专利名称：一种核酸及药物载体和药物组合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及药学领域，具体涉及一种核酸、一种药物载体的制备方法、一种药物载体、一种药物组合物的制备方法和一种药物组合物。
背景技术：
核酸适配体是指能与特定靶分子特异性结合的DNA或RNA。1990年Tuerk和Ellingto报道了一种在体外应用随机单链寡核苷酸文库筛选、扩增特定配体的技术，此种技术可以得到与非核酸靶分子具有高亲和力、高特异性结合的寡核苷酸序列，此技术称为指数富集配基的系统进化技术(SELEX)，筛选出来的寡核苷酸序列称为核酸适配体(Aptamer)。由于核酸适配体与抗体类似,与祀物质结合的特异性亲和力可甚至优于抗体，加上其靶分子广、稳定性强、易改造修饰等特点，可在基础研究、临床诊断、药物研发等方面得以广泛应用。但是，现有的核酸适配体虽然具有与靶物质结合的特异性亲和力而具有靶向性，但是并不具有负载药物的能力。
发明内容
本发明的目的是克服现有的靶核酸适配体不能负载药物的缺陷，提供一种既具有核酸适配体靶向性又能够负载药物的药物载体。本发明提供了一种核酸，其特征在于，该核酸的结构如式(I)所示:V-W-X-Y -Z 式(I)其中，V、W、X、Y和Z各自为单链核酸片段且通过磷酸二酯键依次连接3为核酸适配体的碱基序列和X的碱基序列反向互补，V的核苷酸长度为4-20nt，X的核苷酸长度为4-20nt ；ff的核苷酸长度为4-10nt且不能与V、X、Y或Z互补；Y的核苷酸长度为4_15nt且不能与V、W、X或Z互补。另一方面，本发明还提供了一种药物载体的制备方法，其特征在于，该方法包括:将如上所述的核酸进行变性和退火。另一方面，本发明还提供了一种药物载体，该药物载体为根据如上所述的药物载体的制备方法制备得到的药物载体。另一方面，本发明还提供了一种药物组合物的制备方法，该方法包括:在如上所述的药物载体上负载药物化合物，所述药物化合物为能够与双螺旋DNA结合的药物化合物。另一方面，本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物为根据如上所述的药物组合物的制备方法制备得到药物组合物,且该药物组合物的粒径为5-20nm。本发明提供的核酸既具有靶向性又能够负载药物。本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式
部分予以详细说明。
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式
一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中:图1表示实施例1制备的药物载体的DNA琼脂糖凝胶电泳图。图2表示实施例1、4和5制备的药物组合物(相对于阿霉素溶液中的每mg的阿霉素，第二步得到的含有本发明所述的药物载体的溶液中的核酸用量分别为0mg、0.17mg、lmg、l.67mg、6.67mg和16.7mg)和本底样品的突光图谱。图3表示实施例1制备的药物载体载药前后的圆二色光谱扫描图。图4表示实施例1制备的药物组合物的透射电镜图。图5表示实施例1制备的药物组合物的粒径分布图。图6表示实施例1制备的药物组合物的稳定性荧光扫描图。图7表示实施例1制备的药物组合物的细胞毒性实验结果图。图8表示实施例2制备的药物组合物的细胞毒性实验结果图。图9表示实施例3制备的药物组合物的细胞毒性实验结果图。
具体实施例方式以下结合附图对本发明的具体实施方式
进行详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式
仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。本发明提供了一种核酸，其特征在于，该核酸的结构如式⑴所示:V-W-X-Y-Z 式(I)其中，V、W、X、Y和Z各自为单链核酸片段且通过磷酸二酯键依次连接3为核酸适配体的碱基序列和X的碱基序列反向互补，V的核苷酸长度为4-20nt，X的核苷酸长度为4-20nt且不能与V、X、Y或Z互补；W的核苷酸长度为4_10nt ；Y的核苷酸长度为4_15nt且不能与V、W、X或Z互补。其中，式(I)中，左端表示单链核酸的5’羟基位置，右端表示单链核酸的3’羟基位置。V、W、X、Y和Z之间的的磷酸二酯键自左向右为5’到3’的方向。其中，V的核苷酸长度为 4-20nt，例如可以为 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20nt。