专利名称：一种调控热休克蛋白70表达、数量及活性的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，具体涉 及一种调控热休克蛋白70表达、数量及活性的方法及其应用。
背景技术：
中国卫生部的统计资料表明目前中国每年新生肿瘤患者总数约212. 7万人左右，其中，每年有106万左右的恶性肿瘤新生患者；同时，全国约有268. 5万左右的肿瘤现有患者，其中恶性肿瘤现有患者148. 5万左右。以肺癌的发病率和死亡率为例，美国每年约有16万人死于肺癌，其中75%的患者为非小细胞肺癌(NSCLC)。我国主要城市中，肺癌的发病率已占据各种恶性肿瘤发病率首位。我国每年有近80万人死于肺癌，其中非小细胞肺癌患者约占 80-85% (McCracken M 等，2007，CACancer J Clin57:190-205)。由于肺癌的发展进程快，早期不易发现，晚期易转移，因此其死亡率很高。现有的治疗方法(如放疗、化疗等)副作用大、存在药物抵抗性，治疗效果有限，因此，寻求新的治疗靶点和新的治疗方法显得十分必要。细胞凋亡是目前临床上最常用的肿瘤治疗原理，无论是化疗或者放疗都是通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用，但是肿瘤细胞常常会产生对细胞凋亡的抵抗，从而极大地影响细胞凋亡治疗肿瘤的效果。例如，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)是肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员中继TNF，Fas-L之后发现的第3个凋亡分子。TRAIL具有选择性杀伤肿瘤细胞的作用，能诱导多种肿瘤细胞及转化细胞发生凋亡，但对正常组织及细胞无凋亡诱导作用，并且TRAIL在诱导细胞凋亡过程中，具有较TNF、Fas-L所引起的炎症反应明显较少的优势，因此TRAIL已成为新一代的抗肿瘤药物的热点分子(Walczak H等，1999，Nat Med5:157-163)，目前TRAIL已作为抗肿瘤药物在美国正在II期临床试验、在中国已经完成III期临床试验，主要用于治疗难治性肿瘤如肺癌等，显示出较好的治疗效果。然而，试验中发现仍有不少病人包括肺癌患者出现对TRAIL的药物抵抗，大大降低了 TRAIL的治疗效果，限制了 TRAIL的治疗人群，因此，如何克服TRAIL等细胞凋亡诱导剂治疗中的药物耐受成为迫切需要解决的一个问题。热休克蛋白HSP，除了作为分子伴侣帮助蛋白正确折叠等基本作用外，还以直接或间接的方式参与了细胞凋亡的调节，其作用靶点涉及不同凋亡信号通路的各主要激酶或关键性调控蛋白(Jaattela M，1999，Exp Cell Res248:30-43)，从而可能会是引起TRAIL药物耐受的原因之一。已有研究报道，利用HSP90特异性的抑制剂在体外抑制前列腺癌肿瘤细胞内HSP90逆转了前列腺癌细胞对TRAIL的抵抗性(Ma Y等，2006，Mol CancerTher5:170-178)。该研究提示HSP90可能是逆转肿瘤细胞对TRAIL抵抗性的一个调控靶点。目前针对HSP90作为治疗靶点的药物geldanamycin和17-AAG已经进入临床研究，然而，虽然geldanamycin和17-AAG有良好的抗肿瘤活性,但仍具有局限性，主要表现在稳定性及溶解度有限，分子量大，能够被细胞色素P450所代谢，生物利用率低，且geldanamycin具有严重的肝脏毒性，这些都使其临床应用受到了限制。由于HSP家族成员包括HSP110、HSP90、HSP70，中等分子量HSP和小分子量HSP五大家族，因此，其它热休克蛋白，例如HSP27、HSP70,能够作为肿瘤治疗靶点和肿瘤治疗策略和方法吗？
发明内容
本发明的目的就是针对TRAIL等细胞凋亡诱导剂治疗过程中存在的药物抵抗难题，探索一种增加肿瘤细胞对TRAIL的敏感性的新方法，开发一种新的、有效的肺癌治疗策略。为了达到上述目的，本发明提供了一种增加肿瘤组织或细胞对细胞凋亡敏感性的方法，其特征是通过抑制肿瘤组织或细胞内热休克蛋白HSP70的表达来增加肿瘤组织或细胞对细胞凋亡的敏感性。进一步地，本发明提供了一种调控肿瘤组织或细胞内热休克蛋白HSP70数量及活性的方法，其特征是通过常规的影响细胞内热休克蛋白HSP70数量及活性的方法或手段达 到通过抑制肿瘤组织或细胞内热休克蛋白HSP70的数量及活性来增加肿瘤组织或细胞对细胞凋亡的敏感性的目的。例如，通过筛选HSP70转录的抑制剂抑制HSP70mRNA的转录，或者利用RNA干扰技术或者反义RNA技术降低HSP70mRNA的数量、或者利用HSP70蛋白质合成的抑制剂或者通过加速HSP70蛋白质的降解而减少HSP70蛋白质的数量、或者利用HSP70的抑制剂抑制HSP70的功能及活性。进一步地，本发明提供了一种调控肿瘤组织或细胞内转录因子NF-κ B活性的方法，其特征是通过常规的抑制细胞内HSP70的表达、数量或活性的方法或手段达到增加肿瘤组织或细胞内转录因子NF- K B活性的目的。进一步地，本发明提供了一种调控肿瘤组织或细胞内死亡受体DR4和DR5表达水平的方法，其特征是通过常规的抑制细胞内HSP70的表达、数量或活性的方法或手段达到提高肿瘤组织或细胞DR4和DR5表达水平的目的。进一步地，本发明提供了一种调控肿瘤组织或细胞内JNK和C-Jun的磷酸化或活性的方法，其特征是通过常规的抑制细胞内HSP70的表达、数量或活性的方法或手段达到提高肿瘤组织或细胞内JNK和c-Jun的磷酸化或活性的目的。进一步地，本发明提供了一种调控肿瘤组织或细胞内p53蛋白活性的方法，其特征是通过常规的抑制细胞内HSP70的表达、数量或活性的方法或手段达到提高肿瘤组织或细胞内P53蛋白活性的目的。进一步地，本发明提供了一种调控肿瘤组织或细胞内线粒体细胞凋亡信号途径促凋亡分子Bax、Bid、t-Bid的表达的方法，其特征是通过常规的抑制细胞内HSP70的表达、数量或活性的方法或手段达到提高肿瘤组织或细胞内Bax、Bid、t_Bid、capase3、capase8、capase9的表达、促进肿瘤组织或细胞凋亡的目的。进一步地，本发明提供了一种调控肿瘤组织或细胞内抗凋亡蛋白C-FLIP和Bcl-2表达的方法，其特征是通过常规的抑制细胞内HSP70的表达、数量或活性的方法或手段达到降低肿瘤组织或细胞内C-FLIP和Bcl-2表达、促进肿瘤组织或细胞凋亡的目的。进一步地，本发明提供了一种调控肿瘤组织或细胞中热休克蛋白表达与肿瘤细胞凋亡治疗药物联合应用的治疗策略，其特征是将下调肿瘤组织或细胞内热休克蛋白70的表达来增加肿瘤细胞对肿瘤治疗药物的药物敏感性,增加肿瘤治疗药物诱导肿瘤细胞凋亡的能力、从而显著提高其抗肿瘤效果。进一步地，本发明提供了一种调控肿瘤组织或细胞中热休克蛋白表达与肿瘤细胞凋亡治疗药物联合应用的治疗策略，其特征是将下调肿瘤组织或细胞内热休克蛋白70的表达来增加肿瘤细胞对细胞凋亡诱导剂TRAIL的药物敏感性，增加细胞凋亡诱导剂TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的能力、从而显著提高其抗肿瘤效果。进一步地，本发明提供了一种调控肿瘤组织及细胞中HSP70及各细胞凋亡相关蛋白质表达及活性的方法在分别制备抗肿瘤药物中的应用。进一步地，本发明提供了一种调控肿瘤组织及细胞中HSP70及各细胞凋亡相关蛋白质表达及活性的方法在分别制备与细胞凋亡治疗药物联合应用的药物中的应用。
