专利名称：介导癌细胞细胞毒性的嵌合和人源化抗cd44抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及诊断和治疗癌性疾病,具体地,涉及介导肿瘤细胞细胞毒性；和更具体地，涉及减轻癌性疾病的抗体(CDMAB)，任选与一种或多种CDMAB/化疗剂组合作为用于起始细胞毒性响应的工具的应用。本发明还涉及利用本发明CDMAB的结合测定。
背景技术：
癌症中的CD44:针对人白细胞生成单克隆抗体导致发现CD44抗原；一种在广泛多样的正常组织上和全部类型的造血细胞上表达的单链透明质酸(HA)结合糖蛋白。其最初与淋巴细胞活化和归巢有关。当前，其推定的生理学作用还包括活化炎性基因、调节细胞周期、诱导细胞增殖、诱导分化和发育、诱导细胞骨架重构和细胞迁移和细胞针对凋亡的存活/抗性。在人类中，⑶44的单基因拷贝位于染色体11的短臂，11ρ13上。该基因含有19个外显子；最开始的5个是恒定的，之后的9个是变化的，再之后的3个是恒定的且最后2个是变化的。分化剪接可以导致超过1000种不同的同种型。然而，目前仅确定了数打天然存在的变体。⑶44标准糖蛋白由N-末端胞外(包括20个a.a.引导序列，和膜近侧区(85a.a.))结构域(270a.a.)，跨膜区(21a.a.)和细胞质尾部(72a.a.)组成。胞外区还包含位于N-末端的连接构件。该区长度为92a.a.，并显示出与其他HA结合连接蛋白的同源性。在CD44的小鼠和人形式之间存在高度的同源性。该蛋白的变体形式插入到外显子5的羧基末端并在表达时位于细胞外。⑶44的血清可溶性形式也天然存在并可以由终止密码子(可变区内)或由蛋白水解活性产生。来自多种刺激包括TNF-α的细胞活化导致CD44受体的释放。对于肿瘤细胞也观察到该受体的释放，并且其可以导致人血请⑶44浓度增高高达10倍。高⑶44血清浓度提示恶性肿瘤(卵巢癌是例外)。⑶44的标准形式以约37kD的分子量存在。翻译后修饰使分子量增加到80_90kD。这些修饰包括位于天冬酰胺残基处的氨基末端胞外结构域N-连接的糖基化，位于胞外结构域的羧基末端的丝氨酸/苏氨酸处的O-连接的糖基化和粘多糖添加。剪接变体可以在80-250kD的尺寸范围内变化。HA，位于哺乳动物中的胞外基质(ECM)上的多糖，被认为是主要的⑶44配体。然而，还发现CD44结合这样的蛋白，如胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白等。HA结合和糖基化之间似乎存在相关性。失活的CD44 (不结合HA)具有最高水平的糖基化，活性CD44 (结合HA)具有最低的，而可诱导的CD44(不或 很弱地结合HA，除非受到细胞因子、单克隆抗体、生长因子等的活化)具有活性和失活形式之间某处的糖基化水平。
⑶44可以通过信号转导途径介导它的一些功能，这取决于细胞、刺激和环境的相互作用。这些途径中的一些包括NF K B信号传导级联(参与炎性反应)、Ras-MAPK信号转导途径(涉及活性细胞周期和增殖)、蛋白质Rho家族(涉及细胞骨架重构和细胞迁移)和PI3-K-相关信号传导途径(涉及细胞存活)。全部上述功能与肿瘤疾病的开始和进展密切相关。⑶44还涉及在癌症中通过多种另外的机制起作用。这些包括通过⑶44细胞表面上存在的细胞表面蛋白聚糖对参与恶性肿瘤的受体呈递生长因子、趋化因子和细胞因子。而且，在⑶44-HA复合物内在化后由溶酶体透明质酸酶引起的HA胞内降解可以通过ECM潜在地增加肿瘤侵入和诱导血管发生的可能性。另外，显示出存活或凋亡信号的传输通过标准或可变⑶44受体发生。还提示⑶44参与细胞分化和迁移。这些机制中的许多，如果不是全部，是环境和细胞依赖性的，且若干引起可变的结果。因此，在可以得出任何结论之前需要更多的研究。为了验证⑶44在癌症中的潜在功能作用，采取⑶44的表达研究以确定该受体的分化表达是否与疾病进展相关。然而，在大部分肿瘤类型中观察到不一致的结果，且这可能归因于研究者之间的试剂、技术、病理学评分和细胞类型差异的组合。肾细胞癌和非霍奇金淋巴瘤似乎是另外，其中具有高CD44表达肿瘤的患者一致地具有比他们的低或非CD44表达的负体更短的存活时间。由于其与癌症的联系，⑶44已经是抗癌治疗发 展的靶标。仍然存在一些争论，如关于肿瘤进展需要CD44的标准形式还是变体形式。存在支持这两种观点的体内动物数据，并且同样地其可以是肿瘤类型和甚至细胞类型依赖性的。不同的治疗方法已经包括注射可溶性⑶44蛋白，乙酰透明质酸合成酶cDNA，透明质酸酶，使用⑶44反义和⑶44特异性抗体。每种方法引起了一定程度的成功，从而为抗CD44癌症治疗提供支持。已经实验室生成了变体和标准⑶44特异性单克隆抗体，但是在很大程度上，这些抗体不具有固有的生物活性，相反地，它们特异性结合它们识别的CD44类型。然而，这些是在体外或体内但通常不在两处具有活性的一些。若干抗CD44抗体显示出介导细胞事件。例如，鼠抗体A3D8，针对人红细胞卢氏抗原⑶44标准形式，显示出增强⑶2 (9-1)抗体和⑶3 (0KT3抗体)介导的T细胞活化；另一种抗⑶44抗体具有类似的作用。A3D8还诱导IL-1从单核细胞中释放和IL-2由T淋巴细胞中释放。有趣地，与药物诸如柔红霉素，米托蒽醌和依托泊苷联合使用A3D8通过消除第二信使神经酰胺的产生抑制HL60和NB4AML细胞中的凋亡诱导。J173抗体，其不具有固有活性且针对CD44的类似表位，不抑制药物诱导的凋亡。而且，A3D8和另一种抗⑶44单克隆抗体H90，以及乙酰透明质酸，诱导来自急性骨髓型白血病(AML)患者的白血病胚细胞的分化。然而，在相同的研究中，也结合CD44标准形式的J173抗体不诱导相同细胞的分化。有趣地，H90不结合来自其AML细胞与J173结合的患者子集的AML细胞，这说明这些抗体识别不同的表位。在一项独立的研究中，A3D8和H90均诱导若干AML-来源的细胞系的末期分化。NH44-1抗体，其针对⑶44的85_110kD和200kD形式，通过作者推测为交联或聚集CD44的途径，增加T细胞增殖。总之，不存在这样的证据，即抗体诸如这些适合于用作癌症治疗法，因为它们不针对癌症(例如，活性淋巴细胞)，诱导细胞增殖，或当与细胞毒性试剂一起使用时抑制药物诱导的癌细胞死亡。已经描述了若干抗⑶44抗体，这证明了体内抗肿瘤作用。抗体H90是通过用人红细胞(RBCs)免疫小鼠产生的鼠单克隆抗体，且其据报告结合CD44的所有同种型。对用辐射处理的已接种人AML细胞的NOD-SCID小鼠施用该抗体，三次/周，4周，通过这些细胞阻断种群恢复。另外，在由经历了使用H90抗体处理的动物中获得细胞时，来自这些动物的AML细胞的连续传代未能在接受者小鼠中种群恢复。该抗体的作用似乎是通过干扰白血病干细胞的分化和AML细胞与适当生态位之间的相互作用来介导的。另外，受辐射的具有人脐带血干细胞的NOD-SCID小鼠的种群恢复不受该处理的损伤，这说明了该抗体的选择性作用和还有AML和正常人造血干细胞之间的重要表现型差异。抗体1.1ASML,即针对⑶44的v6变体的小鼠IgGl，显示出减少大鼠胰腺腺癌BSp73ASML的淋巴结和肺转移。受处理的动物的存活随之增多。抗体只有在淋巴结建群之前施用时才有效，且假定其干扰淋巴结中的细胞增殖。体外不存在该抗体对肿瘤细胞直接细胞毒性，且该抗体不增强补体介导的细胞毒性，或免疫效应子细胞功能。没有描述该抗体对人细胞的效用。Breyer等描述了可商购的抗CD44抗体中断同位移植大鼠成胶质细胞瘤进展的应用。大鼠成胶质细胞瘤细胞系C6植入到额叶中，并在I周后，通过大脑内注射给予大鼠3次该抗体的处理。受处理的大鼠证明了减少肿瘤生长，和比缓冲液或同种型对照处理的大鼠更高的体重。该抗体能够抑制细胞在体外与用胞外基质成分覆盖的盖玻片粘连，但是不具有针对细胞的任何直接细胞毒性作用。该抗体没有针对人细胞进行测试。进行了这样的研究，其比较了抗⑶44抗体(頂-7.8.1)和抗⑶44vl0抗体(K926)的功效。将高度转移的鼠黑素瘤品系B16F10，其表达这两种⑶44同种型，静脉内植入小鼠。2天后，在研究的期间内给药抗体，每3天一次。这两种抗体均导致肺转移数量大于50%的显著减少；这两种抗体之间不存在功效的显著差别。该抗体不影响体外增殖，且作者即Zawadzki等推测肿瘤生长的抑制归因于抗体阻断⑶44与其配体的相互作用。在另一项使用M-7.8.1的研究中，Zahalka等证明了该抗体及其F(ab，)2片段能通过鼠T细胞淋巴瘤LB阻断浸润淋巴结。这赋予小鼠显著的存活益处。Wallach-Dayan等显示用⑶44v4_vl0转染不自发形成肿瘤的LB-TR鼠淋巴瘤赋予形成肿瘤的能力。与同种型对照抗体相比，IM-7.8.1的施用减少植入的转染细胞的肿瘤尺寸。这些研究中没有一个证明了关于该抗体的人类效用。`GKff.A3，即小鼠IgG2a，特异于人⑶44并阻止人黑素瘤异种移植物在SCID小鼠中的形成和转移。将该抗体与转移人细胞系SMMU-2混合，并然后进行皮下注射。处理持续随后3周。4周后，与来处理的动物的100%相比，仅1/10小鼠在注射位点发育肿瘤。该抗体的F(ab’)2片段证明了相同的肿瘤形成抑制，这提示该作用机制不依赖于补体或抗体依赖性细胞毒性。如果肿瘤细胞在第一次抗体注射前一周注射，则80%的动物在原发位点发育肿瘤。然而，注意到，存活时间仍然显著延长。尽管延迟的抗体施用对原发肿瘤形成没有作用，但是其完全阻止在末处理动物中存在的向肺、肾、肾上腺、肝和腹膜的转移。该抗体既不具有在体外针对该细胞系的任何直接细胞毒性，也不干扰SMMU-2细胞的增殖，且似乎具有通过影响转移或生长具有其影响肿瘤形成的主要作用。该抗体的一个值得注意的特性是其识别CD44的所有同种型，这提示用于治疗应用的有限可能性。Strobel等描述小鼠异种移植模型中抗⑶44抗体(克隆515)抑制人卵巢癌细胞腹膜植入的应用。将人卵巢细胞系36M2在存在抗CD44抗体或对照抗体的条件下腹膜内植入小鼠中，并且然后在随后的20天内施用处理。5周后，在该抗体处理的组中在腹膜腔中存在显著更少的结节。来自这两种抗⑶44和对照处理的组的结节尺寸相同，这提示细胞一旦植入，则抗体对肿瘤生长没有作用。当皮下植入细胞时，也不存在对肿瘤生长的作用，这说明抗体本身不具有抗增殖或细胞毒性作用。另外，该抗体对体外细胞生长没有作用。VFF-18,也称为BIWAl，是针对⑶44的v6变体的高亲和性抗体，其特异于该多肽的360-370区。该抗体在12名患者的第一阶段临床实验中已经被用作99m锝标记的缀合物。测试了该抗体在患有头和颈的鳞状细胞癌的患者中的安全性和靶向潜力。注射后40小时，14%的注射剂量被肿瘤吸收，在其他器官包括肾、脾和骨髓中具有最少的累积。高度选择性肿瘤结合提示该抗体在放射免疫疗法中的功能，尽管该抗体的异常高亲和性阻止渗透进入肿瘤的较深层。应用BIWAl的其他局限是鼠抗体的免疫原性(12名患者中的11名形成人抗小鼠抗体(HAMA))，遍及肿瘤的异源累积和抗体-可溶性CD44复合物的形式。WO02/094879公开了设计用于克服HAMA反应的VFF-18的人源化形式，称为BIWA4。发现BIWA4具有比母体VFF18抗体显著更低的抗原结合亲和性。令人惊讶地，较低亲和性BIWA4抗体具有比较高亲和性B1WA8人源化VFF-18抗体更好的肿瘤吸收特征。99m锝标记的和186铼标记的BIWA4抗体均在33名患者的第一阶段临床实验中评估，以确定186Re标记的BIWA4的情形中的安全性、耐受能力、肿瘤累积和最大耐受剂量。似乎存在99mTc标记的BIWA4肿瘤相关吸收。关于所有剂量186Re标记的BIWA4没有观察到肿瘤反应，尽管一些具有稳定的疾病；剂量限制性毒性出现在60mCi/m2。存在50-65%的有害事件率，认为33名患者中的12名具有严重的有害事件(血小板减少症、白血球减少症和发烧)且其中6名均受到186Re标记的BIWA4处理的患者在处理过程中或后续由于疾病进展而死亡。2名患者形成人抗人抗体(HAHA)。在20名患者中进行186Re标记的BIWA4的第一阶段剂量逐步增加实验。观察到口腔粘膜炎和剂量限制性血小板减少症和白血球减少症；一名患者形成HAHA反应。在以最高剂量60 mCi/m2处理的5名患者中观察到稳定的疾病。尽管认为对于获得的功效而言安全性和耐性能力是可接受的，但是这些研究与临床研究中的其他非放射性同位素缀合生物疗法相比，具有更高的有害事件率。美国专利申请US 2003/0103985公开了与美登木素生物碱缀合的人源化VFF-18形式，称为BIWI1，用于肿瘤治疗中。发现人源化VFF18抗体，即BIWA4，在与毒素，即BIWIl缀合时，在人外阴表皮状癌、咽鳞状细胞癌或乳腺癌的小鼠模型中具有显著的抗肿瘤作用。未缀合形式，即BIWA4，不具有抗肿瘤作用。在BIWIl的第一阶段实验中，该实验针对受 不可治愈的头颈癌影响的患者，由于实验的过早中断，不可以确定最大耐受剂量，实验的过早中断归因于患者之一由大规模皮肤毒性引起的死亡。在平行的第二项BIWIl实验中，该实验也针对患有头颈癌的患者，确定MTD且它是皮肤毒性的结果。在第三项关于BIWIl的实验中，该实验针对预先经历了化学疗法的转移性乳腺癌患者，大多数常见毒性是轻微的和瞬间皮肤病症。通过该方法，即使不存在功效的客观测量，50%的受处理的患者显示出不依赖剂量的稳定疾病。关于所有实验的总负面风险对比功效评估，由于缺乏致命事件的可预言性，导致停止进一步开发该药物。Mab U36是通过UM_SCC_22B人下咽骨癌细胞免疫和关于癌症和组织特异性的选择产生的鼠单克隆IgGl抗体。通过cDNA克隆和序列分析获得的抗原特征确定角化细胞-特异性⑶44剪接变体epican的v6结构域为Mab U36的靶标。免疫组化研究显示表位局限于细胞膜。此外，Mab U36强烈标记94%的头颈鳞状细胞癌(HNSCC)，并且在这些肿瘤中存在均匀的细胞染色。10名患者99mTc标记的Mab U36研究显示抗体对HNSCC癌的选择性累积(在2天时，20.4+/-12.4%注射的剂量/kg);没有报告副作用，但2名患者形成HAMA。在放射性碘标记的的鼠Mab U36的研究中，存在18名患者中的3个HAMA案例和HNSCC中的选择性同源吸收。为了减小Mab U36的抗原性和减少HAMA率，构建嵌合抗体。嵌合或原始鼠Mab U36均不具有ADCC活性。不存在关于Mab U36的天然功能活性的证据。使用186Re标记的嵌合Mab U36确定Mab U36作为治疗剂的效用。在该第一阶段逐步增加剂量实验中，13名患者接受跟踪剂量的99mTc标记的嵌合Mab U36，随后是186Re标记的嵌合Mab U36。没有报告急性有害事件，但是处理后，在3名患者中的2名中观察到剂量限制性骨髓毒性(myelotoxcity) (1.5 GBq/m2),且在I名受最大耐受剂量(1.0 GBq/m2)处理的患者中观察到血小板减少症。尽管对肿瘤尺寸存在一些影响，但是这些影响达不到对处理的客观反应的标准。关于186Re标记的嵌合Mab U36的进一步研究使用利用粒细胞集落刺激因子刺激的全血再灌输的策略，从而将最大耐受活性加倍到2.8 Gy0在该关于9名患有不同头颈肿瘤的患者的研究中，3名由于与药物有关的贫血而需要输血。其他毒性包括3级骨髓毒性和2级粘膜炎。没有报告客观肿瘤反应，尽管在5名患者中获得稳定疾病3-5个月。因此，可以看到，尽管Mab U36是高度特异性的抗体，但是需要放射性免疫缀合物还实现抗癌作用的缺点限制其有效性，因为获得与涉及临床作用的治疗有关的毒性。总而言之，CD44v6(l.1ASML)和CD44vlO (K926)单克隆抗体分别在注射了转移型胰腺腺癌的大鼠或注射了恶性黑素瘤的小鼠中显示出了降低的转移活性。另一种抗CD44v6抗体(VFF-18及其衍生物)，只有在与美登木素生物碱或放射性同位素缀合时，显示出具有抗肿瘤作用。抗标准CD44单克隆抗体也表现出抑制大鼠成胶质细胞瘤的大脑内进展(抗⑶44)，小鼠T细胞淋巴瘤的淋巴结侵入(1M-7.8.1)以及抑制人卵巢癌细胞系植入裸鼠(克隆515)，小鼠黑素瘤细胞系的肺转移(IM-7.8.1)和人黑素瘤细胞系在SCID小鼠中的转移(GKW.A3)。放射性同位素缀合的Mab U36抗CD44v6抗体及其衍生物在临床实验中具有抗肿瘤活性，其伴随显著的毒性。这些结果，尽管鼓励和支持抗CD44单克隆抗体作为潜在的癌症治疗法的开发，但是证明了有限的效力、安全性、或对人类癌症的适用性。因此，如果分离 一种介导癌细胞细胞毒性的抗体组合物，其CD44在所述细胞上的细胞表面表达的功能作为其吸引力，则将实现有价值的诊断和治疗方法。作为癌症治疗的单克隆抗体:患有癌症的每个个体都是独特的，并且患有与其它癌症不同的癌症，正如个人的身份一样。除此之外，目前的治疗法以相同的方法治疗患有同种类型的癌症、处于相同的阶段的所有患者。这些患者中至少有30%将在一线治疗中失败，由此导致以后几轮的治疗和治疗失败、转移、以及最终死亡的增加的可能性。较好的治疗方法应该是对于特定的个体量身定制的治疗法。目前本身适于量身定制的唯一的治疗法是手术。化疗和放射治疗不能对患者进行量身定做，并且手术本身在大部分情形中不足以产生治愈。随着单克隆抗体的出现，由于每种抗体可以针对单个表位，则开发量身定制的治疗法的方法的可能性变得更加现实。此外,产生针对独特限定特定个体的肿瘤的表位群的抗体组合也是可能的。已经认识到在癌症细胞和正常细胞之间的显著不同是在于癌症细胞包含对转化的细胞特异的抗原，科学团体长期认为单克隆抗体可以设计成通过特异性与这些癌症抗原结合而特异性靶向转化的细胞；因此产生这样的信心:单克隆抗体可以作为“魔力子弹(Magic Bullets)”来消除癌细胞。然而，现在广泛认识到，没有任何一种单个的单克隆抗体可以在所有癌症情形中起作用，并且单克隆抗体可以被开发为一类作为靶向癌症治疗。已经表明按照本文公开的发明的教导分离的单克隆抗体以有益于患者的方式减轻癌性疾病过程，例如通过减少肿瘤负荷的方式，并且在本文中应该不同地称为减轻癌性疾病的抗体(CDMAB)或“抗癌”抗体。目前，癌症患者通常具有很少的治疗选择。对癌症治疗法的管理方法已经在全球存活和发病率中产生了改善。然而，对于特定的个体，这些改善的统计学没有与他们个人情况的改善必然相关。因此，如果采用能够使执业者独立于处于同一团体中的其他患者而治疗每种肿瘤的方法，这将允许产生仅使治疗适合该名个体的独特方法。这样的治疗疗程将理想地增加治愈率，并且产生更好的结果，由此满足长期渴望的需要。历史上，多克隆抗体已经进行了应用，在治疗人类癌症中具有有限的成功。已经使用人血浆治疗淋巴瘤和白血病，但是存在很少延长的好转或反应。此外，与化疗相比，缺少再现性，并且没有其它的益处。实体瘤诸如乳腺癌、黑素瘤和肾细胞癌也已经使用人血液、黑猩猩血清、人血浆和马血清进行治疗，具有相对不可预知的和无效的结果。对于实体瘤，已经存在单克隆抗体的许多临床试验。在20世纪80年代，对于人乳腺癌存在至少4种临床试验，其使用针对特异抗原的抗体或基于组织选择性，在至少47名患者中仅产生一名响应者。直到1998年才出现使用人源化的抗Her2/neu抗体(Herceptin”e)与顺钼组合的成功的临床试验。在该试验中，评估37名患者的响应,其中约
