专利名称：一种抗肿瘤的药物组合物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物领域，涉及一种抗肿瘤的药物组合物及其制备方法和应用。
背景技术：
肿瘤的死亡率在我国高居第二位、仅次于心脑血管疾病，近年每年新增肿瘤患者 250万人，北京市发病率年增2. 58%。由于环境、食物、水污染的加剧以及生活方式的改变， 人类普遍感受到肿瘤的威胁。除了常规的外科手术、化疗、放疗，人类正积极寻求其它低毒副作用的治疗与辅助治疗方法。原发性肝癌是临床上常见的消化道恶性肿瘤，发病率在全球呈上升趋势，每年新发病例约62万例，死亡约60万例[1]，位居全球肿瘤相关死亡的第3位。我国是原发性肝癌大国，发病率与死亡率均居世界之首，我国每年发病人数约34. 7万例，占全球的55%，死亡人数约32. 3万例，约占全球的M%，在肿瘤相关死亡中仅次于肺癌，位居第二 ra。外科手术切除是治疗原发性恶性肿瘤的首选手段，但由于原发性恶性肿瘤起病隐蔽、进展迅速、早期诊断率低，大多数患者在确诊时已经局部或远处转移，无法得到有效的手术治疗。放疗因其屏蔽作用不能保证肿瘤周围的正常组织不受损害而导致各种严重的并发症。化疗是治疗中晚期恶性肿瘤的常用方法之一，可以起到姑息性治疗作用，但目前临床上使用的化疗药物都具有明显的毒副作用、价格昂贵、易产生耐药性，同时治疗效果也不尽如人意。中药或天然药物抗肿瘤作用大多是通过多靶点、多效应来阻断肿瘤发生、发展的多个环节而发挥作用，同时中药具有毒副作用低、价格低廉和耐药性低等优点，因此中药抗肿瘤的研究在国内外倍受重视[3]。从中药或天然药物中探寻、分离提取抗癌作用强、毒副作用小、抑瘤谱广、价格便宜的天然化合物，是研究新的抗肿瘤药物的重要途径。壳寡糖(chitoSan，CTS)是由2-10个2-氨基葡萄糖通过β-1，4-糖苷键连接组成的寡糖，是甲壳素脱乙酰基后进一步的降解产物，具有良好的生物相容性和生物可降解性， 水溶性好，易吸收，而且无毒副作用。壳寡糖有多种生物功能，已应用于医药、食品、农业、化妆品等各个领域。在日本、美国等国家，将壳寡糖作为功能性食品成分广泛地应用于保健食品。近年来，国内外研究证实壳寡糖及其衍生物具有抑制癌细胞及肿瘤生长等作用[4]，作为抗肿瘤药，吸收率高、长期口服无毒副作用是其优点，但抑瘤率较低是它最大的弱点。虫丘蚓纤溶酶(earthworm fibrinolytic enzyme, EFE)亦称蚓激酶(lumbro kinase, LK)，是从蚯蚓提取的一种具有纤维蛋白溶解活性的蛋白水解酶，口服可以进入血流，临床上口服用于溶解血栓(蚓激酶胶囊、普恩福、博洛克)；无明显毒副作用，也见于保健食品(龙舒泰精制地龙胶囊)。目前国内外对壳寡糖、蚯蚓纤溶酶抗肿瘤的研究仅限于单药的研究，虽然两个单药无毒副作用或无明显毒副作用，但抗肿瘤的作用也相对较弱，在实验动物、在临床应用效果也不够理想。能否在利用其安全性的同时、大幅度提高抗肿瘤效果，使之成为理想的抗肿瘤新药。
发明内容
