一种复合载药脂质体及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种复合载药脂质体及其制备方法和应用。该复合载药脂质体包括长循环脂质体和包裹于其中的药物活性组分，所述长循环脂质体为脂质体表面被二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000修饰的脂质体，所述药物活性组分为蒽环类抗生素和白藜芦醇；该复合载药脂质体的制备方法包括利用薄膜-超声法将脂质体源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和药物活性组分制成所述复合载药脂质体，所述药物活性组分为蒽环类抗生素和白藜芦醇。本发明的复合载药脂质体除了对药物敏感肿瘤的发展具有抑制活性外，还可有效地抑制化疗药物耐药性肿瘤的发展，且产生的副作用较小，因此，具有极大的临床应用价值。
【专利说明】一种复合载药脂质体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种复合载药脂质体及其制备方法和应用，更确切地涉及一种克服肿瘤耐药性的复合载药脂质体及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]1、肿瘤耐药性
[0003]目前，在许多肿瘤的治疗中，常规化疗效果差和预后不良是困扰临床的重要难题，而肿瘤多药耐药性(MDR)则是肿瘤化疗失败的关键因素。经治疗后.残存的肿瘤干细胞耐药性形成，常导致对某些药物治疗敏感性降低，并引起肿瘤复发甚至转移。人恶性肿瘤对化疗的耐药性可分为先天性耐药(nature resistance)和获得性耐药(acquired resistance)；根据耐药谱又分为 原药耐药(primary drug resistance, F1DR)和多药耐药(multidrugresistance,MDR)0 PDR只对诱导的原药产生耐药，面对其它药物不产生交叉耐药；MDR是由一种药物诱发，但同时又对其它多种结构和作用机制迥异的抗癌药物产生交叉耐药。
[0004]耐药性产生的机制有多种，如:
[0005]DNA修复能力的增强:化疗药致使DNA损伤，当二氢叶酸还原酶(DHFR)和DNA损伤修复相关酶活性增强(MGMT)可增加其对化疗药的耐药程度。
[0006]P-糖蛋白表达:P-糖蛋白是一种能量依赖性药物排出泵，可以与一些抗肿瘤药物结合，也有ATP结合位点。P-糖蛋白一旦与抗肿瘤药物结合，通过ATP提供能量，就可将药物从细胞内泵出细胞外，使药物在细胞内浓度不断下降，并使其细胞毒作用减弱直至散失，出现耐药现象。P-糖蛋白在正常胆管、肾、小肠、肾上腺、造血干细胞等均有表达，负责激素运输及排泌毒物等生理功能。P-糖蛋白高表达的肿瘤病人常伴预后不良，如低缓解率、高复发率、生存期短，可作为预后评价指标。
[0007]谷胱甘肽S-转移酶:谷胱甘肽是一种含半胱氨酸的三肽，为细胞内主要的非蛋白巯基。谷胱甘肽S-转移酶能够催化机体内亲电性化合物与GSH结合，使有毒化合物增加水溶性、减少毒性，最终排出细胞外。
[0008]2、蒽环类抗生素
[0009]蒽环类抗生素特别是阿霉素是一种抗肿瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。主要适用于急性白血病,对急性白血病(淋巴细胞性和粒细胞性)、恶性淋巴瘤、乳腺癌、支气管肺癌(未分化小细胞性和非小细胞性)、卵巢癌等恶性肿瘤，一般作为第二线药物，即在首选药物耐药时可考虑应用此药。但是随着肿瘤化疗药物在临床治疗中的广泛应用，肿瘤的耐药性问题越来越突出，已成为肿瘤有效治疗的主要障碍之一。而联合用药是目前克服肿瘤耐药性的重要方法之一，也有很多相关研究。比如将阿霉素与维拉帕米联合应用来逆转耐药性，参见文献《阿霉素与维拉帕米联合用药与单一用药的药动学及组织分布比较》(安杰等，中国煤炭工业医学杂志，2002.5 (6):600-601)、《新型阿霉素抗耐药性隐形脂质体的体外细胞毒和体内毒性研究》(王坚成等，药学学报，2005，40(5):475-480)。虽然这种联合用药有逆转耐药性的效果，但是所使用的逆转剂维拉帕米是一种常用的钙离子通道阻断剂，具有引起心率增快，心力衰竭，低血压等副作用，使此类联合用药的应用受到限制。
