TNF-α受体-抗体融合蛋白在制备治疗糖尿病周围神经病变药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种TNF-α受体-抗体融合蛋白的用途，包括TNF-α受体-抗体融合蛋白在制备治疗糖尿病周围神经病变、延缓糖尿病周围神经病变、提高神经传导速度或减轻神经脱髓鞘的药物中的应用。本发明优点在于：通过在DPN大鼠模型上给予TNF-α受体-抗体融合蛋白抑制TNF-α的功能，观察其对DPN大鼠坐骨神经传导速度、神经组织病理学改变及髓鞘碱性蛋白表达的影响，明确了TNF-a在DPN发病机制中的作用，证实了TNF-α受体-抗体融合蛋白可以有效延缓DPN大鼠的周围神经病变的进展，改善DPN大鼠坐骨神经形态学的表现，减轻坐骨神经的脱髓鞘，因而在制备治疗糖尿病周围神经病变的药物中具有广阔的应用前景。
【专利说明】TNF-α受体-抗体融合蛋白在制备治疗糖尿病周围神经病变药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞因子TNF-α受体-抗体融合蛋白的用途，具体地说，是TNF-α受体-抗体融合蛋白在制备治疗糖尿病周围神经病变药物中的应用。
【背景技术】
[0002]糖尿病是一种常见的慢性代谢性疾病，是全球患病率最高的疾病之一。随着社会经济的快速发展，人们生活方式的改变及人口的老龄化，糖尿病的发病率逐年上升。据统计，全世界糖尿病患者人数已超过I亿，随着糖尿病发病率的上升，糖尿病神经病变的发病率亦在不断增长。糖尿病神经病变按神经解剖可分以下几类:周围神经病变、植物神经病变、颅神经病变、脊髓病变和脑部病变。其中糖尿病周围神经病变(Diabetic PeripheralNeuropathy，DPN)是最常见的慢性并发症，约60-90%的糖尿病患者合并周围神经病变。DPN包括对称性周围神经病变、不对称性周围神经病变和神经根病变。最常累及的有股神经、坐骨神经、正中神经、桡神经、尺神经、腓肠神经及股外侧皮神经等。早期症状以感觉障碍为主，但电生理检查发现运动神经及感觉神经均有累及。感觉异常有麻木、蚁走、发热、触电样感觉，往往从远端脚趾上行可达膝上，患者有穿袜子与戴手套样感觉。感觉障碍严重的病例可出现下肢关节病及溃疡。当累及运动神经时，肌力常有不同程度的减退，晚期有营养不良性肌萎缩。研究发现DPN是造成糖尿病患者下肢、足部慢性难治性溃疡、干性坏疽、湿性坏疽、截肢(趾)的主要原因。而且DPN发病隐匿，约40%-60%的患者无明显症状。在糖尿病早期，临床上周围神经病变症状及体征多不明显，但其神经结构、功能可能已受到损害，即周围神经出现节段性脱髓鞘改变，并常伴有轴突变性。
[0003]目前DPN病因尚未完全阐明，既往研究认为是由于多种因素包括遗传因素引起糖、脂肪、蛋白质代谢紊乱和血管异常所致，其主要有以下学说:多元醇途径学说、非酶促蛋白糖基化学说、脂代谢异常学说、氧自由基损伤学说、神经营养因子缺乏学说。临床上针对以上发病机制的治疗包括控制血糖、血压、血脂，营养神经，抗氧化及改善微循环等，但效果不甚理想。一项研究显示，尽管进行强化综合干预治疗，平均随访13.3年，仍有55%的DM患病。因此提示可能存在其他因素在DPN中扮演重要角色。最近有证据表明免疫因素参与了 DPN的发生。由于遗传背景的差异，部分患者可能更易于发生自身免疫紊乱，一般情况下，血-神经屏障的保护作用使循环中的T细胞处于免疫耐受状态。长期高血糖可破坏神经的血管屏障，同时神经髓鞘蛋白糖基化后其抗原性改变，因此血循环或组织中的单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和神经系统的胶质细胞可特异性识别糖基化的神经髓鞘、暴露的外周神经抗原，或胰腺和外周神经共同抗原，吞噬后引起神经髓鞘脱失和自身抗原成分的进一步暴露。同时，活化的免疫细胞可过度表达一系列细胞因子，如TNF-α、IL-1 β等。 [0004]前期研究证实DPN患者和模型大鼠血液中TNF- α表达升高。TNF-a作为一种重要的多功能的免疫细胞因子，参与许多炎性、传染性和自体免疫疾病的发展进程，具有杀伤或抑制肿瘤细胞、提高中性粒细胞的吞噬能力、刺激产生其他细胞因子的作用。DPN的病理改变是无髓鞘神经纤维轴突变性，而有髓鞘神经纤维节段性或弥漫性皱缩，脱髓鞘。其中自身抗原成分暴露引起的免疫反应是导致脱髓鞘的主要原因。T细胞在这些抗原的作用下产生一系列的细胞因子(包括TNF-a等)，后者上调了自身免疫应答，介导了炎症反应过程。另外发现，TNF-a对少突胶质细胞具有毒性作用，能引起脱髓鞘改变，并能刺激单核细胞、内皮细胞分泌IL-1 β和IL-6等炎症因子，以放大或间接增强其本身效应。同时TNF-a尚可抑制血管内皮细胞一氧化氮合酶(NOS)的活性，减弱NO所致的血管舒张作用，并促进多种生长因子、细胞粘附因子的表达，引起内皮功能紊乱和病理改变最终导致管腔狭窄、血流动力学异常、灌注降低，损害了营养神经的血管。
[0005]然而，现有研究仅证实DPN患者和模型大鼠血液中TNF- α表达升高，却并不能证实TNF-a在DPN发病机制中所起的作用，因而无从得知抑制TNF_a对阻止DPN的发展能否起积极作用。
[0006]TNF-α受体-抗体融合蛋白，商品名赛益普，是一种采用重组DNA技术生产的重组融合蛋白，它可以特异性结合TNF，阻断其与细胞表面TNF受体的相互作用，降低其活性。中国期刊《中国药物与临床》，2006年第7期，刊出的论文“重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白治疗类风湿关节炎有效性和安全性研究”，公开了使用TNF-a受体-抗体融合蛋白治疗类风湿关节炎；中国期刊《临床和实验医学杂志》，2008年11期，刊出的论文“重组人II型TNF受体-抗体融合蛋白对强直性脊柱炎患者外周血趋化因子受体CXCR4的表达调控作用”，公开了使用TNF- α受体-抗体融合蛋白显著地抑制CXCR4表达、降低BASDAI评分，同时也能有效地降低红细胞沉降率(ESR)、C-反应蛋白(CRP)炎症活动性指标，有效地缓解和改善AS病情。但 是目前关于利用TNF- α受体-抗体融合蛋白抑制TNF- α治疗DPN还未见相关报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种TNF- α受体-抗体融合蛋白的用途。
[0008]为实现上述目的，本发明采取的技术方案是:
TNF-a受体-抗体融合蛋白在制备治疗糖尿病周围神经病变药物中的应用；
TNF-a受体-抗体融合蛋白在制备延缓糖尿病周围神经病变药物中的应用；
TNF-a受体-抗体融合蛋白在制备提高神经传导速度的药物中的应用；
TNF-a受体-抗体融合蛋白在制备减轻神经脱髓鞘的药物中的应用。
[0009]本发明优点在于:
通过在DPN大鼠模型上，给予TNF-α受体-抗体融合蛋白抑制TNF-α的功能，观察其对DPN大鼠坐骨神经传导速度、神经组织病理学改变及髓鞘碱性蛋白(Myelin BasicProtein，MBP)表达的影响，明确了 TNF_a在DPN发病机制中的作用，证实了 TNF-α受体-抗体融合蛋白可以有效延缓DPN大鼠的周围神经病变的进展，改善DPN大鼠坐骨神经形态学的表现，减轻坐骨神经的脱髓鞘，在制备治疗糖尿病周围神经病变的药物中具有广阔的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】[0010]附图1是治疗前各组间神经传导速度(NCV)比较。并立的四个柱子从左至右依次是:正常组、DPN组、DPN+T1组、DPN+T2组。
[0011]附图2是治疗后各组间神经传导速度(NCV)比较。并立的四个柱子从左至右依次是:正常组、DPN组、DPN+T1组、DPN+T2组。
[0012]附图3是各组治疗前后的MNCV比较。
[0013]附图4是各组治疗前后的SNCV比较。