其中，X的核苷酸长度为 4-20nt，例如可以为 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19 或 20nt。其中，W的核苷酸长度为4-10nt，例如可以为4、6、8、或10nt。其中，Y的核苷酸长度为4-10nt，例如可以为4、5、6、7、8、9或10nt。其中，nt是指核苷酸(nucleotide)的数目。根据本发明所述的核酸，其中，V中的碱基各自独立地为鸟嘌呤(G)或胞嘧啶(C)，X中的碱基各自独立地为鸟嘌呤(G)或胞嘧啶(C)。其中，V的碱基序列和X的碱基序列反向互补，即经过变性和退火后，V和X能够形成双螺旋结构，且该双螺旋结构中的碱基对均为鸟嘌呤与胞嘧啶配对形成的。根据本发明所述的核酸，其中，Z的序列可以为核酸适配体的各种序列，Z可以为DNA或RNA，也可以为DNA和RNA的杂合分子，还可以带有本领域公知的各种核酸修饰，优选情况下，Z 的序列可以为 SEQ ID NO:I (GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG) ,SEQ ID NO:2(GCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGGCGGGGTCACATG)或 SEQ ID NO:3 (GGCGTACGGTAGGCGGGGTCAACTG)。根据本发明所述的核酸，其中，W能够连接V和X即可，优选情况下，W的序列可以为 SEQ ID NO:7 (TTGT)、SEQ ID NO:8 (ATTGTT)或 SEQ ID NO:9 (TATTGTTA)。根据本发明所述的核酸，其中，Y能够连接X和Z即可，优选情况下，Y的序列为SEQID NO:10(TTTT)、SEQ ID NO: 11 (TTTTTT)或 SEQ ID NO: 12 (TTTTTTTT)。根据本发明所述的核酸，其中，优选情况下该核酸的序列为SEQ ID NO:4(CCCCCCTTGTGGGGGGTTTTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG),SEQ ID NO:5 (GGCGGCGGCTTGTGCCGCCGCCTTTTTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG)或 SEQ ID NO:6 (CGCGCGCGTTTGTACGCGCGCGTTTTTTTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG)。本发明所述的核酸可以通过常规的核酸合成方法来制备。本发明还提供了一种药物载体的制备方法，其特征在于，该方法包括:将如上所述的核酸进行变性和退火·。即，本发明所述的药物载体是经过变性和退火后形成了由其核苷酸序列属性所决定的三维结构的核酸。其中，所述变性和所述退火均可以按照本领域公知的方法进行，例如，按照文献(分子克隆实验指南，科学出版社，2002年出版)中的方法进行。根据本发明所述的药物载体的制备方法，其中，优选情况下，所述变性和所述退火均在缓冲液中进行。其中，相对于每重量份的所述核酸，所述缓冲液的用量可以为100-100000重量份，优选为1000-10000重量份。其中，优选情况下，所述缓冲液中，钾离子的含量为150_250mM，镁离子的含量为3-5mM,Tris的含量为26-30mM，pH值为7.2-7.8。在该优选情况下，所述药物载体具有靶向性更好的优异性能。根据本发明所述的药物载体的制备方法，其中，优选情况下，所述变性的温度为95-105°C，变性的时间为4-6分钟；所述退火的降温速度为10-30°C /分钟，所述退火的结束温度为15_25°C。在该优选情况下，所述药物载体具有靶向性更好且稳定性更好的优异性倉泛。本发明还提供了一种药物载体，该药物载体为根据如上所述的药物载体的制备方法制备得到的药物载体。本发明还提供了一种药物组合物的制备方法，该方法包括:在如上所述的药物载体上负载药物化合物，所述药物化合物为能够与双螺旋DNA结合的药物化合物。根据本发明所述的药物组合物的制备方法，其中，负载的条件可以为能使DNA与药物化合物结合的条件，优选情况下，负载的条件包括:温度为0-4°C，时间为2-5小时。其中，典型地，相对于每重量份的药物化合物，所述药物载体的用量可以为0.001-100重量份，优选为0.01-50重量份，更优选为0.1-40重量份，更进一步优选为
