专利名称：聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸-聚乙二醇-汉防己甲素和柔红霉素共聚物纳米粒及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及高分子材料技术领域和纳米靶向肿瘤给药领域，具体涉及PLGA-PLL-PEG-汉防己甲素/柔红霉素的制备，聚乳酸羟基こ酸-聚赖氨酸_聚乙ニ醇聚合物为骨架的纳米载药系统在传递抗肿瘤药物的应用。
背景技术：
化疗是目前治疗癌症的主要方法，然而化疗过程中产生的多药耐药(mult1-drugresistance, MDR)常常导致癌症化疗达不到预期效果。肿瘤细胞一旦对某种药物产生耐受，对其他多种化疗药物也会产生交叉耐受，这ー现象称为多药耐药。据美国癌症协会统计表明，肿瘤年死亡率中，90%以上肿瘤患者的死因都与多药耐药有关。因此，如何逆转多药耐药成为癌症治疗亟待解决的关键问题。长期以来，多药耐药逆转剂的研究一直是血液病领域研究的热点问题。现已证明，由MDRl基因编码的P-糖蛋白(P-gp)过度表达是肿瘤细胞产生MDR的重要原因。Ρ-gp的本质是ー种能量依赖性药物排出泵，可消耗细胞能量将细胞内药物泵出细胞外，从而使细胞内药物浓度下降，药物作用减弱直至丧失，最终导致MDR和肿瘤化疗的失败。因此，逆转MDRl基因与P-gp过度表达成为提高化疗成功率的关键因素。目前，针对P-gp过表达而开发的肿瘤耐药逆转剂主要有钙离子通道阻滞剂、环孢菌素类等。这些化疗药物虽然体外可以完全或部分逆转MDR，但其普遍存在的问题是特异性差，且产生逆转作用的剂量远大于其产生毒性的限制剂量，对心血管系统、免疫系统等有明显的不良反应，因而不适于应用于临床。环孢菌素D衍生物(PSC-833)由瑞士诺华公司研制，是迄今为止国际上第一个进入到临床随机试验的P-gp抑制剂，但由于PSC-833临床试验未见明显耐药逆转作用，目前其上市进程已被全面叫停，意味着目前临床上MDR面临着无药可用的境地。因此，继续寻找新型低毒高效的MDR逆转剂依然是目前研发相关药物的主要方向。而中药及其有效成分，由于其低毒且源自天然植物的特性，逐渐成为MDR抑制剂的研发重点，如汉防己甲素、甲基莲心碱和蝙蝠葛碱等陆续被证明具有逆转肿瘤多药耐药的作用。汉防己甲素(Tet)是植物汉防己的根中的主要活性成分，是ー种对心脏低毒性的钙通道拮抗剂，能够抑制mdrl活化从而抑制P-gp的过度表达，其体外逆转MDR的活性是维拉帕米的10倍，同时具有显著的体内逆转活性，是非常具有开发前景的第三代MDR逆转剂。汉防己甲素对人白血病耐药细胞株K562/A02具有较强的MDR逆转作用，可以增强柔红霉素(DNR)对K562/A02的细胞毒作用。随着汉防己甲素浓度的增加K562/A02细胞中高表达的耐药相关的可溶性钙结合蛋白(SORCIN)基因及sorcin蛋白的表达先增强后减弱，显示汉防己甲素对K562/A02耐药逆转呈浓度依赖性，汉防己甲素可能通过调整SORCIN基因及蛋白的表达參与逆转K562/A02的耐药性；p21蛋白的表达随着TET浓度的増加逐渐增强；mdrl基因的表达随着汉防己甲素浓度的増加不断降低；P_gp的表达随着Tet浓度的增加而逐渐减弱。汉防己甲素作用后，可明显降低K562/A02细胞NF-KB蛋白核转位和胞核NF-KB蛋白表达水平，可能通过抑制NF-KB活化逆转K562/A02细胞多药耐药性。同时，动物实验表明，汉防己甲素在荷瘤鼠体内可达到良好的疗效及安全性[I]。然而汉防己甲素具有半衰期短、有局部刺激性、在水中溶解度低、注射给药毒性较高的等问题，且汉防己甲素常规用药很难达到靶细胞，因此开发具有长效、低毒、低刺激性的汉防己甲素新型载药系统势在必行。