四分之一具有部分响应率，另外四分之一具有较小或稳定的疾病发展。在所述响应者中对发展的中值时间是8.4个月，中值响应持续5.3个月。Herceptin 在1998年首次核准与Taxof组合用于一线应用。临床研究结果显示，与仅接受Taxol 的组(3.0个月)相比，对于接受抗体治疗加Taxd 的那些的疾病发展的中值时间(6.9个月)增加。在中值存活中也存在稍微的增加；对于Herceptin_;il加Taxol 治疗组相对于单独的Taxdi^S疗组为22个月相对于18个月。另外，与单独的Taxol 相比较，在抗体加Taxof1组合组中，在完全(8%相对于2% )和部分响应者(34%相对于15%)的数量中存在增加。然而，与单独的了ax()i 治疗相比较,用Herceptin 和Taxol 治疗导致更高的心脏中毒的发生(分别为13%相对于1% )。此外，Herceptir^g疗法只对过量表达(通过免疫组化(IHC)分析确定)人表皮生长因子受体2(Her2/neu)的患者，患有转移乳腺癌的患者的大约25%中有效；所述人表皮生长因子受体2是一种受体，其目前具有未知的功能或生物学重要的配体。因此，对于患有乳腺癌的患者仍然存在大量未满足的需求。即使可以受益于Herceptin 治疗的那些仍然需要化疗，并且因此仍然必须处理，至少在某种程度上，处理这种治疗的副作用。研究结肠直肠癌的临床试验包括针对糖蛋白和糖脂靶点的抗体。抗体如17-1A，其对于腺癌具有某种特异性，已经在六十多名患者中进行了 2期临床试验，仅有I名患者具有部分响应。在其它试验中，在使用额外的环 磷酰胺的方案中，使用17-1A在52名患者中仅产生I例完全响应和2例较小的响应。迄今为止，17-1A的III期临床试验尚未表现出作为III期结肠癌的辅助治疗的提高的功效。最初核准用于成像的人源化鼠单克隆抗体的应用也没有产生肿瘤衰减。仅在最近，使用单克隆抗体的结肠直肠癌临床研究产生了一些积极的结果。在2004年，ERBITUX 核准用于患有表达EGFR的转移结肠直肠癌的患者的二线治疗，所述患者对基于伊立替康的化疗不起反应(refractory)。来自两组(two-arm) II期临床研究和单组研究的结果表明，ERBITUX 与伊立替康组合分别具有23%和15%的响应率，疾病发展的中值时间分别为4.1个月和6.5个月。来自同一两组II期临床研究和另一单组研究的结果表明，仅用ERBIIUX 治疗分别导致11%和9%的响应率，疾病发展的中值时间分别为1.5个月和4.2个月。因此，在瑞士和美国，ERBITUX 与伊立替康组合治疗，并且在美国，单独的ERB1TIJX 治疗，已经被核准作为在一线伊立替康治疗中失败的结肠癌患者的二线治疗。因此，如同Herceptin ，在瑞士只核准治疗作为单克隆抗体和化疗的组合。另外，在瑞士和美国只核准治疗作为二线治疗用于患者。此外，在2004年，AVASTIN 被核准与静脉内基于5-氟尿嘧啶的化疗组合用作转移性结肠直肠癌的一线治疗。III期临床研究结果表现出与仅用5-氟尿嘧啶治疗的患者相比，用AVASTIN 加5-氟尿嘧啶治疗的患者的中值存活延长(分别为20个月相对于16个月)。然而，同样如同Herceptin 和ERBITUX ，治疗仅被核准作为单克隆抗体和化疗的组合。对于肺癌、脑癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌还继续存在极差的结果。对于非小细胞肺癌的最有希望的最近的结果来自II期临床试验，其中治疗包括与杀细胞药多柔比星缀合的单克隆抗体(SGN-15 ；dox-BR96,抗-唾液酸(sialyl)-LeX)，其与化疗药
TAXOTEREB组合。TAXOTER￡K是唯--种FDA核准的化疗药，用于肺癌的二线治
疗。原始数据显示与单独的TA X OT E R E *相比提高的整体存活时间。在本研究征募的62名患者中，三分之二接 受SGN-15与TAXOTERE18'组合，而其余三分之一接受单独的TAXOTERE'对于接受SGN-15与TAXOTERE 姐合的患者，中值整体存活时间是7.3个月，而与之比较的接受单独的TAXOTERE 的患者是5.9个月。对于接受SNG-15加TAXOTERE 的患者的整体存活时间为I年和18个月的分别为29%和18%，而与之比较的对于接受单独的TAXOTERE 的患者分别为24 %和8 %。计划了进一步的临床试验。临床前，对于黑素瘤使用单克隆抗体已经存在一些有限的成功。这些抗体中很少已经达到临床试验阶段，并且迄今为止没有一种已经被核准或在III期临床试验中表现出有利的结果。治疗疾病的新药的发现受到在30，000种已知的基因产物中缺少相关靶点的鉴定的阻碍，所述30，000种已知的基因可能有助于疾病的发病机理。在肿瘤学研究中，潜在的药物靶点通常由于它们在肿瘤细胞中过量表达的事实来简单地选择。然后筛选这样鉴定的靶点与多种化合物的相互作用。在潜在的抗体治疗的情形中，这些候选化合物通常衍生于根据 Kohler 和 Milstein 所述的基本原理(1975,自然(Nature), 256,495-497, Kohler 和Milstein)的单克隆抗体产生的常规方法。从用抗原(例如，全细胞，细胞级分，纯化的抗原)免疫的小鼠收集脾细胞，并且与无限增殖的杂交瘤配偶体融合。筛选所得到的杂交瘤，并且针对最亲和性地与所述靶点结合的抗体的分泌进行选择。针对癌细胞的许多治疗和诊断抗体，包括Herceptin 和RITUXIMAB，已经使用这些方法产生，并且基于它们的亲和性进
行选择。这种方法中的缺点是两方面的。首先，对治疗或诊断抗体结合选择适当的靶点受到关于组织特异性致癌过程的极少的知识以及用于鉴定这些靶点的所得到的过于单纯化的方法的限制，所述过于单纯化的方法如通过过量表达进行选择。第二，与受体以最大的亲和力结合的药物分子通常具有起始或抑制信号的最大可能性的假设可能不总是这种情形。除了对于乳腺癌和结肠癌的治疗的一些进展之外，作为单一药剂或共同治疗的有效抗体治疗的鉴定和开发对于所有类型的癌症尚是不充足的。现有专利:美国专利号5，750，102公开这样一种方法，其中来自患者肿癌的细胞用MHC基因转染，所述MHC基因可克隆自来自该患者的细胞或组织。然后，使用这些转染的细胞免疫该患者。美国专利号4，861，581公开这样一种方法，所述方法包括下列步骤:获得单克隆抗体，所述单克隆抗体对哺乳动物的肿瘤细胞和正常细胞的内部细胞成分是特异性的，但是对外部成分不是特异性的；标记所述单克隆抗体，使所标记的抗体与已经接受治疗的哺乳动物组织接触以杀死肿瘤细胞；并且通过测量所标记的抗体与退化的肿瘤细胞的内部细胞成分的结合而确定治疗的功效。在制备针对人细胞内抗原的抗体时，专利权所有人认为恶性细胞代表这样的抗原的便利的来源。美国专利号5，171，665提供一种新型抗体以及其生产方法。具体地，该专利教导形成这样的单克隆抗体，所述单克隆抗体具有与人肿瘤例如结肠肿瘤和肺肿瘤相关的蛋白质抗原的那些强结合而与正常细胞以 弱得多的程度结合的性质。美国专利号5，484，596提供一种癌症治疗方法，所述方法包括从人癌症患者手术取出肿瘤组织，处理所述肿瘤组织以获得肿瘤细胞，辐射所述肿瘤细胞以成为存活的但非肿瘤发生性的，并且使用这些细胞制备用于患者的疫苗，所述疫苗能够抑制原发瘤的复发而且同时抑制转移。该专利教导开发与肿瘤细胞的表面抗原反应的单克隆抗体。如在第4栏45行等描述的，专利权所有人在开发用于人肿瘤形成的表达单克隆抗体的活性特异性免疫治疗中使用自生的肿瘤细胞。美国专利号5，693，763教导一种糖蛋白抗原，其是人癌症特有的，并且不依赖于起源的上皮组织。美国专利号5，783，186涉及在表达Her2的细胞中诱导程序性细胞死亡的抗_Her2抗体，产生所述抗体的杂交瘤细胞系，使用所述抗体治疗癌症的方法和包括所述抗体的药物组合物。美国专利号5，849，876描述了用于产生针对黏蛋白抗原的单克隆抗体的新杂交瘤细胞系，所述黏蛋白抗原由肿瘤和非肿瘤组织来源纯化。美国专利号5，869，268涉及产生人淋巴细胞的方法，所述人淋巴细胞产生对目的抗原特异性的抗体，产生单克隆抗体的方法，以及由所述方法产生的单克隆抗体。该专利特别涉及有效用于癌症诊断和治疗的抗-HD人单克隆抗体的生产。美国专利号5，869，045涉及与人癌症细胞反应的抗体、抗体片段、抗体缀合物和单链免疫毒素。这些抗体作用的机制是两面性的，原因在于分子与在人癌症表面上存在的细胞膜抗原反应，并且此外，原因在于所述抗体具有在癌症细胞内部内在化的能力，随后结合，使它们特别有效用于形成抗体-药物和抗体-毒素缀合物。在它们的未修饰形式中，所述抗体还在特定的浓度表现出细胞毒性特征。美国专利号5，780，033公开自体抗体用于肿瘤治疗和预防的应用。然而，这种抗体是来自年老的哺乳动物的抗核自体抗体。在这种情形中，认为该自体抗体是在免疫系统中发现的一种自然抗体类型。因为该自体抗体来自“年老的哺乳动物”，不存在所述自体抗体实际来自被治疗的患者的要求。另外，该专利公开了来自年老的哺乳动物的天然和单克隆抗核自体抗体，和产生单克隆抗核自体抗体的杂交瘤细胞系。美国专利号5，916，561公开抗⑶44基因的变体外显子v6的特异性抗体，VFF-18，及其变体。该抗体是超越比较物抗体的改进，因为其识别人CD44v6变体而非大鼠CD44v6变体。另外，该抗体公开了用于CD44v6表达的诊断测定。关于该抗体没有公开体外或体内功能。
美国专利号5，616，468公开针对含有由人⑶44基因外显子6A编码的序列的合成肽产生的单克隆抗体，Var3.1。具体地,该抗体不结合人0)44的90kD形式且与Hermes-3抗体不同。提供用于检测CD44的v6变体的方法，以及用于基于该抗原来筛选和测定恶性转化的方法。还提供了用于基于在血清中检测该抗原来筛选炎症的方法。美国专利号5，879，898公开结合人⑶44变体6的129bp外显子的特异性抗体，其生成43个氨基酸的肽。单克隆抗体通过许多杂交瘤细胞系产生:MAK〈⑶44>M-1.1.12，MAK〈⑶44>M-2.42.3，MAK〈⑶44>M_4.3.16。该抗体由融合蛋白产生，所述融合蛋白包含新CD44v6氨基酸序列的至少六肽。此外，存在关于检测可以用作癌症诊断的外显子6变体的免疫测定的内容。显著地，没有公开该抗体的体外或体内功能。美国专利号5，942，417公开编码⑶44样多肽的多核苷酸，和利用该多核苷酸及其变体制备重组蛋白的方法。要求保护了针对这些多肽的抗体，然而，不存在具体的实施例且没有保藏分泌所述抗体的克隆。Northern印迹证明该多核苷酸出现在若干组织类型中，但是没有伴随证据显示存在该多核苷酸的翻译和表达。因此，没有这样的证据，即存在针对该多核苷酸的基因产物制备的抗体，这些抗体应该具有体外或体内功能，和它们是否与人癌性疾病相关。美国专利号5，885，575公开与⑶44的变体表位反应的抗体和通过使用该抗体识别该变体的方法。编码该变体的分离的多核苷酸从大鼠细胞分离，且针对该变体的抗体，mAbl.1ASML，识别分子量为120kD，150kD, 180kD，和200kD的蛋白。单克隆抗体1.1ASML的施用延迟大鼠BSp73ASML在同基因大鼠中的生长和转移。显著地，1.1ASML不识别人肿瘤，如其缺乏与LCLC97人大细胞肺癌的反应性所证明地。从LCLC97分离人类同源物，但是没有生成识别该同源物的等价抗体。因此，尽管生成了特异于大鼠CD44的变体的抗体，并显示出影响大鼠肿瘤的生长和转移，但是不存在关于该抗体针对人肿瘤的作用的证据。更明确地，该发明人指出该抗体不识别人类癌症。发明概述本申请利用在U.S.6，180，357专利中教导的生产患者特异的抗癌抗体的方法分离杂交瘤细胞系，所述杂交瘤细胞系编码减轻癌性疾病的单克隆抗体。这些抗体可以针对一种肿瘤特异性制备，并且因此使得癌症治疗的量身定制成为可能。在本申请的情形中，具有杀伤细胞(细胞毒性)或抑制细胞生长(抑制细胞)特性的抗癌抗体在下文中称为细胞毒性的。这些抗体可以用于辅助癌症的分阶段和诊断，并且可以用于治疗肿瘤转移。这些抗体还可以用于通过预防治疗的方式用于预防癌症。与根据传统药物发现样本(paradigm)产生的抗体不同，以这种方式产生的抗体可以靶向这样的分子和途径，所述分子和途径先前没有显示出对于恶性组织的生长和/或存活是必需的。此外，这些抗体的结合亲和力适合起始可能不易受更强的亲和性相互作用影响的细胞毒性事件的需要。此外，将标准化疗形式如放射性核素与本发明的CDMAB缀合也在本发明的范围内，由此集中在所述化疗剂的应用。所述CDMAB也可以与毒素、细胞毒性部分、酶例如生物素缀合的酶、细胞因子、干扰素、靶标或报告部分或造血细胞缀合，由此形成抗体缀合物。所述CDMAB可以单独或与一种或多种CDMAB/化疗剂组合使用。个体化的抗癌治疗的前景将在患者的管理方式中引起改变。可能的临床方案(scenario)是在出现时获得肿瘤样品，并且储存。从该样品，肿瘤可以用一组预先存在的减轻癌性疾病的抗体而确定类型。将患者进行常规分阶段，但是可用的抗体可以用于将患者进一步分阶段。患者可以立即用现有的抗体进行治疗，并且使用本发明描述的方法或通过利用噬菌体展示文库与本发明公开的筛选方法联合，可以产生一组对肿瘤特异性的抗体。由于其它肿瘤可能携带一些与被治疗的肿瘤相同的表位，故将产生的所有抗体加入到抗癌抗体文库中。按照该方法产生的抗体可以有效用于治疗许多患有与这些抗体结合的癌症的患者中的癌性疾病。除了抗癌抗体之外，患者可以选择接受目前推荐的治疗作为多形式治疗方案的一部分。通过本方法分离的抗体对非癌症细胞是相对无毒的事实允许以高剂量使用抗体组合，单独的，或与常规治疗组合。高治疗指数还允许在短时间范围内再次治疗，这应该降低耐受治疗的细胞出现的可能性。 如果患者对初始的治疗疗程没有反应或发展了转移，则可以重二复产生针对肿瘤的特异性抗体的方法，进行再次治疗。此外，所述抗癌抗体可以与从该患者获得的红细胞缀合，并且重新输注用于治疗转移。对于转移癌存在很少有效的治疗，并且转移通常预示着导致死亡的最坏结果。然而，转移癌通常充分地血管化，通过红细胞递送抗癌抗体可以具有将所述抗体集中在肿瘤部位的作用。甚至在转移之前，大部分癌症细胞依赖于宿主的血液供应它们的生存，并且与红细胞缀合的抗癌抗体还可以有效针对原位肿瘤。备选地，所述抗体可以与其它造血细胞缀合，如淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞、天然杀伤细胞等。存在5类抗体，并且每类与由其重链赋予的功能相关。通常认为由裸抗体杀伤癌症细胞通过抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)进行介导。例如，鼠IgM和IgG2a抗体可以通过结合补体系统的C-1成分而激活人补体，由此激活可以导致肿瘤消退的补体激活经典途径。对于人抗体，最有效的补体激活抗体通常是IgM和IgGl。IgG2a和IgG3同种型的鼠抗体有效募集具有Fe受体的细胞毒性细胞，其将导致由单核细胞、巨噬细胞、粒细胞和某些淋巴细胞进行的细胞杀伤。IgGl和IgG3同种型的人抗体介导ADCC。通过Fe区域介导的细胞毒性需要存在效应细胞、其相应受体、或蛋白质，例如NK细胞、T-细胞和补体。在缺乏这些效应子机制的条件下，抗体的Fe部分是无活性的。抗体的Fe部分可以赋予这样的特性，即影响抗体体内药物代谢动力学，但在体外其是无效的。
抗体介导的癌症杀伤的另一种可能的机制可以通过使用催化细胞膜中的不同化学键的水解的抗体以及其相关的糖蛋白或糖脂，即所谓的催化抗体进行。存在3种抗体-介导的癌症细胞杀伤的其它机制。第一种是使用抗体作为疫苗来诱导机体产生针对存在于癌症细胞上的推定的抗原的免疫反应。第二种是使用这样的抗体，所述抗体靶向生长受体，并且干扰它们的功能，或下调所述受体，以致有效地丧失其功能。第三种是所述抗体对细胞表面部分的直接连接的作用，所述细胞表面部分的直接连接可能导致直接的细胞死亡，诸如死亡受体如TRAIL Rl或TRAIL R2的连接，或整联蛋白分子如α νβ3的连接等。癌症药物的临床应用基于所述药物在对患者的可接受的危险模式下的益处。在癌症治疗中，通常是在益处之后最追求生存，然而，除了延长生命之外，还存在许多其它公认的益处。这些其它的益处，其中治疗没有不利地影响生存，包括症状减轻，针对不利事件的保护，复发时间的延长或没有疾病的生存，并且延长发展的时间。这些标准通常被接受，并且管理团体如美国食品及药品管理局(F.D.A.)核准产生这些益处的药物(Hirschfeld等.肿瘤学 / 血液学的重要综述(Critical Reviews in Oncology/Hematolgy) 42:137-143 2002)。除了这些标准之外，公认还存在其它的可以预示这些类型的益处的终点(endpoint)。部分地，由美国F.D.A.授予的加速的核准流程承认存在可能预测患者益处的替代品。到2003年年末，在这种流程下已经核准了 16种药物，并且这些中有4种已经继续获得了完全的核准，即，随后的研究已经表明由替代品终点预测的直接的患者益处。确定药物在实体瘤中的作用的一个重要的终点是通过测量针对治疗的响应而评估肿瘤负荷(Therrasse等国家癌症研究所杂志(Journal of the National CancerInstitute) 92 (3):205-2162000)。关于所述评估的临床标准(RECIST标准)已由癌症国际专家组实体瘤工作组的响应评估标准公布。与适当的对照组相比较，对肿瘤负荷具有证明的作用的药物，如由RECIST标准所述的目标响应所示,最终倾向于产生直接的患者益处。在临床前设定中，肿瘤负荷通常更直接进行评估和记录。因为临床前研究可以转换成临床设定，在临床前模型中产生延长的生存的药物具有最大的预测临床用途。与产生针对临床治疗的积极响应类似，在临床前设定中减少肿瘤负荷的药物还可能对疾病具有显著的直接影响。尽管延长生存是在癌症药物治疗的临床结果后最追求的，但是存在其它的益处，其具有临床应用，并且清楚 地，可能与疾病发展的延迟、延长的生存或二者相关的肿瘤负荷减少还可以导致直接的益处和具有临床影响(Eckhardt等.发展的治疗学:目标化合物的临床试验设计的成功与失败(Developmental Therapeutics !Successes and Failures ofClinical Trial Designs of Targeted Compounds) ;ASC0 教育书，第 39 次年会,2003,第209-219 页)。充分利用U.S.6，180，357的方法，在用来自患者肺肿瘤活检组织的细胞和NC1-H460肺癌细胞系免疫小鼠后，获得小鼠单克隆抗体，H460-16-2。H460-16-2抗原在来自不同组织来源的广泛范围的人细胞系的细胞表面上表达。乳腺癌细胞系MDA-MB-231和皮肤癌细胞系A2058在体外易受H460-16-2的细胞毒性作用的影响。H460-16-2在培养物中针对MDA_MB_231细胞的细胞毒性的结果通过其在植入小鼠时针对这些癌细胞的抗肿瘤活性得到进一步扩展(如S.N.10/603, 000中公开地)。临床前异种移植肿瘤模型被认为是治疗功效的有效预测因子。
在人乳腺癌的预防性体内模型中，H460-16-2处理比同种型对照抗体显著(p
<0.0001)更有效地抑制处理过程中的肿瘤生长。在处理期结束时，给药H460-16-2的小鼠具有仅生长到对照组的1.3%的肿瘤。在处理后的后续时期内，H460-16-2的处理作用持续并且处理组中的平均肿瘤体积继续显著小于对照，直到测量期结束。利用存活率作为抗体功效的测量，评估了 H460-16-2处理组中的死亡风险在处理后70天时，为抗体缓冲液对照组的约71% (P = 0.028)。这些数据证明H460-16-2处理与对照处理组织相比，赋予存活益处。H460-16-2处理似乎是安全的，因为其不诱导任何毒性迹象，包括减少的体重和临床不适。因此，H460-16-2处理是有效的，因为其在充分确定的人乳腺癌模型中，与对照处理组相比，延迟肿瘤生长并提高存活率。另外，H460-16-2在确定的体内肿瘤模型中证明了针对MDA_MB_231细胞的抗肿瘤活性(如S.N.10/603, 000公开地)。用H460-16-2的处理与标准化学治疗药物顺钼进行相比较，且显示出顺钼和H460-16-2处理组与用抗体稀释缓冲液或同种型对照抗体处理的组相比,具有显著(P < 0.001)更小的平均肿瘤体积。H460-16-2处理介导是顺钼化学疗法的约2/3的肿瘤抑制，但是无显著的(19.2% )体重减少(P < 0.003)和临床不适，包括关于顺钼处理观察到的2件与处理有关的死亡。H460-16-2的抗肿瘤活性及其最小毒性使其成为引人注目的抗癌治疗剂。另外，在处理后的期间，H460-16-2显示出显著的存活益处(P <0.02)，因为在处理后> 70天时，H460-16-2组中的死亡风险是同种型对照抗体组中的死亡风险的约一半。观察到的存活益处在处理后持续超过120天，在那时，与H460-16-2处理组的67%相t匕，100%的同种型对照和顺钼处理的小鼠已经死亡。H460-16-2通过与同种型对照抗体组相比延迟肿瘤生长26%，来维持肿瘤抑制。在处理后31天时，H460-16-2通过与同种型对照组相比减少肿瘤生长48%，来限制肿瘤尺寸，这与在处理结束时观察到的49%的减少相当。在确定的乳腺癌肿瘤模型中，这些结果说明了 H460-16-2超过处理期维持肿瘤抑制的潜力，并证明了该抗体在哺乳动物中减少肿瘤负担和提高存活率的能力。除在确定的乳腺癌体内肿瘤模型中的有益`作用外，H460-16-2处理与化学疗法药物(顺钼)的组合在确定的体内前列腺癌模型中具有针对PC-3细胞的抗肿瘤活性(如S.N.10/810, 165中公开地)。利用配对t_检验，H460-16-2加顺钼处理在处理期后立即比缓冲液对照(P < 0.0001)、单独的顺钼处理(P = 0.004)或单独的H460-16-2处理(p
