专利名称：从骨髓中一次性同时培养获得基质干细胞与内皮祖细胞的制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及从骨髓中一次性同时培养获得基质干细胞与内皮祖细胞的制备方法。本发明涉及的能快速增殖、操作简便同时得到基质干细 胞与内皮祖细胞两种细胞，满足临床上高数量级的治疗需要，用于心脑血管的缺血性和出血性疾病治疗。
背景技术：
骨髓基质干细胞是骨髓中非造血实质细胞的干细胞能分化为骨、软骨、脂肪和神经等细胞，也参与机体免疫调节作用。内皮祖细胞是血管内皮细胞的前体细胞，参与损伤血管的修复。骨髓基质干细胞和内皮祖细胞都能用于心脑血管缺血性和出血性疾病治疗，用于调节机体内环境，进行修复损伤血管。目前基质干细胞主要来源是骨髓、脐血、脐带和胎盘等，内皮祖细胞来源主要为骨髓、脐血和外周血。但是它们在其中含量都很低，细胞扩增较难，对它们在研究和应用中受到限制。通常基质干细胞和内皮祖细胞分别需要50ml或更多的骨髓或脐血进行密度梯度离心分离，然后在细胞因子作用下进行体外培养获得。这样一来，每次采集的骨髓或脐血只能用于一种细胞的扩增培养基质干细胞或者内皮祖细胞，获得足够使用的数量级的细胞数。由于基质干细胞和内皮祖细胞都对心脑血管疾病治疗有很大的疗效作用，基质干细胞可以改善机体内环境，包括分泌营养因子和调节机体免疫炎症反应，有助于其或者内皮祖细胞更多地在体内分化为内皮细胞，更好地修复损伤血管。因而从自体骨髓中一次性同时培养获得基质干细胞和内皮祖细胞是很必要的，可联合两者进行应用，发挥最佳的功能。目前纯化和扩增培养方法只能获得基质干细胞或内皮祖细胞其中一种，并且方法较复杂，成本高、耗时较长，很大程度上制约了两者在临床治疗中的使用。
发明内容
本发明的目的就在于为了能一次性同时培养获得基质干细胞和内皮祖细胞，克服上述现有技术的缺陷，提供一种从骨髓中一次性同时培养获得基质干细胞与内皮祖细胞的制备方法，所述制备方法包括5-20ml骨髓直接经葡蔗糖-泛影酸纳溶液密度梯度离心分离，并通过I XPBS (pH值7. 4)洗涤三次获得单个核细胞；一半单个核细胞在a-MEM完全培养基培养获得基质干细胞；另一半单个核细胞在EGM-2完全培养基中培养获得基质干细胞。所述的基质干细胞与内皮祖细胞制备方法，其特征在于，基质干细胞在a-MEM完全培养基(10% (ν/ν)胎牛血清、20ng/mL碱性成纤维生长因子)中原代培养，当培养瓶中生长到80%以上，用O. 025% (m/v)胰酶消化后进行扩增，每次I瓶培养瓶扩增到2瓶，连续扩增5代，可达到2X108以上细胞数量级。内皮祖细胞在EGM-2完全培养基(5% (ν/ν)胎牛血清、50ng/mL表皮生长因子、50ng/mL血管内皮生长因子、50ng/mL人胰岛素样生长细胞因子、lug/mL氢化可的松)中原代培养，当用3 μ g/cm2纤维连接蛋白包被的培养瓶中生长到80%以上，用0.025% (m/v)胰酶消化后进行扩增，每次I瓶培养瓶扩增到2瓶，连续扩增5代，可达到2 X IO8以上细胞
数量级。其中体外增殖培养获得基质干细胞的表型中⑶90、⑶44、⑶105和⑶73阳性率达到90%以上，⑶14、⑶34、⑶45和HLA-DR阳性率低于5%以下；符合基质干细胞表达的标志物要求。扩增得到的内皮祖细胞表型中⑶31阳性率达到90%以上，血管内皮生长因子受体2 (KDR)、⑶34阳性率为15 20%，⑶133阳性率低于5%以下，符合内皮祖细胞表达的标志物要求。所述获得的基质干细胞与内皮祖细胞可同时或单独用于临床应用，进行治疗心血管和脑血管疾病，最佳地发挥两者在临床治疗中的功能，基质干细胞可以改善机体内环境， 包括分泌营养因子和调节机体免疫炎症反应，有助于其或者内皮祖细胞更多地在体内分化为内皮细胞，更好地修复损伤血管。