采用高分子聚合物和天然的高分子材料装载的药物纳米载体可以有效提高抗肿瘤效果，目前成为国际上抗肿瘤研究关注的重点领域。纳米载体具有主要优点如下[2](I)具有较高的药物包载能力，能够包载的药物范围较广，可以是疏水性的药物也可以是亲水性药物，并且无论单方药还是复方药均可包载；(2)有缓释作用，能够延长药物的作用时间；(3)通过修饰可形成亲水端，从而防止蛋白质的吸附，躲避网状内皮系统的捕捉；(4)粒径小且分布窄，易通过生理屏障，在体内具有独特的分布特征。纳米粒在体内的分布主要取决于粒径的大小和表面形态，与核内包裹的药物性质关系不大；(5)可在保证药效的前提下，減少给药剂量，从而减轻或避免毒副作用。 目前用于制备纳米给药系统的载体种高分子载体材料有多种，如聚α-羟基酸，、乳酸-羟基こ酸共聚物(PLGA)、交联聚酯、聚氰基丙烯酸烷酯(PACA)、天然蛋白、壳聚糖、明胶等。本发明选择PLGA-PLL-PEG共聚物作为汉防己甲素的载体。以PEG-PLL-PLGA共聚物作为药物载体的优势明显(I)能够有效減少PLGA被网状内皮系统的摄取，从而增加载体的稳定性，延长其体循环时间；(2)可以通过调节PEG-PLL链的长度来影响聚合物体内的降解性和药物的释放行为，改善药物的释放动力学特征；(3)在共聚物载体上引入PLL可有效增加细胞的摄取率，提高药物疗效；(4)PEG-PLL与PLGA共聚后可以增强聚合物的亲水性，增强了载体对亲水性药物的装载能力。目前PLGA-PLL-PEG共聚物作为载体的合成技术已相对比较成熟[3_5]。PLGA-PLL-PEG载体已被广发应用于多个领域，如应用PLGA-PLL-PEG载体连接R⑶蛋白作为人造血小板用于创伤性出血的治疗；应用PLGA-PLL-PEG包载脑原性神经因子BDNF用于神经蛋白损伤的治疗；应用PLGA-PLL-PEG载体，采用复乳溶剂挥发法包裹SiRNA，用于肿瘤细胞的基因干扰等。柔红霉素作为ー种周期非特异性化疗药，主要用于各种类型的急性白血病(包括粒细胞性、淋巴细胞性和单核细胞性以及粒-単核细胞性)、慢性粒细胞性白血病、恶性淋巴瘤，是ー种非常好的抗肿瘤模型药物。但因柔红霉素易诱发不可逆性心脏毒性，从而限制了它的临床应用。而通过药物载体系统可以改变阿霉素的体内分布，減少其毒副反应的发生。本发明采用PLGA-PLL-PEG共聚物同时包载了柔红霉素与汉防己甲素，可以考察汉防己甲素的MDR逆转效果，以期开发可用于临床的低毒高效的主动靶向耐药逆转剂。參考文献[I]陈宝安，董颖，张鹏，程坚，周云，盛茗，王婷，高峰.汉防己甲素联合屈洛昔芬逆转K562/A02细胞多药耐药的研究[J].中华血液学杂志2002; 23 (12) :660-1.[2]Brannon-Peppas L, Blanchette JO. Nanoparticle and targeted systemsfor cancer therapy. Adv Drug Deliv Rev.2004, 56(11):1649-1659.[3]Bertram JP, Rauch MF, Chang K, Lavik EB. Using Polymer Chemistryto Modulate the Delivery of Neurotrophic Factors from DegradabIe Microspheres:Delivery of BDNF. Pharm Research. 2010, 27(I):82-91.
[4] Zhou J，Patel TRj Fu Mj Bertram JPj Saltzman WM. Octa-functional PLGA nanoparticles for targeted and efficient siRNA delivery to tumors. Biomaterials ，2012，33(2) :583-591.