<0.0001)显著更有效抑制肿瘤生长。在处理期结束时，给药H460-16-2加顺钼的小鼠具有仅生长至缓冲液对照组的28.5%的肿瘤。对于PC-3SCID异种移植模型，体重可以用作疾病进展的替代指示物。所有组中的小鼠都经历了严重体重减轻。在该研究中，所有组中的小鼠在处理期结束时都显示出约23-35%的体重减轻。用H460-16-2处理的组表现出最小程度的体重减轻(21.7% )0处理后，第48天，与缓冲液对照相比，不存在与H460-16-2和顺钼处理有关的体重减轻的显著增加(P = 0.5042)。因此，在充分确定的人前列腺癌模型中，H460-16-2加顺钼处理是有效的，因为其与同种型对照处理组相比延迟了肿瘤生长。
为了确认H460-16-2表位作为药物靶标，先前确定了 Η460_16_2抗原在正常人组织中的表达(S.N.10/603, 000) 0该工作通过比较抗CD44抗体；克隆L178(在S.N.10/647，818，现在的美国专利7，189，397中公开)和克隆BU75 (在S.N.10/810，165中公开)得到扩展。通过用H460-16-2染色IHC，大部分组织未能表达H460-16-2抗原，包括生命器官诸如肝、肾(除管状上皮细胞的边缘染色外)、心脏、和肺的细胞。来自组织染色的结果说明H460-16-2显示出与多种细胞类型的有限结合，但是具有与浸润巨噬细胞、淋巴细胞、和成纤维细胞的结合。BU75抗体显示出类似的染色模型。然而，存在至少一种值得注意的差别；与H460-16-2相比，BU75染色淋巴细胞更强烈。定位H460-16-2抗原和确定其在人群中，诸如乳腺癌患者中的普遍性，对于评估H460-16-2的治疗应用和设计有效的临床实验非常重要。为了解决H460-16-2抗原在来自癌症患者的乳腺肿瘤中的表达，先前对来自50名个体乳腺癌患者的肿瘤组织样品进行筛选H460-16-2抗原的表达(S.N.10/603, 000)并与L178(S.N.10/647，818，现在的美国专利7，189，397)，BU75 (S.N.10/810，165)和抗 Her2 抗体 c-erbB-2 (S.N.10/810，165)比较。这些研究的结果是类似的且显示出62%组织样品关于H460-16-2抗原阳性染色，而73%的乳腺肿瘤组织关于BU75表位是阳性。H460-16-2在患者样品内的表达似乎特异于癌症细胞，因为染色局限于恶性肿瘤细胞。H460-16-2染色来自乳腺癌患者的10份正常组织样品中4份，而BU75染色8份。H460-16-2和BU75抗原的乳腺肿瘤表达似乎主要位于恶性肿瘤细胞的细胞膜，这使得⑶44成为引人注目的治疗靶标。H460-16-2表达进一步基于激素雌激素和孕酮受体的乳腺肿瘤表达来评估，其在乳腺肿瘤的发育、治疗和预后中扮演重要角色。在H460-16-2抗原表达和雌激素或孕酮受体表达之间相关性不明显。当基于其阶段或癌症进展的程度分析肿瘤时，H460-16-2抗原表达和肿瘤期之间同样不存在明显的相关性。关于BU75获得类似的结果。在与c-erbB-2的比较中，H460-16-2表现出完全不同的染色特征，其中52%的关于H460-16-2抗原阳性的乳腺肿瘤组织样品关于Her2表达是阴性的，这说明尚未满足关于乳腺癌患者的靶向治疗需要。关于H460-16-2和Her2 二者都是阳性的乳腺肿瘤组织切片之间也存在染色强度的差别。c-erbB-2抗体也阳性染色正常乳腺组织切片之一。进一步定位H460-16-2抗原和确定其在人群中，诸如前列腺癌患者中的普遍性，公开在S.N.11/364，013中。抗体与53份人前列腺肿瘤和3份正常前列腺组织的结合利用人前列腺正常和肿瘤组织微阵列(Imgenex，圣地亚哥，CA)进行。如S.N.11/364,013中公开地，19/53(36% )的接受 测试肿瘤关于H460-16-2是阳性的。H460-16-2特异于肿瘤细胞和基质成纤维细胞。细胞定位主要在膜和细胞质膜，具有或不具有内腔定位。阳性细胞的百分比在< 10% - > 50%范围内，这说明该抗体与肿瘤细胞的异源结合。不能适当地评估抗体结合与肿瘤期的关系，这归因于不同肿瘤期中肿瘤数量的差异，即肿瘤I，II，III和 IV 期分别为 1/1(100% ),4/12(33% ),0/2(0% )和 11/33(33% )。对 Gleason 分数G3-G4(36%)存在比对Gl-G2(25%)更高度的结合。全部3份正常前列腺组织切片对该抗体是阳性的。然而，组织特异性是关于肌上皮和基质成纤维细胞的并且提供(spared)给腺上皮。存在H460-16-2与测试前列腺肿瘤结合的不均匀性:10/53，6/53，3/53阳性肿瘤分别在< 10-10%，< 50-50%和>50%分类中。作为其与前列腺癌细胞结合的结果，H460-16-2的治疗益处可以潜在地扩展到治疗前列腺癌。进一步定位H460-16-2抗原和确定其在人群，诸如肝癌患者中的普遍性，公开在S.N.11/364，013 中。H460-16-2 抗体显示出与 21/49 (43 % )的测试肝癌，包括 11/37 (30 % )原发性，7/8 (88% )转移性肝细胞癌，1/2(50% )原发性和2/2(100% )转移性胆管癌的结合。该抗体表现出与早期I和II期相比更显著高度结合于晚期肿瘤III和IV期(P =0.03) [I 期，0/2 (O % ) ；II 期，2/17 (12 % ) ；III 期，8/16 (50 % )和 IV 期，6/8 (75 % )] H460-16-2特异于肿瘤细胞和浸润炎性细胞。细胞定位主要在膜。一些肿瘤还展现出扩散性细胞质染色模式。该抗体结合9/9的非肿瘤肝组织。然而，结合局限于窦状细胞和浸润淋巴细胞。H460-16-2抗原似乎特异性表达在晚期肝肿瘤组织上。H460-16-2因此具有作为肝癌治疗中的治疗药物的潜力。为了进一步扩展H460-16-2的潜在治疗益处，先前还确定了该抗原在多种人癌组织中的频率和定位(S.N.10/603，000)并与克隆L178相比较(S.N.10/647，818，现在的美国专利7，189，397)。这些肿瘤类型中的大部分关于L178抗原也是阳性的。如关于人乳腺肿瘤组织，H460-16-2和L178定位发生在肿瘤细胞的膜上。然而，与H460-16-2抗体相比，关于L178存在充分更多的膜定位。而且，在用H460-16-2和L178 二者染色的肿瘤类型中，43%的组织显示出关于L178抗体的更高强度的染色。基于与来自文献中的IHC数据相比较，似乎不存在严格匹配本文中存在的IHC数据的⑶44形式。⑶44的标准形式通常表达在人脑内；H460-16-2抗原却不然。针对pan-CD44同种型的抗体不染色肝(包括Kuppfer细胞)并在生殖周期的所有阶段阳性染色子宫内膜腺体。H460-16-2抗原清楚地存在于Kuppfer细胞上并仅存在于生殖周期的分泌性子宫内膜腺体上。H460-16-2抗原清楚地存在于组织巨噬细胞上且只有变体形式V4/5和V8/9显示出偶然的巨噬细胞染色。与抗⑶44L178和现在的BU75相比，对H460-16-2观察到的类似但不同的结合模式说明H460-16-2抗原是CD44的独特表位。如先前公开地(S.N.10/647，818，现在的美国专利7，189，397)，另外的生物化学数据还说明由H460-16-2识别的抗原是一种形式的⑶44。这得到这样的研究的支持，所述研究显示针对⑶44反应的单克隆抗体(L178)通过免疫沉淀识别与H460-16-2结合的蛋白。Western印迹研究还提示由H460-16-2识别的⑶44表位不存在于v6或vlO上。H460-16-2表位还以碳水化合物和构象依赖性作为特征，而许多抗CD44抗体针对CD44的肽部分。这些IHC和生物化学结果证明H460-16-2结合⑶44抗原的变体。因此，占优势的证据显示H460-16-2通过连接⑶44变体上存在的独特碳水化合物依赖性构象表位而介导抗癌作用。为了本发明的目的，所述表位定义为“CD44的抗原性部分”，其特征在于其结合由杂交瘤细胞系H460-16-2编码的单克降抗体，其抗原性结合片段，其抗原性结合配体或其抗体缀合物的能力。为了进一步说明H460-16- 2抗癌作用背后的机制，进行了透明质酸(HA)结合测定(如S.N.10/810, 165中所公开地)。确定了以50%抑制MDA-MB-231细胞与HA附着需要平均浓度为1.87(+/-1.01)微克/ml的H460-16-2。这些结果说明H460-16-2与，至少部分地，⑶44上负责结合HA的区域相互作用并因此可以通过下调血管发生或肿瘤侵入ECM而介导其抗癌作用。除HA结合测定外，进行细胞周期实验，以确定H460-16-2的体外和体内抗癌作用是否归因于细胞周期的调节(如S.N.10/810, 165中公开地)。24小时和使用20微克/mLH460-16-2后，与同种型对照相比，MDA-MB-231凋亡细胞的数量增多。该作用还似乎是剂量依赖性的。因此，H460-16-2的功效还可以归因于，全部或部分地，其凋亡诱导能力。为了进一步说明H460-16-2作用的机制，当乳腺癌异种移植模型中体内生长的MDA-MB-231 肿瘤凋亡时，进行 H460-16-2 处理(如 S.N.11/364，013 中公开地)。ApoTag染色的肿瘤的连续切片随后进行H & E染色并且利用形态学标准诸如单细胞缺失、细胞收缩和染色质压缩为密质(dense mass)来检测这些的凋亡细胞。如以上部分所述进行达到这些标准的细胞的计数，以提供处理组的平均计数。缓冲液对照组产生平均总分17个细胞(±5.29);而H460-16-2处理组产生平均总分22.5个细胞(±4.201)。因此，如利用细胞形态学所确定地，存在使用H460-16-2处理增加凋亡的趋势。为了促进抗体嵌合物的产生，分别克隆和测序编码重链和轻链可变区的基因(如S.N.11/364，013中公开地)。然后构建和表达人IgGl和IgG2同种型的H460-16-2嵌合轻链和重链(如S.N.11/364，013中公开地)。为了确定嵌合对比鼠抗体的相对功效，进行人乳腺癌的体内模型(如
S.N.11/364，013 中公开地)。鼠 H460-16-2 和(ch) ARH460-16-2_IgGl 在确立的(established)人乳腺癌MDA_MB_231体内模型中减少肿瘤生长。在第62天，即施用最后的剂量后5天时，使用H460-16-2处理导致肿瘤生长抑制39% (平均T/C = 57% )。该肿瘤生长的减少显著区别于对照(P = 0.0037)。嵌合抗体(ch)ARH460-16-2-1gGl导致增强肿瘤生长抑制64% (平均T/C = 26.9% ;p < 0.0001)。相反，嵌合抗体的IgG2形式，(ch)ARH460-16-2-1gG2与缓冲液对照相比，没有显示出肿瘤生长抑制(肿瘤生长抑制=0%;平均T/C = 122% ；p = 0.7264)。贯 穿研究过程不存在毒性临床迹象。总之，在MDA-MB-231乳腺癌模型中，(ch)ARH460-16-2-1gGl证明了与鼠抗体相比相同或更高的功效。先前进行了膜联蛋白-V染色(如S.N.11/364，013中公开地)，以确定H460-16-2的嵌合形式是否能够以与MDA-MB-231人乳腺癌细胞系上的鼠负体相同的方式诱导凋亡。所有3种抗体显示出坏死和坏死/凋亡总数对比其预期同种型对照百分比的剂量依赖性增力口。关于(ch)ARH460-16-2-1gG2，然后(ch) ARH460-16-2_IgGl 和然后 H460-16-2 观察到坏死和坏死/凋亡总数百分比的最大增加。总之，该数据证明H460-16-2抗原是癌症相关的抗原并表达在人中，且是病理学相关癌症靶标。此外，该数据还证明H460-16-2抗体与人癌症组织的结合，并且可以合适地用于诊断、疗法预测、或预后测定。另外，该抗原的细胞膜定位是细胞癌症状态的指示，这是因为大部分非恶性肿瘤细胞中缺乏抗原的表达，且该观察结果允许该抗原，其基因或衍生物，其蛋白质或其变体用于可以是诊断、疗法预测、或预后测定的应用。其他研究，包括抗⑶44抗体的应用，具有不是由H460-16-2表现出的治疗潜力的局限性。H460-16-2证明了体外和体内抗肿瘤活性。先前描述的抗体诸如MAK〈CD44>M-1.1.12，MAK〈CD44>M_2 .423 和 MAK〈CD44>M_4.3.16 不具有归于它们的体外或体内细胞毒性，且VFF-18和Mab U36不显示固有的肿瘤细胞毒性。另外，其他表现出了体内肿瘤作用的抗⑶44抗体也具有某些对于H460-16-2不明显的局限性。例如，ASML1.1，K926，抗CD44和頂_78.1显示出针对分别在异种移植模型中生长的大鼠、鼠科、大鼠和鼠科肿瘤的体内抗肿瘤活性。H460-16-2在人癌症模型中证明了抗肿瘤活性。H460-16-2还针对人⑶44，而抗体诸如ASML1.1仅识别大鼠⑶44。克隆515抗⑶44抗体的确抑制人卵巢细胞系的腹膜肿瘤植入但不阻止或抑制肿瘤生长。H460-16-2能够在SCID小鼠异种移植模型中抑制人乳腺肿瘤生长。GKW.A3是抗人CD44单克隆抗体，其能够抑制在小鼠中生长的人转移性黑素瘤在预防性而非确立的模型中的肿瘤生长。H460-16-2证明了在人乳腺癌的预防性和确立的鼠异种移植模型中的显著抗肿瘤活性。因此，非常明显地，与先前描述的抗⑶44抗体相比，H460-16-2具有较高的抗肿瘤特性。证明了在SCID小鼠中对人乳腺肿瘤的体外和体内抗肿瘤活性和针对人CD44。还显示了在人乳腺癌的预防性和确立的(更临床相关的)模型中的活性且显示了在人前列腺癌的确立的模型中使用顺钼的活性。本发明描述H460-16-2，其相应的嵌合抗体，(ch)ARH460-16-2_IgGl和(ch)ARH460-16-2 (VKOVHO)，其相应的人源化抗体变体(hu) ARH460-16-2的开发和应用。H460-16-2通过其在患有癌性疾病的哺乳动物中的细胞毒性测定，肿瘤生长模型和在延长存活时间中的作用确定。本发明描述癌症治疗领域中的进步，其中首次描述了特异性结合靶分子，CD44上存在的表位的试剂，所述试剂且还作为裸抗体，具有针对恶性肿瘤细胞而非正常细胞的体外细胞毒性特性，且还作为裸抗体，在人癌症体内模型中直接介导抑制肿瘤生长和存活延长。这与任何其他先前所述的抗CD44抗体相比是一个进步，因为尚没有一个显示出具有类似的特性。其还在该领域中提供进步，因为其清楚地首次证明了 CD44直接参与与某些类型肿瘤生长和发育相关的事件。还代表了癌症治疗中的进步，因为其具有在人患者中展现类似抗癌特性的潜力。另外的进步是将这些抗体包括在抗癌抗体文库中应该通过确定不同抗癌抗体的适当组合提高靶向表达不同抗原标记的肿瘤的可能性，从而发现最有效地靶向和抑制肿瘤的生长和发育。总之，本发明教导了 H460-16-2抗原作为治疗剂靶标的应用，即在施用时，可以减小哺乳动物中表达该抗原的癌症的肿瘤负荷，且还可以导致受处理的哺乳动物延长的存活。本发明还教导 CDMABs (H460-16-2，(ch) ARH460-16-2_IgGl，(ch) ARH460-16-2 (VKOVHO)和变体(hu)ARH460-16-2)，以及它们的衍生物、及其抗原结合片段、和其诱导细胞毒性的配体的应用，其靶向它们的抗原，以减少在哺乳动物中表达所述抗原的癌症的肿瘤负荷并导致受治疗哺乳动物延长的存活。此外，本发明还教导在癌性细胞中检测H460-16-2抗原的应用，所述应用可以有效用于携带表达该抗原的肿瘤的哺乳动物的诊断、治疗预测、和预后。因此，本发明的一个目的是利用制备针对来源于特定个体的癌性细胞或一种或多种特定的癌症细胞系产 生的减轻癌性疾病的抗体(CDMAB)的方法，以分离杂交瘤细胞系，和所述杂交瘤细胞系编码的相对应的分离的单克隆抗体及其抗原结合片段，所述CDMAB对于癌症细胞是细胞毒性的，但是同时对于非癌性细胞相对是无毒的。本发明的另一个目的是教导减轻癌性疾病的抗体，其配体和抗原结合片段。本发明的另一个目的是产生减轻癌性疾病的抗体，其细胞毒性通过抗体依赖性细胞毒作用介导。本发明的另一个目的是产生减轻癌性疾病的抗体，其细胞毒性通过补体依赖性细胞毒作用介导。本发明的另一个目的是产生减轻癌性疾病的抗体，其细胞毒性是它们催化细胞的化学键水解的能力的函数(function)。本发明的另一个目的是产生减轻癌性疾病的抗体，所述抗体有效用于癌症诊断、预后和监测的结合测定。本发明的其它目的和优点将通过下述描述变得清楚，其中通过举例说明和实施例的方式描述本发明的某些实施方案。附图简述
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图1证明在确立的人乳腺MDA-MB-468癌模型中Η460_16_2对肿瘤生长的影响。垂直虚线表示腹膜内施用抗体的时期。数据点表示平均值+/-SEM。图2证明在确立的MDA-MB-468乳腺癌模型中Η460-16-2对小鼠体重的影响。数据点表示平均值+/-SEM。图3证明在确立的人PC-3前列腺癌模型中Η460-16-2对肿瘤生长的影响。垂直虚线表示腹膜内施用抗体的时期。数据点表示平均值+/-SEM。图4证明在确立的PC-3前列腺癌模型中Η460-16-2对小鼠体重的影响。数据点表示平均值+/-SEM。图5证明在确立的人乳腺(MDA-MB-231)癌模型中(ch) ARH460-16-2_IgGl以剂量依赖性方式对肿瘤生长的影响。垂直虚线表示腹膜内施用抗体的时期。数据点表示平均值+/-SEM。图6证明在确立的MDA-MB-231乳腺癌模型中(ch) ARH460-16-2_IgGl对小鼠体重的影响。数据点表示平均值+/-SEM。
图7是H460-16-2结合人结肠肿瘤组织微阵列的概述。图8.使用H460-16-2 (A)或同种型对照抗体(B)获得的结肠肿瘤组织上的结合模式的代表性显微图。放大倍数是200倍。图9是(ch)ARH460-16-2-1gGl结合人和猕猴组织微阵列的概述，其中
图例:PNJN:多形核细胞；Lym:淋巴细胞；Mono:单核细胞；ND:未确定- My: rnLi^Ltes;此9: 民嗤细胞；Mee:巨核细胞；Ery:红细胞；N:祌经元； nuc: 胞核二龍:日质；Ep1:上皮；Gan nuc:祌蕴节nuc:神经令细胞核.! ΚΙΗΙ有色上皮；5C1:远回P管；服:近回旋核；Glom nuc:
Resp: p吸；Oo:卵母却辦；Cytos细胞质；Ecc:外分泌汗腺；