进一步地，本发明提供了一种调控细胞中HSP70及细胞凋亡相关蛋白质表达及活性的方法在分别制备促细胞凋亡药物中的应用。进一步地，本发明提供了一种调控细胞中HSP70及细胞凋亡相关蛋白质表达及活性的方法在分别制备与细胞凋亡治疗药物联合应用的药物中的应用。为了达到上述目的，本发明的技术方案是首先构建热休克蛋白HSP70和HSP27的干扰质粒psiHSP70和psiHSP27，分别以非小细胞癌A549SW1573、H460等细胞株为研究对象，验证了以上干扰质粒的干扰效果，然后考查了 HSP70或HSP27通过RNA干扰后低表达与TRAIL治疗联合应用诱导肿瘤细胞凋亡的效果。在细胞水平工作的基础上，本发明又分别建立了 A549皮下实体瘤模型和原位肺癌模型，验证了 HSP70或HSP27通过RNA干扰后低表达与TRAIL联用进行体内治疗的效果。实验结果表明HSP70和HSP27的干扰质粒都能很好地下调细胞内HSP70和HSP27的蛋白表达水平，在细胞水平与TRAIL联用都可有效诱导肿瘤细胞的凋亡，而TRAIL、psiHSP70致HSP70低表达、psiHSP27致HSP27低表达单独使用均不能有效诱导肿瘤细胞凋亡。与TRAIL联用时，psiHSP70致HSP70低表达和psiHSP27致HSP27低表达两种方法体外诱导肿瘤细胞凋亡的能力相当。在皮下实体瘤模型和原位肺癌模型实验时，HSP70和HSP27的干扰质粒与TRAIL联合治疗的结果表明psiHSP70致HSP70低表达可显著提高肿瘤对细胞凋亡治疗方法的敏感性，显著提高肿瘤组织和细胞凋亡及坏死，从而显著抑制实体瘤生长，而psiHSP27致HSP27低表达在体内动物模型上与TRAIL联合治疗不能达到显著提高肿瘤对细胞凋亡治疗方法的敏感性，不能提高肿瘤组织和细胞凋亡及坏死，不能显著抑制实体瘤生长。下调肿瘤组织或细胞内HSP70的表达、数量或活性显著增强NF- κ B的ρ65亚基转位至细胞核中、同时加速I K B的降解，从而增强转录因子NF- K B的活性，显著上调NF- κ B下游靶基因一死亡受体DR4和DR5的表达水平，例如，下调肿瘤组织或细胞内HSP70的表达、数量或活性能将DR5的表达水平上调2倍、与TRAIL联用时则能将DR5的表达水平上调6倍。下调肿瘤组织或细胞内HSP70的表达、数量或活性还能增加JNK和c-Jun的磷酸化、从而促进P53蛋白的活化，p53蛋白的活化将导致下游靶基因一死亡受体DR4和DR5的表达水平上升、增加线粒体细胞凋亡信号途径促凋亡分子Bax、Bid、t_Bid、caspase3、caspase8、caspase9和细胞色素C的表达、同时下调抗凋亡蛋白c_FLIP、Bcl_2的表达,从而达到显著提高肿瘤细胞对细胞凋亡的敏感性、提高肿瘤组织和细胞凋亡及坏死，显著抑制实体瘤生长的效果。与现有的抗肿瘤治疗策略相比，本发明的创新和特别之处在于
(I)首次发明了一种通过调控肿瘤组织或细胞内HSP70的表达、数量或活性增加其对细胞凋亡治疗药物或治疗方法敏感性的方法。(2)首次发明了一种调控肿瘤组织或细胞中HSP70表达、数量或活性与肿瘤细胞凋亡治疗药物联合应用、显著增加抗肿瘤疗效的治疗策略。(3)首次发明了一种通过下调肿瘤组织或细胞内HSP70的表达、数量或活性能够显著增强NF- κ B的活性、显著上调NF- κ B下游靶基因一死亡受体DR4和DR5的表达水平、增加JNK和c-Jun的磷酸化、促进p53蛋白的活化、增加线粒体细胞凋亡信号途径促凋亡分子Bax、Bid、t_Bid、caspase3、caspase8、caspase9和细胞色素C等蛋白质的表达、下调抗凋亡蛋白c-FLIP、Bcl-2等蛋白质表达方法，从而达到显著提高肿瘤细胞对细胞凋亡的敏感性、提高肿瘤组织和细胞凋亡及坏死，显著抑制实体瘤生长的效果。(4)调控HSP70表达、数量或活性能够显著增强肿瘤对细胞凋亡诱导的敏感性，能 够显著增加抗肿瘤疗效，这一特点不是通过下调所有热休克蛋白都能够取得的。更重要的是，即使调控某一 HSP的表达、数量或活性能够在细胞水平显著增加肿瘤细胞对细胞凋亡诱导的敏感性，也不一定能够在动物模型水平达到显著提高肿瘤组织或肿瘤细胞对细胞凋亡治疗方法的敏感性，不一定能够显著增加抗肿瘤疗效。最显著的例证就是本发明发现虽然调控HSP27的表达、数量或活性在细胞水平能够有效增加肿瘤细胞对细胞凋亡的敏感性，其效果甚至与调控HSP70表达、数量或活性的效果相当，但是HSP27的调控在体内实体瘤治疗上没有产生明显的增加抗肿瘤疗效的治疗效果。相形之下，调控HSP70的表达、数量或活性无论在细胞水平还是在动物模型体内都能增加肿瘤组织或细胞对细胞凋亡治疗药物或方法的敏感性，与细胞凋亡治疗药物或方法联用能有效抑制肿瘤生长，具有良好的抗肿瘤治疗效果。(5)调控HSP70表达、数量或活性能够显著增强细胞对细胞凋亡诱导敏感性的方法可以应用于各种促细胞凋亡的治疗，用于制备促细胞凋亡药物。综上所述，本发明了一种通过调控肿瘤组织或细胞内HSP70的表达、数量或活性增加其对细胞凋亡治疗药物或治疗方法的敏感性的方法，将该方法与肿瘤细胞凋亡治疗药物或治疗方法联合应用能够显著增加抗肿瘤疗效。利用该策略，有效解决了肿瘤组织或细胞对细胞凋亡治疗抵抗的难题，达到了有效治疗肿瘤的目的。
四
图I. RNA干扰技术下调细胞内HSP70的表达。1A. RT-PCR方法检测RNA干扰后细胞内HSP70的mRNA水平1、psiLUC; 2、psiHSP70。IB. RNA 干扰后细胞内 HSP70mRNA 水平的定量分析(*P < O. 05) :1、psiLUC; 2、psiHSP70。1C.用HSP70抗体Western blot检测RNA干扰后细胞内HSP70蛋白的表达水平
l、psiLUC;2、psiHSP70。ID. RNA干扰后细胞内HSP70蛋白表达水平的定量分析(*P < O. 05):l、psiLUC; 2、psiHSP70。图2.细胞内HSP70表达下调增强了 A549细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性，抑制了 A549细胞的克隆形成能力。2A.流式细胞仪检测A549细胞经psiLUC、psiHSP70和TRAIL单独处理或者联合处理后细胞的凋亡率(*P < O. 05) :1、PBS; 2, psiLUC; 3, psiHSP70;4、PBS+TRAIL;5、psiLUC+TRAIL;6、psiHSP70+TRAIL。2B. Tunel凋亡检测试剂盒检测A549细胞经psiLUC、psiHSP70和TRAIL单独处理或者联合处理后细胞的凋亡情况。l、A549;2、A549+psiLUC ;3、A549+psiHSP70(*P < O. 05)。2C.A549细胞转染不同剂量的psiLUC或psiHSP70后TRAIL (40ng/ml)诱导的细胞凋亡率。l、psiLUC;2、psiHSP70。2D.A549细胞转染O. 5μ gpsiLUC或psiHSP70后，不同剂量的TRAIL诱导的细胞凋亡率(*P < O. 05)。2E. A549细胞经psiLUC、psiHSP70和TRAIL单独处理或者联合处理后细胞的克隆 形成能力测定。l、A549;2、A549+psiLUC ;3、A549+psiHSP70 (*P < O. 05)。图3. RNA干扰技术下调细胞内HSP27的表达。3Α. RT-PCR方法检测RNA干扰后细胞内HSP27的mRNA水平1、psiLUC; 2、psiHSP27。3B. RNA 干扰后细胞内 HSP27mRNA 水平的定量分析(*P < O. 05) :1、psiLUC; 2、psiHSP7027。3C.用HSP27抗体Western blot检测RNA干扰后细胞内HSP27蛋白的表达水平l、psiLUC;2、psiHSP27。