图I表示本发明中一次性同时获得的基质干细胞和内皮祖细胞形态图；图2表示本发明中获得基质干细胞流式细胞检测结果图；图3表示本发明中获得基质干细胞联合内皮祖细胞体内移植mNSS评分曲线图；图4表示本发明中获得基质干细胞联合内皮祖细胞体内移植后随着时间变化进行脑损伤面积改善曲线图；图5表示本发明中获得基质干细胞联合内皮祖细胞体内移植后对缺血性脑卒中大鼠新生毛细血管分支点数图。
具体实施例方式本发明发现从骨髓来源的单个核细胞，经体外培养可以一次性同时获得基质干细胞和内皮祖细胞，并分别表达两者特有的表面标志，联合两者在心脑血管疾病中更好的发挥细胞功能，从而完成了本发明。对本发明涉及的骨髓中一次性同时培养获得基质干细胞和内皮祖细胞的制造方法进行具体说明。本发明方法的特征在于，包含如下工序，即5-20ml骨髓直接经葡蔗糖-泛影酸纳溶液密度梯度离心分离，并通过I XPBS (pH值7. 4)洗涤三次获得单个核细胞；一半单个核细胞在a -MEM完全培养基培养获得基质干细胞；另一半单个核细胞在EGM-2完全培养基中培养获得基质干细包。作为本发明制造方法中使用的单个核细胞，由骨髓得到的细胞群。上述细胞群无论是从生物体采集的新鲜细胞群或冷冻保存过的细胞群，均可用于本发明。本发明提供一次性同时培养获得的基质干细胞与内皮祖细胞制备方法，其特征在于，基质干细胞在a-MEM完全培养基(10% (ν/ν)胎牛血清、20ng/mL碱性成纤维生长因子)中原代培养，当培养瓶中生长到80%以上，用O. 025% (m/v)胰酶消化后进行扩增，每次I瓶培养瓶扩增到2瓶，连续扩增5代，可达到2X IO8以上细胞数量级。内皮祖细胞在EGM-2完全培养基(5% (ν/ν)胎牛血清、50ng/mL表皮生长因子、50ng/mL血管内皮生长因子、50ng/mL人胰岛素样生长细胞因子、lug/mL氢化可的松)中原代培养，当用3 μ g/cm2纤维连接蛋白包被的培养瓶中生长到80%以上，用0.025% (m/v)胰酶消化后进行扩增，每次I瓶培养瓶扩增到2瓶，连续扩增5代，可达到2 X IO8以上细胞
数量级。本发明的一次性同 时培养获得基质干细胞和内皮祖细胞的制备方法中使用的培养基，没有特殊限制，可以使用基质干细胞和内皮祖细胞扩增培养等中能使用的公知的培养基，例如可以适当地选择使用市售培养基。上述培养基除其原有的构成成分外，还可以含有细胞因子类、适当的蛋白质及其他成分。在培养基中可以添加血清或血浆进行培养。它们在培养基中的添加量不受特殊限制，如大于O容量％至20容量％，且可以根据不同的培养阶段而改变血清或血浆的用量。例如，可以阶段性减少血清或血浆浓度来使用。另外，作为血清或血浆的来源，可以是自己(意味着与所培养的细胞来源相同)或非自己(意味着与所培养的细胞的来源不同)中的任一种，从安全性的观点出发，优选自己来源的血清或血浆。另外，也可以添加如人血清白蛋白之类经分离纯化的血清成分。本发明中一次性同时体外增殖培养获得基质干细胞的表型中⑶90、⑶44、⑶105和⑶73阳性率达到90%以上，⑶14、⑶34、⑶45和HLA-DR阳性率低于5%以下；符合基质干细胞表达的标志物要求。扩增得到的内皮祖细胞表型中⑶31阳性率达到90%以上，血管内皮生长因子受体2 (KDR)、⑶34阳性率为15 20%，⑶133阳性率低于5%以下，符合内皮祖细胞表达的标志物要求。本发明一次性同时培养获得基质干细胞和内皮祖细胞使用上述各种成分及培养基来实施。