Seb:皮Ife膽；Endo:内皮:Spermato:輪感细胞。图10.在人脾(白髓)(A)和猕猴脾(白髓)(B)上使用(ch)ARH460-16-2-1gGl的结合模式的代表性显微图。观察关于这两种物种的染色。放大倍数是40倍。图11.用不同初级抗体溶液探测的500微克MDA-MB-231膜蛋白的Western印迹。泳道1-5使用分别与2微克/mL，10微克/mL，100微克/mL，500微克/mL或1000微克/mL非生物素化H460-16-2混合的生物素化H460-16-2探测。泳道6_10使用分别与2微克/mL, 10微克/mL，100微克/mL，500微克/mL或1000微克/mL非生物素化AR37A335.8混合的生物素化H460-16-2探测。泳道11-15使用分别与2微克/mL, 10微克/mL, 100微克/mL, 500微克/mL或1000微克/mL非生物素化1B7.11混合的生物素化H460-16-2探测。图12.用不同初级抗体溶液探测的500微克MDA-MB-231膜蛋白的Western印迹。泳道1-5使用分别与2微克/mL，10微克/mL，100微克/mL，500微克/mL或1000微克/mL非生物素化H460-16-2混合的生物素化AR37A335.8探测。泳道6_10使用分别与2微克/mL, 10微克/mL，100微克/mL，500微克/mL或1000微克/mL非生物素化AR37A335.8混合的生物素化AR37A335.8探测。泳道11-15使用分别与2微克/mL, 10微克/mL, 100微克/mL, 500微克/mL或1000微克/mL非生物素化8B1B.1混合的生物素化AR37A335.8探测。
图13.AR37A335.8的结合亲和性。通过表面等离振子共振评估该抗体与纯化的重组人⑶44的结合的解离常数。图14.RTK列表，所述RTK的磷酸化受到用(ch) ARH460-16-2_IgGl处理MDA-MB-231细胞以及随后进行血清和增补剂刺激的影响。图15.轻链PCR扩增中使用的引物(按出现的顺序分别为SEQ ID NOS:10-28)。图16.重链PCR扩增中使用的引物(按出现的顺序分别为SEQ ID NOS:29-44)。图17.小鼠 H460-16-2VH 序列(SEQ ID NO:45)。图18.小鼠 H460-16-2 VL 序列(SEQ ID NO:46)。图19.用于产生嵌合的和变体人源化H460-16-2 VH序列的寡核苷酸(按出现的顺序分别为 SEQ ID NOS :47-58)。图20.用于产生嵌合的和变体人源化H460-16-2 VL序列的寡核苷酸(按出现的顺序分别为 SEQ ID NOS:59-68)。图21.ρΑΝΤ18 表达载体。图22.人源化H460-16-2VH变体(按出现的顺序分别为SEQ ID NOS:7和9)。在CDRs下划线。图23.人源化 H460-16-2VL 变体(SEQ ID NO:8)。在 CDRs 下划线。图24.关于H460-16-2的嵌合和人源化变体的结合数据。图25.鼠 H460-16-2，及其人源化变体，(hu) ARH460-16-2 变体 HV1/KV1 和(hu)ARH460-16-2变体HV2/KV1的结合亲和性。通过表面等离振子共振评估该抗体与纯化的重组人⑶44的结合的解离常数。发明详述一般地，当用于概述、描述、实施例和权利要求中时，下述词语或短语具有所示的定义。术语“抗体”以最宽泛的意义使用，并且特别涵盖，例如，单一的单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂、和中和抗体、去免疫的(de-1mmunized)、鼠、嵌合的或人源化的抗体)，具有多表位特异性的抗体组合物，单链抗体，双抗体，三链抗体，免疫缀合物和抗体片段(见下文)。当用于本发明时，术语“单克降抗体”是指从一群基本上均一的抗体获得的抗体，即，除了可能以较少量存在的天然存在的突变之外，构成(comprising)所述群体的个体抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一的抗原性位点。此外，多克隆抗体制剂包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体，与所述多克隆抗体制剂相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性，因为单克隆抗体可以不被其它抗体污染地合成，所以单克隆抗体是有利的。修饰词“单克隆”表示该抗体的特征是从基本上均一的抗体群体获得，并且不被解释为抗体的生产需要通过任何特定的方法。例如，按照本发明使用的单克隆抗体可以通过由Kohler等，自然(Nature), 256:495(1975)首先描述的杂交瘤(鼠或人)方法制备，或可以通过重组DNA方法(参见，例如，美国专利号4，816，567)制备。“单克隆抗体”还可以从曬菌体抗体文库分离，例如，使用Clackson等，自然(Nature), 352:624-628(1991)和 Marks 等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，222:581-597 (1991)中所述的技术。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选地包括其抗原-结合或可变区。抗体片段的实例包括小于全长的抗体，Fab, Fab’，F(ab’)2，和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；单链抗体，单结构域抗体分子，融合蛋白，重组蛋白和由抗体片段形成的多特异性抗体。“完整的”抗体是一种包括抗原-结合可变区以及轻链恒定结构域(CJ和重链恒定结构域Ch1、Ch2和Cg3的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选地，完整的抗体具有一种或多种效应子功能。取决于它们的重链恒定结构域的氨基酸序列，完整抗体可以指定为不同的“种类”。存在5种主要类别的完整抗体:IgA，IgD, IgE, IgGjP IgM，并且它们中的一些可以进一步分成“亚类”(同种型)，例如，IgGl, IgG2，IgG3，IgG4，IgA,IgA2。与不同种类的抗体相对应的重链恒定结构域分别叫作α，δ，ε，Υ，和μ。不同种类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是公知的。抗体“效应子功能”是指归因于抗体的Fe区(天然序列Fe区或氨基酸序列变体Fe区)的那些生物学活性。抗体效应子功能的实例包括Clq结合；补体依赖性细胞毒性；Fe受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC);吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调，等。“抗体依赖性细胞 介导的细胞毒性”和“ADCC”是指细胞介导的反应，其中表达Fe受体(FcRs)的非特异性细胞毒性细胞(例如，天然杀伤(NK)细胞，嗜中性粒细胞，和巨噬细胞)识别在靶细胞上的结合的抗体，并且随后引起该靶细胞的裂解。介导ADCC的主要细胞，即NK细胞，仅表达Fe Y RIII，而单核细胞表达Fe Y RI，Fe Y RII和Fe Y RIII。FcR在造血细胞上的表达总结在Ravetch和Kinet,免疫学年度综述(Annu.Rev.1mmunol) 9:457-92(1991)的第464页表3中。为了评估目的分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，诸如在美国专利号5，500，362或5，821，337中所述的测定。对于所述测定有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地，或另外地，目的分子的ADCC活性可以在体内进行评估，例如，在动物模型中，诸如在Clynes等PNAS(USA)95:652-656(1998)中公开的动物模型中。“效应细胞”是表达一种或多种FcRs并且执行效应子功能的白细胞。优选地，该细胞至少表达Fe Y RIII并且执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)，天然杀伤(NK)细胞，单核细胞，细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；其中PBMCs和NK细胞是优选的。效应细胞可以从其天然来源分离，例如，从血液或PBMCs分离，如本发明所述。术语“Fe受体”或“FcR”用来描述结合抗体的Fe区的受体。优选的FcR是天然人FcR序列。此外，优选的FcR是一种结合IgG抗体的FcR (Y受体)，并且包括Fe Y RI，Fe YRII，和FcyRIII亚类的受体，包括等位基因变体和这些受体的可变剪接形式。FcyRII受体包括Fe Y RIIA ( “激活受体”)Fe y RIIB ( “抑制受体”)，它们具有主要在它们的细胞质结构域不同的相似的氨基酸序列。激活受体Fe Y RIIA在其细胞质结构域包含免疫受体基于酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受体Fe Y RIIB在其细胞质结构域包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见在Μ.[) οη，免疫学年度综述(Annu.Rev.1mmunol) 15:203-234 (1997)中的综述)。FcRs 在 Ravetch和 Kinet,免疫学年度综述(Annu.Rev.Tmmunol)9:457-92 (1991) ；Capel 等，免疫学方法(Immunomethods)4:25-34(1994)；和de Haas等，实验室临床医学杂志(J.Lab Clin.Med.) 126:330-41 (1995)中综述。其它FcRs，包括将在将来鉴定的那些，包含在本发明的术语“FcR”中。该术语还包括新生儿受体，FcRn,其负责将母亲的IgGs转运到胎儿(Guyer等,免疫学杂志(J.1mmunol.) 117:587 (1976)和 Kim 等，欧洲免疫学杂志(Eur.J.1mmunol.) 24:2429 (1994))。“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在存在补体的条件下分子裂解靶点的能力。补体激活途径通过补体系统的第一成分(Clq)同与同源抗原复合的分子(例如，抗体)的结合而起始。为了评估补体激活，可以进行⑶C测定,例如,如在Gazzano-Santoro等,免疫学方法杂志(J.1mmunol.Methods) 202:163(1996)中所述。术语“可变”是指这样的事实，S卩，在抗体之间，某些可变结构域的部分在序列上大量不同，并且其用于每种特定的抗体对于其特定的抗原的结合和特异性。然而，在抗体的整个可变结构域中可变性不是均匀分布的。它集中在轻链和重链可变结构域内称为高变区的三个片段中。可变结构域的更高度保守的部分称为构架区(FRs)。天然重链和轻链的可变结构域分别包括4个FRs，其主要采取β -折叠构型，通过三个高变区连接，其形成环连接，并且在某些情形中形成β_折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FRs紧密相邻保持在一起，并且与另一条链的高变区一起有助于形成抗体的抗原-结合位点(见Kabat等，免疫学兴趣的蛋白的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第5 版.公共卫生服务(Public Health Service),全国卫生研究所(National Institutesof Health), Bethesda, Md.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合,但是表现出多种效应子功能，诸如在抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)中的抗体参与。当用于本发明时，术语“高变区”是指抗体负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包括来自“互补性决定区”或“⑶R”的氨基酸残基(例如，在轻链可变结构域中的残基24-34 (LI)，50-56 (L2)和89-97 (L3)和在重链可变结构域中的31-35 (Hl)，50-65 (H2)和 95-102 (H3) ;Kabat 等，免疫学兴趣的蛋白的序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest),第 5版.公共卫生服务(Public Health Service),全国卫生研究所(National Instit utes of Health), Bethesda, Md.(1991))和 / 或来自“高变环”的那些残基(例如，在轻链可变结构域中的残基26-32 (LI)，50-52 (L2)和91-96 (L3)和在重链可变结构域中的26-32 (HI), 53-55 (H2)和96-101 (H3) ;Chothia和Lesk，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.) 196:901-917(1987))。“构架区”或“FR”残基是除了如本文所定义的所述高变区残基之外的那些可变结构域残基。木瓜蛋白酶消化抗体产生两种相同的抗原-结合片段，其称为“Fab”片段，每个具有单个抗原-结合位点，和剩余的“Fe”片段，它的名称反应了它容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab’)2片段，其具有两个抗原-结合位点，并且仍然能够交联抗原。“Fv”是包含完整的抗原-识别和抗原-结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密、非共价缔合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成。正是在这种构型中每个可变结构域的三个高变区相互作用，以限定在乂^'二聚体表面上的抗原-结合位点。笼统地，6个高变区赋予抗体的抗原-结合特异性。然而，甚至单个可变结构域(或仅包括对抗原特异的3个高变区的Fv的一半)具有识别和结合抗原的能力，尽管是以比完整的结合位点低的亲和力结合。Fab片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CHI)。Fab’片段不同于Fab片段，其通过在重链CHl结构域的羧基端添加几个残基而不同，所述添加的残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH在本发明中是Fab’的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带至少一个游离的巯基(thiol)基团。？(&13’)2抗体片段最初作为一对Fab’片段产生，其在它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。基于它们的恒定结构域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体的“轻链”可以被指定为两种明显不同的类型中的一种，所述两种明显不同的类型称为Kappa(K)和lambda (λ)。“单链Fv”或“scFv”抗体片段包括抗体的V1^Pt结构域，其中这些结构域存在于单一的多肽链中。优选地，Fv多肽还包括在V1^P'结构域之间的多肽连接体，其使得scFv能够形成用于抗原结合的理想结构。对于scFv的综述,参见Pliickthun,在单克隆抗体的药理学(The Pharmacology of Monoclonal 抗体)中，卷 113, Rosenburg 和 Moore 编，SpringerVerlag,纽约，第 269-315 页(1994)。术语“双抗体”是指具有两个抗原-结合位点的小抗体片段，所述片段包括与在同一多肽链(Vh-VJ中的可变轻链结构域连接的可变重链结构域(Vh)。通过使用太短而不允许在同一条链中的两个结构域之间成对的连接体，迫使所述结构域与另一条链的互补结构域成对，并且产生两个抗原-结合位点。例如，在EP404，097 ；W093/11161 ;和Hollinger 等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA),90:6444-6448(1993)中更充分地描述了双抗体。术语“三链抗体”或“三价三聚体”指三个单链抗体的组合。用 '或Vh结构域的氨基酸末端，即不具有任何连接体序列，构建三链抗体。三链抗体具有三个Fv头部，所述Fv头部具有以头-尾的方式环形排列的多肽。所述三链抗体可能的构象是具有三个结合位点的平面，所述结合位点位于彼此相差120度角的平面上。三链抗体可以是单特异性、双特异性或三特异性的。 “分离的”抗体是一种已经被鉴定并且与其天然环境的成分分离和/或从中回收的抗体。它的天然环境的污染成分是干扰抗体的诊断或治疗应用的物质，并且可以包括酶、激素、和其它蛋白或非蛋白溶质。因为将不存在抗体天然环境的至少一种成分，分离的抗体包括在重组细胞内原位的抗体。然而，一般地，分离的抗体应该通过至少一个纯化步骤制备。与目的抗原，例如CD44抗原“结合”的抗体是一种能够以充足的亲和力结合所述抗原的抗体，以便所述抗体通过靶向表达所述抗原的细胞而有效用作治疗或诊断剂。在所述抗体是一种结合CD44的抗体的情形中，与其它受体相反，它通常优先结合CD44，并且不包括偶然发生的结合，如非特异性Fe接触，或不包括与其它抗原所常见的翻译后修饰结合，并且可以是一种不与其它蛋白显著交叉反应的抗体。用于检测与目的抗原结合的抗体的方法在本领域中是公知的，并且可以包括，但不限于，如FACS、细胞ELISA和蛋白质印迹的测定。当用于本发明时，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换地使用，并且所有这样的名称包括后代。还应该理解，由于故意的或偶然的突变，所有的后代在DNA内容物上可能不是精确相同的。包括在初始转化的细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的突变的后代。这将通过使用不同名称的上下文变得清楚。
“治疗或处理”是指治疗性治疗和预防或预防性措施，其中目的是预防或减缓(减轻)目的病理症状或病症。需要治疗的那些包括已经患有病症的那些，以及倾向于患有病症的那些，或要预防病症的那些。因此，在本发明中待治疗的哺乳动物可以已经诊断患有病症或可以是倾向于或易受病症影响的。术语“癌症”和“癌性的”是指或描述哺乳动物中的生理状况，所述生理状况的典型特征在于失控的细胞生长或死亡。癌症的实例包括，但不限于，癌，淋巴瘤，胚细胞瘤，肉瘤，和白血病或淋巴恶性病。所述癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)，肺癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌，腹膜癌，肝细胞癌，胃癌(gastric or stomach cancer)，包括胃肠癌，胰腺癌，成胶质细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾脏或肾癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝的癌症，肛门癌，阴茎癌，以及头颈癌。
