 Asp742。
69.一种结合VEGFR2的氨基酸残基724-733从而拮抗VEGFR2的活性的分离的抗体或其抗原结合部分。
70.一种结合VEGFRl的氨基酸残基Arg720和Asp725从而拮抗VEGFRl的活性的分离的抗体或其抗原结合部分。
71.一种结合VEGFR3的氨基酸残基Arg737和Asp742从而拮抗VEGFR3的活性的分离的抗体或其抗原结合部分。
72.—种结合选自于人VEGF受体的Arg726和Asp731的至少一个氨基酸残基从而拮抗人VEGF受体的活性的分离的抗体或其抗原结合部分。
73.一种结合选自于人VEGF受体的Arg720和Asp725的至少一个氨基酸残基从而拮抗人VEGF受体的活性的分离的抗体或其抗原结合部分。
74.一种结合选自于人VEGF受体的Arg737和Asp742的至少一个氨基酸残基从而拮抗人VEGF受体的活性的分离的抗体或其抗原结合部分。
全文摘要
本发明提供了与血管内皮生长因子(VEGF)受体胞外域(D7)的最近膜Ig-样结构域结合的成分，其中该成分拮抗该VEGF受体的活性。
文档编号A61K39/395GK102724996SQ201080059967
公开日2012年10月10日 申请日期2010年12月20日 优先权日2009年12月29日
发明者J·施勒辛格, 杨艳 申请人:耶鲁大学