专利名称：Toll样受体7和8激动剂及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种激动剂，特别涉及一种Toll样受体7和8(TLR7/8)激动剂及应用。
背景技术：
对于病毒和肿瘤，直至目前，人们没有很好的药物来应对，对于非自限性病毒和多种肿瘤，机体免疫系统仍是主要的防御力量。近年来，一些免疫调节剂，比如肿瘤坏死因子a(TNF-a)，自介素12(IL-12)和白介素6(IL_6)等细胞因子，被用于抗病毒和抗肿瘤治疗中，疗效比较理想，但是，价格昂贵，难以联合使用。
自从90年代末期，Toll样受体(TLR)发现以来，人们逐渐认识到多种TLR家族成员处于机体免疫前线，能够特异性地识别不同的病原模式分子，启动固有免疫，来阻击外源性病原微生物的入侵和破坏。这些病原模式分子主要包括脂蛋白、脂多糖和核酸结构的碎片等，由此可见，虽然病原微生物中的外壳蛋白可能早期接触机体免疫系统，而核酸序列可能在病毒复制繁殖后，才被机体识别，因此，机体免疫系统往往处于“被动”防御的状态。为了提高机体的“主动”防御机制，国内外学术界认识到，根据TLR识别特征，来操控免疫调节，增进免疫力，可以提高抗病毒和抗肿瘤的效果。
2004年Heil小组在《科学》杂志上发表文章，首次提出了病毒中一组富含⑶结构的单链RNA能够被机体免疫细胞上的TLR7和TLR8特异性地识别，特别是，其中被称为 ssRNA40的序列，结构为GCCGUCUGUU⑶⑶GACUC，能够刺激以TNF_a，IL-12和IFN-a为主的多种细胞因子高水平释放，为细胞免疫治疗提供了新的策略。
那么，科学利用TLR7/8识别病毒病原模式分子，并介导多种细胞因子释放的特性，有利于增进机体免疫力；同时，TLR7/8的天然配基(核苷酸片段)相对于细胞因子，在价格上要便宜，质量便于控制，安全性好，因此，寻找高效的TLR7/8天然激动剂或类天然激动剂，对于临床抗病毒和抗肿瘤治疗都具有积极的意义。
申请人长期从事Toll样家族相关先天免疫研究，目前，针对TLR7/8识别病毒单链 RNA特征的规律，利用生物信息学技术，高通量分析了富含GU结构的RNA基序，包括不同侧翼碱基的组合排列特征序列，通过实验筛选验证，成功获得了本发明的SSRNA120，其免疫效率在先前SSRNA40的两倍以上，可作为未来抗病毒和抗肿瘤的辅助治疗药物。发明内容
本发明的目的在于提供一种Toll样受体7和8激动剂及用途。所述激动剂能特异性作用于TLR7/8，促使机体免疫细胞高效释放TNF-a，IL-12和IFN_a等细胞因子，从而上调免疫功能，可用于抗病毒和抗肿瘤的辅助治疗。
本发明的技术方案是
Toll样受体7和8(TLR7/8)的强力激动剂，所述强力激动剂包含 ⑶CUGA⑶⑶⑶UCUUG的核苷酸序列片段。
上述激动剂在制备治疗抗病毒和抗肿瘤药物中的用途。
本发明所述激动剂基本结构为5、-GUCUGAGUGUGUUCUUG-3"的核苷酸序列片段，其中富含GU结构，以及相应的侧翼碱基组合排列特征，可通过硫代骨架修饰来稳定其结构。 本发明所述激动剂能与TLR7/8发生特异性结合，促使机体免疫细胞高效释放TNF-a，IL-12 和IL-6等细胞因子，从而上调免疫功能。其效能是以往报道的SSRNA40的两倍以上。