本发明中使用的培养开始时的细胞数没有特殊限制，例如优选IXlO4ceIls/mL-1 X 108cells/mL、更优选 I X 106cells/mL-l X 107cells/mL。另外，培养条件也没有特殊限制，可以使用通常的细胞培养中使用的条件。例如，可在37°0、5%0)2等条件下培养。还可以实施如下等操作间隔适当的时间添加新鲜培养基来稀释细胞培养液，或更换培养基，或更换细胞培养用器材等。本发明次性同时培养获得基质干细胞和内皮祖细胞的制备方法中，对培养期没有特殊限制，例如可以实施总天数为4 30天、优选21 28天的培养。本发明提供用上述本发明的次性同时培养获得基质干细胞和内皮祖细胞。在生物体内发挥更好细胞功能，达到很好的治疗效果。此外，上述同时应用基质干细胞和内皮祖细胞，因此非常利于在治疗上应用。以下，结合实施例对本发明做更具体的描述，但本发明不限于此。实施例一骨髓中一次性同时培养获得基质干细胞和内皮祖细胞采集20mL正常捐献者骨髓(与其签署知情同意书)，采用Ficoll密度梯度离心分离，经1父？85( !1值7.4)洗涤三次，得到的单个核细胞，计数。20mL骨髓获得约40X IO6Cells单个核细胞。一半单个核细胞(约20X IO6Cells)重悬在a-MEM完全培养基(10% (ν/ν)胎牛血清、20ng/mL碱性成纤维生长因子)中，添加到25cm2培养瓶中，每瓶5mL，细胞浓度为2X106cells/mL，在5% CO2中在37°C下开始培养。另一半单个核细胞(约20X IO6Cells)重悬在EGM-2完全培养基(5% (ν/ν)胎牛血清、50ng/mL表皮生长因子、50ng/mL血管内皮生长因子、50ng/mL人胰岛素样生长细胞因子、lug/mL氢化可的松)中原代培养，添加到3 μ g/cm2纤维连接蛋白包被的25cm2培养瓶中，每瓶5mL，细胞浓度为2X106cells/mL，在5% CO2中在37°C下开始培养。当骨髓来源基质干细胞和内皮祖细胞在培养瓶中生长到80%以上，用0.025%(m/v)胰酶消化后进行扩增，第一次扩瓶中为每2瓶25cm2培养瓶扩增到I瓶75cm2培养瓶，分别使用各自新鲜的完全培养基进行传代培养其中内皮祖细胞需使用3μ g/cm2纤维连接蛋白包被的培养瓶；以后每I瓶75cm2培养瓶扩增到2瓶，连续扩增5代，其中培养内皮祖细胞时不再使用3 μ g/cm2纤维连接蛋白包被的培养瓶；基质干细胞和内皮祖细胞增殖培养后均可达到2X108以上细胞数量级。实施例二 骨髓中一次性同时培养获得的基质干细胞和内皮祖细胞流式细胞检测培养到最后一天(第5代)，分别取I瓶生长好的的基质干细胞和内皮祖细胞用O. 025% (m/v)胰酶消化，消化液用O. 5mL小牛血清终止，然后在1000rpm、4°C下离心5分钟，细胞分别用ImL a -MEM和EGM-2培养基重悬，取20ul细胞液用I XPBS (pH7. 4)稀释20倍，稀释液加入I倍体积的苔盼兰溶液，混匀后加入到细胞计数板，于倒置显微镜下观察计数，蓝色染色的为死细胞，不染色的为活细胞。取苔盼兰染色计数后的3X IO6细胞，基质干细胞分三组进行流式细胞仪检测，第一组分别添加到有20 μ LFITC标记鼠抗人⑶34单抗、20 μ L PE标记鼠抗人⑶19单抗的离心管中；第二组分别添加到有20 μ LFITC标记鼠抗人⑶44单抗和20 μ L PE标记鼠抗人⑶105单抗的离心管中；第三组分别添加20 μ LFITC标记鼠抗人⑶45单抗、20 μ L PE标记鼠抗人⑶73单抗；第四组分别添加20 μ L FITC标记鼠抗人⑶14单抗、20 μ L PE标记鼠抗人⑶90单抗；第五组为同型对照，分别添加到有20μ L FITC标记鼠IgGl和20 μ LPE标记鼠IgGl (美国BD公司)。