专利名称：动物源型阳离子抗菌肽的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于动物保健品生产及应用研究领域，具体涉及动物源型阳离子抗菌肽的制备方法及其应用。
背景技术：
随着对抗菌肽研究的日益深入，其独特的抗菌作用已引起人们的高度重视，国内有关抗菌肽的专利有3项，内容主要涉及抗菌肽抗微生物病原体感染和抗菌肽用于保鲜技术等；国外仅法国Entomcd公司已获多项专利申请，并在世界范围内使用这些新肽进行人体疾病的治疗。现在许多抗菌肽已进入II期或III期临床实验。以上专利和发明都是基于植物、昆虫或者人源型的抗菌肽，由于种属之间的差别， 这些蛋白对于禽和动物来说安全性和有效性都还没有得到证实。但可以为我们研究动物源型阳离子抗菌肽提供参考。阳离子抗菌肽作为畜禽体本身固有的先天性非特异性防御体系的重要组成成分， 在农业上的应用主要有2个方面，一是取代或部分取代目前喂养动物所用的抗生素，减少动物养殖中对抗生素的依赖，并减少畜禽产品中药物残留。二是通过转基因技术将广谱抗菌肽基因导入动植物体内，增加动植物对各种病原菌的抵抗能力。细菌性感染的防治是长期以来困扰人们的一个重要难题，特别是细菌耐药性的出现，更突出了问题的复杂性和解决问题的迫切性。由于阳离子抗菌肽作用机理独特，体外未有耐药菌株产生，且许多阳离子抗菌肽的抗菌谱广，对革兰氏阳性菌及阴性菌均有作用，使它极可能成为传统抗生素的理想替代品。
发明内容
本发明提供了一种动物源型阳离子抗菌肽的制备方法，并提供了此种阳离子抗菌肽替代抗生素在畜禽疾病防治中的应用。本发明的技术原理为根据基因工程原理和阳离子抗菌肽抗菌机制进行研制和应用。本发明的制备方法如下(1)抗菌肽基因设计与优化Jurgen Fink等在对抗菌肽结构类似物的研究中发现，用人工合成基因方法的杂合抗菌肽，其杀菌活性远高于母体，抗菌谱也有所增加。因此我们将两种动物源型抗菌肽的氨基酸残基片段杂合在一起，，选用基因工程菌偏爱密码子即高表达基因常用密码进行氨基酸编码，再借助DNA分析软件对其中不合适的部分密码子串联组织进行适当修改调整、优化，最终我们得到优化好的抗菌肽gal-sphe的核苷酸和氨基酸序列如下抗菌肽gal-sphe 核苷酸序列(SEQ ID NO. 1) ATGGGTATCTTCCTGCTGTTCCTGGTTCTGCTGGCTGTTCCGCAGGCTGC
TCCGGAATCTGACACCGTTACCTGCCGTCTGCGTCGTGGTTTCTGCGCTC
GTGGTCGTTGCCGTTTCCCGTCTATCCCGATCGGTCGTTGCTCTCGTTTCGTTCAGTGCTGCCGTCGTGTTTGG编码多肽序列(SEQ ID NO. 2)MGIFLLFLVLLAVPQAAPESDTVTCRLRRGFCARGRCRFPSIPIGRCSRFVQCCRRVff(2)抗菌肽基因的克隆将得到的抗菌肽基因片段(gal-sphe)克隆到已经选择好的载体IMPACT-CN，然后将质粒(IMPACT-CN)转化进入基因工程菌(ER2566)，在含有氨苄青霉素和X-gal、IPTG的培养基上培养(37°C，12-16小时)，筛选出含有重组质粒 (IMPACT-CN-gal-sphe)的菌落，并将菌落在4°C保存。所述含有氨苄青霉素和X-gal、IPTG的培养基优选为含有100 μ g/ml氨苄青霉素和涂布有 20mg/ml X-galUmM/ml IPTG 的培养基(Tryptone (胰蛋白胨):10g/L，Yeast Extract (酵母提取物):5g/L，NaCl (氯化钠)10g/L，Agar (琼脂):15g/L)0(3)抗菌肽的表达与纯化挑取单菌落于LB液体培养基中(含氨苄青霉素 100 μ g/ml)，37°C振荡培养至0D600达0. 5-0. 7 ；加入终浓度为0. 3mM的IPTG，37°C振荡培养池，诱导蛋白表达；5000Xg，4°C离心10分钟收集菌体；用裂解缓冲液将菌体重悬，冰浴， 超声破碎细胞，使蛋白释放；使用Chitin柱对蛋白进行纯化。