[5] Bertram JP，Williams CA, Robinson R，Segal SSj Flynn NT, Lavik EB.1ntravenous Hemostat: Nanotechnology to Halt Bleeding. Sci Trans I Med. 2009，1(11) : 11-22。发明内容
技术问题本发明提供的技术方案为选用相容性好的生物可降解材料PLGA、PLL、 PEG作为合成新型纳米载药系统的原料，制备不同类型的PEG-PLL-PLGA聚合物，并应用此载体携载抗肿瘤药物柔红霉素和，制备纳米粒，并在末端偶联靶体，构建一种具有主动靶向性能的抗肿瘤药物纳米载体PEG-PLL-PLGA，可以有效减少柔红霉素的毒性，克服多药耐药。
本发明所要解决的技术问题包括合成适宜装载药物的聚合物载体、制备纳米粒条件的优化及试验过程中一系列检测方法的确定。
技术方案本发明所述的聚合物PLGA-PLL-PEG是一种较好的药物载体，它可以通过不同药剂学方法如溶剂扩散法、乳化溶剂挥发法、复乳化溶剂挥发法等，制备得到纳米粒或微球，且可控制超声、高速匀浆、高压均质等机械条件的强弱，从而得到不同粒径范围的载药粒子(10(T2000nm)。制得的纳米粒表面光滑，大小均一，载药量及包封率高。本发明中所述载体分子量范围为4X 104-5X 105，其中PLGA为德国盈创公司 RESOMER 系列产品，聚乳酸与羟基乙酸比例包括85:15、75:25、65:35、50:50。
本发明所述的多聚物纳米载体包载的抗肿瘤药物为柔红霉素、所述的中药逆转剂为汉防己甲素。采用高效液相色谱法测定其载药量，结果纳米粒子的载药量为O. 19Γ13%。
本发明的聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸-聚乙二醇-汉防己甲素和柔红霉素共聚物纳米粒为聚乳酸羟基乙酸与聚赖氨酸连接为嵌段结构，聚赖氨酸与聚乙二醇之间为接枝结构，聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸-聚乙二醇聚合物的分子量为4Χ 104-5X IO5 ;所述纳米粒子粒径范围为IOO-1OOOnm ;聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸-聚乙二醇聚合物包载的药物为汉防己甲素和柔红霉素；包载药物使用的方法为自乳化溶剂挥发法、乳化溶剂挥发法、复乳化溶剂挥发法。
所述聚乳酸羟基乙酸粘度范围为0. 15^0. 8dL/g，其中聚乳酸与羟基乙酸比例为 (85 50) : (15 50);所述聚赖氨酸分子量范围50(T20000g/mol ;所述聚乙二醇分子量范围 100(T8000g/mol。
本发明聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸-聚乙二醇-汉防己甲素和柔红霉素共聚物纳米粒的制备方法为将聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸-聚乙二醇共聚物溶解在有机溶剂O中， 形成油相聚合物；将汉防己甲素与柔红霉素溶解到内水相W1，中形成水溶液，再将该水溶液慢慢加入至油相聚合物中乳化形成初乳w/o，将制得初乳w/o迅速加入至外水相W2中，复乳化形成复乳W1AVw2纳米粒溶液，将复乳W1AVW2纳米粒溶液中有机相挥干，高速冷冻离心机离心溶液，沉淀物用水重旋，离心，重复操作即可制得聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸-聚乙二醇-汉防己甲素和柔红霉素共聚物纳米粒。
所述的聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸-聚乙二醇共聚物浓度为l(T50mg/ml，汉防己甲素与柔红霉素的浓度为l 20mg/ml。
所述的有机溶剂O为以下溶剂中的一种二氯甲烷、二氯甲烷与丙酮的混合物、乙酸乙酯、二氯甲烷与甲醇的混合物。