[0014]附图5是各组大鼠坐骨神经HE染色结果图。A:正常组(100X)，B:DPN+T2组(100X )，C:DPN 组(100X )，D:DPN 组(300X )。
[0015]附图6是各组大鼠髓鞘劳克-坚牢蓝染色结果(横状位)。A:正常组(100X )，B:DPN+T2 组(100X)，C:DPN 组(100X)，D:DPN 组(300X)。
[0016]附图7是各组大鼠髓鞘劳克-坚牢蓝染色结果(纵状位)。六-正常组^。。※)，B:DPN+T2 组(100X )，C:DPN 组(100X )，D:DPN 组(300X )。
[0017]附图8是各组大鼠坐骨神经透射电镜图片。第一排从左至右为A、B，第二排从左至右为 C、D。A:正常组(4000X )，B:DPN+T2 组(4000X)，C:DPN 组(4000X )，D:DPN 组(13000X )。
[0018]附图9是MBP在坐骨神经上的表达。△:正常组(300\)，8观奸了2组(300父)，(::DPN 组(300X )。
[0019]附图10是各组MBP的表达。
[0020]附图11 是各组 western-blot 结果。1:DPN 组，2:DPN+T1 组，3:DPN+T2 组，4:正常`组。
【具体实施方式】
[0021]下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0022]一、实验材料
实验动物:6周龄(140-160g)的Wistar大鼠，雄性，共60只，购自复旦大学上海医学院动物中心。动物使用符合上海市动物管理委员会管理条例。单笼饲养，饲养室安静，保持温度为20±2°C，相对湿度为60%，光照时间12h/天，清洁饮水，造模前标准饲养。
[0023]清洁级大鼠普通维持饲料，购自复旦大学上海医学院动物中心；高脂、高糖饲料，即在清洁级大鼠普通维持饲料中加入质量分数为10%猪油和质量分数为20%蔗糖，混匀干燥后照射消毒灭菌。
[0024]兔抗大鼠MBP单克隆抗体,购自Sigma公司；辣根过氧化酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗，购自北京中山生物技术有限公司；TNF-a受体-抗体融合蛋白，购自上海中信国健药业股份有限公司；链脲霉素(STZ)，购自Sigma公司。
[0025]二、实验方法
I实验动物的分组、DPN大鼠模型的建立和治疗
分组:实验动物被分成4组，每组各12只。正常组、DPN组、DPN+低剂量TNF-α受体-抗体融合蛋白组(0.4mg/Kg/次，简称DPN+T1组)和DPN+高剂量TNF- α受体-抗体融合蛋白组(4mg/Kg/次，简称DPN+T2组)。
[0026]DPN大鼠模型的建立:DPN组、DPN+T1组与DPN+T2组大鼠采用高脂、高糖饲料。高月旨、高糖饲料喂养6周后，腹腔注射STZ 30mg / kg，注射前禁食12h以上但不禁水。造模后48h测大鼠空腹血糖(测试前禁食12h)，以血糖高于16.7mmol/L为大鼠2型糖尿病模型造模成功的判定标准。造模成功后继续高脂、高糖饲料喂养4周，即建立DPN模型。
[0027]治疗方法:正常组大鼠采用清洁级大鼠普通维持饲料。DPN+T1组与DPN+T2组分别皮下注射TNF- α受体-抗体融合蛋白0.4mg/Kg/次和4mg/Kg/次，2次/周，连续4周。DPN组与正常组皮下注射等量生理盐水。实验过程中要定期监测各组血糖水平，保证DPN组、DPN+T1组与DPN+T2组在治疗后的血糖水平无统计学差异。
[0028]2坐骨神经神经传导速度(NCV)测定
于治疗前和治疗后分别测定大鼠的坐骨神经传导速度(NCV)，包括运动神经传导速度(Motor Nerve Conduction Velocity, MNCV)和感觉神经传导速度(Sensory NerveConduction Velocity, SNCV)?