(4)体外抑菌试验本课题采用测定体外最小抑菌浓度的方法鉴定所得到的抗菌肽抗菌活性，检测抗菌肽活性所用的菌种购于中国兽药监察所菌种中心和中国科学院微生物研究所菌种中心，分别为革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus) CMC(^6003，枯草杆菌(Bacillus subtilis)DB430，短小芽孢杆菌(Bacillus pum ilus)CMCC63202，藤黄微球菌(Micrococcus luteus)CMCC28001 ；革兰氏阴性菌大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC8099,乙型副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi2B) CMCC50094。采用96孔板法检测抗菌肽的最小抑菌浓度。最小抑菌浓度见表1。表1本发明抗菌肽对各菌种的最小抑菌浓度
检测菌种MIC(mg/L)Staphylococcus aureus CMCC2600364Bacillus subtilis DB43054Bacillus pumilus CMCC6320242Micrococcus luteus CMCC2800147Escherichia coli ATCC809964Salmonella paratyphi2B CMCC5009460本试验证明阳离子抗菌肽具有广谱抗菌作用和很高的抗菌活性，可以替代抗生素防治畜禽细菌性感染，为临床上新型抗菌药的开发展示了新途径。
本发明的有益效果是(1)鉴于畜禽抗菌肽基因序列及相关内容国内外尚未报道，根据畜禽抗菌肽序列定向修改、设计生物基因的方法，并借助计算生物学手段优化密码子设计其编码序列；(2)选用IMPACT-CN表达载体，克隆后的多肽核苷酸序列(gal-sphe)将与质粒载体(IMPACT-CN)中的壳多糖序列形成一种融合基因序列，以利于其后的纯化工作。(3)制约抗菌肽推广应用的瓶颈是抗菌肽从融合表达体系中高效分离纯化的技术，本研究所获得的融合蛋白(gal-sphe-intein)由于含有一段叫做htein(蛋白质的内含子)的序列，而能够在还原的环境下进行自我裂解，从而将阳离子抗菌多肽释放出来，与以前的方法相比较，这种方法能够在重组阳离子多肽的发酵生产及纯化过程中节省大量的昂贵蛋白酶，此外，本系统采用的质粒载体重组蛋白表达成一种可溶性形式，而不是包涵体，从而省去了复性等一系列烦杂的步骤。(4)所表达的阳离子抗菌肽可提高肉鸡和仔猪的饲料报酬和养殖利润。
具体实施例方式实施例一将抗菌肽gal linacin 14N端1-24氨基酸残基片段 (MGIFLLFLVLLAVPQAAPESDTVT(SEQ ID NO. 3))和抗菌肽Spheniscin_2C端5-38氨基酸残基片段(CRLRRGFCARGRCRFPSIPIGRCSRFVQCCRRVW(SEQ ID NO. 4))杂合(即将两个片段连接起来)在一起，得到氨基酸序如下MGIFLLFLVLLAVPQAAPESDTVTCRLRRGFCARGRCRFPSIPIGRCSR FVQCCRRVW。根据上述氨基酸序列，选用基因工程菌偏爱密码子即高表达基因常用密码进行氨基酸编码，再借助DNA分析软件对其中不合适的部分密码子串联组织进行适当修改调整、 优化(即选择表达该蛋白的宿主菌偏好使用的氨基酸密码子，以提高表达效率)，最终我们得到优化好的抗菌肽gal-sphe的核苷酸序列和氨基酸序列如下。抗菌肽gal-sphe 核苷酸序列(SEQ ID NO. 1)ATGGGTATCTTCCTGCTGTTCCTGGTTCTGCTGGCTGTTCCGCAGGCTGCTCCGGAATCTGACACCGTTACCTGCCGTCTGCGTCGTGGTTTCTGCGCTCGTGGTCGTTGCCGTTTCCCGTCTATCCCGATCGGTCGTTGCTCTCGTTTCGTTCAGTGCTGCCGTCGTGTTTGG编码多肽序列(SEQ ID NO. 