3D. RNA干扰后细胞内HSP27蛋白表达水平的定量分析(*P < O. 05):l、psiLUC; 2、psiHSP27。图4.细胞内HSP70表达下调增强了 A549细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性，抑制了 A549细胞的克隆形成能力。4A.流式细胞仪检测A549细胞经psiLUC、psiHSP70和TRAIL单独处理或者联合处理后细胞的凋亡率(*P < O. 05) :1、PBS; 2, psiLUC; 3, psiHSP27;4、PBS+TRAIL;5、psiLUC+TRAIL;6、psiHSP27+TRAIL。4B. Tunel凋亡检测试剂盒检测A549细胞经psiLUC、psiHSP27和TRAIL单独处理或者联合处理后细胞的凋亡情况。l、A549;2、A549+psiLUC ;3、A549+psiHSP27(*P < O. 05)。4C.A549细胞转染不同剂量的psiLUC或psiHSP27后TRAIL (40ng/ml)诱导的细胞凋亡率。l、psiLUC;2、psiHSP27。4D. A549细胞转染O. 5 μ g psiLUC或psiHSP27后，不同剂量的TRAIL诱导的细胞凋亡率(*P < O. 05)。4E. A549细胞经psiLUC、psiHSP27和TRAIL单独处理或者联合处理后细胞的克隆形成能力测定。l、A549;2、A549+psiLUC ;3、A549+psiHSP27 (*P < O. 05)。图5. HSP70、HSP27低表达对相关下游信号分子的调控和影响。5A. Western blot 检测 A549 细胞经 psiLUC、psiHSP70、psiHSP27 和 TRAIL单独处理或者联合处理后细胞内Bcl-2家族蛋白(Bcl-2、Bax、Bad、Bid)的表达1、psiHSP70+TRAIL;2、psiHSP27+TRAIL;3、psiLUC+TRAIL;4、TRAIL;5、psiHSP27;6、psiHSP70。5B. Western blot 技术检测 A549 细胞经 psiLUC、psiHSP70、psiHSP27 和 TRAIL单独处理或者联合处理后细胞质内I K Ba和NF-KB p65的蛋白表达水平以及细胞核内NF-kB p65的蛋白表达水平。细胞质中以GAPDH作为内标，细胞核中以Lamin B作为内标1、psiHSP70+TRAIL;2、psiHSP27+TRAIL; 3、psiLUC+TRAIL; 4、TRAIL;5、psiHSP27;6、psiHSP70。5C. Western blot 技术检测 A549 细胞经 psiLUC、psiHSP70、psiHSP27 和 TRAIL单独处理或者联合处理后细胞内c-FLIP-L的蛋白表达水平。I、psiHSP70+TRAIL;2、psiHSP27+TRAIL;3、psiLUC+TRAIL; 4、TRAIL;5、psiHSP27;6、psiHSP70。5D. Western blot 技术检测 A549 细胞经 psiLUC、psiHSP70、psiHSP27 和 TRAIL 单独处理或者联合处理后细胞内P53和磷酸化p53的蛋白表达水平1、psiHSP70+TRAIL;2、psiHSP27+TRAIL;3、psiLUC+TRAIL;4、TRAIL;5、psiHSP27;6、psiHSP70。5E. Western blot 技术检测 A549 细胞经 psiLUC、psiHSP70、psiHSP27 和 TRAIL单独处理或者联合处理后细胞内c-JUN、phospho-c-JUN, JNK, phospho-JNK的蛋白表达水 平。I、psiHSP70+TRAIL;2、psiHSP27+TRAIL; 3、psiLUC+TRAIL; 4、TRAIL;5、psiHSP27;6、psiHSP70。图6· A549细胞经psiLUC、psiHSP70、psiHSP27和TRAIL单独处理或者联合处理后细胞内DR4、DR5mRNA和蛋白水平的变化.6A. RT-PCR 技术检测 A549 细胞经 psiLUC、psiHSP70、psiHSP27 和 TRAIL 单独处理或者联合处理后细胞内DR4和DR5的mRNA的转录水平。I、psiHSP70+TRAIL; 2、psiHSP27+TRAIL;3、psiLUC+TRAIL; 4、TRAIL;5、psiHSP27;6、psiHSP70。6B.图 6A 的定量分析(*P〈0. 05)。I、psiHSP70+TRAIL; 2、psiHSP27+TRAIL; 3、psiLUC+TRAIL;4、TRAIL;5、psiHSP27;6、psiHSP70。6C. Western blot 技术检测 A549 细胞经 psiLUC、psiHSP70、psiHSP27 和 TRAIL单独处理或者联合处理后细胞内DR4和DR5的蛋白表达水平。I、psiHSP70+TRAIL;2、psiHSP27+TRAIL;3、psiLUC+TRAIL; 4、TRAIL;5、psiHSP27;6、psiHSP70。图7.体内异位肿瘤动物模型分析RNA干扰致HSP70低表达与TRAIL联用的抗肿瘤治疗效果。7A.肿瘤生长曲线(*Ρ〈0· 05)。1、PBS对照；2、psiLUC对照；3,TRAIL ;4、psiHSP70 ；5、psiLUC+TRAIL ;6、psiHSP70+TRAIL。7B.肿瘤组织中 DR4、DR5 的 mRNA 水平。UPBS 对照;2、psiLUC 对照；3,TRAIL ;4、psiHSP70 ;5、psiLUC+TRAIL ;6、psiHSP70+TRAIL。图8.体内异位肿瘤动物模型分析RNA干扰致HSP27低表达与TRAIL联用的抗肿瘤治疗效果。8A.肿瘤生长曲线(*P〈0. 05): 1、PBS 对照;2、psiLUC 对照;3、TRAIL ;4、psiHSP27 ；5、psiLUC+TRAIL ;6、psiHSP27+TRAIL。8Β·肿瘤组织中 DR4、DR5 的 mRNA 水平:I、PBS 对照;2、psiLUC 对照;3、TRAIL ;4、psiHSP27 ;5、psiLUC+TRAIL ;6、psiHSP27+TRAIL。图9.流式细胞仪检测三种非小细胞肺癌细胞NSCLC (A549，SW1573和H460)经psiLUC、psiHSP70和TRAIL单独处理或者联合处理后细胞的凋亡率(*P<0. 05)。1、PBS;2、psiLUC;3、psiHSP70;4、PBS+TRAIL;5、psiLUC+TRAIL;6、psiHSP70+TRAIL。
图10.体内原位肺癌动物模型分析RNA干扰致HSP70及HSP27低表达与TRAIL联用的抗肿瘤治疗效果。10A.荧光素活性检测肺癌生长曲线。I、PBS对照；2、TRAIL ;3、psiHSP27 ;4、psiHSP70 ;5、psiHSP27+TRAIL ;6、psiHSP70+TRAIL。10B.体内原位肺癌动物模型生存情况。I、PBS对照；2、TRAIL ;3、psiHSP27 ;4、psiHSP70 ;5、psiHSP27+TRAIL ;6、psiHSP70+TRAIL。
五具体实施例方式