所述的水相W1为去离子水、2°/Γ8%吐温80溶液、O. 2°/Γθ. 8%的聚乙烯醇溶液或O.1°/Γθ. 6%的泊洛沙姆溶液中的一种。
所述的乳化形成初乳W1A)的的方法为10(T400W超声、采用3000rpm IOOOOrpm 高剪切机高速匀浆或500bar IOOObar高压均制法；复乳化形成复乳W1AVW2纳米粒溶液中有机相挥发方式为减压旋蒸法，条件是O. OlMPa O. 07MPa, 35 40°C ;或O. 3% 0. 6%g/ml聚乙烯醇溶液中搅拌挥发。
所述的外水相W2为1°/Γ3%的聚乙烯醇溶液或1°/Γ3%的泊洛沙姆溶液；内水相与外水相的比例为l:l(Tl:30，内水相与有机相比例为1:2 1:6。
所述的聚乙烯醇醇解度为879T89%m0l/mol，粘度CPS为4. 6-5. 4，所使用的泊洛沙姆型号为泊洛沙姆F68或泊洛沙姆188。
本发明聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸-聚乙二醇-汉防己甲素和柔红霉素共聚物纳米粒的应用于治疗白血病及白血病多药耐药。
有益效果本发明所述的以PLGA-PLL-PEG为载体的纳米粒，可以同时装载一种或两种溶解性相似的抗肿瘤药物，并可连接靶向基团如转铁蛋白单抗、多肽、叶酸等，聚合物与靶向基团之间的连接是通过共价键连接。这种纳米体系中，由抗肿瘤药物、逆转剂协同发挥抗肿瘤及逆转多药耐药的作用，而靶向基团提高了纳米粒的靶向性，减小了毒副作用。
本发明所述的PLGA-PLL-PEG载药纳米粒，可以制备成冻干制剂，提高纳米粒的稳定性。所使用的冻干保护剂包括甘露醇、乳糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖等，所用浓度59TlO%。
本发明制备方法简便，制备纳米粒所使用的方法适于工业化生产，装载药物范围广，特别适于毒副作用较大的难溶性抗肿瘤药物。
图1是纳米粒装载药物的模式图，
图2是聚合物载体结构及偶联抗体过程图，
图3是制备柔红霉素纳米粒的粒径分布图(MalvrenZetasizer 3000HS激光粒度仪，横坐标为粒径，纵坐标为响应值)，
图4为制备的柔红霉素与汉防己甲素纳米粒的粒径分布图(MalvrenZetasizer 3000HS激光粒度仪，横坐标为粒径，纵坐标为响应值)，
图5为制备的柔红霉素汉防己甲素纳米粒的外观图及透射电镜下外观图(日立 Η-7650透射电子显微镜)，
图6是当流动相为水乙腈=780:220 (磷酸调至ΡΗ2. O)时，柔红霉素与汉防己甲素的液相图谱。
具体实施方式
以下均对本发明进一步说明，但不仅限于本发明内容。
实施例1. PLGA-PLL-PEG/盐酸柔红霉素纳米粒的制备
采用复乳化溶剂挥发法(W/0/W)制备，取适量柔红霉素溶于6%的吐温80溶液中， 作为水相，而聚合物载体溶于二氯甲烷与丙酮(1:广4:1)的混合溶液中，作为油相，将水相滴入油相中搅拌，其中水相与油相比例为(1: 2 1:5)使用超声仪超声制得初乳(WO)0将初乳迅速加入至外水相1. 5%聚乙烯醇溶液中搅拌，倒入高压均质机中复乳化(W/0/W)，控制一定压力及均质时间，制得PLGA-PLL-PEG/盐酸柔红霉素纳米粒，搅拌蒸出有机溶剂，离心洗涤，冷冻干燥制得冻干纳米粒制剂，纳米粒的载药量为1°/Γ6%，粒径可控在15(T20000nm 之间。
实施例2. PLGA-PLL-PEG/汉防己甲素纳米粒的制备
采用乳化挥发法制备，将聚合物溶于二氯甲烷中，再加入乙醇溶液制成油相(0)， 将汉防己甲素溶解在其中，将其滴加入乳化剂溶液(1. 5%聚乙烯醇或2%泊洛沙姆F68) 中，油相与水相的比例为1:5 1:10，一定功率超声形成0/W溶液，室温搅拌固化，除去有机相，离心洗涤，冷冻干燥制得冻干纳米粒制剂，纳米粒的载药量为ι°/Γιι%，粒径可控在 10(Tl0000nm 之间。
实施例3. PLGA-PLL-PEG/柔红霉素/汉防己甲素纳米粒的制备