[0029]3神经组织病理学改变的观察 3.1 DPN大鼠坐骨神经标本的收集
3.1.1光镜标本的采集
腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，分离双侧坐骨神经，取长约Icm置于10%甲醛固定待作光镜。1%锇酸染色，常规脱水、石蜡包埋，精密轮转切片机(德国LEICA RM2135型)连续切片，厚5 μ m。
[0030]3.1.2电镜标本的采集
剥离神经，在戊二醛中取样`l*l*(3-4)mm，两端用刀切平，勿剪；神经纵向分成四部分，利于固定液渗入；保存于0-4°C冰箱，勿使戊二醛结冰。
[0031]3.2 HE 染色 具体染色方法如下:
1)二甲苯I脱蜡IOmin左右(自动染色机染IOmin)；
2)二甲苯I1、III脱蜡5min左右(自动染色机染IOmin)；
3)无水酒精(乙醇)I洗去二甲苯Imin(机染Imin)；
4)无水酒精(乙醇)II洗去二甲苯Imin(机染Imin)；
5)95% 酒精 Imin (机染 Imin)；
6)85% 酒精 Imin (机染 Imin)；
7)75% 乙醇 Imin ；
8)蒸馏水洗2min；
9)苏木素染色5-20min(可以根据染色结果和要求调整时间)，自来水冲洗；
10)分化液分化30s；
11)自来水浸泡15min或温水(约50°C) 5min ；
12)置伊红液2min；
13)自来水冲洗；
14)常规脱水，透明，封片:95%乙醇(I)min— 95%乙醇(II) Imin — 100%乙醇(I )Imin — 100 % 乙醇(II ) Imin — 二甲苯石碳酸(3:1) Imin — 二甲苯(I ) Imin — 二甲苯
(II)lmin—中性树脂封固。镜下观察。
[0032]3.3坚牢蓝染色具体染色方法如下:
1)脱蜡水化至95%酒精；
2)LFB (坚劳蓝)600C 2-5h瓶密封(新配时)或37°C过夜最佳；
3 ) 95%酒精(冲洗，洗净)；
4)蒸馏水洗(流水冲洗干净)；
5)0.05%碳酸锂溶液5s，注意，使用后要经常更换，保持新鲜；
6)70%酒精两次；
7)蒸馏水洗(流水冲洗干净)；
8)显微镜下观察，重复5-7次至白质和灰质有鲜明对比，标准:核无色，髓鞘在浅灰/蓝色背景下呈绿宝石色；
9)70%酒精洗;
10)0.5%伊红浸一下(新配)，乙醇性依红好(可不用)；
11)蒸馏水洗；
12)Cresyl violet (结晶紫)浸一下(新配);
13)70%酒精洗至可见 核和尼氏小体呈紫色，大约30s ；
14)蒸馏水洗；
15)脱水95%酒精I次，100%酒精2次(快)吹干二甲苯透明，封片；
16)结果:髓鞘蓝色，尼氏小体和神经细胞紫色，红细胞宝蓝色。
[0033]3.4电镜观察
取2.5%戊二醛固定的坐骨神经组织，用1%锇酸固定，Epon812包埋，超薄切片，乙酸双氧铀和枸橼酸铅双染色，乙醇丙酮梯度脱水，透射电镜(Philips CM 120)观察。
[0034]4免疫组织化学染色法检测MBP的表达
4.1免疫组织化学染色及切片制作
切片入0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.2-7.4)漂洗3次，每次5min。然后入含有10%正常兔血清中，37°C孵育Ih。将切片放入稀释后的第一抗体(兔抗鼠1:400)中，37°C孵育4h，移入4°C冰箱孵育48-72h。然后经PBS漂洗3次，切片入辣根过氧化物酶标记的第二抗体(HRP 羊抗兔 IgG 1:2000)，37°C孵育 lh。PBS 漂洗 3 次，再用 0.lmol/L Tris-HCL缓冲液洗5min。切片挑入0.05% DAB+0.05mol/L Tris-HCL缓冲液，加3%过氧化氢1-2滴显色，反应需5-15min，显微镜下观察监控呈色反应。切片入0.05mol/L Tris-HCL缓冲液终止反应，洗去非特异性着色。贴片，晾干，透明，封片，镜下观察。
[0035]4.2阴性对照及免疫组织化学染色阳性细胞记数
对照实验:以正常兔血清和PBS代替一抗，同步进行上述免疫组织化学染色，结果为阴性。光镜下(100X)对各组大鼠脑片免疫阳性细胞进行细胞计数。每一脑片在皮层和海马