实施例一以RNA干扰技术下调肿瘤细胞或组织中HSP70的表达，联合应用抗肿瘤药物TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡，治疗小鼠A549实体瘤模型为实施例I、HSP70干扰质粒的构建米用Genscript公司的软件siRNA target finder从HSP70序列内选择合适的革巴序列，然后再用Genscript公司的软件siRNA Construct Builder构建了可以连接到载体pRNAT-U6. Ι/Neo的用于干扰的DNA片段。该DNA片段包括正义链(sense strand,与目标序列相同)、发夹结构、反义链(antisense strand,与正义链互补),位于3’端可使转录终止的poly T信号；此外，为了便于与载体pRNAT-U6. 1/Neo相连,在两端分别添加了 BamH I(G I GATCC),Hind III (A I AGCTT)的酶切位点。由Gensicript公司软件设计出的用于HSP70RNA 干扰的片段如下5’ -GGATCCCGGACGAGTTTGAGCACAAGTTGATATCCGCTTGTGCTCAAACTCGTC CTTTTTTCCAAAAGCTT-3’。设计好的干扰序列的两条互补单链由申能博彩生物科技有限公司合成。两条片断序列分别为5' -GATCCCGGACGAGTTTGAGCACAAGTTGATATCCGCTTGTGCTCAAACTCGTCCTTTTTTCCAAA-S'；5' - AGCTTTTGGAAAAAAGGACGAGTTTGAGCACAAGCGGATATCAACTTGTGCTCAAACTCGTCCGG-3’ 。本实验选用pRNA-U6. Ι/Neo作为表达HSP70干扰RNA的载体。将公司合成的两条片断退火得到双链DNA，载体质粒pRNAT-U6. Ι/neo用BamHI和HindIII限制性内切酶酶切，退火后的dsDNA与酶切后的质粒用T4DNA连接酶连接从而得到HSP70的干扰质粒psiHSP70。将连接产物转化ToplO感受态细菌扩增，用Ampcillin平板筛选并转化了重组质粒的菌落。用PCR鉴定出的阳性克隆并交给上海博彩公司测序。测序结果表明HSP70的RNA干扰质粒构建正确。具体步骤与条件如下合成的两条互补单链退火得到dsDNA。退火步骤具体如下1 μ I正义链片段(1μ g/μ 1)，1μ I 反义链片段(1μ g/μ 1)，1μ I 20XSSC,17y I ddW，混合后置于 95°C 10分钟，然后25°C I小时，最后稀释混合物至终浓度为40ng/l·! I (I. 25倍稀释)，_20°C存放备用。质粒载体的酶切条件如下双蒸水(ddW) 49 μ I, Buffer K 6 μ I, pRNAT_U6. 1/Neo1μ I (I μ g/μ I), BamH 12 μ 1，Hind ΙΙΙ2μ 1,60 μ I 酶切体系 37°C 酶切 3 小时。然后 3S柱离心式琼脂糖DNA小量快速纯化试剂盒回收目的载体片段。DNA片断与质粒载体的连接条件如下2 μ I消化的载体，6 μ I退火产物，3μ 1T4DNA连接酶缓冲液，1μ I BSA, 2 μ I T4DNA连接酶，16 μ I ddW混匀后25°C反应3小时，-20°C存放备用。2、HSP70干扰质粒的干扰效果及其与TRAIL联用在细胞水平诱导A549细胞凋亡能力的检测(1)HSP70干扰质粒干扰效果分析A549细胞培养在含10%新生牛血清的DMEM(含100U/ml青霉素和ΙΟΟμ g/ml链霉素)中，并放置37°C，5% C02的培养箱中生长。转染前24小时，取处于对数生长期的细胞，胰酶消化后以每孔IX IO5个细胞接种于24孔板，每孔加Iml完全培养液，将培养板移入培养箱，培养24小时。当细胞汇合度达到70%时，除去培养液，用制备的已经静置10-15分钟的体积为ΙΟΟμ I的转染复合物(100 μ I PBS，2yg质粒,3 μ gGenEscort Reagent转染试剂),加入200 μ I无血清和无抗生素的培养液,混勻后得到共计300 μ I的转染液，然后分别加入孔中，每孔300 μ I转染液。37°C培养4小时后将24孔板中溶液吸出，每孔加入Iml完全培养液，继续培养48小时，收获细胞进行RT-PCT和western blot 分析。 RT-PCR:转染48小时后收集细胞，PBS洗涤一次。加入Iml TrizoK IO6个细胞)，用枪吹打至细胞完全溶解。室温放置5分钟。加入200 μ I的氯仿/mlTrizol，振荡15秒后放置2-3分钟，12000g离心15分钟，2-8°C。吸取上层，转移到干净eppendorf管中，加入500 μ I异丙醇，放置10分钟，12000g离心10分钟，2-8°C。可见RNA沉淀。弃去上清，加入lml75%乙醇洗涤沉淀，7500g离心5分钟，在空气中晾干RNA沉淀，加入30 μ I DEPC处理的DDW溶解。采用25μ I逆转录体系，将提取的模板RNA5y I与9. 5μ I oligo(dT)混匀，70°C变性5分钟，立即转移至冰上放置5分钟。随后加入AMV buffer 5μ l,dNTP 2. 5 μ l,RNaseInhibitor I μ I, AMV Reverse Transcriptase 2 μ I,混勻后 42°C水浴反应 I 小时。取等量的cDNA做模板做PCR扩增，采用20 μ I PCR反应体系:10 X Taq buffer 2 μ I，dNTP2 μ I，Mg2+ly I, DDWll. 5 μ 1，上游引物 I μ 1，下游引物 I μ 1，cDNA 模板 I μ 1，Taqpolymerase0. 5 μ I。PCR条件94 V热变性4分钟，94 V变性40秒，55 °C退火40秒，72 °C延伸40秒，循环数为25个，最后72°C延伸7分钟。PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，EB显色。所用特异性引物为HSP70 正义链5，-GTGCCGGCCTACTTCAACGACTC-3'；HSP70 反义链5’-GCTGGCCTGGGTGCTGGACGACA-3'；GAPDH 正义链 W-AACGACCCCTTCATTGACHV ；GAPDH 反义链 j’-TCCACGACATACTCAGCACHV。Western blot :转染48小时后收集细胞，用预冷的PBS将细胞沉淀洗涤一次后，加入细胞裂解液混匀，冰上放置30分钟后，12000rpm离心15分钟，吸取上清,通过考染法进行蛋白定量，最后加入4X loading buffer沸水浴10分钟,样品便制备完成,可以-20°C保存。按照分子克隆中的配方配制12% SDS-PAGE胶，通过测定的样品蛋白含量计算，尽可能保持各个样品上样量一致，上样量为50μ g。采用恒压进行电泳分离，然后使用半干法将PAGE胶中蛋白转印至PVDF膜上，恒流lmA/cm2电转3小时。转移结束后用丽春红S对膜进行染色，直至出现红色的蛋白条带，标记Marker的位置。然后配制5%的脱脂奶粉(PBST配制)对膜进行包被，可以4°C封闭过夜或者25°C室温I小时。包被结束后，用PBST将牛奶洗去，根据抗体说明用PBST稀释一抗(primary antibody)至最佳工作浓度,将膜一抗包被室温孵育I小时或4°c过夜。然后将膜放置在摇床，用PBST洗涤5次，每次5-10分钟。下一步为包被二抗，将HRP (辣根过氧化物酶)标记的二抗1:2000PBST稀释，与膜共同孵育I小时后，同样PBST洗漆5次,每次5-10分钟。最后，按照产品说明配制发光底物溶液滴加于PVDF膜上，室温放置1-2分钟，用滤纸将多余发光液吸干，将膜用保鲜膜包被后放入压片夹移入暗房，取X光片置于膜上曝光1-5分钟后，冲洗胶片，根据曝光条带判断蛋白的表达结果O(2)HSP70干扰与TRAIL联用在细胞水平诱导A549细胞凋亡能力的检测A,流式细胞仪检测细胞凋亡将HSP70干扰质粒通过GenEscort Reagent转染试剂转染到A549细胞中，24小时后加入TRAIL诱导细胞凋亡，18小时后收获处理后的细胞，重悬于100 μ I的sample buffer中，一边振荡一边滴加预冷的70%乙醇lml,4°C固定过夜。 