采用复乳化溶剂挥发法(W/0/W)制备，取适量柔红霉素和盐酸化汉防己甲素溶于 6%的吐温80溶液中，作为水相，而聚合物载体溶于二氯甲烷与丙酮的混合溶液中，作为油相，将水相滴入油相中搅拌，使用超声仪超声制得初乳(W/0)。将初乳迅速加入至外水相1.5%聚乙烯醇溶液中搅拌，倒入高压均质机中复乳化(W/0/W)，控制一定压力及均质时间， 制得PLGA-PLL-PEG/盐酸柔红霉素纳米粒，搅拌蒸出有机溶剂，离心洗涤，冷冻干燥制得冻干纳米粒制剂，纳米粒的柔红霉素载药量为1%飞％，汉防己甲素载药量为ι°/Γιο%，粒径可控在 15(T20000nm 之间。
实施例4. PLGA-PLL-PEG/柔红霉素/汉防己甲素纳米粒的制备
采用溶剂扩散法制备，将柔红霉素、汉防己甲素与聚合物溶于丙酮-二氯甲烷混合液(1: f 1:3)中形成油相，再加入至含乳化剂(2%泊洛沙姆)的水相中，油相与水相的比例1: Γ1:10，冰浴，使用一定频率的超声乳化后，室温搅拌，离心洗涤，冷冻干燥制得冻干纳米粒制剂，纳米粒的载药量为1°/Γ7%，汉防己甲素载药量为1°/Γ4%，粒径可控在15(T20000nm 之间。
实施例5.转铁蛋白单抗与载药纳米粒的交联
将纳米粒溶于PBS7. 4溶液中，超声30s，与转铁蛋白单抗的PBS7. 4溶液混合搅拌， 反应3h,反应液经过蛋白快速层析系统和Sepharose CL-4B柱,除去游离转铁蛋白单抗后制得PLGA-PLL-PEG-antiTf纳米粒；将纳米粒溶于PBS7. 4溶液中，超声30s，加入1-(3- 二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与硫代琥珀酰亚胺(S-NHS)，再加入转铁蛋白抗体，搅拌反应3、h,反应液经过蛋白快速层析系统和Sepharose CL-4B柱,除去游离抗体后制得 PLGA-PLL-PEG-antiTf 纳米粒。
权利要求
1.一种聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸-聚乙二醇-汉防己甲素和柔红霉素共聚物纳米粒，其特征在于聚乳酸羟基乙酸与聚赖氨酸连接为嵌段结构，聚赖氨酸与聚乙二醇之间为接枝结构，聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸-聚乙二醇聚合物的分子量为4X 104-5X IO5 ;所述纳米粒子粒径范围为IOO-1OOOnm ;聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸-聚乙二醇聚合物包载的药物为汉防己甲素和柔红霉素；包载药物使用的方法为自乳化溶剂挥发法、乳化溶剂挥发法、 复乳化溶剂挥发法。
2.根据权利要求1所述的聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸-聚乙二醇-汉防己甲素和柔红霉素共聚物纳米粒，其特征在于所述聚乳酸羟基乙酸粘度范围为O. 15^0. 8dL/g，其中聚乳酸与羟基乙酸比例为(85 50) : (15 50);所述聚赖氨酸分子量范围50(T20000g/mol ； 所述聚乙二醇分子量范围100(T8000g/mol。
3.—种如权利要求1所述的聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸-聚乙二醇-汉防己甲素和柔红霉素共聚物纳米粒的制备方法，其特征在于将聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸-聚乙二醇共聚物溶解在有机溶剂O中，形成油相聚合物；将汉防己甲素与柔红霉素溶解到内水相W1, 中形成水溶液，再将该水溶液慢慢加入至油相聚合物中乳化形成初乳W1A),将制得初乳W1/ O迅速加入至外水相W2中，复乳化形成复乳W1ZCVW2纳米粒溶液，将复乳W/0/%纳米粒溶液中有机相挥干，高速冷冻离心机离心溶液，沉淀物用水重旋，离心，重复操作即可制得聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸-聚乙二醇-汉防己甲素和柔红霉素共聚物纳米粒。