抗肿瘤治疗周期长、影响因素多，特别是中晚期患者机体已经衰弱，因此抗肿瘤药的安全性和抗肿瘤效果是两个并重的指标。从中药或天然药物分离提取抗肿瘤有效成分， 选择低毒副作用的有效成分，试验它们不同的配方组合以求大幅度提高抗肿瘤效果，是开拓抗肿瘤新药的有效途径。本发明采用体内和体外实验相结合，以人肝癌SMMC-7721细胞株和小鼠肝癌H22移植瘤为模型，进一步研究壳寡糖-蚯蚓纤溶酶不同配比组合物的抑瘤效果、抑瘤机理以及对动物的毒副作用，旨在保持无毒副作用-无明显毒副作用的基础上， 显著提高新的药物组合物的抗肿瘤效果。本发明的目的是通过以下方式实现的一种抗肿瘤的药物组合物，其特征在于该药物组合物的有效成分包括壳寡糖和蚯蚓纤溶酶(又称蚓激酶)；其中，壳寡糖和蚯蚓纤溶酶的用量比为IOOg 10万 100 万uku，优选为IOOg 10万 70万uku，进一步优选IOOg 10万 30万uku，最优选 IOOg 20万 30万uku。本发明所采用的原料可为壳寡糖或蚯蚓纤溶酶不同程度提取、 提纯的粗制品、精制品及其衍生物或其它含壳寡糖、含蚯蚓纤溶酶的复方或者混合物。采用的壳寡糖聚合度为2 10。本发明所述的壳寡糖和蚯蚓纤溶酶可直接混合制成散剂或加入药学可接受的辅料制成口服制剂。所述的口服制剂为胶囊剂、片剂、颗粒剂或丸剂；胶囊剂优选肠溶胶囊，颗粒剂优选肠溶颗粒剂、片剂优选肠溶片剂。该药物组合物的服用剂量为成人日服壳寡糖300 4500mg和蚯蚓纤溶酶600 3000ukuo本发明所述的抗肿瘤的药物组合物可在制备治疗或预防肿瘤的药物或辅助抗肿瘤的保健食品中应用。特别是在制备治疗或预防乳腺癌、胃癌、肺癌、直肠癌、食道癌、肝癌、 胰腺癌的药物或辅助抗肿瘤的保健食品中应用。本发明所使用的壳寡糖具体可通过以下方法制备得到酶解法制备的食品级壳寡糖的水溶液，超过滤，合并滤过液，冷冻干燥，得聚合度2-10的壳寡糖白色粉末。所使用的蚯蚓纤溶酶可通过以下方法制备得到新鲜赤子爱胜蚓为原料，勻浆、 NaCl溶液抽提，用活化的大孔阴离子交换树脂交换、洗涤、洗脱，洗脱液超过滤、洗涤、浓缩， 冷冻干燥，即得。本发明通过以下4个方面探讨其抗癌功效1.体外试验①取对数生长期人肝癌SMMC-7721的单细胞悬液，细胞浓度3 X IO4个/ml接种96 孔板、每孔200 μ 1，培养Mh.后加入不同浓度的单药或药物组合物继续培养Mh.、48h.、 72h.，吸弃上清、MTT法测定癌细胞增殖抑制率。②单细胞悬液接种细胞瓶，生长贴壁后加入不同浓度单药或药物组合物继续培养 48h.，在倒置显微镜下观察细胞形态；同时胰蛋白酶消化收集细胞，测定细胞凋亡率。2.体内试验给昆明种小鼠皮下注射定量荷瘤鼠腹水细胞，制备鼠肝癌H22移植瘤模型。分别用单药或者不同配方的药物组合物给药20天，停药24h后处死动物①剥离瘤块计算抑瘤率；②取出肝、肾，固定、切片、HE染色，作组织病理学观察；③眼眶采血、生化检测肝肾功能；④剥离脾脏称重、计算脾指数。3.抗肿瘤机制的探讨不同浓度的单药或药物组合物加入人肝癌SMMC-7721细胞培养孔、继续培养48h， 提取细胞RNA，用RT-PCR测定细胞Bcl-2基因表达的变化。扩增得到的PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳，用ImageJ软件进行定量分析。鼠肝癌H22移植瘤的荷瘤鼠，经不同浓度的单药或药物组合物灌胃治疗20天后， 处死动物、剥离瘤块，固定、切片，用免疫组化的方法检测肿瘤组织中Bcl-2蛋白的表达。4.在晚期肿瘤患者的初步临床应用经过反复的动物试验和多名健康志愿者口服试验、确证本发明药物组合物的安全性后，应31名晚期肿瘤患者和家属的要求，自愿服用本发明药物组合物，观察其疗效和安全性。与现有技术比较本发明的有益效果1.通过对实验动物的观察和动物肝肾的组织病理观察、肝肾功能生化检测以及脾指数计算证实，本发明药物组合物无明显毒副作用。