然后3000rpm离心5分钟，吸去上清，加入ImlPI染色液，混匀后室温避光放置30分钟以上，在24小时内检测。使用cellquest软件采集数据并进行分析。B, TUNEL试剂盒检测细胞凋亡将HSP70干扰质粒通过GenEscort Reagent转染试剂转染到A549细胞中，24小时后加入TRAIL诱导细胞凋亡，18小时后收获处理后的细胞，4%多聚甲醛固定，TUNEL试剂盒(德国默克公司)检测细胞凋亡。比较HSP70干扰质粒转染与否对TRAIL诱导凋亡效果的影响，设好各项平行对照。(3)HSP70干扰与TRAIL联用对A549细胞克隆形成能力的影响分析克隆形成实验检测A549细胞转染HSP70干扰质粒前后对TRAIL的药物敏感性。约300个对数生长期的转染细胞(不转染细胞设为对照)均分到60mm的平皿中(设3个平行实验)，48小时后待细胞完全贴壁后加入TRAIL处理细胞，48小时后，细胞换上完全培养基培养14天，每5天换一次培养基。14天培养结束后进行Giemsa染色，计数每个平皿中的细胞克隆数(30个细胞以上的集落算作一个克隆)。比较HSP70干扰质粒转染与否的A549细胞在TRAIL处理后的克隆形成能力，计算下调HSP70表达后细胞对TRAIL的药物敏感度的增加倍数。药物敏感度增加倍数计算公式如下Al=(psiHSP70转染后的细胞形成的克隆数-TRAIL和psiHSP70联合处理后的细胞形成的克隆数)/psiHSP70转染后的细胞形成的克隆数A2=(未转染的细胞形成的克隆数-TRAIL单独处理后的细胞克隆数)/未转染的细胞形成的克隆数药物敏感度增加倍数=A1/A23、分析HSP70干扰质粒与TRAIL联用对A549细胞受体凋亡通路和线粒体凋亡通路上关键蛋白的影响将HSP70干扰质粒通过GenEscort Reagent转染试剂转染到A549细胞中，24小时后加入TRAIL诱导细胞凋亡，18小时后收获处理后的细胞，，加入RIPA细胞裂解液，冰上裂解30分钟,然后离心并定量,在加入上样缓冲液后，做样,用caspase-8、caspase_3、caspase-9、PARP、Bcl-2、Bax、Bid、Bad、cytochrome c 的特异性抗体进行 western blot 技术分析各蛋白的表达变化情况4、分析HSP70干扰质粒与TRAIL联用后A549细胞TRAIL的受体蛋白DR4和DR5的表达变化将HSP70干扰质粒通过GenEscort Reagent转染试剂转染到A549细胞中，24小时后加入TRAIL诱导细胞凋亡，18小时后收获处理后的细胞，一部分细胞提取RNA，逆转录，RT-PCR技术分析细胞中DR4和DR5的mRNA水平；另外一部分细胞加入RIPA细胞裂解液，冰上裂解30分钟，然后离心并定量，在加入上样缓冲液后，做样，用DR4和DR5的特异性抗体进行western blot技术分析DR4和DR5的蛋白水平5、分析HSP70干扰质粒与TRAIL联用后对A549细胞内NF- κ B信号通路的影响将HSP70干扰质粒通过GenEscort Reagent转染试剂转染到Α549细胞中，24小时后加入TRAIL诱导细胞凋亡，18小时后收获处理后的 细胞，用细胞核制备试剂盒(上海将来试剂有限公司)制备细胞质和细胞核蛋白，然后分别加入上样缓冲液后，做样，用NF- κ Bp65,1 κ Ba ,GAPDH和Lamin B的特异性抗体进行western blot技术分析各蛋白在细胞质和细胞核内的表达变化情况。6、分析HSP70干扰质粒与TRAIL联用后对A549细胞内c_FLIP_L蛋白表达水平的影响将HSP70干扰质粒通过GenEscort Reagent转染试剂转染到A549细胞中，24小时后加入TRAIL诱导细胞凋亡，18小时后收获处理后的细胞，加入RIPA细胞裂解液，冰上裂解30分钟，然后离心并定量，在加入上样缓冲液后，做样，用c-FLIP-L的特异性抗体进行western blot技术分析蛋白的表达变化情况。7、分析HSP70干扰质粒与TRAIL联用后对A549细胞内p53和磷酸化p53蛋白表达水平的影响将HSP70干扰质粒通过GenEscort Reagent转染试剂转染到A549细胞中，24小时后加入TRAIL诱导细胞凋亡，18小时后收获处理后的细胞，加入RIPA细胞裂解液，冰上裂解30分钟，然后离心并定量，在加入上样缓冲液后，做样，用p53和磷酸化p53 (81位苏氨酸位点)的特异性抗体进行western blot技术分析蛋白的表达变化情况。8、分析HSP70干扰质粒与TRAIL联用后对A549细胞内JNK信号通路的影响将HSP70干扰质粒通过GenEscort Reagent转染试剂转染到A549细胞中，24小时后加入TRAIL诱导细胞凋亡，18小时后收获处理后的细胞，加入RIPA细胞裂解液，冰上裂解30分钟，然后离心并定量，在加入上样缓冲液后，做样，用c-JUN、ph0Sph0-C-JUN、JNK、phospho-JNK的特异性抗体进行western blot技术分析蛋白的表达变化情况。9、联合应用HSP70干扰质粒基因治疗与TRAIL药物治疗的抗肿瘤效率分析(I)裸鼠A549实体瘤皮下模型的建立将A549细胞用PBS悬浮至浓度为5 X IO6个/ml，然后每只裸鼠右侧背部皮下经皮下注射ΙΟΟμ L(5X IO5细胞)，注意观察肿瘤的生长情况，大约在一周左右，原位肿瘤大小生长至约125mm3时，根据治疗方法的不同将小鼠分成六组，每组8只，开始治疗。六组的治疗方式分别为1)空白对照组(不做任何治疗);2)siRNA pRNT-U6. I空载质粒对照(psiLUC)注射治疗；3) TRAIL药物治疗；4)HSP70干扰质粒(psiHSP70)注射治疗；5) siRNA pRNT_U6. I空载质粒(psiLUC)对照+TRAIL联合治疗；6) HSP70干扰质粒(psiHSP70) +TRAIL联合治疗。干扰质粒基因治疗方式每隔5天治疗一次，一共治疗3次。具体方法是将混合好的干扰质粒与转染试剂混合物直接注射到肿瘤组织中，首次治疗是注射20 μ I (5μ I HSP70干扰质粒(I μ g/μ 1)，5 1 GenEscort Reagent 转染试剂(I μ g/μ I), 10 μ I PBS)混合物，后两次治疗是注射 40 μ I (10 μ I HSP70 干扰质粒(I μ g/ μ I )，10 μ I GenEscort Reagent 转染试剂(I μ g/ μ I )，20 μ I PBS)混合物。首次干扰质粒基因治疗后开始TRAIL腹腔注射治疗，每天注射一次，每次注射100 μ g, 一共治疗14天。(2)实体瘤中干扰质粒转染效率鉴定待肿瘤大小生长至约125mm3，开始在瘤体内注射psiLUC (空载干扰质粒)和转染试剂的混合物，在注射后的第0、1、2、3、4、5天，取肿瘤组织切片，荧光显微镜下直接观察转染效率(3)肿瘤生长曲线分析从开始分组治疗，每两天测量肿瘤大小，并按下列公式计算肿瘤体积
O.5236XLI X (L2)2,其中LI为肿瘤长轴，L2为肿瘤短轴。开始治疗后第17天,处死小鼠。并通过回归方程计算肿瘤生长曲线。