2)MGIFLLFLVLLAVPQAAPESDTVTCRLRRGFCARGRCRFPSIPIGRCSRFVQCCRRVff实施例二抗菌肽基因的克隆将得到的抗菌肽基因片段(gal-sphe)，克隆到已经选择好的载体IMPACT-CN，然后将质粒(IMPACT-CN)转化进入基因工程菌(ER2566)，在含有100 μ g/ ml氨苄青霉素和涂布有20mg/ml X-galUmM/ml IPTG的培养基(Tryptone (胰蛋白胨) 10g/L，Yeast Extract (酵母提取物):5g/L，NaCl (氯化钠):10g/L，Agar 琼脂 15g/L)上培养(37°C，12-16小时)，筛选出含有重组质粒(IMPACT-CN-gal-sphe)的菌落，并将菌落在 4°C保存。
实施例三抗菌肽的表达与纯化1.细菌培养可直接取一个单菌落，加入IL LB液体培养基中(含氨苄青霉素 100 μ g/ml)，37°C振荡培养至0D600达0. 5-0. 7。注可挑取新转化有重组表达质粒的单菌落，先接种于IOml液体培养基(含氨苄青霉素100yg/ml)，37°C振荡培养3_4h，后接种于 IL液体培养基(含氨苄青霉素100 μ g/ml)，37°C培养至0D600达0. 5。2.诱导蛋白表达加入终浓度为0. 3mM的IPTG，37°C振荡培养池，诱导蛋白表达。 设立阴性对照。取样10-20 μ 1进行SDS-PAGE电泳，取样1_2 μ 1进行^festern blot鉴定。3.细胞收集5000Xg，4°C离心10分钟，弃上清。-20/_80°C贮存。将细胞冻融以利于破碎。以下步骤4-9除有特殊注明以外，均应4°C操作。4.破碎细胞用 50ml 适当的裂解缓冲液(IOmM Tris-HCl, pH8. 5,0. 5Μ NaClor Buffer Bi)将菌体重悬，冰浴，超声破碎细胞，使蛋白释放。19000 X g离心30分钟，上清即为澄清的细胞粗提物。5. Chitin 柱的平衡将 24ml chitin beads (15ml 柱床体积)倒入 2. 5 X IOcm 柱中，10个柱床体积的相应缓冲液(同步骤4用液)4°C进行柱平衡。注=Chitin的用量由融合蛋白的总量来决定，每毫升柱床体积能够结合3士0. Img蛋白，因此一升培养菌所获得的 45士 Img融合蛋白大约需要15ml柱床体积的树脂。6. Chitin柱将澄清的细胞粗提物缓慢加入Chitin柱，流速为0. 5-1. Oml/min。 取少量流过液进行SDS-PAGE电泳，并与细胞粗提物的电泳进行比较，观察亲和柱的蛋白结合效率。上柱前可将细胞粗提物与Column Buffer按比例1 2_1 5混合稀释，以提高
蛋白结合效率。7.洗柱用SOOmL(至少20倍柱床体积)的缓冲液彻底洗柱，由于CBD和 Chitinbeads的结合力很强，洗柱时可以用较高的流速(如2-3ml/min)和更苛刻的洗柱条件(如高盐IMNaCl和/或非离子性去污剂)。8.诱导htein的自我裂解活性用3倍柱床体积的Buffer B3 (含30_50MmDTT) 洗柱，用柱帽堵上，4°C放置过夜。用于IPL连接反应的目标蛋白(C末端带有硫酯键)则需用 Buffer B4(含 MESNA)诱导 intein 的裂解。9.目标蛋白的洗脱次日，用3倍柱床体积的Buffer Bl或相应的诱裂解 Bufferf (-DTT)，将目的蛋白洗脱收集。大约收集10管，每管5ml (1/2柱床体积)。实施例四(一 )提高肉鸡饲料转化率和养殖利润的试验1、试验动物白羽肉鸡3000只，随机分为3组，每组1000只。2、实验药物根据本专利方法制备的阳离子抗菌肽。3、实验方法1组为空白对照组，不用任何药物。2组阳离子抗菌肽组，用法日粮(玉米60. 2 %，麦麸3 %，豆粕30 %，磷酸氢钙 1. 3%，石粉1.2%，食盐0.3%，油3%，添加剂1%)中长期(整个饲养周期)添加5mg/kg。
3组用盐酸林可霉素，用法日粮(玉米60. 2 %，麦麸3 %，豆粕30 %，磷酸氢钙 1. 3%，石粉1.2%，食盐0.3%，油3%，添加剂)中长期(整个饲养周期)添加；Mmg/