置于4°C冰箱染色30分钟，然后用ImL的I X磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三次，最后用O. 5mL的IXPBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur基本型流式细胞仪检测(美国BD公司)。图I结果显示，骨髓来源的基质干细胞培养到第5代，其⑶90、⑶73、⑶44和⑶105阳性率都大于95%以上，⑶14、⑶19、⑶34和⑶45阴性率都小于5%，表明基质干细胞经体外大量增殖后仍保持很好的细胞表型。取苔盼兰染色计数后的3X IO6细胞，内皮祖细胞分三组，第一组分别添加到有20 μ L FITC标记鼠抗人⑶31单抗和20 μ L PE标记鼠抗人KDR单抗的离心管中；第二组分别添加20yL FITC标记鼠抗人⑶34单抗和20 μ L PE标记鼠抗人⑶133单抗；第三组为同型对照，分别添加到有20 μ L FITC标记鼠IgGl、20 μ L PE标记鼠IgGl ;置于4°C冰箱染色30分钟，然后用ImL的I X磷酸盐缓冲液PBS洗涤三次，最后用O. 5mL的I XPBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur基本型流式细胞仪检测。图2结果显示，骨髓来源的内皮祖细胞培养到第5代，其⑶31阳性率都大于95%以上，血管内皮生长因子受体2 (KDR)和⑶34阳性率分别为15%和16. 3%左右，⑶133阳性率为3. I %，表明内皮祖细胞经体外大量扩增后仍保持很好的细胞表型。
实施例三本实施例说明含有本发明骨髓中一次性同时培养获得基质干细胞联合内皮祖细胞在缺血性脑卒中动物模型中应用。分别取实施例I和2所得的传代代数为第5代的基质干细胞和内皮祖细胞培养物，细胞经O. 025% (m/v)胰酶消化及O. 5mL小牛血清终止后，800rpm下离心5min后收集细胞沉淀，用O. 9%的氯化钠溶液洗涤3次，然后用该O. 9%的氯化钠溶液重悬至2 X IO6个ML的浓度，分别制备2X IO6个/mL浓度的基质干细胞和内皮祖细胞注射液，于4°C下保存备用。将购自首都医科大学的缺血性脑卒中大鼠模型，随机分为A、B、C和D四组，每组 10只，A组为骨髓来源的基质干细胞注射液治疗组，B组骨髓来源的内皮祖细胞注射液治疗组，C组骨髓来源的基质干细胞联合内皮祖细胞注射液治疗组，D组为同体积O. 9%的氯化钠溶液空白组。A和B组在第O天大鼠模型用微量注射器以5 μ L/min速度注射到患侧纹状体内，注射I X IO6个/mL细胞，即O. 5mL基质干细胞或内皮祖细胞注射液，第7天和第14天以相同剂量再次注射；C组在第O和7天大鼠模型用微量注射器以5 μ L/min速度注射到患侧纹状体内，注射I X IO6个/mL细胞，即O. 5mL基质干细胞注射液，第14天以相同剂量注射内皮祖细胞注射液；D组于相同时间点和位置注射O. 5mL生理盐水，分别于移植时间点和移植后第1、2、3、5、7周对所有大鼠进行改良神经功能缺失评分(modified NeurologicalSeverity Scores, mNSS),结果如下表 2 所不。表I
权利要求
