专利名称：一种明胶纳米球的制备方法
技术领域：
本发明属于明胶球制备技术领域，特别是涉及ー种纳米级、形态规则、尺寸均一、 分散度好的明胶纳米球的制备方法。
背景技术：
明胶是胶原变性后形成的天然高分子，由于其具有良好的生物降解能力和生物相容性而被广泛用于医疗和制药行业。随着生物材料科学的不断发展，纳米级明胶球以其具有比表面积大、小尺寸、无毒、无抗原性等特点而成为倍受青睐的药物载体。当药物与明胶复合被制成载药明胶纳米球后，随着纳米球的稳定降解，可以达到缓释或控释药物的效果。 特殊的明胶纳米球在体内还可以达到靶向分布的作用。作为基因载体，明胶纳米球还可以携帯基因进入细胞，从而对肿瘤等疾病进行特异性治疗。明胶纳米球在未来的制药领域中将具有广泛的应用前景。作为药物和基因的载体，影响明胶纳米球性能的因素主要包括明胶球的尺寸、分散程度和球形。它们不但决定明胶纳米球的降解时间、药物释放特性，同时还决定明胶球能否进入细胞。由于明胶溶液粘度大，在制备明胶纳米球的过程中易发生球与球相互粘连甚至融合，从而使球的尺寸变大、相互粘连或球形不规则。这进ー步导致明胶纳米球释放药物的速度不稳定，而且较大的或相互粘连的明胶纳米球在结合基因后无法进入细胞。目前制备明胶球的方法主要有乳化-凝聚法、单凝聚法和喷雾法。其中乳化-凝聚法利用油相乳化明胶溶液，过程相对繁复，且产物中易留有油相杂质，制备出的明胶球大小不均。而喷雾法制备明胶球时要求的温度较高，且往往制备出的明胶球尺寸相对较大，是制备微米级明胶球的常用方法。单凝聚法是最常用的制备纳米级明胶球的方法。但利用该法制备明胶纳米球时，由于明胶球在水相中不稳定，制得的明胶纳米球常存在粘连严重和球形不规则等问题。二次单凝聚法(two-step desolvation)以单凝聚法为基础,选取大分子量的明胶为材料制备明胶纳米球，使得形成的明胶球在粘连和球形方面得到了一定程度的改善，但尺寸不均，球与球粘连、融合仍是明胶纳米球制备过程中的技术难题。这使目前制备的明胶纳米球在载药与载基因方面的应用受到了极大的限制。
发明内容
本发明的目的是为了克服明胶纳米球制备技术的不足而在二次单凝聚法基础上对明胶纳米球制备方法提出的进ー步改进和创新，从而提供了一种制备纳米级、形态规则、 尺寸均一、分散度好的明胶球的方法。这种明胶纳米球可以作为药物的载体，达到缓释药物或向细胞内转染基因的目的。本发明提出的制备明胶纳米球的新方法，包括以下步骤I)取0. I Ig明胶加入到IOml水中，加热溶解制备成明胶水溶液，向该明胶水溶液中加入IOml丙酮，获得沉淀的明胶；2)用IOml溶液溶解沉淀的明胶，并将反应体系的pH值调整为7. 0 9. 0 ;
3)在超声和冰水浴条件下用20ml 80ml丙酮乳化步骤2)的明胶溶液，得到乳化体系；4)向上述乳化体系中加入IOOiU 400iU质量分数为25%的戊ニ醛，继续超声和冰水浴3 5分钟，然后将溶液固化；5)最后将固化后的溶液离心，用丙酮在超声下清洗沉淀3 5次，烘干后得到明胶纳米球。上述方法中，步骤I)中所用明胶为A型明胶，其等电点为7 9;步骤2)中的溶液是水或者是药物活性物质的水溶液；步骤3)中超声的功率密度为0. 3w/cm2 0. 5w/ cm2，丙酮乳化明胶溶液是将明胶溶液逐滴加入到温度为-20°C 10°C的丙酮中；步骤4)是在_20°C 10°C条件下固化Ih 48h ;步骤5)中的离心条件为9000r/min 13000r/min ； 是在50°C 60°C条件下烘干，从而得到明胶纳米球。