[0010]3、白藜芦醇
[0011]20世纪80年代，世界卫生组织调查发现，尽管法国人偏爱奶酪等高脂肪食物，但冠心病发病率和死亡率低于其他西方国家，其原因可能是与法国人常饮含白藜芦醇的葡萄酒有关。此后，白藜芦醇备受关注。到目前为止至少已在21科、31属的72种植物中发现了白藜芦醇。白藜芦醇主要来源于寥科植物虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.etZucc.)的莖和根，葡萄科植物葡萄(Vitis vinifera)果实的皮和籽，豆科植物花生(Arachishypogaea)的种子等。 [0012]白藜芦醇是一种天然无毒的抗氧化剂，可降低血液粘稠度，抑制血小板凝结和血管舒张，保持血液畅通，可预防癌症的发生及发展，具有抗动脉粥样硬化和冠心病，缺血性心脏病，高血脂的防治作用。此外，白藜芦醇还具有保护心血管、抗氧化、抗自由基、抗炎、抗菌等作用，而且还有很多的临床使用实例。
【发明内容】
[0013]本发明的目的是克服现有技术中蒽环类抗生素以及与其他抗癌药联合使用的蒽环类抗生素药物对耐药性肿瘤疗效都较差的缺陷，提供一种对耐药性肿瘤疗效较好且产生的副作用较小的复合载药脂质体及其制备方法和应用。
[0014]为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种复合载药脂质体，其特征在于，该复合载药脂质体包括长循环脂质体和包裹于其中的药物活性组分，所述长循环脂质体为脂质体表面被二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000 (DSPE-mPEG2000)修饰的脂质体，所述药物活性组分为蒽环类抗生素和白藜芦醇。
[0015]另一方面，本发明提供一种复合载药脂质体的制备方法及由该方法制得的复合载药脂质体，其特征在于，该方法包括，利用薄膜-超声法，将脂质体源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和药物活性组分制成所述复合载药脂质体，所述药物活性组分为蒽环类抗生素和白藜芦醇。
[0016]再一方面，本发明还提供上述复合载药脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0017]本发明的复合载药脂质体含有蒽环类抗生素和白藜芦醇，除了对药物敏感肿瘤的发展具有抑制活性外，还可有效地抑制化疗药物耐药性肿瘤的发展，且产生的副作用较小，因此，具有极大的临床应用价值。
[0018]本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的【具体实施方式】一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中:
[0020]图1a是本发明一种实施方式的复合载药脂质体的透射电镜图，图1b是本发明一种实施方式的复合载药脂质体的粒径分析结果图；
[0021]图2a显示出本发明一种实施方式的复合载药脂质体处理A549敏感细胞24小时后的结果，图2b显示出该复合载药脂质体处理A549抗性细胞24小时后的结果；
[0022]图3a显示出本发明一种实施方式的复合载药脂质体处理A549敏感细胞48小时后的结果，图3b显示出该复合载药脂质体处理A549抗性细胞48小时后的结果；
[0023]图4a显示出本发明一种实施方式的复合载药脂质体处理A549敏感细胞72小时后的结果，图4b显示出该复合载药脂质体处理A549抗性细胞72小时后的结果；
[0024]图5a显示出本发明一种实施方式的载药脂质体处理药物敏感性肺腺癌荷瘤裸鼠后肿瘤的变化结果，图5b显示出本发明一种实施方式的载药脂质体处理耐药性肺腺癌荷瘤裸鼠后肿瘤的变化结果。
【具体实施方式】
[0025]以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0026]本发明提供一种复合载药脂质体，其特征在于，该复合载药脂质体包括长循环脂质体和包裹于其中的药物活性组分，所述长循环脂质体为脂质体表面被二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000修饰的脂质体，所述药物活性组分为蒽环类抗生素和白藜芦醇。