0.5-20重量份。其中，所述药物载体的用量是以所述药物载体中的核酸的量计算的。其中，可以通过将所述药物载体的溶液与所述药物化合物的溶液混合的方法进行负载，所述药物载体的溶液中，所述药物载体的浓度可以为0.001-10mg/ml，所述药物化合物的溶液中，所述药物化合物的浓度可以为0.001-10mg/ml。根据本发明所述的药物组合物的制备方法，其中，能够与双螺旋DNA结合的药物化合物已为本领域公知。典型地，所述药物化合物可以为阿霉素、柔红霉素、喜树碱、表阿霉素和米托蒽醌中的至少一种。本发明还一种药物组合物，该药物组合物为根据如上所述的所述的药物组合物的制备方法制备得到药物组合物，且该药物组合物的粒径为5-20nm。以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，核酸均由三博远志公司进行合成；DNA琼脂糖凝胶电泳采用的是EB染色的方法，其中EB溶液为TIANGEN公司的市售品，琼脂糖为invtoogen公司的市售品；荧光萃灭图谱是通过多功能连续酶标仪测得，所用酶标仪为TECAN公司出产，型号为Infinite M200 ;圆二色光谱图通过JASCO公司的J-810型号的圆二色光谱仪扫描测得；透射电镜图通过FEI公司的透射电镜(TecnaiG2 20S-TWIN, 200kV)观察得到；粒径分析图谱通过Malvern公司的激光粒度仪动态光散射(Zetasizer NanoZS)测定。实施例1本实施例通过包括如下步骤的方法制备药物组合物。第一步:合成序列为SEQ ID NO:4 (5’-CCCCCCTTGTGGGGGGTTTTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’)的DNA(由三博远志公司提供商业化DNA合成服务)，即为本发明所述的核酸。第二步:将300D (1000 μ g)的序列为 SEQ ID NO:4 的 DNA 与 1000 μ I (约 IOOOmg)缓冲液(150mM的KCl、3mM的MgCl2和26mM的Tris-HCl的水溶液)混合，然后在95°C水浴中保持4分钟后以10°C /分钟的降温速度降至室温，即得到含有本发明所述的药物载体的溶液(核酸浓度为lmg/ml)。此溶液即为通过本 发明提供的药物载体制备方法制备得到的药物载体的溶液状态。第三步:将第二步得到的含有本发明所述的药物载体的溶液(含有Img的核酸)与浓度为10μΜ(5.79mg/ml)阿霉素溶液(含有Img的阿霉素)混合，2°C下，孵育2小时，即得到含有本发明所述的药物组合物的溶液。此溶液即为通过本发明提供的药物组合物制备方法制备得到的药物组合物的溶液状态。实施例2本实施例通过包括如下步骤的方法制备药物组合物。第一步:合成序列为SEQ ID NO:5 (5J-GGCGGCGGCTTGTGCCGCCGCCTTTTTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’ )的DNA (由三博远志公司提供商业化DNA合成服务)，即为本发明所述的核酸。第二步:将20D (66 μ g)的序列为 SEQ ID NO:5 的 DNA 与 230 μ I (约 230mg)缓冲液(200mM的KCl、4mM的MgCl2和28mM的Tris-HCl的水溶液)混合，然后在100°C水浴中保持5分钟后以20°C /分钟的降温速度降至室温，即得到含有本发明所述的药物载体的溶液(核酸浓度为0.29mg/ml)。此溶液即为通过本发明提供的药物载体制备方法制备得到的药物载体的溶液状态。第三步:将第二步得到的含有本发明所述的药物载体的溶液(含有0.066mg的核酸)与浓度为 ο μ M(5.27mg/ml)柔红霉素溶液(含有1.2Img的柔红霉素)混合，4°C下，孵育2小时，即得到含有本发明所述的药物组合物的溶液。此溶液即为通过本发明提供的药物组合物制备方法制备得到的药物组合物的溶液状态。实施例3本实施例通过包括如下步骤的方法制备药物组合物。第一步:合成序列为SEQ ID NO:6(5’-CGCGCGCGTTTGTACGCGCGCGTTTTTTTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’ )的DNA (由三博远志公司提供商业化DNA合成服务)，即为本发明所述的核酸。第二步:将IOD (33 μ g)的序列为 SEQ ID NO:6 的 DNA 与 230 μ I (约 230mg)缓冲液(200mM的KCl、4mM的MgCl2和28mM的Tris-HCl的水溶液)混合，然后在95°C水浴中保持4分钟后以30°C /分钟的降温速度降至室温，即得到含有本发明所述的药物载体的溶液(核酸浓度为0.14mg/ml)。此溶液即为通过本发明提供的药物载体制备方法制备得到的药物载体的溶液状态。