本发明的药物组合物用于晚期肿瘤患者，长者连续18个月，同样未出现明显毒副作用。2.本发明的药物组合物与两个单药体外、体内的抗肿瘤效果相比十分显著地提高癌细胞增殖抑制率；十分显著地提高抑瘤率；十分显著地提高肿瘤细胞凋亡率；十分显著地下调Bcl-2 mRNA的表达和下调Bcl_2蛋白的表达。3.本发明的药物组合物中两个单药的相互作用性质为协同作用。因此，本发明药物组合物用于制备治疗或预防肿瘤的药物或辅助抗肿瘤的保健食品，具有十分良好的应用前景与显著的社会效益和经济效益。
图1-1.单药壳寡糖抑制人肝癌SMMC-7721细胞的量效曲线图1-2.单药蚯蚓纤溶酶抑制人肝癌SMMC-7721细胞的量效曲线图1-3.药物组合物壳寡糖-蚯蚓纤溶酶联合抑制SMMC-7721细胞的时效曲线图中，1.lmg/ml 壳寡糖，2. 2mg/ml 壳寡糖，3. 2. 5uku/ml 蚯蚓纤溶酶，4. lmg/ml 壳寡糖+2. 5uku/ml蚯蚓纤溶酶，5. 2mg/ml壳寡糖+2. 5uku/ml蚯蚓纤溶酶，6. 5uku/ml蚯蚓纤溶酶，7. lmg/ml壳寡糖+5uku/ml蚯蚓纤溶酶，8. 2mg/ml壳寡糖+5uku/ml蚯蚓纤溶酶图2-1.生理盐水对照组肝癌SMMC-7721细胞形态的变化图中，生理盐水对照组细胞大小均一，呈上皮型贴壁生长，外形为梭形或多角形， 轮廓清晰，细胞间结构紧密，折光性好，生长旺盛。图2-2. lmg/ml壳寡糖引起肝癌SMMC-7721细胞形态的变化图中，lmg/ml壳寡糖处理4 后，细胞形态未见明显改变，细胞密度略有降低，其余较对照组没有明显变化。图2-3. 3uku/ml蚯蚓纤溶酶引起肝癌SMMC-7721细胞形态的变化图中，3uku/ml蚯蚓纤溶酶处理4 后，细胞形态未见明显改变，细胞密度略有降低。图2-4. 5uku/ml蚯蚓纤溶酶引起肝癌SMMC-7721细胞形态的变化
图中，5uku/ml蚯蚓纤溶酶处理4 后，细胞出现皱缩、逐渐变圆，细胞密度降低， 细胞间接触变松，折光性及贴壁能力变弱。图2-5. lmg/ml壳寡糖luku/ml蚯蚓纤溶酶联合作用引起肝癌SMMC-7721细胞形态的变化图中，lmg/ml壳寡糖_3uku/ml蚯蚓纤溶酶联合作用4 后，细胞明显皱缩，细胞体积变小，密度明显降低。图2-6. lmg/ml壳寡糖_5uku/ml蚯蚓纤溶酶联合作用引起肝癌SMMC-7721细胞形态的变化图中，lmg/ml壳寡糖_5uku/ml蚯蚓纤溶酶联合作用4 后，细胞皱缩严重、体积明显缩小，失去正常多角形的形态，细胞间排列疏松，折光性及贴壁能力变弱。图3-1.生理盐水对照组对SMMC-7721细胞凋亡的影响生理盐水对照组细胞凋亡率(2. 36% )；
Quad %Gated %
UL0.92UR7.18
LL89.57
LR2.36图3-2. 3uku/ml蚯蚓纤溶酶对SMMC-7721细胞凋亡的影响3uku/ml蚯蚓纤溶酶处理48h后细胞凋亡率(15. 22% )
Quad % Gated %
UL5.51UR31.77
LL50.20
LR15.22图3-3. lmg/ml壳寡糖对SMMC-7721细胞凋亡的影响lmg/ml壳寡糖处理48h.后细胞凋亡率(7. 46% )
Quad % Gated %
UL5.18UR9.19
LL78.17
LR7.46图3-4. lmg/ml壳寡糖-;3uku/ml蚯蚓纤溶酶联合对SMMC-7721细胞凋亡的影响lmg/ml壳寡糖luku/ml蚯蚓纤溶酶联合处理细胞48h，凋亡率46% )0药物组合物组凋亡率与单药组、与对照组差异均十分显著(P < 0. 01)。