1.一种从骨髓中一次性同时培养获得基质干细胞与内皮祖细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括5-20ml骨髓直接经葡蔗糖-泛影酸纳溶液密度梯度离心分离，并通过I XPBS洗涤三次获得单个核细胞；然后将一半所述单个核细胞在a -MEM完全培养基培养获得基质干细胞，另一半所述单个核细胞在EGM-2完全培养基中培养获得内皮祖干细胞； 其中，基质干细胞的制备过程为，将一半所述单个核细胞在a-MEM完全培养基中原代培养，当培养瓶中基质干细胞生长到80%以上，用0. 025%胰酶消化后进行扩增，每次I瓶培养瓶扩增到2瓶，连续扩增5代，其细胞数量级达到2 X IO8以上；其中，所述的a -MEM完全培养基包括10%胎牛血清、20ng/mL碱性成纤维生长因子； 内皮祖细胞的制备过程为，另一半所述单个核细胞在EGM-2完全培养基中原代培养，当内皮祖细胞在用3 iig/cm2纤维连接蛋白包被的培养瓶中生长到80%以上，用0. 025%胰酶消化后进行扩增，每次I瓶培养瓶扩增到2瓶，连续扩增5代，其细胞数量级达到2 X IO8以上；其中，所述的EGM-2完全培养基包括5%胎牛血清、50ng/mL表皮生长因子、50ng/mL血管内皮生长因子、50ng/mL人胰岛素样生长细胞因子、lug/mL氢化可的松。
所述胎牛血清的浓度为v/v，所述胰酶的浓度m/v，所述PBS的pH值为7. 4。
2.根据权利要求I所述的基质干细胞与内皮祖细胞，其特征在于，所述扩增得到的基质干细胞的表型中⑶90、⑶44、CD105和CD73阳性率达到90%以上，⑶14、⑶34、CD45和HLA-DR阳性率低于5%以下； 所述扩增得到的内皮祖细胞的表型中CD31阳性率达到90%以上，血管内皮生长因子受体2 (KDR)、CD34阳性率为15 20%，⑶133阳性率低于5%以下。
3.一种从骨髓中一次性同时培养获得基质干细胞与内皮祖细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括 采集20mL骨髓，采用Ficoll密度梯度离心分离，经I XPBS洗涤三次，得到的单个核细胞，计数；20mL骨髓获得约40X IO6ceIls单个核细胞；其中，所述PBS的pH值为7. 4 ; 将一半单个核细胞重悬在a -MEM完全培养基中，添加到25cm2培养瓶中，每瓶5mL，细胞浓度为2X 106cellS/mL，在5% CO2中在37°C下开始培养；其中，所述的a -MEM完全培养基包括10%胎牛血清、20ng/mL碱性成纤维生长因子； 将另一半单个核细胞重悬在EGM-2完全培养基中原代培养，添加到3 u g/cm2纤维连接蛋白包被的25cm2培养瓶中，每瓶5mL，细胞浓度为2X 106cellS/mL，在5% CO2中在37°C下开始培养；其中，所述的EGM-2完全培养基包括5%胎牛血清、50ng/mL表皮生长因子、50ng/mL血管内皮生长因子、50ng/mL人胰岛素样生长细胞因子、lug/mL氢化可的松； 当所述基质干细胞和内皮祖细胞在培养瓶中生长到80%以上，用0.025%胰酶消化后进行扩增，第一次扩瓶中为每2瓶25cm2培养瓶扩增到I瓶75cm2培养瓶，分别使用各自新鲜的完全培养基迁行传代培养，其中内皮祖细胞需使用3 y g/cm2纤维连接蛋白包被的培养瓶；以后每I瓶75cm2培养瓶扩增到2瓶，连续扩增5代，其中培养内皮祖细胞时不再使用g/cm2纤维连接蛋白包被的培养瓶；基质干细胞和内皮祖细胞增殖培养后均可达到2X IO8以上细胞数量级。
所述胎牛血清的浓度为v/v，所述胰酶的浓度m/v。