第三步:将第二步得到的含有本发明所述的药物载体的溶液(含有0.033mg的核酸)与浓度为8 μ M (4.34mg/ml)表阿霉素溶液(含有0.99mg的表阿霉素)混合，1°C下，孵育3小时，即得到含有本发明所述的药物组合物的溶液。此溶液即为通过本发明提供的药物组合物制备方法制备得到的药物组合物的溶液状态。实施例4 按照实施例1的方法制备药物组合物，所不同的是，在第三步中，相对于阿霉素溶液中的每mg的阿霉素，第二步得到的含有本发明所述的药物载体的溶液中的核酸用量分别为 0.17mg、1.67mg、6.67mg 和 16.7mg。实施例5按照实施例1的方法制备药物组合物，所不同的是，在第三步中，用水替代阿霉素的溶液，水的用量与第二步得到的含有本发明所述的药物载体的溶液的体积相等。测试实施例1将实施例1-3得到的纳米药物组合物分别按如下方法进行凝胶电泳分析、负载药物荧光萃灭检测、圆二色光谱分析、显微形态观察、粒径分布测试和稳定性测试。按照文献(分子克隆实验指南，科学出版社，2002年出版)中的方法，通过1% (重量体积比)的琼脂糖凝胶电泳分析，EB染色分析，测得实施例1中的药物载体如图1所示的条带，图1中的电泳条带亮度明显较强，说明实施例1中的药物载体形成了 DNA双链结构。通过Tecan公司的M200连续光谱多功能酶标仪，按照其说明书中的方法，扫描实施例1、4和5制备的药物组合物(相对于阿霉素溶液中的每mg的阿霉素，第二步得到的含有本发明所述的药物载体的溶液用量(以核酸的量计算)分别为0mg、0.17mg、lmg、l.67mg、
6.67mg和16.7mg)和本底样品的荧光图谱，结果如图2所示。其中，以实施例1中的缓冲液作为本底(基线)样品。图2的结果表明阿霉素的荧光随着核酸浓度的升高而减低，说明阿霉素能够嵌插到核酸分子结构中，进而引起荧光的萃灭。
通过JASCO公司的J-810圆二色光谱分析仪，按照其说明书中的方法，检测实施例1制备的药物载体和药物组合物的圆二色光谱图，结果如图3所示，图3的结果说明经过退火得到得药物载体负载药物前后，结构并未发生变化，都能得到四链体的结构。通过FEI公司的透射电镜(Tecnai G220S-TWIN，200kV)按照其说明书中的方法，观察实施例1制备的药物组合物，可见实施例1制备的药物组合物如图4所示的显微形态，其粒径为20nm左右。通过Malvern公司的激光粒度仪按照其说明书中的方法,对实施例1制备的药物组合物进行动态光散射(Zetasizer NanoZS)测定，测得实施例1制备的药物组合物具有如图5所示的粒径分布。图5的结果说明所制备的药物组合物粒径分布较为均一。通过Tecan公司的连续光谱多功能酶标仪按照其说明书中的方法，扫描实施例1制备的药物组合物在PBS溶液中分别放置0、2、5、12、24、48、72小时后的荧光扫描图谱，其中，以游离态的阿霉素作为参照，以显示其稳定性。图6的结果说明所制备的药物组合物具有极强的稳定性，在体外环境中药物不易从所制备的药物载体中逃逸出来，便于保存，而在体内环境下，随着核酸被内源性 的核酸酶降解，药物化合物即可得到释放。对实施例2和3制备的药物组合物进行如上相同的测试，得到与如上基本相同的检测结果，本发明在此不再赘述。测试实施例2将实施例1得到的纳米药物组合物按如下方法进行细胞毒性试验。已知人源乳腺癌细胞高表达核仁素受体，但人源正常肝细胞低表达或不表达核仁素受体，实施例1制备的药物组合物中的核酸适配体部分靶向于核仁素受体。选用两株不同的细胞进行检测实施例1制备的药物组合物的靶向性的实验，其中一株为人源乳腺癌细胞(MCF-7)，另一株为人源正常肝细胞(L02)。按照文献(细胞培养，司徒镇强，世界图书出版公司，1996年)中的方法将上述两株细胞分别进行培养，而后分别加入实施例1制备的药物组合物(以阿霉素的量计，药物组合物在细胞培养液中的浓度如图所示)，加药72小时后按照文献(细胞培养，司徒镇强，世界图书出版公司，1996年)中的方法(MTT法)检测细胞存活率(阳性对照为含相同浓度的游离阿霉素的培养基，阴性对照为不含阿霉素的空白培养基)。结果如图7所示，图7的结果表明，实施例1所制备的药物组合物对正常细胞基本无杀伤作用(但游离阿霉素对正常细胞的杀伤作用较为明显)，并且能够特异性的杀伤肿瘤细胞(比单独用游离阿霉素具有更强的杀伤作用)，因而实施例I所制备的药物组合物具有针对人源乳腺癌细胞的靶向性。对实施例2和3制备的药物组合物进行如上相同的测试，得到与如上基本相同的检测结果，结果如图8和图9所示。图8的结果表明，实施例2所制备的药物组合物对正常细胞基本无杀伤作用(但游离柔红霉素对正常细胞的杀伤作用较为明显)，并且能够特异性的杀伤肿瘤细胞(比单独用游离柔红霉素具有更强的杀伤作用)，因而实施例2所制备的药物组合物具有针对人源乳腺癌细胞的靶向性。图9的结果表明，实施例3所制备的药物组合物对正常细胞基本无杀伤作用(但游离表阿霉素对正常细胞的杀伤作用较为明显)，并且能够特异性的杀伤肿瘤细胞(比单独用游离表阿霉素具有更强的杀伤作用)，因而实施例3所制备的药物组合物具有针对人源乳腺癌细胞的靶向性。以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式