6Quad % Gated % UL3.18UR 17.19LL 56.17LR 23.46
图4-1.生理盐水对照组移植瘤
图4-2.壳寡糖组(150mg/kg · d)移植瘤，抑瘤率17. 13%。
图4-3.蚯蚓纤溶酶组(lOOOuku/kg · d)移植瘤，抑瘤率18. 65%。
图4-4.壳寡糖(150mg/kg · d)联合蚯蚓纤溶酶(1000uku/kg · d)组移植瘤，抑瘤率 49. 07%。由图4-1、4-2、4-3、4-4可见各组药物对小鼠肝癌H22移植瘤的抑制作用。
图5-1.生理盐水组肝脏切片(X200)
图5-2.壳寡糖组(150mg/kg · d)肝脏切片(X200)
图5-3.蚯蚓纤溶酶组(lOOOuku/kg · d)肝脏切片(X200)
图5-4.壳寡糖(150mg/kg · d)联合蚯蚓纤溶酶(1000uku/kg · d)组肝脏切片(X200)
图6-1.生理盐水组小鼠肾脏切片(X200)
图6-2.壳寡糖组(150mg/kg · d)小鼠肾脏切片(X200)
图6-3.蚯蚓纤溶酶组(lOOOuku/kg · d)肾脏切片(X200)
图6-4.壳寡糖(150mg/kg · d)联合蚯蚓纤溶酶(lOOOuku/kg · d)组肾脏切片(X200)
图7-1.人肝癌细胞Bcl-2 mRNA的RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
图7-2.人肝癌细胞Bcl-2基因表达的半定量分析
图7-1和7-2显示各组药物对人肝癌SMMC-7721细胞Bcl_2 mRNA表达的下调。
其中，M. Maker、l.空白对照、2. 0. 5mg/ml壳寡糖组、3. lmg/ml壳寡糖组、4. 3uku/
ml蚯蚓纤溶酶组、5. 0. 5mg/ml壳寡糖+!3uku/ml蚯蚓纤溶酶组、6. lmg/ml壳寡糖+!3uku/ml 蚯蚓纤溶酶组。图8-1.模型组移植瘤Bcl-2蛋白表达(X200)图中，模型组肿瘤组织中Bcl-2蛋白的表达增强(Bcl-2蛋白染成黄色-棕黄色)图8-2.蚯蚓纤溶酶组(lOOOuku/kg · d)Bcl-2 蛋白表达(X200)图8-3.壳寡糖组(150mg/kg · d)Bcl-2 蛋白表达(X200)图8-4.壳寡糖(150mg/kg · d)_蚯蚓纤溶酶(1000uku/kg · d)组Bcl-2蛋白表达 (X200)
具体实施例方式试验例1单药和药物组合物的制备1.壳寡糖的制备壳寡糖，酶解法生产、食品级，梭子蟹壳为原料，购自潍坊海之源生物制品公司。将食品级壳寡糖溶于蒸馏水成10%溶液，IOOrnl溶液置于MSC400杯式超滤器(上海摩速科学器材)、超滤膜切割分子量2KD，加压、搅拌过滤；补加少量蒸馏水继续加压、搅拌过滤，合并滤过液、冷冻干燥，即得。成品为白色粉末，分子量低于2000D，收得率55%左右。取适量样品HPLC分析M，Waters糖柱，流动相为乙腈水=50 50 (含3%。氨水)，流速为ImL/ min0以葡聚糖标准品制作标准曲线，实测样品聚合度为2-9。2.蚯蚓纤溶酶的制备以新鲜赤子爱胜蚓为原料，采用离子交换法直接从蚯蚓勻浆提取[专利号ZL 2009 10(^6780. 6 —种利用离子交换树脂直接提取蚯蚓纤溶酶的工业化生产方法]。步骤为①新鲜或冷冻赤子爱胜蚓，在0. 