4.如权利要求1-3任一项所述的从骨髓中一次性同时培养获得基质干细胞与内皮祖细胞的制备方法，其特征在于，所述基质干细胞和内皮祖细胞流式细胞检测方法为 培养到最后一天，即第5代，分别取I瓶生长好的所述基质干细胞和内皮祖细胞用.0.025%胰酶消化，消化液用0. 5mL小牛血清终止，然后在1000rpm、4°C下离心5分钟，细胞分别用ImL a -MEM和EGM-2培养基重悬，取20ul细胞液用I XPBS稀释20倍，稀释液加入I倍体积的苔盼兰溶液，混匀后加入到细胞计数板，于倒置显微镜下观察计数，蓝色染色的为死细胞，不染色的为活细胞； 取苔盼兰染色计数后的3X IO6细胞，基质干细胞分三组进行流式细胞仪检测，第一组分别添加到有20 ii L FITC标记鼠抗人⑶34单抗、20 u LPE标记鼠抗人⑶19单抗的离心管中；第二组分别添加到有20 ii L FITC标记鼠抗人⑶44单抗和20 y L PE标记鼠抗人⑶105单抗的离心管中；第三组分别添加20 u LFITC标记鼠抗人⑶45单抗、20 U L PE标记鼠抗人⑶73单抗；第四组分别添加20 ii L FITC标记鼠抗人⑶14单抗、20 u L PE标记鼠抗人⑶90单抗；第五组为同型对照，分别添加到有20 ii L FITC标记鼠IgGl和20 ii L PE标记鼠IgGl ；置于4°C冰箱染色30分钟，然后用ImL的I X磷酸盐缓冲液PBS洗涤三次，最后用0. 5mL的IXPBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur基本型流式细胞仪检测；结果显示，所述基质干细胞培养到第5代，其⑶90、⑶73、⑶44和⑶105阳性率都大于95%以上，⑶14、⑶19、⑶34和⑶45阴性率都小于5%，其表明基质干细胞经体外大量增殖后仍保持很好的细胞表型； 取苔盼兰染色计数后的3 X IO6细胞，内皮祖细胞分三组，第一组分别添加到有20 y LFITC标记鼠抗人⑶31单抗和20 ii L PE标记鼠抗人KDR单抗的离心管中；第二组分别添加.20 u L FITC标记鼠抗人⑶34单抗和20 ii L PE标记鼠抗人⑶133单抗；第三组为同型对照，分别添加到有20 ii L FITC标记鼠IgGl、20 u L PE标记鼠IgGl ;置于4°C冰箱染色30分钟，然后用ImL的I X磷酸盐缓冲液PBS洗涤三次，最后用0. 5mL的I XPBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur基本型流式细胞仪检测；结果显示，所述内皮祖细胞培养到第5代，其CD31阳性率都大于95%以上，血管内皮生长因子受体2 (KDR)、CD34阳性率为15 20%，⑶133阳性率低于5%以下。表明内皮祖细胞经体外大量扩增后仍保持很好的细胞表型。
5.根据权利要求1-4任意一项制备方法所制备的基质干细胞与内皮祖细胞的应用，其特征在于，所制备的基质干细胞联合内皮祖细胞同时用于临床应用，进行治疗心血管或脑血管疾病。
全文摘要
一种从骨髓中一次性同时培养获得基质干细胞与内皮祖细胞的制备方法，及其用途。该方法直接从骨髓中一次性同时培养基质干细胞和内皮祖细胞，所制备的上述两种细胞纯度高、方法简单、快速扩增获得。所制备的基质干细胞和内皮祖细胞增殖的细胞数可达到2×108以上，细胞活力大于95％，满足临床上高数量级的治疗需要。
文档编号A61K35/28GK102796702SQ20121032472
公开日2012年11月28日 申请日期2012年9月5日 优先权日2012年9月5日
发明者陈镇洲, 郭阳 申请人:陈镇洲