(4)肿瘤组织内DR4和DR5的表达水平分析在肿瘤治疗后的第15天取肿瘤组织，加入Trizol，匀浆后提取RNA，用DR4和DR5特异性的引物进行RT-PCR实验，分析肿瘤组织中DR4和DR5的mRNA水平。DR4 特异性引物为5’ -CCGCGGCCACACCCAGCAAAGT-3’ 和5，-GCAGCAGGACCCCGACGACGACA-3，；DR5 特异性引物为5’ -GTGGGGACCCTGAGCGTGTG-3’ 和5’-CTCCAAGGCATCCAGCAGGGTGTG-3’实施例二以RNA干扰技术下调肿瘤细胞或组织中HSP27的表达，联合应用抗肿瘤药物TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡，治疗小鼠A549实体瘤模型为实施例I、HSP27干扰质粒的构建HSP27干扰质粒的设计与构建方法同实施例一所述。由Gensicript公司软件设计出的用于 HSP27 RNA 干扰的片段如下5’ -GGATCCCGTCTCATCGGATTTTGCAGTTGATATCCGCTGCAAAATCCGATGAGACTTTTTTCCAAAAGC-3’，由申能博彩生物科技有限公司合成的两条片段序列为5’-GATCCCGTCTCATCGGATTTTGCAGTTGATATCCGCTGCAAAATCCGATGAGACTTTTTTCCAAA-3’ 和5’-AGCTTTTGGAAAAAAGTCTCATCGGATTTTGCAGCGGATATCAACTGCAAAATCCGATGAGACGG-3’ 。2、HSP27干扰质粒的干扰效果及其与TRAIL联用在细胞水平诱导A549细胞凋亡能力的检测(1)HSP27干扰质粒干扰效果分析细胞转染和处理方法同实施例一所述，分别进行RT-PCT和western blot分析其干扰效果。RT-PCR所用特异性引物为HSP27 正义链5’-CGCGCTCAGCCGGCAACTCAG-3’ ；HSP27 反义链5’-CGGCAGCAGGGGTGGGCATCC-3’ ；GAPDH 正义链5’-AACGACCCCTTCATTGAC-3’ ；GAPDH 反义链5’-TCCACGACATACTCAGCAC-3’ ；(2)HSP27干扰与TRAIL联用在细胞水平诱导A549细胞凋亡能力的检测A，流式细胞仪检测细胞凋亡方法同实施例一所述。B, TUNEL试剂盒检测细胞凋亡方法同实施例一所述。(3)HSP27干扰与TRAIL联用对A549细胞克隆形成能力的影响分析克隆形成实验检测A549细胞转染HSP27干扰质粒前后对TRAIL的药物敏感性。方法同实施例一所述。
3、分析HSP27干扰质粒与TRAIL联用对A549细胞受体凋亡通路和线粒体凋亡通路上关键蛋白的影响将HSP27干扰质粒通过GenEscort Reagent转染试剂转染到A549细胞中，24小时后加入TRAIL诱导细胞凋亡，18小时后收获处理后的细胞，加入RIPA细胞裂解液，冰上裂解30分钟,然后离心并定量,在加入上样缓冲液后，做样,用caspase-8、caspase_3、caspase-9、PARP、Bcl_2、Bax、Bid、Bad、cytochromec 的特异性抗体进行 western blot 技术分析各蛋白的表达变化情况。4、分析HSP27干扰质粒与TRAIL联用后A549细胞TRAIL的受体蛋白DR4和DR5的表达变化将HSP27干扰质粒通过GenEscort Reagent转染试剂转染到A549细胞中，24小时后加入TRAIL诱导细胞凋亡，18小时后收获处理后的细胞，一部分细胞提取RNA，逆转录，RT-PCR技术分析细胞中DR4和DR5的mRNA水平；另外一部分细胞加入RIPA细胞裂解液，冰上裂解30分钟，然后离心并定量，在加入上样缓冲液后，做样，用DR4和DR5的特异性抗 体进行western blot技术分析DR4和DR5的蛋白水平。5、分析HSP27干扰质粒与TRAIL联用后对A549细胞内NF- κ B信号通路的影响将HSP27干扰质粒通过GenEscort Reagent转染试剂转染到Α549细胞中，24小时后加入TRAIL诱导细胞凋亡，18小时后收获处理后的细胞，用细胞核制备试剂盒(上海将来试剂有限公司)制备细胞质和细胞核蛋白，然后分别加入上样缓冲液后，做样，用NF- κ Bp65, I κ B a , GAPDH和Lamin B的特异性抗体进行westernblot技术分析各蛋白在细胞质和细胞核内的表达变化情况。6、分析HSP27干扰质粒与TRAIL联用后对A549细胞内c-FLIP-L蛋白表达水平的影响将HSP27干扰质粒通过GenEscort Reagent转染试剂转染到A549细胞中，24小时后加入TRAIL诱导细胞凋亡，18小时后收获处理后的细胞，加入RIPA细胞裂解液，冰上裂解30分钟，然后离心并定量，在加入上样缓冲液后，做样，用c-FLIP-L的特异性抗体进行western blot技术分析蛋白的表达变化情况。7、分析HSP27干扰质粒与TRAIL联用后对A549细胞内p53和磷酸化p53蛋白表达水平的影响将HSP27干扰质粒通过GenEscort Reagent转染试剂转染到A549细胞中，24小时后加入TRAIL诱导细胞凋亡，18小时后收获处理后的细胞，加入RIPA细胞裂解液，冰上裂解30分钟，然后离心并定量，在加入上样缓冲液后，做样，用p53和磷酸化p53 (81位苏氨酸位点)的特异性抗体进行western blot技术分析蛋白的表达变化情况。8、分析HSP27干扰质粒与TRAIL联用后对A549细胞内JNK信号通路的影响将HSP27干扰质粒通过GenEscort Reagent转染试剂转染到A549细胞中，24小时后加入TRAIL诱导细胞凋亡，18小时后收获处理后的细胞，加入RIPA细胞裂解液，冰上裂解30分钟，然后离心并定量，在加入上样缓冲液后，做样，用c-JUN、ph0Sph0-C-JUN、JNK、phospho-JNK的特异性抗体进行western blot技术分析蛋白的表达变化情况。9、联合应用HSP27干扰质粒基因治疗与TRAIL药物治疗的抗肿瘤效率分析(I)裸鼠A549实体瘤皮下模型的建立
将A549细胞用PBS悬浮至浓度为5X IO6个/ml，然后每只裸鼠右侧背部皮下经皮下注射ΙΟΟμ L(5X105cell)，注意观察肿瘤的生长情况，大约在一周左右，原位肿瘤大小生长至约125mm3时，根据治疗方法的不同将小鼠分成六组，每组8只，开始治疗。六组的治疗方式分别为1)对照组(不做任何治疗)；2) siRNA pRNT-U6. I空载质粒对照(psiLUC)注射治疗；3)TRAIL药物治疗；4)HSP27干扰质粒(psiHSP27)注射治疗；5)siRNA pRNT_U6. I空载质粒(psiLUC)+TRAIL联合治疗；6) HSP27干扰质粒(psiHSP27)+TRAIL联合治疗。干扰质粒基因治疗方式每隔5天治疗一次，一共治疗3次。具体方法是将混合好的干扰质粒与转染试剂混合物直接注射到肿瘤组织中，首次治疗是注射20 μ I (5 μ I干扰质粒(I μ g/μ 1),5μ I GenEscort Reagent转染试剂(I μ g/μ I )，10 μ I PBS)混合物，后两次治疗是注射 40 μ I (10 μ I 干扰质粒(I μ g/μ I), 10 μ I GenEscort Reagent 转染试剂(I μ g/μ I )，20μ1 PBS)混合物。首次干扰质粒基因治疗后开始TRAIL腹腔注射治疗，每天注射一次，每次注射100 g，一共治疗14天。(2)实体瘤中干扰质粒转染效率鉴定方法同实施例一所述。(3)肿瘤生长曲线分析方法同实施例一所述。 (4)肿瘤组织内DR4和DR5的表达水平分析在肿瘤治疗后的第15天取肿瘤组织，加入Trizol，匀浆后提取RNA，用DR4和DR5特异性的引物进行RT-PCR实验，分析肿瘤组织中DR4和DR5的mRNA水平。