“化疗剂”是有效用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的实例包括烷基化试剂，如塞替哌和环磷酰胺(CYTOXAN );烷基磺酸酯如白消安，英丙舒凡，和哌泊舒凡；吖丙啶类如苯佐替派(benzodopa),卡波醌，美妥替哌(meturedopa),和乌瑞替哌(uredopa)；ethylenimines和methylamelamines,包括六甲蜜胺，曲他胺，三亚乙基磷酰胺，塞替哌(triethyIenethiophosphoramide)和三轻甲蜜胺(trimethy11meIamine)；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥，萘氮芥(chlornaphazine)，cholophosphamide，雌莫司汀，异环磷酰胺，氮芥(mechlorethamine),盐酸氧氮芥,美法仑，新氮芥，苯芥胆甾醇，泼尼莫司汀，曲磷胺，乌拉莫司汀；亚硝基脲(nitrosureas)如卡莫司汀，氯脲菌素，福莫司汀，洛莫司汀，尼莫司汀，雷莫司汀；抗生素如阿克拉霉素(aclacinomysins),放线菌素，authramycin,偶氮丝氨酸，博来霉素，放线菌素 C, calicheamicin, carabicin, carnomycin,嗜癌霉素，色霉素，放线菌素D，柔红霉素，地托比星，6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸,多柔比星，表柔比星，依素比星，伊达比星，马塞罗霉素，丝裂霉素，麦考酚酸，诺拉霉素，橄榄霉素，培洛霉素，potfiromycin,嘌罗霉素，三铁阿霉素，罗多比星，链黑霉素，链佐星，杀结核菌素，乌苯美司，净司他丁，佐柔比星；抗代谢物如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似物如denopterin,甲氨喋呤，喋罗呤,三甲曲沙；嘌呤类似物如氟达拉滨，6-巯嘌呤，thiamiprine，硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨，阿扎胞苷，6-氮尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷，二脱氧尿苷，去氧氟尿苷，依诺他滨，氟尿苷，5-FU，雄激素诸如卡普睾酮，屈他雄酮丙酸盐，环硫雄醇，美雄烧，睾内酯；抗肾上腺药(ant1-adrenals)如氨鲁米特,米托坦，曲洛司坦；叶酸补偿物如frolinic acid ;醋葡醒内酯；轻醒磷酰胺配糖(aldophosphamideglycoside) ;5_ 氨基酮戍酸；安 Π丫唳；bestrabucil ;比生群；依达曲沙(edatraxate)；defofamine ;秋水仙胺；地B丫醌；elformithine ;依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；轻基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁 ；异丙嗪(phenamet);卩比柔比星；鬼臼酸；2_乙基酰肼(2-ethylhydrazide);丙卡巴肼；PSK: ;雷佐生；西佐喃；锗螺胺；细格孢氮杂酸；三亚胺醌；2，2’，2”-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烧；gacytosine ；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替哌；紫杉烷类，例如，紫杉醇(TAXOL ,Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton,新泽西)和多西他赛(IAX.0Ttl.RE ，Aventis, Rhone-Poulenc Rorer, Antony,法国);苯丁酸氮芥；吉西他滨；6_硫鸟喋呤；巯嘌呤；甲氨喋呤；钼类似物如顺钼和卡钼；长春碱；钼；依托泊苷(VP-16);异环磷酰胺；丝裂霉素C ;米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺消灵(novantrone);替尼泊苷；道诺霉素；氨喋呤；适罗达；伊班膦酸盐；CPT-11 ;拓扑异构酶抑制剂RFS2000 ;二氟甲基鸟氨酸(DMFO);视黄酸；esperamicins ;卡培他滨；以及任何上述物质的药用盐、酸或衍生物。下列物质也包含在本定义中，它们是:作用调控或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素药剂，诸如抗雌激素药，包括例如他莫昔芬，雷洛昔芬，抑制4 (5)-咪唑的芳香酶，4-羟基他莫昔芬，曲沃昔芬，keoxifene, LY117018,奥那司酮,和托瑞米芬(Fareston);和抗雄激素药诸如氟他胺，尼鲁米特，比卡鲁胺，亮丙立德，和戈舍瑞林；以及任何上述物质的药用盐、酸或者衍生物。用于治疗目的的“哺乳动物”是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人，小鼠，S CID，或裸鼠或小鼠品系，家畜和农场动物，以及动物园、运动或宠物动物，诸如绵羊、狗、马、猫、牛、等等。在本发明中优选地，所述哺乳动物是人。“寡核苷酸”是长度短的、单链或双链的多聚脱氧核苷酸，其通过已知方法化学合成(如磷酸三酯、亚磷酸酯、或亚磷酰胺化学，使用固相技术，如在1988年5月4日公布的EP266, 032中所述的，或通过脱氧核苷H-磷酸酯中间物,如Froehler等,核酸研究(Nucl。Acids Res.)，14:5399-5407,1986所述)。然后在聚丙烯酰胺凝胶上纯化它们。按照本发明，非人(例如鼠)免疫球蛋白的“人源化的”和/或“嵌合的”形式是指这样的抗体，所述抗体包含特异的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv，Fab，Fab’，F(ab’)2或抗体的其它抗原-结合亚序列)，与原始抗体相比较，其导致人抗_小鼠抗体(HAMA)、人抗-嵌合抗体(HACA)或人抗-人抗体(HAHA)反应的减少，并且所述抗体包含来源于所述非人免疫球蛋白的、对再现所需要的作用是必需的必需部分(例如，一个或多个CDR(S)、抗原结合区、可变结构域等)，同时保留与所述非人免疫球蛋白相当的结合特征。对于大部分，人源化的抗体是这样的人免 疫球蛋白(受体抗体)，其中来自该受体抗体互补性决定区(CDRs)的残基被来自非人物种(供体抗体)CDRs的、具有需要的特异性、亲和性和能力的残基取代，所述非人物种如小鼠、大鼠或兔。在一些情形中，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相对应的非人FR残基取代。此外，所述人源化的抗体可以包括在受体抗体和在所引入的CDR或FR序列中都找不到的残基。进行这些修饰以进一步限定和最优化抗体性能。通常，所述人源化的抗体应该包括基本上不少于至少一个、和典型地两个可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR区与非人免疫球蛋白的那些相对应，并且所有或基本上所有的FR残基是人免疫球蛋白共有序列的那些。所述人源化抗体优化地还应该包括至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，典型地是人免疫球蛋白的恒定区。“去免疫的(De-1mmunized) ”抗体是对于给定的物种是无免疫原性的或较少免疫原性的免疫球蛋白。去免疫可以通过抗体的结构改变实现。可以使用本领域技术人员已知的任何去免疫技术。例如，用于使抗体去免疫性的一种适宜的技术记述在于2000年6月15日公布的WO 00/34317中。 诱导“程序性细胞死亡”的抗体是一种通过任何方式诱导程序性细胞死亡的抗体，所述方式示例而不限于，膜联蛋白V的结合，胱天蛋白酶活性，DNA的片段化，细胞收缩，内质网膨胀，细胞片段化和/或膜囊泡的形成(称为凋亡小体)。当用于本文时，“抗体诱导的细胞 毒性”应该理解为意指这样的细胞毒性作用，所述细胞毒性作用来源于由以保藏号PTA-4621保藏在ATCC的杂交瘤产生的杂交瘤上清或抗体，由以保藏号PTA-4621保藏在ATCC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的人源化抗体，由以保藏号PTA-4621保藏在ATCC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌合抗体，及其抗原结合片段，或抗体配体，所述作用不必与结合程度相关。在整个说明书中，备选地，杂交瘤细胞系以及由其产生的分离的单克隆抗体由它们的内部命名 H460-16-2(鼠)，(ch)ARH460-16-2-1gGl, (ch) ARH460-16-2 (VKOVHO)，(hu)ARH460-16-2 或保藏命名 ATCCPTA-4621 指示。当用于本文时，“抗体-配体”包括这样的部分，所述部分表现出针对靶抗原的至少一个表位的结合特异性，并且其可以是完整的抗体分子、抗体片段、以及至少具有它的抗原-结合区或部分(即，抗体分子的可变部分)的任何分子，例如，Fv分子，Fab分子，Fab’分子，F(ab’)2分子，双特异性抗体，融合蛋白，或特异性识别和结合这样的抗原的至少一个表位的任何遗传工程分子，所述抗原与由命名为ATCC PTA-462KATCC PTA-4621抗原)的杂交瘤细胞系产生的分离的单克隆抗体、由以保藏号PTA-4621保藏在ATCC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的人源化抗体、由以保藏号PTA-4621保藏在ATCC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌合抗体及其抗原结合片段结合。当用于本文时，“减轻癌性疾病的抗体”(CDMAB)是指这样的单克隆抗体及其抗体-配体，所述单克隆抗体以有益于患者的方式减轻癌性疾病过程，例如，通过减少肿瘤负荷或延长肿瘤携带个体的生存的方式。"CDMAB相关结合剂”，以 其广义，理解为包括，但不仅限于，竞争结合于至少一个CDMAB靶表位的任何形式的人或非-人抗体、抗体片段、抗体-配体等。“竞争性结合剂”理解为包括对至少一个CDMAB靶表位具有结合亲和力的任何形式的人或非-人抗体、抗体片段、抗体-配体等。待治疗的肿瘤包括原发肿瘤和转移瘤，以及顽固性肿瘤。顽固性肿瘤包括对使用单独化疗剂、单独抗体、单独辐射或其组合的治疗未能应答或对其具有抗性的肿瘤。顽固性肿瘤还包括表现出受使用所述试剂治疗抑制但停止治疗后至多5年、有时至多10年或更长复发的肿瘤。可以治疗的肿瘤包括未血管化、或尚未充分血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。可以因此治疗的实体肿瘤实例包括乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、神经胶质瘤和淋巴瘤。所述肿瘤的一些实例包括表皮样 肿瘤，鳞状细胞肿瘤，诸如头颈肿瘤，结肠直肠肿瘤，前列腺肿瘤，乳腺肿瘤，肺肿瘤，包括小细胞和非-小细胞肺肿瘤，胰腺肿瘤，甲状腺肿瘤，卵巢肿瘤，和肝肿瘤。其他实例包括卡波西肉瘤、CNS瘤、成神经细胞瘤、毛细血管成血管细胞瘤、脑膜瘤和脑转移瘤、黑素瘤、胃肠癌和肾癌和肉瘤、横纹肌肉瘤、成胶质细胞瘤优选多形性成胶质细胞瘤、和平滑肌肉瘤。当用于本文时，“抗原-结合区”意指分子识别靶抗原的部分。当用于本文时，“竞争性抑制”意指使用常规的交互(reciprocal)抗体竞争测定(Belanger L., Sylvestre C.和Dufour D.(1973),通过竞争性和夹心方法对α胎蛋白的酶联免疫测定(Enzyme linked immunoassay for a fetoprotein by competitive andsandwich procedures).Clinica Chimica Acta 48,15)能够识别和结合这样的决定族位点，所述决定簇位点是由命名为ATCC PTA-4621的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体(ATCCPTA-4621抗体)、由以保藏号PTA-4621保藏在ATCC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的人源化抗体、由以保藏号PTA-4621保藏在ATCC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌合抗体、其抗原结合片段或抗体配体所针对的。当用于本文时，“靶抗原”是ATCC PTA-4621抗原或其部分。当用于本文时，“免疫缀合物”意指与细胞毒素、放射性试剂、细胞因子、干扰素、靶标或报告部分、酶、毒素、抗肿瘤药或治疗药剂化学或生物学连接的任何分子或CDMAB,如抗体。所述抗体或CDMAB可以在分子的任何位置处与所述细胞毒素、放射性试剂、细胞因子、干扰素、靶标或报告部分、酶、毒素、抗肿瘤药或治疗药物连接，只要它能够结合其靶点。免疫缀合物的实例包括抗体毒素化学缀合物和抗体-毒素融合蛋白。适合于用作抗-肿瘤试剂的放射性试剂是本领域中那些技术人员已知的。例如，使用1311或211At。利用常规技术使这些同位素附着于抗体(例如Pedley等，英国癌症杂志(Br.J.Cancer) 68，69-73 (1993))。备选地，附着于抗体的抗-肿瘤试剂是活化前体药物的酶。可以施用这样的前体药物，所述前体药物保持其失活形式直到其到达肿瘤位点，一旦施用抗体复合物所述前体药物在该位点处转化为其细胞毒素形式。实际上，将抗体-酶缀合物施用于患者并容许定位在待治疗的组织区域。然后将前体药物施用于患者，从而使向细胞毒性药物的转化发生在待治疗组织区域中。备选地，与抗体缀合的抗-肿瘤试剂是细胞因子，诸如白细胞介素-2(IL_2)、白细胞介素-4(IL_4)或肿瘤坏死因子a (TNF-α )。所述抗体靶向针对肿瘤的细胞因子，以使得细胞因子在不影响其他组织的条件下介导针对肿瘤的损伤或破坏。利用常规重组DNA技术使细胞因子在DNA水平上与抗体融合。还可以使用干扰素。当用于本文时，“融合蛋白”意指任何嵌合蛋白，其中抗原结合区与生物活性分子如毒素、酶、荧光蛋白 、发光标记、多肽标记物、细胞因子、干扰素、靶标或报告部分或蛋白药物连接。本发明还预期本发明的CDMAB，靶标或报告部分与所述CDMAB相连接。靶标部分是结合对的第一个成员。抗-肿瘤试剂，例如，与所述对的第二个成员缀合，且由此针对抗原-结合蛋白结合的位点。所述结合对的常见实例是抗生物素蛋白和生物素。在优选的实施方案中，生物素与本发明CDMAB的靶抗原缀合，并由此为抗-肿瘤试剂或与抗生物素蛋白或链亲和素缀合的其他部分提供靶标。备选地，生物素或另一种所述部分与本发明CDMAB的靶抗原相连接，并用作，例如诊断系统中的报告分子，在所述诊断系统中可检测的信号-生成试剂与抗生物素蛋白或链亲和素缀合。可检测的信号-生成试剂有效用于体内和体外诊断目的。信号生成试剂产生可测量的信号，所述信号是可以通过外部方法，通常电磁辐射测量法检测的。通常，所述信号生成试剂是酶或发色团，或由荧光、磷光或化学发光引起的发光。发色团包括在紫外或可见区吸收光的染料，且可以是酶催化反应的底物或降解产物。而且，在本发明范围内包括本发明CDMAB体内和体外用于研究或诊断方法的用途，这在本领域中是公知的。为了执行如本文中所预期的诊断方法，本发明还可以包括试剂盒，所述试剂盒包括本发明的CDMAB。所述试剂盒应该有效用于通过检测CDMAB的靶抗原在该个体细胞中的过量表达而确定处于某种类型癌症风险中的个体。诊断测定试剂盒
预期利用处于诊断测定试剂盒形式的本发明CDMAB确定肿瘤的存在。通常基于一种或多种肿瘤-特异性抗原，例如在生物学样品，诸如血液、血清、尿液和/或肿瘤活组织检查中的蛋白质和/或编码所述蛋白的多核苷酸的存在，检测患者中的肿瘤，所述样品应该是获自所述患者的。所述蛋白起指示具体肿瘤，例如结肠、乳腺、肺或前列腺肿瘤存在或缺乏的标记的作用。还预期所述抗原应该具有检测其他癌性肿瘤的效用。在诊断试剂盒中包括包含本发明CDMAB的结合试剂或CDMAB相关结合试剂，允许检测与生物学样品中的试剂相结合的抗原水平。多核苷酸引物和探针可以用于检测编码肿瘤蛋白的mRNA水平，其也指示是否存在癌症。为了使该结合测定具有诊断性，产生这样的数据，即所述数据与和正常组织中存在的抗原相比具有统计学显著性的抗原水平相关，从而能够实施识别确定地诊断癌肿瘤存在的结合。预期许多形式应该有效用于本发明的诊断测定，如本领域中普通技术人员已知地，从而使用结合试剂检测样品中的多肽标记。例如，如Harlow和Lane,抗体:实验室手册(抗体:ALaboratory Manual),冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory), 1988 中举例说明的。还预期前述诊断测定形式的任意和全部组合、改变或修饰。患者中是否存在癌症应该典型地通过以下确定:(a)使获自患者的生物学样品与结合试剂接触；(b)检测样品中与结合试剂结合的多肽水平；和(c)比较多肽水平和预定截断值。在举例说明的实施方案中，预期该测定应该包括使用固定在固体支持物上的基于CDMAB的结合试剂结合以及去除样品的残余中的多肽。结合的多肽然后可以利用检测试剂检测，所述检测试剂包含报告基团并特异性结合于结合试剂/多肽复合物。例证性检测试剂可以包括基于CDMAB的结合试剂，所述结合试剂特异性结合于多肽或抗体或特异性结合于所述结合试剂的其他试剂，诸如抗-免疫球蛋白、蛋白质G、蛋白质A或凝集素。在备选的实施方案中，预期可 以使用竞争测定，其中用报告基团标记多肽，并容许其在结合试剂与样品一起温育后结合于固定的结合试剂。样品与固定的结合试剂的反应性指示是所述样品成分抑制标记的多肽与结合试剂结合的程度。对于在所述测定中使用合适的多肽包括结合试剂对其具有结合亲和力的全长肿瘤-特异性蛋白和/或其部分。所述诊断试剂盒具有固体支持物，其可以处于蛋白质可以附着的本领域中普通技术人员已知的任何材料形式。合适的实例可以包括微量滴定板中的检测孔或硝化纤维或其他合适的膜。备选地，所述支持物可以是珠或盘，诸如玻璃、玻璃纤维、胶乳或塑料材料诸如聚苯乙烯或聚氯乙烯。所述支持物还可以是磁性粒子或光纤传感器，诸如例如美国专利号5，359,681中公开的那些。预期利用多种本领域中那些技术人员已知的技术将结合试剂固定在固体支持物上，这详细地记述在专利和科学文献中。术语“固定”指非共价缔合诸如吸附和共价附着，其在本发明的情形中，可以是所述试剂和所述支持物官能团之间的直接连接，或可以是通过交联剂的连接。在优选但非限制性实施方案中，通过吸附固定于微量滴定板的孔或膜是优选的。吸附可以通过使结合试剂，在合适的缓冲液中，与固体支持物接触一段合适的时间获得。接触时间可以随温度变化，且应该通常在约I小时-约I天的范围内。结合试剂与固体支持物的共价附着一般通过首先使该支持物与双功能试剂反应实现，所述双功能试剂与支持物和结合试剂上的官能团，诸如羟基或氨基基团二者反应。例如，结合试剂可以通过使用苯醌或通过使支持物上的醛基与结合配偶体上的胺和活性氢缩合共价附着于具有合适聚合物涂层的支持物(参见，例如，Pierce ImmunotechnologyCatalog and Handbook (皮尔斯免疫技术目录和手册)，1991,在A12A13)。