随机取6个视野，求其算术平均值，最后测定结果均以X 土 S表示。
[0036]5 Western-blot 方法检测 MBP 的表达
5.1 SDS-PAGE凝胶的制备
先在制胶用的两层玻璃板中加入新鲜配制的5ml 10%分离胶，然后加％0压胶30min凝固后将水到出，并用滤纸洗干分离胶的表面，然后灌入新鲜配制的5%浓缩胶，插入梳子，待胶凝固后放入装有1% SDS电泳缓冲液的电泳槽中拔出梳子。
[0037]5.2加样和电泳
蛋白样本融化后加等体积2% SDS上样缓冲液短暂离心，煮沸3min，每个泳道中加等体积样品10-20 μ 1，采用Mini Trans-Blot电泳仪(Bio-Rad公司)先用IOOV电泳待样品指示线到达分离胶和浓缩胶分界线时将电压调至120V，待溴酚蓝电泳至分离胶底部时结束电泳。
[0038]5.3 转膜
采用湿转法转膜，电泳结束后取出凝胶，切除分离胶及多余的泳道，在转膜夹板的两层海绵之间丛负极到正极依次放置修剪好的滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸，放入电泳槽中(胶在负极侧，膜在正极侧)，电泳槽中加满预冷的电泳缓冲液，0°C，30V恒定电压，转膜9h。转膜结束后，将膜用丽春红染色约3-5min，然后用自来水漂洗以观察转移效果；同时用考马斯亮蓝对凝胶进行染色约半小时，脱色，观察蛋白转膜的充分性。滤纸和海绵应放入转移缓冲液中平衡30min，PVDF膜在甲醇中预湿30min。
[0039]5.4 封闭
将PVDF膜浸入含10%的脱脂奶粉辣根过氧化物美的TBST的封闭液中，置于水平摇床上，室温封闭Ih，然后用TBST清洗3次，每次5min。
[0040]5.5免疫印迹
用TBST配制一抗(羊抗鼠1:400)，将PVDF膜的放入配好的抗体稀释液中，保证抗体吸附面全部与液体接触，中间无气泡，4°C过夜，TBST清洗3次，每次IOmin ;用TBST配制HRP标记的兔抗山羊二抗(工作浓度为1: 2000)。
[0041]5.6 ECL发光及显影
取ECL试剂盒的A液和B液各0.5ml，混匀后与膜于室温下作用60s，用平头镊钳住膜片，垂直置于吸水纸以吸去过量试剂，置膜片于二层保鲜膜之间，小心赶尽气泡，将膜片吸附蛋白面朝上，置于X光片盒中，于暗室中压上X片，曝光2-5min，显影液显影40s，定影液定影2min,水洗IOmin,晾干。
[0042]5.7结果分析
以β-actin作为内参照，以证明各组蛋白上样量相等，上述硝酸纤维素膜洗膜后与β -actin的一抗结合，再与二抗结合，ECL显色，X光胶片曝光。将X光胶片采用Bio-Rad2000型凝胶成像系统在白光下扫描后，应用QUANTITY ONE软件(Bio-Rad公司)进行吸光度分析，以MBP/ β -actin比值表示各组蛋白表达水平。
[0043]6统计方法
统计学处理采用SPSS 11.0。将所有样品的MBP/β-actin比值，免疫阳性细胞计数结果进行Independent-samples t检验分析。
[0044]三、实验结果
I治疗前后各组间NCV的变化
研究发现治疗前DPN各组间NCV数值无统计学差异(P>0.05)。治疗后DPN+T1组NCV高于DPN组，但无统计学意义(P>0.05);而DPN+T2组MNCV和SNCV明显高于DPN组(P〈0.05)。具体结果参见表1、表2及图1、图2。
[0045]表1治疗前各组NCV (m/s)
【权利要求】
1.TNF-α受体-抗体融合蛋白在制备治疗糖尿病周围神经病变药物中的应用。
2.TNF-α受体-抗体融合蛋白在制备延缓糖尿病周围神经病变药物中的应用。
3.TNF-α受体-抗体融合蛋白在制备提高神经传导速度的药物中的应用。
4.TNF-α受体-抗体融合蛋白在制备减轻神经脱髓鞘的药物中的应用。
【文档编号】A61P3/10GK103656620SQ201210342183
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月17日 优先权日:2012年9月17日
【发明者】陈英辉, 施晓红, 许国雄, 李炳, 陈碧琴 申请人:复旦大学附属金山医院