14mol/L NaCl溶液中勻浆并搅拌提取2小时，随即4000g离心或过滤除去沉淀，得蚯蚓粗提液。②无离子水调节蚯蚓粗提液的电导率 l-5ml/Ω，已活化的大孔阴离子交换树脂装柱、上样、进行动态离子交换，用电导率l-5ml/ Ω NaCL液洗涤。③用0. 5 4. 5mol/L pH 5-6的NaCl溶液梯度洗脱、收集纤溶酶洗脱峰。④洗脱液通过超过滤洗涤、浓缩，冷冻干燥，即得。⑤产品质量符合国家药品标准 WSl-(X-052)-2001Z 按干品计算效价不低于12000单位/mg(即12uku/mg)，比活力不低于 20000单位/mg蛋白质(即20uku/mg ptrotein)。纤维蛋白平板法[9]实测纤溶酶效价 25uku/mg。试验例2不同单药和药物组合物对人肝癌SMMC-7721细胞生长的抑制作用1.人肝癌SMMC-7721细胞的培养细胞株购自上海细胞所。将SMMC-7721细胞接种于含适量的培养液(RPIM-1640加10%热灭活的小牛血清)的培养瓶内，置37°〇、5%0)2培养箱内培养。胰酶消化法传代细胞，每2 3天传代1 次，取对数生长期细胞用于实验。2.统计学方法采用统计学软件SPSS 13. 0对相关数据进行分析，两样本均数比较采用成组t检验，计数资料比较采用X2检验，以P < 0. 05为有统计学意义。根据Weeb系数[5]来判定联合应用药物的相互作用关系预估效应C = AXB，其中 A、B分别指两个单药作用的细胞实际存活率。当两药联合作用的细胞实际存活率< C时， 联合用药表现为协同作用；当C <联合用药组细胞实际存活率< A和B时，联合用药表现为相加作用。3.人肝癌SMMC-7721细胞增殖抑制试验(1)单药对人肝癌细胞的增殖抑制试验(MTT法)取对数生长期人肝癌细胞，胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液、3X IO4个/ml，接种于96孔板内、200 μ 1/孔，其中3个孔留作空白对照，在37°C、5% CO2培养Mh。取出96 孔板，加入不同浓度梯度的蚯蚓纤溶酶或壳寡糖200 μ 1，使每孔蚯蚓纤溶酶终末浓度分别为 0. 625uku/ml、l. 25uku/ml、2. 5uku/ml、5uku/ml、10uku/ml，每孔壳寡糖终末浓度分别为 0. 125mg/ml、0. 25mg/ml、0. 5mg/ml、lmg/ml、2mg/ml、4mg/ml，阴性对照组每孔加入 200 μ 1 普通培养液，空白孔加200μ1普通培养液不加细胞。每个浓度设4个复孔。置37°C、5% CO2培养箱中分别培养Mh、48h、72h，弃上清，每孔加入5mg/ml MTT 20 μ 1，继续温育4h，吸弃上清，每孔加入二甲基亚砜(DMSO) 150 μ 1，振荡lOmin，用自动酶标读数仪，在波长570nm 处测定各孔吸光值(A)，取4个复孔的平均值。以药物浓度为横轴，A值为纵轴绘制细胞生长曲线，并计算药物作用Mh、48h、72h的增殖抑制率。抑制率=[1-(实验组平均A值-空白孔平均A值)/ (阴性对照组平均A值-空白孔平均A值)]X 100%。试验结果表明1、壳寡糖对SMMC-7721细胞增殖有一定的抑制作用，但是作用较弱。(见图1_1)2.蚯蚓纤溶酶对SMMC-7721细胞增殖有一定的抑制作用(P < 0. 05)，作用比壳寡糖强，具有时间、剂量依赖性。