还预期所述诊断测定试剂盒采用双-抗体夹心式测定的形式。该测定可以通过首先使抗体，例如本发明公开的固定在固体支持物，通常是微量滴定板的孔上的CDMAB，与样品接触进行，从而容许该样品中的多肽结合于固定的抗体。然后从固定的多肽-抗体复合物中去除未结合的样品，并加入包含报告基团的检测试剂(优选地，能够结合于多肽上不同位点的二级抗体)。然后使用适合于特异性报告基团的方法确定保持与固体支持物结合的检测试剂的量。 在具体实施方案中，预期抗体一旦固定在如上所述的支持物上，应该通过使用本领域中普通技术人员已知的任何合适封闭剂，诸如牛血清清蛋白或吐温20 (西格玛化学公司(Sigma Chemical C0.), St.Louis, M0.)封闭支持物上剩余的蛋白质结合位点。然后使固定的抗体与样品一起温育，且容许多肽结合于所述抗体。温育前，可以用合适的稀释齐U，诸如磷酸盐缓冲液(PBS)稀释样品。通常，合适的接触时间(即温育时间)应该进行选择以对应于这样的时间期，所述时间期足以检测获自患有特定选择的肿瘤的个体的样品中多肽的存在。优选地，接触时间足以获得在结合和未结合多肽之间平衡时获得的结合水平的至少约95%的结合水平。本领域中那些普通技术人员应该承认获得平衡所需的时间可以容易地通过测定经过一段时间发生的结合水平来确定。还预期未结合的样品应该然后通过用合适的缓冲液清洗固体支持物而去除。然后应该将包含报告基团的二级抗体加入固体支持物。然后进行检测试剂与固定的抗体-多肽复合物在一起温育一段足以检测结合的多肽的时间量。随后，然后去除未结合的检测试剂，并利用报告基团检测结合的检测试剂。用于检测报告基团的方法必须特异于所选报告基团的类型，例如，针对放射性基团，闪烁计数或放射自显影法通常是适合的。光谱法可以用于检测染料、发光基团和荧光基团。生物素可以利用与不同报告基团(通常，放射性或荧光基团或酶)偶联的抗生物素蛋白检测。酶报告基团可以通常通过添加底物(通常进行一段特定时期)，随后进行反应产物的光谱或其他分析来检测。为了使用本发明的诊断测定试剂盒确定是否存在癌症，诸如前列腺癌，通常将从保持与固体支持物结合的报告基团检测到的信号与对应于预确定截断值的信号相比较。例如，用于检测癌症的例证性截断值可以是当使固定的抗体与来自无癌症患者的样品一起温育时获得的平均信号。通常，认为产生高于预确定截断值约3个标准偏差的信号的样品是癌症阳性的。在备选的实施方案中，按照Sackett等，临床流行病学(ClinicalEpidemiology).临床医学基本科学(A Basic Science for Clinical Medicine),利特尔布朗公司(Little Brown and C0.)，1985，106-7页的方法，截断值司以利用接受者操作曲线(Receiver Operator Curve)确定。在该实施方案中，截断值可以从对应于关于诊断检测结果的每种可能的截断值的正阳性率(即灵敏性)和假阳性率(100%-特异性)对的图表确定。在最接近左上角的图表中的截断值(即包含最大面积的值)是最准确的截断值，且司以认为产生高于由该方法确定的截断值的信号的样品是阳性的。备选地，截断值司以沿着图表向左移动，从而最小化假阳性率，或向右移动，从而最小化假阴性率。一般，认为产生高于由该方法确定的截断值的信号的样品对癌症是阳性的。
预期可通过所述试剂盒进行的诊断测定以流通式或试验纸检验(strip test)形式进行，其中结合试剂固定在膜，诸如硝化纤维膜上。在流通式检测中，当样品流经膜时，样品中的多肽结合于固定的结合试剂。第二种标记的结合试剂在包含该第二种结合试剂的溶液流经该膜时，再结合于结合试剂-多肽复合物。结合的第二种结合试剂的检测可以然后如上所述进行。在试验纸检验形式中，将结合试剂结合的膜的一端浸没在包含样品的溶液中。该样品沿该膜移动经过包含第二种结合试剂的区域，并到达固定的结合试剂的区域。所述第二结合试剂在固定的抗体区域处的浓度指示癌症的存在。在结合位点形成可以视觉读取的图案，诸如线，指示阳性检测。缺乏所述图案指示阴性结果。一般，选择固定在膜上的结合试剂的量，从而在生物学样品包含足以在处于上述形式的双-抗体夹心式测定中产生阳性信号的多肽水平时，产生视觉可辨别的图案。对于在本诊断测定中使用的优选结合试剂是目前公开的抗体，其抗原-结合片段、和如本文中所述的任何CDMAB相关结合试剂。固定在膜上的抗体的量应该是有效引起诊断测定的任意量，且可以在约25毫微克-约I微克的范围内。典型地，所述检测可以利用非常小量的生物学样品进行。另外，本发明的CDMAB由于其识别其靶抗原的能力，可以用在进行研究的实验室中。为了更充分地理解本文所述的本发明，进行了下述描述。本发明提供特异性识别和结合ATCC PTA-4621抗原的CDMAB( S卩，ATCC PTA-4621CDMAB，由以保藏号PTA-4621保藏在ATCC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的人源化抗体、由以保藏号PTA4621保藏在ATCC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌合抗体、其抗原结合片段或抗体配体)。通过以保藏号PTA-4621保藏在ATCC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的CDMAB司以以任何形式存在，只要它具有这样的抗原-结合区，所述抗原-结合区竞争性抑制由杂交瘤ATCC PTA-4621产生的分离的单克隆抗体与其靶抗原的免疫特异性结合。因此，具有与ATCC PTA-4621抗体相同的结合特异性的任何重组蛋白(例如，融合蛋白，其中所述抗体与第二蛋白如淋巴因子或肿瘤抑制性生长因子结合)均落入本发明的范围内。在本发明的一个实施方案中，所述CDMAB是ATCC PTA-4621抗体。在其它实施方案中，所述CDMAB是抗原结合片段，其可以是Fv分子(如单链Fv分子)、Fab分子、Fab’分子、F(ab’)2分子、融合蛋白、双特异性抗体、异种抗体或具有ATCCPTA-4621抗体的抗原-结合区的任何重组分子。本发明的CDMAB针对所述ATCC PTA-4621单克隆抗体针对的表位。本发明的CDMAB可以在分子内进行修饰，即，通过氨基酸修饰，以产生衍生物分子。化学修饰也可以是可能的。通过直接突变、亲和力成熟方法、噬菌体展示或链改组的修饰也司以是司能的。亲和力和特异性可以通过突变CDR和/或苯丙氨酸色氨酸(FW)残基和筛选具有所需特征的抗原结合位点进行改进或改良。(例如，Yang等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，(1995) 254:392-403)。一种方法是随机化各个残基或残基的组合，从而在其它方面相同的抗原结合位点群中，2-20个氨基酸的子集存在于特定位置处。备选地，突变可以通过易错PCR方法在一定范围的残基中诱导(例如，Hawkins等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.), (1992)226:889-96)。在另一个实例中，包含重链和轻链可变区基因的噬菌体展示载体可以在大肠杆菌(E.coli)突变菌株中增殖(例如，Low等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，(1996) 250:359-68)。这些诱变方法是许多本领域中技术人员已知方法的例证。增加本发明抗体亲和力的另一种方式是进行链改组，其中重链或轻链与其他重链或轻链随机配对，从而制备具有较高亲和力的抗体。抗体中的多种CDR也可以利用其他抗体中相对应的⑶R改组。衍生物分子将保留所述多肽的功能特性，S卩，具有这样的取代的分子仍然允许所述多肽与所述ATCC PTA-4621抗原或其部分结合。这些氨基酸取代包括，但不必要限于，本领域内已知为“保守的”氨基酸取代。例如，充分确定的蛋白质化学原理认为，通常可以在蛋白质内频繁进行称为“保守氨基酸取代”的特定的(certain)氨基酸取代，而不改变该蛋白质的构象或功能。这样的变化包括用异亮氨酸(I)，缬氨酸(V)，和亮氨酸(L)中的任一种取代这些疏水性氨基酸中的任意其它一种；用天冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)，并且反之亦然；用谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)，并且反之亦然；和用丝氨酸(S)取代苏氨酸(T)，并且反之亦然。其它取代也可以被认为是保守的，这取决于特定氨基酸的环境及其在蛋白质的三维结构中的作用。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)常常可以互换，同样丙氨酸和缬氨酸(V)也可以互换。相对疏水性的甲硫氨酸(M)常常可以与亮氨酸和异亮氨酸互换，并且有时可以与缬氨酸互换。赖氨酸(K)和精氨酸(R)常常在这样的情形中互换，在所述情形中，氨基酸残基的重要特征是其电荷，并 且这两种氨基酸残基的不同的pK’ s并不显著。在特定的情形中，还有其它的变化司以被认为是“保守的”。实施例1关于人MDA-MB-468乳腺癌细胞的体内肿瘤实验以前证明了(如 S.N.10/603,000 中公开)H460-16-2 针对 MDA-MB-231 人乳腺癌异种移植模型的功效。为了扩展该发现，在MDA-MB-468人乳腺煽异种移植模型中测试H460-16-2。参考图1和2，对8_10周龄雌性无胸腺裸鼠通过在每只小鼠在右腰处皮下注射而植入在100微升PBS溶液中的500万人乳腺煽细胞(MDA-MB-468)。将小鼠随机分成2个处理组，每组10只。在植入后第35天，即当小鼠平均肿瘤体积达到约83mm3时，在用含有2.7mM KCl7ImM KH2PO4,137mM NaCl和20mM Na2HPO4的稀释剂从储备的浓缩液稀释后，对每组腹膜内施用300微升体积的20mg/kg的H460-16-2检测抗体或缓冲液对照。然后，在约三周内每周施用所述抗体和对照样品三次。大约每3-10天用测径器测量肿瘤生长。在8剂抗体后，结束处理。在肿瘤测量的同时记录动物的体重。在研究结束时，一旦它们达到终点，按照CCAC指导将所有动物处死。H460-16-2在人乳腺癌细胞的MDA_MB_468体内确立模型中显著抑制肿瘤生长。如在第79天，即最后抗体剂量后26天时确定地，与缓冲液处理组相比，用ARIUS抗体H460-16-2处理减少MDA-MB-468肿瘤生长62.8% (p = 0.005506, t_检验)图1。肿瘤生长抑制通过用对照和处理组减去最初肿瘤体积计算。在整个研究过程中，不存在明显的临床毒性迹象。以每周时间间隔测量的体重是健康和不能健壮生长的替代品。从研究的开始到结束，所有组中的平均体重均增加(图2)。在第35天和第79天之间，平均体重在对照组中增加1.82g(7.2% )和在H460-16-2处理组中增加2.30g(9.9% )。在处理期间内，各组间不存在显著差别。
总之，H460-16-2在人乳腺煽异种移植模型中是良好耐受的，并且显著抑制肿瘤生长。实施例2关于人PC-3前列腺癌细胞的体内肿瘤实验以前证明了(如S.N.10/810, 165中公开)H460-16-2与化疗剂顺钼结合针对PC-3人前列腺癌异种移植模型的功效。为了确定在缺乏该药物时是否能证明该功效，在不同的小鼠品系异种移植模型中单独地测试H460-16-2。参考图3和4，对8_10周龄雄性无胸腺裸鼠通过在每只小鼠的右腰处皮下注射而植入在100微升PBS溶液中的500万人前列腺癌细胞(PC-3)。将小鼠随机分成2个处理组，每组10只。在植入后第6天，即当小鼠平均肿瘤体积达到约 95mm3 时，在用含有 2.7mM KCl, ImM KH2PO4,137mM NaCl 和 20mM Na2HPO4 的稀释剂从储备的浓缩液稀释后，对每组腹膜内施用300微升体积的20mg/kg的H460-16-2检测抗体或缓冲液对照。然后，在约三周内每周施用所述抗体和对照样品三次。大约每4-10天用测径器测量肿瘤生长。在10剂抗体后，结束处理。在肿瘤测量的同时记录动物的体重。在研究结束时，一旦它们达到终点，按照CCAC指导将所有动物处死。H460-16-2在人前列腺癌的PC-3体内确立模型中显著抑制肿瘤生长。如在第71天，即最后抗体剂量后44天时确定地(图3)，与缓冲液处理组相比，用ARIUS抗体財60-16-2处理减少？(:-3肿瘤生长61.9% (p = 0.002414，t_检验)。肿瘤生长抑制通过用对照和处理组减去最初肿瘤体积计算。在整个研究过程中，不存在明显的临床毒性迹象。以每周时间间隔测量的体重是健康和不能健壮生长(fail to thrive)的替代品。从研究的开始到结束，所有组中的平均体重均增加(图4)。在第6天和第71天之间，平均体重在对照组中增加3.47g(14.3% )和在H460-16-2处理组中增加3.86g(15.1% )0在处理期间内，各组间不存在显著差别。总之，H460-16-2在这种人前列腺癌异种移植模型中是良好耐受的，并且单独作为抗体，显著抑制肿瘤生长。实施例3关于人MDA-MB-231乳腺癌细胞的体内肿瘤实验以前证明了(如S.N.10/603, 000中公开)Η460_16_2针对MDA-MB-231人乳腺癌异种移植模型的功效。为了确定有效剂量水平，在确立的MDA-MB-231人乳腺癌异种移植模型中测试处于多种剂量的(ch)ARH460-16-2-1gGl。参考图5和6，对8_10周龄雌性SCID小鼠通过在每只小鼠的右腰处皮下注射而植入在100微升PBS溶液中的500万人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)。当小鼠平均肿瘤体积达到约IOOmm3时，将小鼠随机分成5个处理组，每组 10 只。在植入后第 11 天，在用含用 2.7mMKCl, ImM KH2PO4,1 37mM NaCl 和 20mM Na2HPO4的稀释剂从储备的浓缩液稀释后，对每组腹膜内施用300微升体积的20、10、2或0.2mg/kg的(ch)ARH460-16-2-1gGl检测抗体或缓冲液对照。然后，在约三周内每周施用所述抗体和对照样品三次。大约每4-7天用测径器测量肿瘤生长。在10剂抗体后，结束处理。在肿瘤测量的同时记录动物的体重。在研究结束时，一旦它们达到终点，按照CCAC指导将所有动物处死。
(ch)ARH460-16-2-1gGl证明了在人乳腺癌的MDA-MB-231体内确立模型中的剂量依赖性肿瘤生长抑制和退化，第11天-第32天之间处理期间内的最低剂量为0.2mg/kg，且在给药后继续维持肿瘤生长抑制。如在第55天，即最后抗体剂量后23天时确定地，与缓冲液-处理组相比，使用20、10、2或0.2mg/kg剂量的ARIUS抗体(ch) ARH460-16-2_IgGl处理分别以 91.3,89.0,86.1 或 63.5% (p < 0.00001，t_ 检验)减小 MDA-MB-231 肿瘤的生长(图5)。在整个研究过程中，不存在明显的临床毒性迹象。以每周时间间隔测量的体重是健康和不能健壮生长的替代品。从研究的开始到结束，所有组中的平均体重均增加(图6)。在第O天和第55天之间，平均体重在对照组中增加2.33g(ll.9% )和在剂量为20、10、2和0.2mg/kg 的 H460-16-2 处理组中分别增加 2.44g(12.8%),2.0g (10.0%),2.0g (10.5%),和2.0g (10.5% )。在处理期间内，各组间不存在显著差别。总之，(ch)ARH460-16-2-1gGl在这种人乳腺癌异种移植模型中在所有测试的剂量以剂量依赖性方式 是良好耐受的，并且显著抑制肿瘤生长并产生肿瘤尺寸的退化。实施例4人结肠肿瘤组织染色进行了关于人结肠肿瘤组织的IHC研究，以进一步评估H460-16-2与人癌症的结合。进行了 IHC最优化研究，从而确定其他实验条件。利用人结肠肿瘤组织微阵列(Imgenex,圣地亚哥，CA)进行H460-16-2与59份人结肠肿瘤组织的结合。组织切片通过在58°C温箱中干燥I小时去石蜡并通过浸没在科普林缸(Coplin jar)的二甲苯5次,4分钟/次脱腊。在通过一系列分级乙醇清洗(100%至75% )处理后，使切片在水中重新水合。将载玻片浸没在IOmM柠檬酸盐缓冲液pH6 (Dako，多伦多，安大略)中，然后以高、中、和低能量设置各微波处理5分钟，并且最后浸没在冷PBS中。然后将载玻片浸没在3%过氧化氢溶液中6分钟，用PBS清洗3次，5分钟/次，干燥并在通用封闭溶液(Dako，多伦多，安大略)中室温温育5分钟。H460-16-2，抗人肌肉肌动蛋白(克隆HHF35，Dako，多伦多，安大略)，或同种型对照抗体(针对黑曲霉(Aspergilltsniger)葡糖氧化酶，即在哺乳动物组织中既不存在也不可诱导的酶；Dako，多伦多，安大略)在抗体稀释缓冲液中(Dako，多伦多，安大略)稀释到其工作浓度(除了抗肌动蛋白被稀释到0.5微克/mL外，每种抗体为5微克/mL)，并在湿润室内室温温育I小时。然后用PBS清洗载玻片3次，5分钟/次。使用如提供的HRP缀合的二级抗体(Dako预见系统(Dako Envision System),多伦多，安大略)在室温下检测/显现初级抗体的免疫反应性30分钟。在该步骤后，载玻片用PBS清洗3次，5分钟/次，并且通过添加DAB (3，3’ - 二氨基联苯胺tetrahydrachloride,Dako,多伦多，安大略)发色团底物溶液以在室温下进行免疫过氧化物酶染色10分钟形成颜色反应。在自来水中洗涤载玻片终止发色反应。在用梅尔苏木精(Sigma Diagnostics (西格玛诊断)，Oakville, ON)复染色后,载玻片用分级乙醇(75-100% )脱水并用二甲苯透明化。利用封固剂(mounting media) (Dako Faramount,多伦多，安大略)封盖载玻片。利用Axiovert 200 (Ziess加拿大，多伦多，0N)显微镜法检验载玻片，并用 Northern Eclipse Imaging Software (北方日食图像软件)(Mississauga,ON)获得和保存数字图像。由组织病理学家对结果进行阅读、评分和解释。图7显示人结肠肿瘤组织阵列的H460-16-2染色结果的总结。由该表，36/59(61%)的测试肿瘤对于H460-16-2是阳性的。H460-16-2特异于肿瘤细胞和基质成纤维细胞(图8)。细胞定位主要在膜和细胞质膜。阳性细胞的百分比在< 10%->50%的范围内，这说明该抗体与肿瘤细胞的异源结合。不能准确评估抗体结合和肿瘤阶段(AmericanJoint Committee on Cancer, AJCC staging)的关系,这归因于不同肿瘤阶段之间肿瘤数量的差异，即 I，II，III 和 IV 期分另Ij为 0/0，19/29 (66% ), 14/25 (56% )和 3/5 (60% ) 抗肌动蛋白，作为阳性抗体对照，显示出与肌内组织预期的阳性结合。IgG同种型阴性对照显示出与检测组织的阴性结合。作为其结合结肠癌细胞的结果，H460-16-2的治疗益处可以扩展到治疗结肠煽。实施例5 正常人和猕猴交叉反应性进行IHC研究，以表征正常猕猴组织上的H460-16-2抗原。使用抗体(ch)ARH460-16-2-1gGl (FITC，由LifeSpan标记，西雅图，WA，美国)和同种型对照抗体(Sigma (西格玛),由LifeSpan标记,西雅图，WA,美国)进行抗体滴定实验，以确定将导致最小背景和最大检测信号的浓度。为了最优化，以20微克/mL, 10微克/mL,5微克/mL,和