药物活性物质的水溶液可以是脱氧核糖核酸、肽、蛋白质中的ー种，或两种，或三种溶解于水后形成的药物水溶液，浓度在I X 10_12g/ml I X 10_2g/ml范围内。其中脱氧核糖核酸可以是具有治疗作用的脱氧核糖核酸片段，也可以是脱氧核糖核酸与载体形成的复合物，如质粒、脱氧核糖核酸脂质体复合物等。脱氧核糖核酸与明胶纳米球的复合物进入细胞后，在细胞内表达脱氧核糖核酸编码的蛋白质，从而达到基因治疗的目的。肽可以是具有治疗作用的寡肽或多肽，例如胸腺肽、脑腺肽。蛋白质可以是具有治疗作用的简单蛋白质或结合蛋白质，例如球蛋白、糖蛋白。肽和蛋白质类药物可以在体内环境中随着明胶纳米球的不断降解而被缓慢释放，从而延长药物的作用时间，減少给药次数。药物活性物质的水溶液还可以是具有治疗作用的无机物、有机物或各自相应的盐的水溶液，浓度在lXlO.g/ ml lXlO—ig/ml范围内。无机物及其相应的盐可以是无机化合物或络合物，如氯化钾、顺钼(Cl2H6N2Pt)15有机物及其相应的盐例如唑来膦酸，唑来膦酸钠，辛伐他汀(C25H38O5)15上述药物活性物质还可以通过侧链，吸附力，共价健或离子健结合到明胶纳米球表面。例如首先在明胶纳米球表面连接带正电的多聚こ烯亚胺，形成侧链后再连接脱氧核糖核酸。与现有技术相比，本发明具有以下优点(I)在明胶溶液乳化前，将其pH值调整为7.0 9.0范围内，即明胶溶液的等电点附近，有效消除或降低了明胶分子本身所帯电荷对球形和球粘连的影响；(2)与单凝聚法中将乳化剂加入到明胶溶液中不同，本发明中明胶溶液乳化采用反向乳化的方法，即将明胶溶液缓慢滴加到低温的乳化剂中，这使乳化剂中的明胶溶液能及时且良好乳化；(3)采用低温的乳化剂使明胶溶液乳化成球后可以快速凝固，从而避免球与球融合导致的球形不规则和尺寸变大；(4)乳化过程采用超声乳化的方法，超声均匀作用于每个纳米球，使球与球之间产生相对运动，从而使制备出的纳米球更趋分散，球形更加规则；(5)可任意改变明胶纳米球中的药物含量，进而制备出载药量不同的明胶纳米球。本发明所述方法制备的明胶纳米球为微黄色粉末，通过扫描电镜和粒度仪检测发现明胶纳米球的直径在50 350nm范围内。与现有技术相比，所制得的明胶纳米球大小相对均一，分散性好，球形规则。通过本发明所制备的明胶纳米球可作为药物和基因载体用于药物缓释和细胞内基因转染，经特殊修饰后还可以用于药物或基因的靶向释放。作为药物载体，该方法制备出的明胶纳米球可更稳定的缓释药物。作为基因载体，该方法制备出的明胶纳米球将更有利于细胞吞噬和向细胞内转染基因。
图I :实施例I制备的平均粒径为210nm的明胶纳米球扫描电镜图；如图显示，明胶纳米球大小相对均一，分散良好，球形规则。图2 :实施例2制备的平均粒径为200nm的明胶纳米球扫描电镜图；如图显示，明胶纳米球大小相对均一，分散良好，球形规则。图3 :实施例3制备的平均粒径为140nm的明胶纳米球扫描电镜图；如图显示，明胶纳米球大小相对均一，分散良好，球形规则。图4 :实施例5制备的平均粒径为180nm的唑来膦酸明胶纳米球扫描电镜图。如图显示，唑来膦酸明胶纳米球大小相对均一，分散良好，球形规则。图5 :实施例5制备的平均粒径为180nm的唑来膦酸明胶纳米球的缓释曲线。如图显示，随着明胶纳米球的溶解，唑来膦酸释放平稳，无突释现象。明胶纳米球于32天时完全溶解并将唑来膦酸完全释放。