4.根据权利要求3所述的聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸-聚乙二醇-汉防己甲素和柔红霉素共聚物纳米粒的制备方法，其特征在于所述的聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸-聚乙二醇共聚物浓度为l(T50mg/ml,汉防己甲素与柔红霉素的浓度为l 20mg/ml。
5.根据权利要求3所述的聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸-聚乙二醇-汉防己甲素和柔红霉素共聚物纳米粒的制备方法，其特征在于所述的有机溶剂O为以下溶剂中的一种二氯甲烷、二氯甲烷与丙酮的混合物、乙酸乙酯、二氯甲烷与甲醇的混合物。
6.根据权利要求3所述的聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸-聚乙二醇-汉防己甲素和柔红霉素共聚物纳米粒的制备方法，其特征在于所述的水相W1为去离子水、0.2%~0.8%吐温80溶液或O. 1%~0. 6%的泊洛沙姆溶液中的一种。
7.根据权利要求3所述的聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸-聚乙二醇-汉防己甲素和柔红霉素共聚物纳米粒的制备方法，其特征在于所述的乳化形成初乳W1A)的的方法为10(T400W 超声、采用3000rpnTl0000rpm高剪切机高速勻衆或500bar IOOObar高压均制法；复乳化形成复乳W1AVW2纳米粒溶液中有机相挥发方式为减压旋蒸法，条件是O. OlMPa^O. 07MPa, 35^40 °C ;或O. 39Π). 6%g/ml聚乙烯醇溶液中搅拌挥发。
8.根据权利要求3所述的聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸-聚乙二醇-汉防己甲素和柔红霉素共聚物纳米粒的制备方法，其特征在于所述的外水相W2为19Γ3%的聚乙烯醇溶液或1°/Γ3%的泊洛沙姆溶液；内水相与外水相的比例为l:l(Tl:30，内水相与有机相比例为 1:2 1:6。
9.根据权利要求8所述的聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸-聚乙二醇-汉防己甲素和柔红霉素共聚物纳米粒的制备方法，其特征在于所述的聚乙烯醇醇解度为.879T89%mol/mol，粘度CPS为4. 6-5. 4，所使用的泊洛沙姆型号为泊洛沙姆F68或泊洛沙姆188。
10.一种如权利要求1所述的聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸-聚乙二醇-汉防己甲素和柔红霉素共聚物纳米粒的应用，其特征在于该共聚物纳米粒主要用于治疗白血病及白血病多药耐药 。
全文摘要
本发明公开了聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸-聚乙二醇-汉防己甲素和柔红霉素共聚物纳米粒及其制备和应用，具体步骤包括共聚物溶解在有机溶剂(O)中，形成油相聚合物，将药物溶解到水相(W1)中，再将水相慢慢加入至油相中乳化形成初乳(W1/O)，将制得初乳迅速加入至另一水相(W2)中，复乳化形成复乳(W1/O/W2)，将复乳化的纳米粒溶液中有机相挥干，高速冷冻离心机离心溶液，沉淀物用水重旋，离心，重复操作两次，制得PLGA-b-PLL-g-PEG包载的汉防己甲素和柔红霉素共聚物纳米粒。本发明共聚物纳米粒载体制备方法简便，药物装载方法适于工业化生产，环境污染少。
文档编号A61P35/02GK102988374SQ20121047252
公开日2013年3月27日 申请日期2012年11月20日 优先权日2012年11月20日
发明者陈宝安, 王永禄, 刘苒, 李学明, 郭莉婷, 陈卫, 程坚, 殷海祥, 张孝平, 鲍文 申请人:东南大学