[0027]根据本发明，所述药物活性组分中，蒽环类抗生素和白藜芦醇的摩尔比可以在较宽的范围内变化，例如，所述蒽环类抗生素和白藜芦醇的摩尔比可以为1:0.01-100 ;本发明的发明人发现，在一定浓度范围内，随着白藜芦醇量的增加，其与蒽环类抗生素的协同作用也越来越显著，优选地，所述蒽环类抗生素和白藜芦醇的摩尔比为1:1-80，进一步优选为1:3-40，综合考虑白藜芦醇的协同作用和蒽环类抗生素的细胞毒性，最优选为1:5-20。本发明的发明人发现，使用上述优选比例范围内的蒽环类抗生素和白藜芦醇能够获得具有更高治疗效果的复合载药脂质体。
[0028] 根据本发明，所述蒽环类抗生素可以为本领域常用的各种蒽环类抗生素。由于蒽环类抗生素都具有7，8，9，10-四氢-5，12-四并苯醌的结构骨架，因此蒽环类抗生素能够通过嵌入DNA双链的碱基之间，形成稳定复合物，抑制DNA复制与RNA合成，从而阻碍快速生长的癌细胞的分裂，或者，抑制拓扑异构酶II，影响DNA超螺旋转化成为松弛状态，从而阻碍DNA复制与转录。优选情况下，所述蒽环类抗生素为阿霉素或盐酸阿霉素。本发明的发明人发现，当使用阿霉素或盐酸阿霉素作为本发明复合载药脂质体的药物活性组分之一时，能够获得更好的抗肿瘤活性。
[0029]本发明中，所述长循环脂质体与药物活性组分的摩尔比可以与现有技术中脂质体载体与药物活性组分的比例相同，优选地，所述长循环脂质体与药物活性组分的摩尔比为I:0.001-0.5，进一步优选为 I:0.01-0.3，最优选为 I:0.02-0.1。
[0030]根据本发明，所述长循环脂质体可以与现有技术中的常规的长循环脂质体相同，其中，脂质体与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000的摩尔比可以在很宽的范围内变化，例如可以为1:0.01-1，优选为1:0.02-0.2，进一步优选为1:0.05-0.1。
[0031]本发明提供一种复合载药脂质体的制备方法，其特征在于，该方法包括，利用薄膜-超声法，将脂质体源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和药物活性组分制成所述复合载药脂质体，所述药物活性组分为蒽环类抗生素和白藜芦醇。[0032]根据本发明的方法，所述药物活性组分中，蒽环类抗生素和白藜芦醇的摩尔比可以根据需要进行调节，优选地，所述蒽环类抗生素和白藜芦醇的摩尔比为1:0.01-100，进一步优选为1: 1-80，再优选为1: 3-40，最优选为1:5-20。
[0033]本发明中，所述蒽环类抗生素可以为本领域常用的各种蒽环类抗生素。由于蒽环类抗生素都具有7，8，9，10-四氢-5，12-四并苯醌的结构骨架，因此蒽环类抗生素能够通过嵌入DNA双链的碱基之间，形成稳定复合物，抑制DNA复制与RNA合成，从而阻碍快速生长的癌细胞的分裂，或者，抑制拓扑异构酶II，影响DNA超螺旋转化成为松弛状态，从而阻碍DNA复制与转录。优选情况下，所述蒽环类抗生素为阿霉素或盐酸阿霉素。本发明的发明人发现，当使用阿霉素或盐酸阿霉素作为本发明复合载药脂质体的药物活性组分之一时，能够获得更好的抗肿瘤活性。
[0034]本发明中，所述脂质体源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和药物活性组分的摩尔比为可以为常规的脂质体载体与药物活性组分的比例，优选地，所述脂质体源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和药物活性组分的摩尔比为 I:0.01-1:0.001-0.5，进一步优选为 I:0.02-0.2:0.01-0.3，最优选为 I:0.05-0.1:
0.02—0.1
[0035]本发明中，所述脂质体源可以为本领域任何常规的能够制得脂质体载体的物质，包括但不限于大豆卵磷脂、氢化大豆磷脂、蛋黄卵磷脂中的至少一种，优选为大豆卵磷脂。本领域技术人员公知的是，所述脂质体源还可以包括一定量的胆固醇，上述磷脂与所述胆固醇的摩尔比可以在较宽范围内选择，例如，可以为2-10:1。
[0036]本发明中，所述脂质体源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000、蒽环类抗生素和白藜芦醇均可以通过商购获得。