本发明所述激动剂的制备过程按上述核苷酸序列，通过普通RNA化学合成、硫代修饰并纯化的方法获得。所述激动剂剂型为粉末(水溶性)，使用时，经HBS缓冲液稀释， 并与DOTAP(阳离子脂质体)形成混合液(按1 2体积比，详见实施例1)。该激动剂可在体外诱导细胞活化后，进行回输疗法，或通过注射剂或输液剂等形式给药。可分高中低三个剂量，酌情给药针对体外诱导使用时，高剂量为25 μ g/lxlO6个靶细胞/ml，中剂量为 10yg/lxl06个靶细胞/ml，低剂量为Syg/lxlO6个靶细胞/ml ；刺激时间M小时后，进行回输。针对成人可经静脉体内诱导时，高剂量10mg，中剂量5mg，高剂量2. 5mg。可按每天一次，每周为一个疗程，实际疗程次数可按临床具体情况而定。
由于本发明所述激动剂的作用靶点明确、活化效率高、安全性好的优点，在免疫调节过程中，能有力增进机体免疫功能，可作为抗病毒、抗肿瘤的辅助治疗药物，以及相关研究实验用的试剂，具有广泛的应用前景。
图1为SSRNA120通过TLR7刺激细胞因子TNF_a释放状况；
图2为ssRNA120通过TLR8刺激细胞因子TNF_a释放状况；
图3为ssRNA120通过TLR8刺激细胞因子IL-12释放状况；
图4为SSRNA120刺激人外周血单个核细胞释放细胞因子状况；具体实施方式
下面的实施例可详细地说明本发明，但不以此限制本发明。
实施例1 :Toll样受体7和8激动剂实例及制备
激动剂名称ssRNA120
序列结构GUCUGA⑶⑶⑶UCUUG
jf㈣ π I^J :rG氺rU氺rC氺rU氺rG氺rA氺rG氺rU氺rG氺rU氺rG氺rU氺rU氺rC氺rU氺rU氺rG (氺为ψι it修饰，r为RNA)
制备方式化学合成，委托美国htegrated DNA technologies (IDT)公司。初产量为 250 nmole RNA oligo，纯化量为 45. 2 nmoles，即 255. 5 μ g。
使用配置1) ssRNA120由HBS缓冲液稀释成0. 1 μ g/ μ 1 ；
2)阳离子脂质体DOTAP由HBS缓冲液，以1 3比例稀释；
3)将上述第1和2步试剂按1 2比例混合，作为工作液。
实施例2 :ssRNA 120通过TLR7的免疫活化效应测定(ELISA法)
2. 1主要材料、试剂与设备
1)细胞株=RAff264. 7 (ATCC, USA.)。
2)细胞培养基:DMEM (Gibco, Inc.，USA)。
3)参考试剂fakeRNA120(5，-GACAGAGAGAGAACAAG-3，)
ssRNA40(5，-GCCGUCUGUU⑶⑶GACUC-3，)
(IDT, Inc.合成)
4)Elisa 试剂盒抗鼠 TNF_a(eBioscience，Inc.，USA)。
5)细胞培养箱FORMA 3111.
6)酶标仪全波长多功能酶标仪(Thermo Scientific, USA).