(见图1-2)(2)药物组合物对人肝癌细胞增殖抑制试验(MTT法)根据上一项单药抑制试验结果，计算得出各组的IC5tl值，选择合适的壳寡糖、蚯蚓纤溶酶浓度配比组成联合用药的组合物，重复MTT法，绘制细胞增殖曲线，计算壳寡糖、蚯蚓纤溶酶以及壳寡糖联合蚯蚓纤溶酶作用Mh、48h、72h的细胞增殖抑制率。本试验选择的药物组合物配比为lmg/ml壳寡糖、2mg/ml壳寡糖分别与2. 5uku/ ml蚯蚓纤溶酶、5uku/ml蚯蚓纤溶酶联合作用。(见图1_3)试验结果表明1.壳寡糖联合蚯蚓纤溶酶的四种药物组合物、不同时段对癌细胞的增殖抑制率均显著提高，与对应浓度的两个单药组相比，差异都十分显著(P < 0.01)。 (见图1-3)2. lmg/ml壳寡糖联合2. 5uku/ml或5uku/ml蚯蚓纤溶酶，作用24h、48h和72h，各组的细胞的存活率均高于预计值C、低于相应单药组A和B的实际存活率，两种组合物中两个单药的相互作用性质为相加作用。(见表1、图1-3)3. 2mg/ml壳寡糖联合2. 5uku/ml或5uku/ml蚯蚓纤溶酶，作用24h、48h和72h，各组细胞的存活率均低于预计值C，更低于相应单药组A和B的实际存活率，两种组合物中两个单药的相互作用性质为协同作用。(见表1，图1-3)表1.药物组合物作用于SMMC-7721细胞的存活率和C值(％ )
权利要求
1.一种抗肿瘤的药物组合物，其特征在于该药物组合物的有效成分包括壳寡糖和蚯蚓纤溶酶；其中，壳寡糖和蚯蚓纤溶酶的用量比为IOOg 10万 100万uku。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤的药物组合物，其特征在于药物组合物中壳寡糖和蚯蚓纤溶酶的用量比为IOOg 10万 70万uku。
3.根据权利要求2所述的抗肿瘤的药物组合物，其特征在于药物组合物中壳寡糖和蚯蚓纤溶酶的用量比为IOOg 10万 30万uku。
4.根据权利要求1、2或3所述的抗肿瘤的药物组合物，其特征在于所述的壳寡糖聚合度为2 10。
5.根据权利要求1所述的抗肿瘤的药物组合物，其特征在于壳寡糖和蚯蚓纤溶酶直接混合制成散剂或加入药学可接受的辅料制成口服制剂。
6.根据权利要求5所述的抗肿瘤的药物组合物，其特征在于所述的口服制剂为胶囊剂、片剂、颗粒剂或丸剂。
7.根据权利要求6所述的抗肿瘤的药物组合物，其特征在于所述的胶囊剂为肠溶胶囊，颗粒剂为肠溶颗粒剂，片剂为肠溶片剂。
8.根据权利要求1所述的抗肿瘤的药物组合物，其特征在于该药物组合物的服用剂量为成人日服壳寡糖300 4500mg和蚯蚓纤溶酶600 3000uku。
9.权利要求1所述的抗肿瘤的药物组合物在制备治疗或预防肿瘤的药物或辅助抗肿瘤的保健食品中的应用。
10.权利要求1所述的抗肿瘤的药物组合物在制备治疗或预防乳腺癌、胃癌、肺癌、直肠癌、食道癌、肝癌、胰腺癌的药物或辅助抗肿瘤的保健食品中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种抗肿瘤的药物组合物及其制备方法和应用，该药物组合物的有效成分包括壳寡糖和蚯蚓纤溶酶；其中，壳寡糖和蚯蚓纤溶酶的用量比为100g∶10万～100万uku。本药物组合物中两个单药的相互作用关系为协同增效作用。
文档编号A61K31/722GK102225198SQ201110178160
公开日2011年10月26日 申请日期2011年6月28日 优先权日2011年6月28日
发明者张晓晓, 张治国, 连桂芳 申请人:南京农业大学