[0037]本发明中，所述薄膜-超声法的具体步骤为本领域技术人员公知，即，将各种原料溶解后去除溶剂制成薄膜，然后通过超声破碎制得颗粒。
[0038]优选地，所述薄膜-超声法中的超声条件包括:频率为100-800W，优选为200-400W ;超声时间为5-30S，优选为10-20S ;间隔时间为2-20S，优选为5-10S ;循环次数为5-30次，优选为10-20次。其中，超声时间指的是每次超声持续的时间，即超声时间不包括间隔时间。
[0039]具体地，所述薄膜-超声法可以包括以下步骤，
[0040](I)将脂质体源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000、蒽环类抗生素、白藜芦醇和第一有机溶剂混合，得到第一混合溶液；或者将脂质体源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000、白藜芦醇和第一有机溶剂混合，得到第一混合溶液，
[0041](2)蒸发去除第一混合溶液中的第一有机溶剂，形成薄膜，
[0042](3)将所述薄膜与纯水或生理盐水混合得到第二混合溶液，超声得到所述复合载药脂质体；或者将所述薄膜与溶有蒽环类抗生素的纯水或生理盐水混合得到第二混合溶液，超声得到所述复合载药脂质体。
[0043]其中，所述第一有机溶剂可以为能够溶解各种原料的溶剂，优选为无水乙醇、氯仿和甲醇中的至少一种，最优选为无水乙醇。
[0044]所述蒸发的方法为本领域常规的方法，只要能够将其中的第一有机溶剂去除即可，例如可以在旋转蒸发仪中进行。[0045]所述第一有机溶剂的加入量可以为本领域的常规选择，优选地，在第一混合溶液中，所述蒽环类抗生素的浓度为I X 10-4mOl/L-10mOl/L。
[0046]所述纯水或生理盐水的加入量也可以为本领域的常规选择，优选地，在第二混合溶液中，所述蒽环类抗生素的浓度为lX10_5mOl/L-10mOl/L，进一步优选为lX10_3mol/L-lmol/L,最优选为 5X10 2mol/L_0.5mol/L。
[0047]本发明对于所述脂质体源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000、蒽环类抗生素、白藜芦醇和第一有机溶剂的混合方式没有特别的限定，优选地，先将脂质体源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和第一有机溶剂混合，再加入白藜芦醇，制备成第一混合溶液，挥发成薄膜后加入溶有蒽环类抗生素的第二溶液。其中，对于脂质体源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和第一有机溶剂三者的加入顺序没有特别的限定。本发明的发明人发现，通过上述优选的方法，能够得到治疗效果更好的复合载药脂质体。 [0048]本发明提供了由上述方法制得的复合载药脂质体。
[0049]本发明还提供上述复合载药脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明的所述复合载药脂质体不仅适合于制备抗药物敏感性肿瘤的药物，还特别适合于制备抗耐药性肿瘤的药物。
[0050]所述肿瘤和耐药性肿瘤包括但不限于卵巢癌、乳腺癌、非小细胞癌、头颈癌、食管癌、精原细胞瘤、肝癌、肺腺细胞癌、前列腺癌和非何金氏淋巴瘤，以及它们的耐药性肿瘤中的至少一种。
[0051]以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0052]以下通过实施例对本发明进行更详细的说明。本发明的实施例中，所用大豆卵磷脂购自上海沪宇生化试剂有限公司，商品号为LE030A，CAS号为8002-43-5 ;所用蛋黄卵磷脂购自上海沪宇生化试剂有限公司，商品号为P0051 ;所用胆固醇购自湖北康宝泰精细化工有限公司，CAS号为57-88-5。所用二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000购自genzyme公司，商品号为LP-R4-039, CAS号为147867-65-0 ;所用蒽环类抗生素为盐酸阿霉素(ADR)，购自北京华奉联博科技有限公司，CAS号为25316-40-9 ;所用白藜芦醇(Res)购自湖北兴银河化工有限公司，CAS号为501-36-0。