2.5微克/mL在福尔马林固定的、石蜡包埋的和新鲜冷冻的组织上进行连续稀释。抗体(ch)ARH460-16-2-1gGl和同种型对照抗体用作初级抗体，二级抗体是在兔中制备的抗-FITC抗体(DAKO，Mississauga, 0N，加拿大)。主要检测系统由具有DAB作为发色团的DAKOEnvision过氧化物酶标记聚合物(DAKO, Mississauga, 0N,加拿大)组成,其用于产生褐色沉淀。阴性对照由在缺乏初级抗体的条件下在相邻切片上进行完整免疫组化程序组成。用与尼康(Nikon)显微镜连接的DVC 1310C数码相机捕获载玻片的高能量图像。用装备有莱卡(Leica)DMLA显微镜的LifeSpan专有成像仪(ALIAS system)捕获完整切片的图像。用Adobe Photoshop将图像作为TIFF文件保存。抗体(ch) ARH460-16-2_IgGl在2.5微克/mL显示出阳性人对照组织的强染色，更高抗体浓度时背景更高。因此，浓度2.5微克/mL用于进一步免疫组化研究。同样地，福尔马林固定、石蜡包埋的组织显 示出比冷冻切片更少的背景染色；因此，固定的组织用于进一步IHC研究。总之，由关于有限数量样品的最优化研究，信号存在于人和灵长类动物样品的福尔马林固定组织上，尽管人皮肤比灵长类动物皮肤组织更阳性染色。关于16份正常人和猕猴(血液、骨髓、脑、结肠、眼睛、心脏、肾、肝、肺、骨骼肌、卵巢、胰腺、皮肤、脾、睾丸和甲状腺)福尔马林固定石蜡包埋组织进行扩展的IHC(图9和10)。在人样品中，(ch)ARH460-16-2-1gGl证明在下述细胞类型中对中度细胞质或膜染色很微弱:嗜中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞的子集、骨髓中的myeloid series、浆细胞子集、II型肺细胞、表皮角化细胞和皮肤附器。白质束也微弱阳性。微弱的细胞核染色见于神经元和神经胶质、肠神经节细胞、和睾丸和呼吸上皮之一的样品。其他细胞类型和组织是阴性的，包括红细胞系列和巨核细胞，神经元和神经胶质，结肠上皮，平滑肌，内皮，成纤维细胞，除巨噬细胞外的眼睛，心脏，肝，卵巢，胰腺，骨骼肌，淋巴细胞和脾内皮，和甲状腺。IgG同种型对照抗体在测试的所有人组织中是阴性的。在猴组织内，在许多组织中存在与人样品相比更高水平的细胞核染色。也在嗜中性粒细胞、神经元子集、结肠上皮细胞子集、淋巴细胞和巨噬细胞子集、偶然收集的管、卵巢和眼睛中的多种细胞类型、精母细胞中观察到对中等细胞质染色很微弱。细胞核染色见于大多数也对细胞质染色阳性的细胞类型中。以下细胞类型在缺乏细胞质或膜染色的条件下表现出细胞核染色:神经胶质，脑膜细胞，心肌细胞，肾小球和肾小管和肾管中的细胞子集，胆管上皮，呼吸上皮和肺细胞、和胰岛。猕猴组织中的IgG同种型对照表现出神经元中的微弱细胞核染色，和结肠和白质束中神经内分泌细胞的微弱细胞质染色。当比较这两种物种之间的染色模式时，跨越若干细胞类型证明了猕猴样品增加的细胞核染色，包括神经元、心肌细胞、肾小管上皮、和胆管。关于细胞质或膜染色，观察到以下区别:在猕猴结肠上皮细胞、神经元、卵巢的卵母细胞和卵泡上皮，和精母细胞中观察到略微增加的染色。人骨髓髓样前体比猕猴样品中观察到的早期前体更加阳性。其他组织，包括外周血样品、肺、骨骼肌、胰腺、皮肤、脾、和甲状腺在猕猴和人样品之间显示出类似的染色。为了进行在一些切片，特别是猕猴组织中的那些切片中过程的细胞核染色，关于人和猕猴肺、皮肤、和心脏组织，以2.5，1.25，0.6，0.3，0.15，0.08，和0.04微克/mL的(ch)ARH460-16-2-1gGl浓度使用冷冻切片，从而确定在胶原蛋白和结缔组织中保持初级信号但降低背景的浓度，并还评估一些福尔马林固定的组织中存在的细胞核染色。然后将处于该浓度的载玻片与以前关于这两种物种中相同器官的福尔马林固定组织的研究进行比较。在浓度1.5微克/mL时，细胞核染色人和灵长类动物的福尔马林固定组织样品中均基本降低，且在冷冻样品内，细胞核染色大量缺乏，这强烈地提示福尔马林固定的组织中普遍的细胞核染色是人工的，且归因于方法学或固定人工制品。总之，嵌合抗体(ch)ARH460-16-2-1gGl与猕猴正常组织交叉反应。实施例6
交叉竞争研究为了进一步表征H460-16-2和AR37A335.8(如 S.N.11/364，013 中公开地)的结合特性，通过Western印迹进行抗体竞争实验，从而确定H460-16-2和AR37A335.8识别CD44的相似的还是不同表位。利用制备的孔梳，在非还原条件下对500微克MDA-MB-231总膜制剂进行SDS-PAGE，所述孔梳横跨2个10%聚丙烯酰胺凝胶的每一个的完整长度。将来自该凝胶的蛋白质以150V，在4°C转移到PVDF膜2小时。在旋转平台上用处于TBST中的5%脱脂奶，在4°C封闭该膜约17小时。该膜用约20mLTBST清洗2次，并置于产生20个单独通道的Western多银幕仪中，在其中应用不同的探测溶液。以前，利用EZ-连接NHS-PEO固相生物素化试剂盒(Pierce，Rockford，IL)制备了生物素化的H460-16-2和AR37A335.8。初级抗体溶液通过混合生物素化的H460-16-2或生物素化的AR37A335.8和不同浓度的非生物素化的抗体而制备。具体地，制备溶液含有在处于TBST中的3%脱脂奶中的I微克/mL生物素化的H460-16-2加上2微克/mL，10微克/mL，100微克/mL，500微克/mL或1000微克/mL非生物素化的抗体。所用的非生物素化的抗体是H460-16-2，AR37A335.8和对照抗体1B7.11 (同种型对照，抗TNP鼠IgGl，内部纯化)。含有I微克/mL生物素化的AR37A335.8的溶液利用以上列出的相同浓度的非生物素化的抗体AR37A335.8，H460-16-2和对照抗体8B1B.1 (同种型对照，抗蓝舌病病毒鼠IgG2b，内部纯化)制备。在摇动平台上，将初级抗体溶液在所述膜上的单独的通道内室温温育2小时。在摇动平台上，将每个通道用TBST清洗3次，10分钟。将处于TBST中的3%脱脂奶中的0.01微克/mL过氧化物酶缀合的链霉抗生物素蛋白的二级溶液(Jackson Immunoresearch (杰克逊免疫研究)，West Grove,PA)应用到所述膜上的每个通道中。将该膜在二级溶液中，在摇动的平台上室温温育I小时。在摇动平台上，将每个通道用TBST清洗3次，10分钟。将该膜从多银幕仪中取出并用增强的化学发光检测溶液(GE Healthcare(GE卫生保健)，LifeSciences (生命科学)，以前的 Amersham Biosciences (Amersham 生物科学)，Piscataway,NJ)，按照制造商的指导，进行温育。然后对该膜进行拍照和显影。图11和12显示抗体竞争实验的结果。生物素化的H460-16-2的结合，在与浓度为100微克/mL以上(100倍过量；图11，图A，泳道1_5)的非生物素化的H460-16-2混合时，受到完全地抑制，而生物素化的AR37A335.8的结合，在与浓度为10微克/mL以上(10倍过量；图12，图B，泳道6-10)的非生物素化的AR37A335.8混合时，受到完全地抑制。生物素化的H460-16-2的结合在任何含有IgGl同种型对照抗体的样品中不受抑制(图11，图C，泳道11-15)，且生物素化的AR37A335.8的结合在任何含有IgG2b同种型对照抗体的样品中不受抑制(图12，图C，泳道11-15)。这说明关于与相同非生物素化抗体混合的生物素化抗体观察到的结合抑制归因于抗原结合位点被非生物素化抗体，而不是单独的过量抗体的非特异性相互作用而占据。生物素化的AR37A335.8的结合，在与浓度为500微克/mL以上(500倍过量；图12，图A，泳道1-5)的非生物素化的H460-16-2混合时，受到完全地抑制，且生物素化的H460-16-2的结合，在与所有测试浓度(图11，图B，泳道6_10)的非生物素化的AR37A335.8混合时，受到完全地抑制。这些结果说明H460-16-2的结合阻止AR37A335.8的结合，且反之亦然。总之，竞争Western印迹的结果提示⑶44分子的由H460-16-2和AR37A335.8识别的表位是相同或在空间上彼此非常接近的，这样一种抗体的结合可以完全封闭另一种抗体的结合。实施例7确定AR37A335.8与rhCD44的结合亲和性AR37A335.8与重组CD44 (rhCD44)的结合亲和性通过表面等离振子共振(SPR)确定。利用标准胺偶联程序固定重组人⑶44/Fc (R&D系统，Minneapolis，MN，美国)。通过注射104微升0.4M EDC和0.1M NHS的1:1混合物(流速10微升/分钟)激活CM5传感器芯片(GE Healthcare (GE卫生保健)，Piscataway, NJ,美国，以前的Biacore)的表面。rhCD44以20微克/mL(稀释在IOmM乙酸钠，pH5.5)的浓度注射以达到约500RU。最后，在该表面上注射119微升1.0M乙醇胺- HClpH8.5，以封闭传感器芯片表面上任何未占据的活化位点。注射不同浓度的AR37A335.8抗体。为了后继注射再生传感器芯片表面通过以50微升/分钟的流速注射IOmM甘氨酸-HCl pH2.070秒实现。抗体稀释在运行缓冲液(HBS_EP+,GE Healthcare (GE 卫生保健)，Piscataway,NJ 美国，以前的 Biacore)中并以0.67-667nM范围内的浓度连续注射，并在每个周期之间再生表面。作为对照，也在参考表面上注射各种抗体浓度，其不使得rh⑶44固定在该表面上。利用Biacore TlOO评估软件1.1版，利用简单的1:1相互作用模型对获得的sensograms进行动力学分析。结合和解离率常数用于计算抗体的KD。实验利用Biacore TlOO系统(GE Healthcare (GE卫生保健)，Piscataway，NJ美国，以前的Biacore)进行。该实验的结果关于AR37A335.8产生0.09425nM的KD图13)。这些结果说明AR37A335.8具有处于纳摩尔以下(sub-nanomolar)范围内的KD，且AR37A335.8的亲和性高于H460-16-2的亲和性(参考以下实施例10)。还将结合率常数(Ka)和解离率常数(Kd)列表(图13)。
实施例8磷酸-RTK(受体酪氨酸激酶)蛋白质组Profiler印迹为了确定受嵌合的(ch)ARH460-16-2_IgGl处理影响的胞内信号传导途径，利用蛋白质组profiler人磷酸-RTK抗体阵列(ARY001, R&D Systems Inc.(R&D系统公司)，Minneapolis, MN)对来自用(ch)ARH460-16-2_IgGl处理的细胞的溶胞产物进行筛选。处理和制备细胞以前的工作(如S.N.11/364,013中公开地)利用在重度联合免疫缺损小鼠(SCID)中生长的MDA-MB-231乳腺癌细胞，证明了(ch)ARH460-16-2_IgGl在乳腺癌异种移植模型中的体内功效。因此，对胞内信号传导分子活性的筛选利用MDA-MB-231细胞系进行。MDA-MB-231细胞生长至接近汇合，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，并然后在血清和增补剂-缺乏的培养基中37°C饥饿过夜。此后，将(ch)ARH460-16-2-1gGl(20微克/mL)或人IgGl (Sigma-Aldrich, St.Louis, MI) (20微克/mL)加入到细胞中并容许在4°C结合20分钟。然后通过向细胞中加入胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠以提供10% FBS，1% L-谷氨酰胺，和1%丙酮酸钠的最终浓度来刺激细胞。将细胞置于37°C温育器中并在刺激后I小时收集细胞溶胞产物。通过用PBS清洗细胞2次和在NP-40溶胞缓冲液(20mMTris-HCl (pH8.0)，137mM氯化钠，10%甘油，2mM EDTA, ImM原钒酸钠，10微克/mL牛胰蛋白酶抑制剂，10 微克 /mL 抑酶醛肽，I % NP-40 (Igepal* CA-630，Sigma-Aldrich, St.Louis,
MI))中收获来收集溶胞产物。通 过吸移管吹吸重新混悬细胞，将其转移到1.5mL微量离心管中并通过涡旋在4°C混合30分钟。然后以14000xg离心溶胞产物5分钟，并将上清液转移到干净的管中。蛋白质浓度通过二辛可宁酸(BCA)蛋白测定(Pierce, Rockford, IL)确定。人磷酸-RTK抗体阵列人磷酸-RTK抗体阵列按照制造商所述的流程，针对MDA-MB-231细胞溶胞产物筛选(第3修订版，2005年11月，R&D系统抗体阵列ARY001)。简言之，每种人磷酸-RTKprofiler膜通过在1.5mL阵列缓冲液I (Partn0.895477:R&D系统抗体阵列ARY001)中，在摇动平台摇动器中温育I小时制备。对于每种处理，150微克总蛋白用阵列缓冲液I稀释达至IJl.5mL的总体积。将该混合物加入到制备的profiler膜中，并在摇动平台摇动器中4°C温育过夜。然后在IX清洗缓冲液(由25X储液(Part n0.895003:R&D系统抗体阵列ARY001)在纯化蒸馏水中稀释)中清洗每个膜三次并与稀释在IX阵列缓冲液2 (5X阵列缓冲液2，Part n0.895478:R&D系统抗体阵列ARY001)中的1.5mL抗磷酸酪氨酸-HRP检测抗体混合物(Part n0.841403:R&D系统抗体阵列ARY001) —起温育2小时。在IX清洗缓冲液中清洗膜三次，并使其暴露于ECL+Western检测试剂(GE Healthcare (GE卫生保健)，LifeSciences (生命科学)，Piscataway,NJ),以显影。膜暴露于化学发光胶片(Kodak(柯达)，Rochester, NY)并利用X-射线医学处理器显影。显影的X-射线胶片上的磷酸-RTK阵列数据通过在发送模式扫描仪上扫描胶片和利用图像J分析软件(Image Jl.37v, NIH)分析阵列图像文件量化。对于每种RTK，利用膜透明区域的像素密度计算关于相应复制点的平均像素密度，并从背景信号中减去。对于各相应磷酸-蛋白靶标，(ch)ARH460-16-2-1gGl处理样器的平均标准化像素密度除以同种型对照，人IgGl处理样品的平均标准化像素密度，以获得相对变化比。磷酸-蛋白信号的减少百分比通过由I减去相对变化比并乘以100确定。来自用(ch)ARH460-16-2-1gGl温育的磷酸-RTK阵列的结果显示在图14中。与同种型对照相比，(ch)ARH460-16-2-1gGl处理用免疫球蛋白样和EGF样结构域l(Tie-l)诱导RTK酪氨酸激酶磷酸化的减少(约51 %)。Tie-1和Tie-2—起形成血管生成素、促进血管发生的生长因子的受体。血管生成素与其受体的结合诱导Tie-1和Tie-2的磷酸化和启动促进细胞生长的细胞信号传导。(ch)ARH460-16-2-1gGl在受到血清和增补剂刺激时，可以减少Tie-1的磷酸化，这提示(ch) ARH460-16-2-1gGl可以通过活化血管生成素/Tie-1/2受体配体复合物阻断生长因子诱导细胞分化和肿瘤进展。实施例9
H460-16-2 的人源化重组DNA技术利用本领域中公知的方法,和适当时,这些方法中所用酶的厂商使用说明进行。详细实验室方法也记述如下。利用多聚A 束系统 1000 (Poly A Tract SystemlOOO) mRNA 提取试剂盒(PromegaCorp.，Madison,WI),按照制造商的说明，由杂交瘤H460-16-2细胞提取mRNA。反转录mRNA如下:对于K轻链，5.0微升mRNA与1.0微升20pmol/微升MuIgGnVL_3’弓丨物0L040 (图15)和5.5微升无核酸酶水(Promega Corp., Madison, WI)混合。对于λ轻链,5.0微升mRNA与1.0微升20pmol/微升MuIgGn'-3，引物0L042(图15)和5.5微升无核酸酶水(Promega Corp., Madison, WI)混合。对于 Y 重链，5 微升 mRNA 与 1.0 微升 20pmol/ 微升 MuIgG Vh_3’ 引物 0L023 (图 16)和 5.5 微升无核酸酶水(Promega Corp.,Madison, WI)混合。将全部三种反应混合物置于被设置为70°C的预热的热循环器块中5分钟。将这些在冰上冷冻5分钟，随后分别加入到4.0微升ImPromII5x反应缓冲液(Promega Corp,.Madison, WI), 0.5 微升 RNasin 核糖核酸酶抑制剂(Promega Corp,.Madison, WI), 2.0 微升 25mM MgCl2 (Promega Corp,.Madison, WI), 1.0 微升 IOmM dNTP 混合物(Invitrogen,Paisley, UK)和 1.0 微升 Improm II 反转录酶(Promega Corp., Madison, WI)中。将反应混合物在室温下温育5分钟，随后转移到设置为42°C的预热PCR块中I小时。此后，通过在PCR块中70°C温育15分钟热灭活反转录酶。 如下由cDNA扩增重链和轻链序列:PCR总混合物通过将37.5微升IOx高保真扩展PCR 缓冲液:(Roche (罗氏)，Mannheim,德国)，7.5 微升 IOmM dNTP 混合物(Invitrogen,Paisley,英国)和3.75微升高保真扩展DNA聚合酶(Roche (罗氏)，Mannheim,德国)加入到273.75微升无核酸酶水中制备。将该总混合物在冰上分配为容纳在15个薄壁PCR反应管中的21.5微升等分试样。向这些管中的6个加入2.5微升MuIgVH-3’反转录反应混合物和1.0微升重链5’引物集合HA-HF (关于引物序列和引物集合组成参见图16)。向另外7个管中加入2.5微升MuIgKVL-3’反转录反应和1.0微升轻链5’引物集合LA-LG (图15)。向最后的管中加入2.5微升血181^1^3’反转录反应和1.0微升λ轻链引物MuIgA VL5, -LI。将反应置于热循环器块中并加热到95°C 2分钟。进行聚合酶链反应(PCR)反应:在94°C进行30秒，55°C进行I分钟和72°C进行30秒的循环，进行40次。最后在72°C加热PCR产物5分钟，并然后保持在4 C。利用 pGEM-T 易载体(easy Vector)系统 I (Promega Corp.,Madison,WI)试剂盒，将扩增产物克隆到PGEM-T易载体中并测序。由此生成的VH和VL序列分别显示在图17和18中。为了生成嵌合抗体，利用引物0L437和0L438通过PCR扩增VH区基因(图19);设计这些，从而利用来自所述cDNA克隆之一的质粒DNA作为模板在5 ’ MluI和3 ’ Hindi 11限制性酶位点中进行改造。向0.5mLPCR管中，将5微升IOx高保真扩展PCR缓冲液:(Roche (罗氏),Mannheim,德国)，1.0 微升 IOmM dNTP 混合物(Invitrogen, Paisley,英国)，0.5 微升引物0L437，0.5微升引物0L438，1.0微升模板DNA和0.5微升高保真扩展DNA聚合酶(Roche (罗氏)，Mannheim,德国)力口入至丨J 41.5微升无核酸酶水中。利用寡核苷酸0L439和0L090 (图20)以相似的方法扩增VL区，从而在BssHII和BamHI限制性酶位点中改造。将反应置于热循环器块中并加热到95°C 2分钟。进行聚合酶链反应(PCR)反应:在94°C进行30秒，55 °C进行I分钟和72°C进行30秒的循环，进行30次。最后在72°C加热PCR产物5分钟，并然后保持在4°C。