kg ο屠宰后称重，计算料肉比和利润。有明显效果与盐酸林可霉素用药组相比，料肉比低或者相同，利润高或者相同有效果料肉比比盐酸林可霉素用药组高，比空白组低；利润比盐酸林可霉素用药组低，比空白组高。无效料肉比比空白组高，利润比空白组低。试验结果如表2所示表2 料肉比及毛利对比试验结果
空白组盐酸林可霉素组阳离子抗菌肽组料肉比2.562.031.98毛利2.012.683.154、结论日粮中按照5mg/kg长期添加阳离子抗菌肽时，可显著提高饲料报酬和利润率。( 二)提高仔猪饲料转化率试验1、试验动物20 50kg的仔猪160头，随机分为2组，每组80只。2、实验药物根据本专利方法制备的阳离子抗菌肽。3、实验方法1组阳离子抗菌肽组，用法日粮(玉米50%，麦麸22%，黄豆4%，菜籽饼8%，蚕蛹10%，鱼粉3.5%，骨粉1.4%，钙粉0.5%，食盐0.3%，复合添加剂0.3% )中长期(30 天)添力口 5mg/kg。2组用硫酸粘菌素，用法日粮(玉米50%，麦麸22%，黄豆4%，菜籽饼8%，蚕蛹 10%，鱼粉3. 5%，骨粉1. 4%，钙粉0. 5%，食盐0. 3%，复合添加剂0. 3% )中长期(30天) 添加 20mg/kg。记录试验初体重、试验末体重、料肉比。试验结果如表3所示表3 两组初体重、末体重及料肉比对比试验结果处理对照组 (硫酸粘菌素20mg/kg)阳离子抗菌肽组 (5 mg/kg)始重，kg29.3829.68末重，kg47.2747.83日增重，g639.10648.20日釆食量，kg1.341.31料肉比2.102.06 4、结论日粮中按照5mg/kg长期添加阳离子抗菌肽时，可显著提高饲料转化率。
权利要求
1.一种动物源型阳离子抗菌肽，其为抗菌肽gal-sphe，其核苷酸序列如SEQID NO. 1所述。
2.权利要求1所述动物源型阳离子抗菌肽的制备方法，其特征是，(1)抗菌肽基因的克隆将权利要求1所述的抗菌肽gal-sphe基因克隆到载体 IMPACT-CN，然后将质粒IMPACT-CN转化进入基因工程菌ER2566，在含有氨苄青霉素和 X-gal、IPTG的培养基上培养，培养温度37°C，培养时间为12-16小时，筛选出含有重组质粒 IMPACT-CN-gal-sphe的菌落，并将菌落在4°C保存；(2)挑取单菌落于含有氨苄青霉素100yg/ml的LB液体培养基中，37°C振荡培养至 0D600达0. 5-0. 7 ；加入终浓度为0. 3mM的IPTG，37°C振荡培养3h，诱导蛋白表达；5000 X g， 4°C离心10分钟收集菌体；用裂解缓冲液将菌体重悬，冰浴，超声破碎细胞，使蛋白释放；使用Chitin柱对蛋白进行纯化。
3.如权利要求2所述的动物源型阳离子抗菌肽的制备方法，其特征是，所述含有氨苄青霉素和X-gal、IPTG的培养基为含有100 μ g/ml氨苄青霉素和涂布有20mg/ml X_gal、 ImM/ml IPTG的培养基；培养基中胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂 15g/L0
4.权利要求1所述的动物源型阳离子抗菌肽在防治畜禽细菌性感染方面的应用。
5.权利要求1所述的动物源型阳离子抗菌肽在降低料肉比，提高饲料报酬方面的应用。
全文摘要
本发明公开了动物源型阳离子抗菌肽的制备方法及其应用。本发明将SEQ ID NO.1所述的阳离子抗菌肽基因克隆到载体，然后将质粒转化进入基因工程菌，在培养基上培养12-16小时，筛选出含有重组质粒的菌落；挑取单菌落于LB液体培养基中，振荡培养至OD600达0.5-0.7；加入IPTG，振荡培养3h，诱导蛋白表达；4℃离心10分钟收集菌体；用裂解缓冲液将菌体重悬，冰浴，超声破碎细胞，使蛋白释放；使用Chitin柱对蛋白进行纯化。试验证明本发明阳离子抗菌肽具有广谱抗菌作用和很高的抗菌活性，可以替代抗生素防治畜禽细菌性感染，为临床上新型抗菌药的开发展示了新途径。
文档编号A61P31/04GK102229666SQ20111014047
公开日2011年11月2日 申请日期2011年5月27日 优先权日2011年5月27日
发明者刘思当, 汪安国, 王尚明, 高蕾 申请人:山东迅达康兽药有限公司