[0053]实施例1
[0054]本实施例用于制备复合载药脂质体:ADR+Res脂质体_1。
[0055](I)将4X 10_2mol大豆卵磷脂、10_2mol胆固醇、2X 10_3mol 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000与150ml的无水乙醇混合，溶解后加入1.2X 10_3mol白藜芦醇，得到第一混合溶液，
[0056](2)蒸发去除第一混合溶液中的无水乙醇，形成薄膜，
[0057](3)将3X 10_4mol蒽环类抗生素与5ml生理盐水混合，加入所述薄膜中超声得到复合载药脂质体，即ADR+Res脂质体-1。
[0058]所述超声的条件包括:频率为350W，超声18s，间隔8s，超声15次。
[0059]实施例2[0060]本实施例用于制备复合载药脂质体:ADR+Res脂质体_2。
[0061](I)将4X 10_2mol大豆卵磷脂、10_2mol胆固醇、2X 10_3mol 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000与200ml的无水乙醇混合，溶解后加入3.6X 10_3mol白藜芦醇，得到第一混合溶液，
[0062](2)蒸发去除第一混合溶液中的无水乙醇，形成薄膜，
[0063](3)将3X 10_4mol蒽环类抗生素与4ml生理盐水混合，加入所述薄膜中超声得到复合载药脂质体，即ADR+Res脂质体_2。
[0064]所述超声的条件包括:频率为400W，超声15s，间隔5s，超声10次。
[0065]对比例I
[0066]根据实施例2的方法制备蒽环类抗生素载药脂质体(ADR脂质体)，不同的是，不加入白藜芦醇。
[0067]对比例2
[0068]根据实施例2的方法制备白藜芦醇载药脂质体(Res脂质体)，不同的是，不加入蒽环类抗生素。
[0069]对比例3
[0070]根据实施例2的方法，将4X l(T2mol大豆卵磷脂、l(T2mol胆固醇和2X l(T3mol 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基`聚乙二醇2000与200ml的无水乙醇混合，制得长循环脂质体。
[0071]实施例3
[0072]本实施例用于制备复合载药脂质体:ADR+Res脂质体_3。
[0073](I)将8X l(T2mol的大豆卵磷脂、2X l(T2mol胆固醇、2X l(T3mol的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000与100ml的氯仿混合，溶解后加入6X 10_3mol白藜芦醇，得到第一混合溶液，
[0074](2)蒸发去除第一混合溶液中的氯仿，形成薄膜，
[0075](3)将3X 10_4mol蒽环类抗生素与3ml纯水混合，加入所述薄膜中超声得到复合载药脂质体，即ADR+Res脂质体_3。
[0076]所述超声的条件包括:频率为300W，超声20s，间隔10s，超声20次。
[0077]实施例4
[0078]本实施例用于制备复合载药脂质体:ADR+Res脂质体_4。
[0079](I)将0.4mol蛋黄卵磷脂、0.1mol胆固醇、2X 10_2mol 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000与100ml的无水乙醇混合，溶解后加入1.2 X IO^mol白藜芦醇，得到第一混合溶液，
[0080](2)蒸发去除第一混合溶液中的无水乙醇，形成薄膜，
[0081](3)将3X 10_4mol蒽环类抗生素与2ml生理盐水混合，加入所述薄膜中超声得到复合载药脂质体，即ADR+Res脂质体_4。
[0082]所述超声的条件包括:频率为500W，超声10s，间隔5s，超声12次。
[0083]测试例I
[0084]用透射电镜(型号为Tecnai G2F20U-TWIN)对ADR+Res脂质体_3进行检测，结果如图1a所示，由图1a可以看出，复合载药脂质体形成了较为均一的直径为50-80nm的颗粒。[0085]用纳米粒度及Zeta电位分析仪(型号为Zetasizer Nano ZS)对液态ADR+Res脂质体-3粒径进行进一步的检测，结果如图1b所示，由图1b可以进一步看出，复合载药脂质体形成了较为均一的颗粒。