中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合 ，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
权利要求
1.一种核酸，其特征在于，该核酸的结构如式(I)所示: V-W-X-Y-Z 式(I) 其中，V、W、X、Y和Z各自为单链核酸片段且通过磷酸二酯键依次连接；z为核酸适配体的碱基序列和X的碱基序列反向互补，V的核苷酸长度为4-20nt，X的核苷酸长度为4-20nt ；ff的核苷酸长度为4-10nt且不能与V、X、Y或Z互补；Y的核苷酸长度为4_15nt且不能与V、W、X或Z互补。
2.根据权利要求1所述的核酸，其中，V中的碱基各自独立地为鸟嘌呤或胞嘧啶，X中的碱基各自独立地为鸟嘌呤或胞嘧啶。
3.根据权利要求1或2所述的核酸，其中，Z的序列为SEQID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3o
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的核酸，其中，W的序列为SEQID NO:7、SEQ IDNO:8 或 SEQ ID NO:9 ；Υ 的序列为 SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11 或 SEQ ID NO:12。
5.根据权利要求1所述的核酸，其中，该核酸的序列为SEQID NO:4, SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6ο
6.—种药物载体的制备方法,其特征在于,该方法包括:将权利要求1-5中任意一项所述的核酸进行变性和退火。
7.根据权利要求6所述的药物载体的制备方法，其中，所述变性和所述退火均在缓冲液中进行，所述缓冲液中，钾离子的含量为150-250mM，镁离子的含量为3_5mM，Tris的含量为26-30mM，pH值为7.2-7.8 ;相对于每重量份的所述核酸，所述缓冲液的用量为100-100000 重量份。
8.根据权利要求6或7所述的药物载体的制备方法，其中，所述变性的温度为95-105°C，变性的时间为4-6分钟；所述退火的降温速度为10-30°C /分钟，所述退火的结束温度为15-25°C。
9.一种药物载体,该药物载体为根据权利要求6-8中任意一项所述的药物载体的制备方法制备得到的药物载体。
10.一种药物组合物的制备方法，该方法包括:在权利要求9所述的药物载体上负载药物化合物，所述药物化合物为能够与双螺旋DNA结合的药物化合物。
11.根据权利要求10所述的药物组合物的制备方法，其中，负载的条件包括:温度为0-4°C，时间为2-5小时，相对于每重量份的药物化合物，所述药物载体的用量为0.001-100重量份。
12.根据权利要求10或11所述的药物组合物的制备方法，其中，所述药物化合物为阿霉素、柔红霉素、喜树碱、表阿霉素和米托蒽醌中的至少一种。
13.—种药物组合物，该药物组合物为根据权利要求10-11中任意一项所述的方法制备得到药物组合物，且该药物组合物的粒径为5-20nm。
全文摘要
本发明提供了一种核酸，其特征在于，该核酸的结构如式(1)所示其中，V、W、X、Y和Z各自为单链核酸片段且通过磷酸二酯键依次连接；Z为核酸适配体；V的碱基序列和X的碱基序列反向互补。本发明还提供了一种药物载体的制备方法，该方法包括将如上所述的核酸进行变性和退火。本发明还提供了一种药物载体，该药物载体为根据如上所述的药物载体的制备方法制备得到的药物载体。本发明还提供了一种药物组合物的制备方法，该方法包括在如上所述的药物载体上负载药物化合物。本发明还提供了根据如上所述的药物组合物的制备方法制备得到药物组合物。本发明提供的核酸既具有靶向性又能够负载药物。
文档编号A61K47/48GK103160512SQ20111042156
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月15日 优先权日2011年12月15日
发明者梁兴杰, 马会利, 柳娟, 魏妥 申请人:国家纳米科学中心