实施例三HSP70干扰与TRAIL联用在细胞水平诱导多种非小细胞肺癌细胞NSCLC (A549，SW1573和H460)凋亡能力的检测(流式细胞仪检测细胞凋亡)将HSP70干扰质粒通过GenEscort Reagent转染试剂转染到A549, SW1573和H460细胞中，24小时后加入TRAIL诱导细胞凋亡，18小时后收获处理后的细胞，重悬于100 μ I的sample buffer中，一边振荡一边滴加预冷的70%乙醇lml,4°C固定过夜。然后3000rpm离心5分钟，吸去上清，加入Iml PI染色液，混匀后室温避光放置30分钟以上，在24小时内检测。使用cellquest软件采集数据并进行分析。实施例四在肺癌原位肿瘤模型上联合应用HSP70、HSP27低表达治疗与TRAIL药物治疗的抗肿瘤效率分析I、裸鼠A549实体瘤原位模型的建立裸鼠，6-7周龄，雌性。将带有荧光素酶的A549-luc-c8细胞用PBS悬浮至浓度为7X IO7个/ml，经台盼蓝染色测定活性后，将30 μ I细胞悬液和30 μ I基质胶(Matrigel)混匀，在快凝固之前以胰岛素注射针将混悬液共60μ I沿裸鼠左肩胛线第6肋间缓慢穿刺进针约8mm后向肺内注射，每只实验裸鼠接种细胞数约2Χ106个。接种后，采用冷泉港公司Caliper小动物活体成像仪观察肺部肿瘤细胞的生长情况，接种两周后，根据治疗方法的不同将小鼠分成六组，每组8只，开始治疗。六组的治疗方式分别为1)对照组(不做任何治疗)；2) TRAL药物治疗；3) HSP27干扰质粒(psiHSP27)注射治疗；4) HSP70干扰质粒(psiHSP70)注射治疗；5) HSP27干扰质粒(psiHSP27) +TRAIL联合治疗；6) HSP70干扰质粒(psiHSP70)+TRAIL联合治疗。干扰质粒基因治疗方式每隔5天治疗一次，一共治疗3次。具体方法是将混合好的干扰质粒与转染试剂混合物直接注射到肿瘤组织中，每次注射 20 μ I (5 μ I HSP70 或 HSP27 干扰质粒(lyg/μ 1)，5μ IGenEscort Reagent 转染试剂(1μδ/μ1),10μ1 PBS)混合物。首次干扰质粒基因治疗后开始TRAIL腹腔注射治疗，每天注射一次，每次注射100 μ gg, 一共治疗21天。2、肿瘤生长曲线分析从肿瘤细胞移植后开始，每周用小动物活体成像仪观察肿瘤的生长情况，测量荧光素酶的活性(每秒的光子数)，并通过回归方程计算肿瘤生长曲线。3、荷瘤小鼠生存率分析从肿瘤细胞移植后开始，每日监控小鼠存活情况直至肿瘤细胞移植后的第75天。上述发明实施例充分显示本发明发现了下调HSP70的表达、数量及活性可增加肿瘤细胞对细胞凋亡的敏感性、并增强抗肿瘤药物的抗肿瘤治疗效果。利用RNA干扰技术下调了 A549肿瘤细胞内HSP70的mRNA与蛋白水平的表达(图I)，在低剂量(40ng/μ I)TRAIL诱导后，流式细胞仪和TUNEL凋亡检测发现了下调A549肿瘤细胞内HSP70的表达增 强了肿瘤细胞对TRAIL的敏感性，增加了细胞的凋亡率(图2)。并且，在40ι^/μ1 TRAIL诱导下，细胞凋亡率与转染的psiHSP70干扰质粒量呈剂量依赖关系(图2)。同样地，在转染一定量的psiHSP70 (OAyg)后，细胞凋亡率与TRAIL的用量呈剂量依赖关系(图2)。克隆形成实验表明psiHSP70与TRAIL联合处理显著抑制了 A549细胞的克隆形成能力(图2)，HSP70的表达下调使A549细胞对TRAIL的药物敏感度增加了 52. 5倍(图2)。本发明还发现了下调HSP27的表达、数量及活性可增加肿瘤细胞对细胞凋亡的敏感性。利用RNA干扰技术下调了 A549肿瘤细胞内HSP27的mRNA与蛋白水平的表达(图3)，在低剂量(40ng/ μ I )TRAIL诱导后，流式细胞仪和TUNEL凋亡检测发现了发现下调A549肿瘤细胞内HSP27的表达增强了肿瘤细胞对TRAIL的敏感性，增加了细胞的凋亡率(图4)。并且，在40ng/l·! I TRAIL诱导下，细胞凋亡率与转染的psiHSP27干扰质粒量呈剂量依赖关系(图4)，同样地，在转染一定量的psiHSP27 (O. 5 μ g)后，细胞凋亡率与TRAIL的用量呈剂量依赖关系(图4)。克隆形成实验表明psiHSP27与TRAIL联合处理显著抑制了 A549细胞的克隆形成能力(图4)，HSP27的表达下调使A549细胞对TRAIL的药物敏感度增加了 47. 5倍(图4)。由上可见，在细胞水平下调HSP27的表达、数量及活性可以产生与HSP70相似的增加肿瘤细胞对细胞凋亡敏感性的效果。因此，下调HSP70与HSP27的表达、数量及活性都有可能作为一种增加肿瘤组织或细胞对细胞凋亡敏感性的方法。本发明通过Western blot技术分析发现与HSP27相比，下调A549肿瘤细胞内HSP70的表达、数量及活性后，用TRAIL诱导激活了 caspase家族蛋白(caspase-8、caspase-9、caspase_3)的级联反应和PARP的剪切,增加了 Bcl_2家族促凋亡蛋白Bax、Bad、t-Bid的表达，下调了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达(图5)，并促进了细胞色素C从线粒体释放到细胞质，最终导致细胞凋亡。与HSP27相比，RNA干扰技术下调细胞内HSP70的表达、数量及活性后激活了NF-κ B信号通路，从而增加了肿瘤细胞对细胞凋亡的敏感性。对于HSP70的表达、数量及活性下调的细胞，细胞质内I κ Ba和NF-κ B p65的蛋白表达水平下降，细胞核内NF-κ Bρ65的蛋白表达水平增加(图5)，从而证明NF-κ B ρ65发生了从细胞质到细胞核的转位，从而在细胞核中发生转录因子的调控作用。与HSP27相比，RNA干扰技术下调细胞内HSP70的表达、数量及活性后显著降低了细胞内抗凋亡蛋白质c-FLIP-L的表达(图5)，从而增加肿瘤细胞对细胞凋亡的敏感性。
与HSP27相比，RNA干扰技术下调细胞内HSP70的表达、数量及活性后显著增加了细胞内转录因子P53的表达和磷酸化水平(81位苏氨酸位点的磷酸化)，导致p53蛋白质的活化(图5)。p53可以激活凋亡信号蛋白质DR4/5的表达、Bax的表达，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白质的表达，从而增加肿瘤细胞对细胞凋亡的敏感性。与HSP27相比，RNA干扰技术下调细胞内HSP70的表达、数量及活性后显著增加了细胞内转录因子c-JUN的表达及其磷酸化、JNK的磷酸化，导致c-JUN和JNK的激活(图5)。c-JUN和JNK的激活可以激活p53蛋白质和Bid、t-Bid等的表达，同时抑制抗凋亡蛋白c-FLIP-L的表达，从而增加肿瘤细胞对细胞凋亡的敏感性。进一步地,通过Western blot技术分析发现在TRAIL诱导下，与HSP27相比较，下调细胞内HSP70的表达、数量及活性后，细胞内TRAIL的受体蛋白DR4和DR5mRNA的表达水平增加(图6),蛋白表达水平增加(图6)。通过Western blot技术分析发现下调A549肿瘤细胞内HSP27的表达、数量及活性后用TRAIL诱导激活了 caspase家族蛋白(caspase-8、caspase9、caspase-3)的级联反应和PARP的剪切(图6),增加了 Bcl_2家族促凋亡蛋白 Bax、Bad、t-Bid的表达，下调了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达(图6)，并促进了细胞色素C从线粒体释放到细胞质，最终导致细胞凋亡。