[0086]测试例2
[0087]本测试例用于在细胞水平上检测本发明的复合载药脂质体的活性。
[0088]细胞实验1:在96孔板中接种A549敏感细胞(人肺腺癌细胞)，接种量为5000个细胞/孔，细胞贴壁后加药，根据药物的不同分为5组，分别是:
[0089](I)生理盐水组；
[0090](2)脂质体组(单独加入对比例3制得的长循环脂质体)；
[0091](3)蒽环类抗生素脂质体组(加入对比例I制得的ADR脂质体)，其中，蒽环类抗生素在培养基中的终浓度为5 μ g/ml ；
[0092](4)白藜芦醇脂质体组(加入对比例2制得的Res脂质体)，其中，白藜芦醇在培养基中的终浓度为lSyg/ml ；
[0093](5)同时包裹蒽环类抗生素和白藜芦醇的脂质体组(ADR+Res脂质体)，其中，包括4个小组，分别加入实施例1-4制得的ADR+Res脂质体-1、ADR+Res脂质体-2、ADR+Res脂质体-3和ADR+Res脂质体_4，其中，各组中蒽环类抗生素在培养基中的终浓度均为5 μ g/ml,而白藜芦醇的终浓度分别是5,15, 25, 50 μ g/ml,每个浓度6个重复孔；
[0094]其中，(2)组中的脂质体加入量和(5)组中加入ADR+Res脂质体_2的脂质体加入量相同。在加药24h，48h，72h后用MTS试剂盒检测OD值。
[0095]细胞实验2:根据与细胞实验I相同的方法进行检测，不同的是，接种A549蒽环类抗生素抗性细胞。
[0096]细胞实验的结果如图2a-2b、3a_3b和4a_4b所示。
[0097]图2a和图2b为处理24小时后的结果，其中，纵轴表示测得的OD值，其反映出存活细胞的数量，各组柱状图反映出生理盐水组、脂质体组、蒽环类抗生素脂质体组、白藜芦醇脂质体组，以及ADR+Res脂质体-1至ADR+Res脂质体_4中的一组的测试结果(横轴表示白藜芦醇在培养基中的终浓度，从左至右依次为ADR+Res脂质体-1至ADR+Res脂质体-4的测试结果)。图2a为对A549敏感细胞的检测结果，图2b为对蒽环类抗生素耐药性肺腺癌细胞(A549抗性细胞)的检测结果。图2a中，加入不同浓度的白藜芦醇的ADR+Res脂质体-1至ADR+Res脂质体-4对肺腺癌细胞的抑制活性与单独使用蒽环类抗生素的抑制活性接近，甚至在加入低浓度的白藜芦醇时，ADR+Res脂质体-1至ADR+Res脂质体-4的抑制活性还差于单独使用蒽环类抗生素的效果。但是从图2b中可以看出，蒽环类抗生素脂质体对于蒽环类抗生素耐药性肿瘤细胞几乎不再具有抑制活性，而根据本发明的复合载药脂质体ADR+Res脂质体-1至ADR+Res脂质体-4均具有明显的癌细胞抑制活性。并且，随着白藜芦醇浓度的增加，其抑制活性越来越显著。
[0098]图3a和图3b为处理48小时后的结果，其中，图3a为对A549敏感细胞的检测结果，图3b为对A549抗性细胞的检测结果。图3a和图3b与图2a和图2b的结果类似，加入不同浓度的白藜芦醇的ADR+Res脂质体-1至ADR+Res脂质体-4对肺腺癌细胞的抑制活性与单独使用蒽环类抗生素的抑制活性接近，但是，蒽环类抗生素脂质体对于蒽环类抗生素耐药性肿瘤细胞几乎不再具有抑制活性，而根据本发明的ADR+Res脂质体-1至ADR+Res脂质体-4均具有明显的癌细胞抑制活性。[0099]图4a和图4b为处理72小时后的结果，其中，图4a为对A549敏感细胞的检测结果，图4b为对A549抗性细胞的检测结果。图4a和图4b与上述两组图的结果也类似，相比于图3a和图3b，图4a和图4b中的存活细胞的数目进一步下降。
[0100]由上述结果可以看出，本发明的复合载药脂质体特别适合于抑制蒽环类抗生素抗性肿瘤细胞的发展和繁殖，并且具有明显的浓度依赖性和时间依赖性，在处理72小时后，仍有明显的抗肿瘤活性，说明本发明的复合载药脂质体的抗肿瘤活性持久。
[0101]测试例3
[0102]本测试例用于在动物水平上检测本发明的载药脂质体对蒽环类抗生素耐药的肺腺癌的抑制活性。
[0103]动物实验:通过皮下注射分别将A549药物敏感及抗性细胞接种至16gBalb/c的裸鼠中，IO7个细胞/只，当肿瘤长至3mm时打药，将药物敏感瘤小鼠及抗性瘤小鼠分别随机分为5组:
[0104](I)生理盐水组，
[0105](2)脂质体组(注射对比例3制得的脂质体)，
[0106](3)蒽环类抗生素脂质体组(注射对比例I制得的ADR脂质体，注射量为8mg/kg体重)，
[0107](4)白藜芦醇脂质体组(注射对比例2制得的Res脂质体，注射量为20mg/kg体重)，
[0108](5)同时包裹蒽环类抗生素和白藜芦醇的脂质体组(注射实施例2制得的ADR+Res脂质体)，每天腹腔注射，蒽环类抗生素注射量为8mg/kg体重，白藜芦醇注射量为20mg/kg体重。
[0109]其中，(2)组中的脂质体注射量与(5)组相同。注射2周后取出肿瘤照相，结果如图5a，5b所示(每组三个平行实验)。
[0110]由图5a可以看出，与生理盐水组相比，单独使用白藜芦醇脂质体对肿瘤无明显抑制作用，使用本发明的ADR+Res脂质体-2与单独使用蒽环类抗生素脂质体则都可以显著抑制肺腺癌的增长，但是本发明的ADR+Res脂质体-2产生的抑制效果更加显著。由图5b可以看出，与生理盐水组相比，单独使用蒽环类抗生素脂质体和单独使用白藜芦醇脂质体虽然对蒽环类抗生素耐药的肺腺癌细胞产生了一定的抑制作用，但是本发明的ADR+Res脂质体-2对蒽环类抗生素耐药的肺腺肿瘤产生的抑制作用更加显著。
[0111]动物实验结果进一步证明了本发明的载药脂质体对敏感性及耐药性肿瘤均具有强的抑制活性。
【权利要求】
1.一种复合载药脂质体，其特征在于，该复合载药脂质体包括长循环脂质体和包裹于其中的药物活性组分，所述长循环脂质体为脂质体表面被二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000修饰的脂质体，所述药物活性组分为蒽环类抗生素和白藜芦醇。
2.根据权利要求1所述的复合载药脂质体，其中，所述药物活性组分中，蒽环类抗生素和白藜芦醇的摩尔比为1:0.01-100，优选为1:1-80O
3.根据权利要求1或2所述的复合载药脂质体，其中，所述蒽环类抗生素为阿霉素或盐酸阿霉素。
4.根据权利要求1所述的复合载药脂质体，其中，所述长循环脂质体与药物活性组分的摩尔比为1:0.001-0.5。
5.根据权利要求1或4所述的复合载药脂质体，其中，所述长循环脂质体中，脂质体与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000的摩尔比为1:0.01-1。
6.一种复合载药脂质体的制备方法，其特征在于，该方法包括，利用薄膜-超声法，将脂质体源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和药物活性组分制成所述复合载药脂质体，所述药物活性组分为蒽环类抗生素和白藜芦醇。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述药物活性组分中，蒽环类抗生素和白藜芦醇的摩尔比为1:0.01-100，优选为1:1-80O
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，所述蒽环类抗生素为阿霉素或盐酸阿霉素。
9.根据权利要求6所述的方法，其中，所述脂质体源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和药物活性组分的摩尔比为1:0.01-1:0.001-0.5。`
10.根据权利要求6所述的方法，其中，所述薄膜-超声法中的超声条件包括，频率为100-800W，超声时间为5-30S，间隔时间为2-20S，循环次数为5-30次。
11.由权利要求6-10中任意一项所述的方法制得的复合载药脂质体。
12.权利要求1-5和11中任意一项所述的复合载药脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其中，所述肿瘤为耐药性肿瘤。
【文档编号】A61K31/05GK103655474SQ201210335727
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月11日 优先权日:2012年9月11日
【发明者】孟洁, 杨先达, 王琛 申请人:国家纳米科学中心