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进ー步的阐述，而不是要以此对本发明进行限制。实施例I :取IOOmg A型明胶(购于sigma公司，胶冻强度175Bloom)加入到IOml水中， 60°C下溶解制备成明胶水溶液。向明胶水溶液中快速倾倒入IOml丙酮，去除上层悬浊液， 取沉淀的明胶，将沉淀的明胶再次用IOml水溶解。用浓度均为lmol/L的氢氧化钠和盐酸溶液将反应体系的PH值调整为7. O。取温度为-20°C的丙酮20ml，在超声和冰水浴条件下将明胶溶液逐滴加入到丙酮中，得到乳化体系。超声功率密度为0. 3w/cm2。然后向乳化体系中加入100 u I质量分数为25%的戊ニ醛，继续超声和冰水浴3分钟后将溶液移至_20°C 条件下固化I小时，9000r/min离心,去上清后,用丙酮在超声下清洗沉淀3次,在50°C烘箱内烘干，从而得到明胶纳米球42mg。实施例2 取IOOOmg A型明胶加入到IOml水中，60°C下溶解制备成明胶水溶液。向明胶水溶液中快速倾倒入IOml丙酮，去除上层悬浊液，取沉淀的明胶，将沉淀的明胶再次用IOml 水溶解。用浓度均为lmol/L的氢氧化钠和盐酸溶液将明胶溶液的pH值调整为9. O。取温度为10°C的丙酮80ml，在超声和冰水浴条件下将明胶溶液逐滴加入到丙酮中，得到乳化体系。超声功率密度为0. 5w/cm2。向乳化体系中加入400 ill质量分数为25%的戊ニ醛，继续超声冰水浴5分钟后将溶液移至10°C条件下固化48小吋，13000r/min离心，去上清后， 用丙酮在超声下清洗沉淀5次，在60°C烘箱内烘干，从而得到明胶纳米球486mg。实施例3 取500mg A型明胶加入到IOml水中，60°C下溶解制备成明胶水溶液。向明胶水溶液中快速倾倒入IOml丙酮，去除上层悬浊液，取沉淀的明胶，将沉淀的明胶再次用IOml水溶解。用浓度均为lmol/L的氢氧化钠和盐酸溶液将明胶溶液的pH值调整为7. 8。取温度为0°C的丙酮40ml，在超声和冰水浴条件下将明胶溶液逐滴加入到丙酮中，得到乳化体系。超声功率密度为0. 4w/cm2。向乳化体系中加入200 ill质量分数为25%的戊ニ醛，继续超声冰水浴4分钟后将溶液移至(TC条件下固化24小吋，10000r/min离心，去上清后，用丙酮在超声下清洗沉淀4次，在60°C烘箱内烘干，从而得到明胶纳米球223mg。实施例4 取800mg A型明胶加入到IOml水中，60°C下溶解制备成明胶水溶液。向明胶水溶液中快速倾倒入IOml丙酮，去除上层悬浊液，取沉淀的明胶，将沉淀的明胶再次用IOml 水溶解。用浓度均为lmol/L的氢氧化钠和盐酸溶液将明胶溶液的pH值调整为8. 2。取温度为_5°C的丙酮60ml，在超声和冰水浴条件下将明胶溶液逐滴加入到丙酮中，得到乳化体系。超声功率密度为0. 5w/cm2。向乳化体系中加入300 ill质量分数为25%的戊ニ醛，继续超声冰水浴4分钟后将溶液移至0°C条件下固化3小吋，9000r/min离心，去上清后，用丙酮在超声下清洗沉淀5次，在60°C烘箱内烘干，从而得到明胶纳米球349mg。实施例5:取500mg A型明胶加入到IOml水中，60°C下溶解制备成明胶水溶液，向明胶水溶液中迅速加入IOml丙酮,使部分明胶沉淀。将沉淀的明胶再次用IOml浓度为lmg/ml的唑来膦酸(C5HltlN2O7P2 H2O)水溶液溶解。用浓度均为lmol/L的氢氧化钠和盐酸溶液将明胶溶液的PH值调整为8. 5。取温度为_5°C的丙酮40ml。在超声和冰水浴条件下将明胶溶液逐滴加入到丙酮中，得到乳化体系。超声功率密度为0. 4w/cm2。向乳化体系中加入200 ill 质量分数为25%的戊ニ醛，继续超声冰水浴5分钟。将溶液移至_20°C条件下固化3小吋， 9000r/min离心，去上清后，用丙酮在超声下清洗沉淀3次，在60°C烘箱内烘干，从而得到唑来膦酸明胶纳米球212mg。