2. 2实验方法将RAW264. 7细胞稀释至1 X 106/mL，加入96孔板(200 μ L/孔)，置 37°C,5%C02培养箱培养2h后，加入5 μ g/ml ssRNA120为实验组；5 μ g/mlssRNA40为阳性对照组；5 μ g/ml fakeRNA120为无效对照组；D0TAP-HBS缓冲液为空对照组，以上各组均设 4复孔。继续培养24h后，收集上清，按试剂盒操作说明，进行Elisa实验，以450nm处测定的各孔吸光度(OD45tl)值，获取TNF-a浓度。
2. 3实验结果ssRNA120与ssRNA40均能刺激7细胞释放TNF_a，并且， ssRNA120刺激力显著高于ssRNA40(P < 0. 001)，但是，fakeRNA120无刺激效应，因此， 相对于fakeRNA120的GA结构，说明ssRNA120的⑶结构发挥了刺激作用；同时，相对于 SSRNA40，说明SSRNA120的GU结构与相邻碱基的不同排列后，能发挥更强的刺激作用。此外，由于7细胞本身含有TLR7而无TLR8，所以，此状态下，该效应主要为ssRNA120 经TLR7介导的。如附图1所示。
实施例3 :ssRNA 120通过TLR8的免疫活化效应测定(ELISA法)
3. 1主要材料、试剂与设备
1)细胞株THP-1 (ATCC, USA.)。
2)细胞培养基RPMI1640 (Gibco, Inc.，USA)。
3) Elisa 试剂盒抗人 TNF_a 和抗人 IL_12p40 (eBioscience，Inc.，USA)。
4)细胞培养箱FORMA 3111.
5)酶标仪全波长多功能酶标仪(Thermo Scientific, USA).
3. 2实验方法将THP-I细胞稀释至1 X 106/mL，加入96孔板(200 μ L/孔)， 置37 °C，5% CO2培养箱培养2h后，以1.25,2. 5, 5,10, 20 μ g/ml为浓度梯度，分别加入 SSRNA120设为各剂量实验组；并以此梯度加入SSRNA40设立各剂量对照组，以上各组均设4 复孔。培养24h后收集上清，按试剂盒操作说明，进行Elisa实验，分别检测TNF-a和IL-12 的浓度。
3. 3实验结果ssRNA120和ssRNA40均能刺激THP-1细胞释放TNF_a和IL-12，而且，SSRNA120刺激效能约是SSRNA40的两倍，并且量效关系明显。同时，由于THP-I本身含有TLR8而无TLR7，故该效应主要是ssRNA120通过TLR8介导的。如附图2，图3所示。
实施例4 :ssRNA 120对人外周血单个核细胞(hPBMC)的免疫活化效应测定
3. 1主要材料、试剂与设备
1)细胞hPBMC (西南医院血库提高.)。
2)细胞培养基RPMI1640 (Gibco, Inc.，USA)。
3)Elisa 试剂盒抗人 TNF_a，抗人 IL_12p40，抗人 IL-6 (eBioscience，Inc.，USA)。
4)细胞培养箱FORMA 3111.
5)酶标仪全波长多功能酶标仪(Thermo Scientific, USA).
3. 2实验方法将hPBMC细胞稀释至1 X 106/mL，加入96孔板QOO μ L/孔)，置 370C ,5% CO2培养箱培养2h后，加入5 μ g/ml ssRNA120为药物刺激组，D0TAP-HBS缓冲液为空对照组，各组设4复孔。培养24h后收集上清，按试剂盒操作说明，进行Elisa实验，分别检测各细胞因子浓度。
3. 3实验结果由于hPBMC同时含有TLR7和8，实验数据表明，相对于DOTAP组， ssRNA120能刺激hPBMC高水平释放TNF_a，IL-12以及IL-6 (ρ < 0. 001)。如附图4所示。
权利要求
1.一种iToll样受体7和8激动剂，其特征在于激动剂包含⑶CUGAGUGUGUUCUUG的核苷酸序列片段。
2.权利要求1所述的激动剂在制备治疗抗病毒和抗肿瘤药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种针对Toll样受体7和8激动剂及用途，所述激动剂为含有17个碱基特征的核苷酸序列片段，其基本结构为GUCUGAGUGUGUUCUUG。所述激动剂能特异性与TLR7/8结合，促使机体免疫细胞高效释放TNF-a，IL-12和IL-6等细胞因子，而上调免疫功能，可用于抗病毒和抗肿瘤的辅助治疗。
文档编号A61P31/12GK102499938SQ201110328040
公开日2012年6月20日 申请日期2011年10月25日 优先权日2011年10月25日
发明者周红, 曹红卫, 李彦, 祝元峰, 郑江 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院