进一步地，通过Western blot技术分析发现在TRAIL诱导下，下调细胞内HSP27的表达、数量及活性后，细胞内TRAIL的受体蛋白DR4和DR5mRNA的表达水平并没有明显增加(图6)，蛋白表达水平也无明显增加(图6)。进一步，将下调细胞内HSP70的表达、数量及活性治疗方法与TRAIL联用，在A549实体肿瘤模型上评价其抑瘤效果。首先考察了体内干扰质粒的转染效率，psiLUC质粒通过转染试剂注射到实体瘤体内后，在荧光显微镜下观察发现干扰质粒可在瘤体内抑制持续数天，转染效率较高，保证了体内基因治疗的可行性。接下来考察了 psiHSP70干扰质粒与TRAIL联用的抑瘤效果，在第24天，psiHSP70干扰质粒与TRAIL联合抑瘤率为64% (图7)，显示了明显的抗肿瘤效果(与对照组相比P〈0. 05)。而psiHSP70干扰质粒单独治疗组、TRAIL单组治疗组抑瘤效果与对照组相比均不显著(图7)，因此，psiHSP70干扰质粒与TRAIL显示了很好的协同治疗效应，显著抑制了肿瘤的生长。RT-PCR技术显示在肿瘤治疗后的第15天，psiHSP70干扰质粒与TRAIL联合治疗导致肿瘤组织中TRAIL的受体DR4和DR5的表达水平增加(图7)，从而增加肿瘤组织了对TRAIL的药物敏感性，促进了肿瘤细胞的凋亡，达到了肿瘤治疗的目的。进一步，再下调细胞内HSP27的表达、数量及活性治疗方法与TRAIL联用，在A549实体肿瘤模型上评价其抑瘤效果。在第24天，psiHSP27干扰质粒与TRAIL联合抑瘤率为25%(图8)，治疗效果与对照组相比并不显著，而TRAIL和psiHSP27单独治疗的抑瘤率分别为21%和41%(图8)，治疗效果与对照组相比也不显著，说明psiHSP27干扰质粒与TRAIL联用没有显示明显的协同治疗效应，没能有效抑制肿瘤的生长。RT-PCR技术显示在肿瘤治疗后的第15天，psiHSP27干扰质粒与TRAIL联合治疗组中DR4和DR5的表达水平与对照组相比，没有明显的增加(图8)，因此下调HSP27在体内不能增加肿瘤细胞对TRAIL的药物敏感性，肿瘤组织对TRAIL药物抵抗，不能有效抑制肿瘤生长。进一步，本发明在多种肿瘤细胞(A549，SW1573和H460上比较了下调细胞内HSP70的表达、数量及活性对肿瘤细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡的敏感性的影响，结果显示，下调细胞内HSP70的表达、数量及活性能够在多种细胞内大大增强肿瘤细胞对细胞凋亡诱导的敏感性，使原来对细胞凋亡不敏感的肿瘤细胞变为对细胞凋亡极其敏感(图9)。进一步，本发明在肺癌原位肿瘤模型上比较和验证了联合应用下调细胞内HSP70或HSP27的表达、数量及活性与TRAIL药物治疗的抗肿瘤效果。结果显示只有下调细胞内HSP70的表达、数量及活性与TRAIL联合进行治疗才能产生显著的抗肿瘤效果、即显著增强肿瘤细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡的敏感性；将下调细胞内HSP27的表达、数量及活性与TRAIL联合进行治疗则不具有这种效果。因此，这说明这种显著增强的肿瘤治疗效果不是HSP类蛋白质所共有的，而是HSP70所特有的；而且，这种效果不是仅从细胞水平的实验就可以获得、推断或衍生的，因为HSP27和HSP70在细胞 水平表现出相同的增加肿瘤细胞对细胞凋亡诱导的敏感性。因此，并非下调所有热休克蛋白的表达、数量或活性都能作为肿瘤治疗的靶点。进一步，本发明在细胞水平和动物水平都证明通过下调肿瘤组织或细胞内HSP70的表达、数量或活性能够显著增强NF- κ B的活性、显著上调NF- κ B下游靶基因一死亡受体DR4和DR5的表达水平、增加JNK和c-Jun的磷酸化、促进p53蛋白的活化、增加线粒体细胞凋亡信号途径促凋亡分子Bax等蛋白质的表达、下调抗凋亡蛋白c-FLIP、Bcl-2等蛋白质表达的方法，从而达到显著提高肿瘤细胞对细胞凋亡的敏感性、提高肿瘤组织和细胞凋亡及坏死，显著抑制实体瘤生长的效果。HSP70的这种特性不是HSP类蛋白质所共有的，例如HSP27即使在细胞水平也没有这种性质。我们同时还针对来源于肝癌、前列腺癌、结肠癌、胃癌等肿瘤细胞进行了实验，也获得了类似的实验结果。以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种调控热休克蛋白70表达、数量及活性的方法，其特征是通过常规的影响细胞内HSP70表达、数量及活性的方法及手段达到通过抑制组织及细胞内HSP70的表达、数量及活性来增加组织及细胞对细胞凋亡的敏感性，上述常规的影响细胞内HSP70表达、数量及活性的方法及手段是指通过筛选HSP70转录的抑制剂抑制HSP70 mRNA转录的方法，利用RNA干扰技术和反义RNA技术降低HSP70 mRNA的数量的方法，利用HSP70蛋白质合成抑制剂和通过加速HSP70蛋白质的降解而减少HSP70蛋白质数量的方法，利用HSP70的抑制剂抑制HSP70的功能及活性的方法。
2.权利要求I所述的一种调控热休克蛋白70表达、数量及活性的方法在调控组织及细胞内转录因子NF-K B及活性中的应用。
3.权利要求I所述的一种调控热休克蛋白70表达、数量及活性的方法在调控组织及细胞内死亡受体DR4和DR5表达及活性中的应用。
4.权利要求I所述的一种调控热休克蛋白70表达、数量及活性的方法在调控组织及细胞内JNK和c-Jun的磷酸化及活性中的应用。
5.权利要求I所述的一种调控热休克蛋白70表达、数量及活性的方法在调控组织及细胞内P53蛋白及活性中的应用。
6.权利要求I所述的一种调控热休克蛋白70表达、数量及活性的方法在调控组织及细胞内细胞凋亡信号途径促凋亡分子Bax、Bid、t-Bid、capsase 3> capsase 8、capsase 9的表达和促细胞凋亡活性中的应用。
7.权利要求I所述的一种调控热休克蛋白70表达、数量及活性的方法在调控组织及细胞内抗凋亡蛋白C-FLIP和Bcl-2表达及活性中的应用。
8.权利要求I所述的一种调控热休克蛋白70表达、数量及活性的方法在促细胞凋亡药物中的应用。
9.权利要求I所述的一种调控热休克蛋白70表达、数量及活性的方法在制备与细胞凋亡治疗药物联合应用的药物中的应用。
10.权利要求I所述的一种调控热休克蛋白70表达、数量及活性的方法在制备与细胞凋亡诱导蛋白TRAIL联合应用的药物中的应用。
11.权利要求I所述的一种调控热休克蛋白70表达、数量及活性的方法在制备抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明属生物技术领域，具体涉及一种调控热休克蛋白70表达、数量及活性的方法及其应用。利用本发明还能够调控肿瘤组织及细胞内转录因子NF-κB及活性、死亡受体DR4和DR5表达及活性、JNK和c-Jun的磷酸化及活性、p53蛋白的表达及活性、促凋亡分子Bax、Bid、t-Bid、capsase3、capsase8、capsase9表达及其促细胞凋亡活性、抗凋亡蛋白c-FLIP和Bcl-2表达及活性，促进肿瘤组织及细胞凋亡。本发明还涉及上述方法在制备与细胞凋亡诱导药物联合应用的药物中的应用。
文档编号A61P35/00GK102816792SQ20121029366
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月17日 优先权日2012年8月17日
发明者华子春, 庄红芹 申请人:南京大学