权利要求
1.一种明胶纳米球的制备方法，其步骤如下1)取0.I Ig明胶加入到IOml水中，加热溶解制备成明胶水溶液，向该明胶水溶液中加入IOml丙酮，获得沉淀的明胶；2)用IOml溶液溶解沉淀的明胶，并将反应体系的pH值调整为7.0 9. 0 ;3)在超声和冰水浴条件下用20ml 80ml丙酮乳化步骤2)的明胶溶液，得到乳化体系;4)向上述乳化体系中加入100ill 400 u I质量分数为25%的戊ニ醛，继续超声和冰水浴3 5分钟，然后将溶液固化；5)最后将固化后的溶液离心，用丙酮在超声下清洗沉淀3 5次，烘干后得到明胶纳米球。
2.如权利要求I所述的ー种明胶纳米球的制备方法，其特征在干步骤I)中所用明胶为A型明胶，其等电点为7 9。
3.如权利要求I所述的ー种明胶纳米球的制备方法，其特征在干步骤2)中的溶液是水溶液或者是药物活性物质的水溶液。
4.如权利要求3所述的ー种明胶纳米球的制备方法，其特征在于药物活性物质的水溶液是脱氧核糖核酸、肽、蛋白质中的ー种，或两种，或三种溶解于水后形成的药物水溶液， 浓度在 I X l(T12g/ml I X l(T2g/ml 范围内。
5.如权利要求3所述的ー种明胶纳米球的制备方法，其特征在于药物活性物质的水溶液是具有治疗作用的无机物、有机物或各自相应的盐的水溶液，浓度在lXlO.g/ml I X KT1gAil 范围内。
6.如权利要求I所述的ー种明胶纳米球的制备方法，其特征在干步骤3)中超声的功率密度为 0. 3w/cm2 0. 5w/cm2。
7.如权利要求I所述的ー种明胶纳米球的制备方法，其特征在干步骤3)中丙酮乳化明胶溶液是将明胶溶液逐滴加入到温度为-20°C 10°C的丙酮中。
8.如权利要求I所述的ー种明胶纳米球的制备方法，其特征在于步骤4)所述的固化是在-20°C 10°C条件下固化Ih 48h。
9.如权利要求I所述的ー种明胶纳米球的制备方法，其特征在干步骤5)中的离心条件为 9000r/min 13000r/min。
10.如权利要求I所述的ー种明胶纳米球的制备方法，其特征在干步骤5)中的烘干温度为50°C 60°C。
全文摘要
本发明属于明胶球制备技术领域，特别是涉及一种纳米级、形态规则、尺寸均一、分散度好的明胶纳米球的制备方法。该方法克服了现有技术的不足，是通过调整溶液pH值、明胶溶液反向滴加、低温超声乳化等方法，控制明胶球的尺寸，减少明胶球之间的粘连和融合，使制备出的明胶纳米球球形良好，球与球之间更趋分散。该方法操作简单，所制备的明胶纳米球为微黄色粉末，直径在50～350nm范围内。作为药物载体，该方法制备出的明胶纳米球可更稳定的缓释药物。作为基因载体，该方法制备出的明胶纳米球更有利于细胞吞噬和向细胞内转染基因。
文档编号A61K47/42GK102604128SQ20121011512
公开日2012年7月25日 申请日期2012年4月18日 优先权日2012年4月18日
发明者倪世磊, 孙宏晨, 孙海珠, 张恺, 杨柏, 金翔宇 申请人:吉林大学