然后，分别在Mlul/Hindlll和BssHII/BamHI位点处将PCR产物的VH和VL区分别克隆到双载体pANT18 (图21)中。pANT18是基于pAT153的质粒，其包含人Ig重链和轻链表达盒和dhff选择基因。所述重链盒由受hCMVie启动子驱动的具有下游人IgG多聚A区的人基因组IgGl恒定区基因组成。所述轻链盒包含受hCMVie启动子驱动的具有下游轻链多聚A区的基因组人K恒定区。人Ig引导序列和恒定区之间的克隆位点容许可变区基因的插入。PANT18还包含受SV40启动子驱动的具有下游SV40多聚A区的仓鼠dhfr基因。人源化V区基因利用用于PCR的小鼠H460-16-2VH和VL模板构建，所述PCR使用长重叠寡核苷酸引入来自同源人VH和VL序列的氨基酸。用于生成不同人源化VH和VL序列的寡核苷酸分别显示在表19和20中。还将人源化变体直接克隆到表达载体PANT18中。人源化VH和VL变体的序列分别显示在图22和23中。`将由此产生的嵌合(ch) ARH460-16-2 (VKOVHO)，和人源化构建体通过电穿孔转染到CHO/dhff-细胞(ECACC，94060607)中，并在缺乏次黄嘌呤和胸昔的培养基(具有L-谷氨酰胺和丙酮酸钠的高葡萄糖DMEM(Invitrogen, Paisley,英国)+5%渗析的FBS(目录号26400-044 Invitrogen,Paisley,英国)，脯氨酸(Sigma(西格玛)，Poole,英国)和青霉素/链霉素(Invitrogen, Paisley,英国)中选择。如通过下述人IgGl/κ捕获ELISA所测量地，基于在培养基中分泌的人IgG水平选择集落。扩大选择的集落并通过使用ImLHiTrapMabSelect SuRe柱(GE Healthcare (GE卫生健康)，Amersham,英国)的蛋白A亲合层析法，遵照制造商建议的条件从细胞培养物上清中纯化抗体。纯化的抗体过滤灭菌，随后+4°C保存(在PBS ρΗ7.4中)。抗体浓度通过使用纯化的人IgGl/ κ (Sigma (西格玛)，Poole，UK)作为标准物的hlgGl/kappa捕获ELISA计算。免疫吸附96孔板(Nalge nunc, Hereford,英国)用在IXPBS(pH 7.4)中以1: 1500稀释的小鼠抗人IgG Fe-特异性抗体(I6260Sigma(西格玛)，Poole,UK)在37°C包被I小时。在PBS+0.05%吐温20中清洗板三次，随后加入稀释在2%BSA/PBS中的样品和标准物。室温下温育板I小时，随后在PBS/吐温中清洗三次并加入在2% BSA/PBS中以1: 1000稀释的100微升/孔检测抗体山羊抗人κ轻链过氧化物酶缀合物(Α7164 Sigma (西格玛)，Poole，英国)。在室温下温育板I小时，随后用PBS/吐温清洗5次，并用(PD底物(Sigma(西格玛)，Poole，英国)检测结合的抗体。该测定在黑暗中显影5分钟，随后通过加入3M HCl终止。然后在MRX TCII板读数器(Dynex Technologies (Dynex技术),Worthing,英国)中在490nm读该测定板。嵌合(ch) ARH460-16-2 (VKOVHO)，和人源化变体抗体在利用H460-16-2小鼠抗体的基于ELISA的竞争测定中测试，利用生物素标记物微型生物素化试剂盒(Biotintagmicro biotinylation kit) (Sigma(西格玛)，Poole,英国)生物素化。生物素化的小鼠H460-16-2用于在存在不同浓度的竞争抗体的条件下结合重组的人⑶44(R&D systems (R&D系统)，Abingdon,英国)。将重组人⑶44以处于0.05 M碳酸盐缓冲液pH9.0 (Sigma(西格玛)，Poole,英国)中的5微克/mL,在+4°C,在免疫吸附96孔微滴定板(Nalge nunc,Hereford，英国)上固定过夜。将生物素化的小鼠H460-1 6_2抗体稀释到0.2微克/mL并与处于0-20微克/mL浓度范围内的等体积的竞争抗体混合。⑶44板在PBS+0.05 %吐温20中清洗3次。将100微升抗体混合物转移到⑶44包被的板的孔中，并将其在室温下温育I小时。清洗该板，并且通过加入链霉抗生物素蛋白-HRP缀合物(Sigma(西格玛)，Poole,英国)(以1: 500稀释)和TMB底物(Sigma(西格玛)，Poole,英国)检测结合的生物素化的小鼠H460-16-2。该测定在黑暗中显影5分钟，随后通过加入3M HCl终止。然后在MRXTCII 板读数器(Dynex Technologies (Dynex 技术)，Worthing,英国)中以 450nm 处的吸光度读该测定板。吸光度相对测试抗体浓度作图，以提供图24中所示的图表。显示出，嵌合(ch) ARH460-16-2 (VK0VH0)抗体和2种人源化变体在与生物素化的H460-16-2抗体竞争结合重组⑶44中与小鼠H460-16-2抗体等效。实施例10
确定鼠科H460-16-2和(hu) ARH460-16-2变体与rhCD44的结合亲和性通过确定结合重组CD44(rhCD44)后各自的解离常数，比较Η460_16_2，(hu)ARH460-16-2变体I和(hu) ARH460-16-2变体2的结合亲和性。利用标准胺偶联程序固定重组人CD44/Fc (R&D Systems (R&D系统)，Minneapolis，MN，美国)。通过注射104微升0.4M EDC和0.1M NHS的1:1混合物(流速10微升/分钟)激活CM5传感器芯片(GE Healthcare (GE卫生保健)，Piscataway，NJ美国以前的Biacore)的表面。以浓度20微克/mL(稀释于IOmM乙酸钠ρΗ5.5中)注射rhCD44以达到约500RU。最后，将119微升1.0M乙醇胺-HCL pH8.5注射到该表面上，从而封闭传感器芯片表面上的任何未占据活化位点。注射不同浓度的H460-16-2，(hu)ARH460-16-2变体I或(hu)ARH460-16-2变体2。为了后继注射再生传感器芯片表面通过以50微升/分钟的流速注射IOmM甘氨酸-HCl pH2.070秒实现。抗体稀释在运行缓冲液(HBS-EP+，GEHealthcare (GE 卫生保健)，Piscataway, NJ 美国，以前的 Biacore)中并以 0.67_667nM 范围内的浓度连续注射，并在每个周期之间再生表面。作为对照，也在参考表面上注射各种抗体浓度，其不使得rh⑶44固定在该表面上。利用Biacore T100评估软件1.1版，利用简单的1:1相互作用模型对获得的sensograms进行动力学分析。结合和解离常数用于计算抗体的 KD。实验利用 Biacore T100 系统(GE Healthcare (GE 卫生保健),Piscataway, NJ美国，以前的Biacore)进行。这些实验的结果关于鼠H460-16-2产生4.19 nM的数值，而发现(hu)ARH460-16-2 变体 HV1/KV1 和(hu) ARH460-16-2 变体 HV2/KV1 的 KD 分别为 6.32和3.17nM(图25)。这些结果说明所有抗体具有处于纳摩尔范围内的KD，且人源化抗体的亲和性类似于母体鼠H460-16-2的亲和性。还将结合常数(Ka)和解离常数(Kd)列表(图25)。
实施例11分离竞争性结合剂给定抗体，本领域普通技术人员可以产生竞争性抑制CDMAB，例如竞争性抗体，其是一种识别相同表位的抗体(Belanger L 等头 Clinica Chimica Acta4815_18 (1973))。一种方法需要(entails)用这样的免疫原进行免疫，所述免疫原表达被所述抗体识别的抗原。样品可以包括，但不限于，组织、分离的蛋白或细胞系。得到的杂交瘤可以使用竞争测定进行筛选，所述竞争测定是一种鉴定抑制测试抗体结合的抗体的测定，诸如ELISA，FACS或蛋白质印迹。另一种方法可以使用曬菌体展示抗体文库，和淘选(panning)识别所述抗原的至少一个表位的抗体(Rubinstein JL等年度生物化学(Anal Biochem) 314:294-300 (2003) )0在每种情形中，基于抗体置换初始标记抗体与其靶抗原的至少一个表位的结合的能力，选择抗体。因此，这样的抗体将如初始抗体一样具有识别抗原的至少一个表位的特征。
实施例12克隆H460-16-2单克隆抗体的可变区以前确定了来自由H460-16-2杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体的重链(Vh)和轻链的可变区序列(如S.N.11/364，013中所公开)。为了生成嵌合和人源化IgG，可以将可变轻和司变重结构域亚克隆到合适的载体中表达(如以上实施例9中所公开)。在另一个实施方案中，H460-16-2或其去免疫的、嵌合的或人源化的形式通过在转基因动物中表达编码所述抗体的核酸产生，从而表达并司以回收抗体。例如，抗体可以以促进回收和纯化的组织特异性方式表达。在一个该实施方案中，本发明的抗体表达在乳腺中，从而在哺乳期过程中分泌。转基因动物包括但不仅限于小鼠、山羊和兔。(i)单克隆抗体使用常规方法容易地分离并测序编码单克隆抗体(如以上实施例9中所公开)的DNA(例如，通过使用能够特异性结合编码所述单克隆抗体重链和轻链的基因的寡核昔酸探针)。杂交瘤细胞作为这样的DNA的优选来源。一旦分离，所述DNA可以置于表达载体内，然后将其转染到不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞中，如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或骨髓瘤细胞中，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。也可以修饰所述DNA，例如，通过人重链和轻链恒定结构域编码序列取代替换同源鼠序列。也可以使用合成蛋白质化学中的已知方法，包括涉及交联剂的那些方法，体外制备嵌合抗体或杂交抗体。例如，可以使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键构建免疫毒素。用于这一目的的适当试剂的实例包括亚氨基硫羟酸盐(iminothiolate)和甲基_4_巯基 butyrimidate。(ii)人源化抗体人源化抗体具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为“引入”的残基，其典型地来自“引入的”可变结构域。司以通过Winter及合作者的方法用啮齿类CDRs或CDR序列取代相对应的人抗体序列进行人源化(Jones等，自然(Nature) 321:522-525(1986) ;Riechmann 等，自然(Nature) 332:323-327(1988)；Verhoeyen 等，科学(Science) 239:1534-1536 (1988);在 Clark,今日免疫学(hmmunol.Today) 21:397-402(2000)中的综述)。
可以通过使用母体和人源化序列的三维模型分析母体序列和多种概念人源化产物的方法而制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是本领域技术人员可获得的和熟悉的。图解和展示所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序是可获得的。这些展示的观察允许分析残基在所述候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即，分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。以这种方式，可以从共有和引入序列中选择FR残基且组合FR残基，以便获得需要的抗体特征，如对靶抗原增加的亲和性。通常，⑶R残基直接且最显著地(most substantially)参与影响抗原结合。(iii)抗体片段已经开发了生产抗体片段的各种技术。这些片段可以通过重组宿主细胞产生(综述于 Hudson,现代免疫学观点(Curr.0pin.1mmunol.) 11:548-557 (1999) ；Little 等，今日免疫学(Immunol.Today) 21:364-370 (2000))。例如，Fab，-SH片段可以直接从大肠杆菌回收，并且化学偶联以形成F(ab’)2片段(Carter等，生物技术(Biotechnology)IO:163-167(1992))。在另一个实施方案中，使用亮氨酸拉链GCN4促进F(ab’)2分子的组装而形成F(ab’)2。根据另一种方法，可以直接从重组宿主细胞培养物分离Fv，Fab或F(ab’ )2片段。
实施例13包括本发明的抗体的组合物本发明抗体可以用作预防/治疗癌症的组合物。所述包括本发明抗体的用于预防/治疗癌症的组合物可以作为它们采用液体制剂的形式施用，或作为适用于人或哺乳动物(例如，大鼠、兔、绵羊、猪、牛、猫、犬、猿猴、等等)的制剂的药物组合物□服或肠胃外(例如，静脉内、腹膜内、皮下、等等)施用。本发明抗体可以以本身施用，或可以作为适当的组合物施用。用于所述施用的组合物可以包含药用载体，和本发明抗体或其盐，稀释剂或赋形剂。这样的组合物以适于口服或肠胃外施用的药物制剂的形式提供。用于肠胃外施用的组合物的实例是可注射制剂、栓剂等。可注射制剂可以包括这样的剂型，诸如静脉内、皮下、皮内和肌内注射，滴注，关节内注射等等。这些可注别制剂可以通过公知方法制备。例如，可注射制剂可以通过将本发明抗体或其盐溶解、混悬或乳化在常规用于注射的无菌水性介质或油性介质中而制备。对于水性注射介质，存在如生理盐水，含有葡萄糖和其他辅助试剂的等渗溶液等，其可以与适当的增溶剂如醇(例如乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂(例如，聚山梨酸酯80，HC0-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50 moIs)加合物))等组合使用。对于油性介质，使用例如芝麻油、大豆油等，其可以与增溶剂如苯甲酸苄酯、苯甲醇等组合使用。这样制备的注射剂通常装在适当的安瓿中。用于直肠施用的栓剂可以通过将本发明抗体或其盐与常规用于栓剂的基质混合而制备。用于口服施用的组合物包括固体或液体制剂，具体为片剂(包括糖衣和薄膜包被的片剂)，丸剂、粒剂、粉末制剂、胶囊(包括软胶囊)、糖浆、乳液、混悬液等。这样的组合物通过公知方法制备，并且可以包含常规用在药物制剂领域中的媒介物(vehicle)、稀释剂或赋形剂(excipient)。用于片剂的媒介物(vehicle)或赋形剂(excipient)的实例包括乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸镁等。有利地，将上述用于口服或肠胃外应用的组合物制备成适于符合活性成分剂量的单位剂量的药物制剂。所述单位剂量制剂包括，例如，片剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓿)、栓齐U、等等。所包含的前述化合物的量通常为5-500mg/剂量单位形式；优选地特别是在注射液形式中含有约5-约IOOmg的上述抗体，并且对于其他形式含有10-250mg的上述抗体。前述包括本发明抗体的预防性/治疗性药剂或调节剂的剂量可以取决于下列各项而不同:被施用的受试者，目的疾病，病症，施用途径等等。例如，当用于治疗/预防目的时，例如，治疗/预防成年人中的乳腺癌时，有利地以约0.01-约20mg/kg体重、优选地约
0.1-约10mg/kg体重且更优选地约0.1-约5mg/kg体重的剂量静脉内施用本发明的抗体，约1-5次/天，优选约1-3次/天。在其他肠胃外和口服施用中，所述药剂可以以与上述剂量相对应的剂量施用。当病症特别严重时，可以依据病症增加剂量。本发明抗体可以以其自身或以适当组合物的形式施用。用于施用的组合物可以包含药用载体与前述抗体或其盐，稀释剂或赋形剂。这样的组合物以适于口服或肠胃外施用(例如，血管内注射、皮下注射等)的药物制剂的形式提供。上述每种组合物还可以包含其他活性成分。此外，本发明抗体可以与其他药剂联合使用，所述其他药剂例如烷基化试剂(例如，环磷酰胺，异环磷酰胺(ifosfamide),等)，代谢拮抗剂(例如，甲氨喋呤，5_氟尿喃啶，等)，抗肿瘤抗生素 (例如，丝裂霉素，阿霉素，等)，植物来源的抗肿瘤药(例如，长春新碱，长春地辛，泰素，等)，顺钼，卡钼，依托泊苷，伊立替康，等。本发明抗体和上述药物可以同时或以交错的次数施用给患者。本文中所述的治疗方法，特别是对于癌症的，也可以同施用其他抗体或化疗剂进行。例如，也可以施用针对EGFR的抗体，诸如ERBITUX (西妥昔单抗(cetuximab))，特别是当治疗结肠癌时。ERBITUX 还显示出有效治疗银屑病。其他组合使用的抗体包括Herceptin (曲妥单抗)(特别是当治疗乳腺癌时)，AVASTINk (特别是当治疗结肠癌时)，和SGN-15 (特别是当治疗非-小细胞肺癌时)。施用本发明的抗体和其他抗体/化疗剂可以同时，或者分别，通过相同或不同的途径进行。使用的化疗剂/其他抗体方案包括认为最佳适合于治疗患者病症的任何方案。不同的恶性肿瘤可以需要使用特异性抗-肿瘤抗体和特异性化疗剂，所述特异性抗-肿瘤抗体和特异性化疗剂应该基于具体患者确定。在本发明的优选实施方案中，化学治疗与抗体治疗同时，或更优选地，化学治疗在抗体治疗后施用。然而，应该强调的是，本发明不局限于任何具体的施药方法或途径。证据的优势表明H460-16-2、(ch)ARH460-16-2_IgG2 和(ch)ARH460-16-2_IgGl通过与⑶44上存在的表位连接而介导抗癌作用。以前还显示，(如在S.N.10/647，818，现在的美国专利7，189，397中公开地)H460-16-2抗体可以用于从表达细胞诸如MDA-MB-231细胞免疫沉淀关联抗原。此外，司以表明，H460-16-2，(ch)ARH460-16-2-1gG2, (ch)ARH460-16-2-1gGl, (ch) ARH460-16-2 (VKOVHO)或人源化变体，(hu)ARH460-16_2 可以用于检测表达与其特异性结合的⑶44抗原部分的细胞和/或组织；这使用所示的但不限于FACS、细胞ELISA或IHC的技术。如用H460-16-2抗体，其他抗⑶44抗体司以用于免疫沉淀和分离⑶44抗原的其他形式，且抗原也司以用于利用相同类型的测定抑制那些抗体与表达该抗原的细胞或组织的结合。SEQ ID NOs
权利要求
1.特异性结合人CD44的人源化抗体，其中所述单克隆抗体包括SEQIDNO:7的重链可变区氨基酸序列；和选自SEQ ID NO:8的轻链可变区氨基酸序列； 或其人⑶44结合片段。
2.有效治疗人肿瘤的组合物，包括处于组合形式的: 权利要求1的人源化抗体或人CD44结合片段； 所述抗体或其抗原结合片段与选自由细胞毒性部分、酶、放射性化合物、细胞因子、干扰素、靶标或报告部分和造血细胞组成的组中的成员的缀合物；和 需要量的药用载体； 其中所述组合物有效治疗所述人肿瘤。
3.有效治疗人肿瘤的组合物，包括处于组合形式的: 权利要求1的人源化抗体或人CD44结合片段；和需要量的药用载体； 其中所述组合物有效治疗所述人肿瘤。
4.有效治疗人肿瘤的组合物，包括处于组合形式的: 权利要求1的人源化抗体或人CD44结合片段与选自由细胞毒性部分、酶、放射性化合物、细胞因子、干扰素、靶标或报告部分和造血细胞组成的组中的成员的缀合物；和 需要量的药用载体； 其中所述组合物有效治疗所述人肿瘤。
5.用于检测人癌性肿瘤存在的测试试剂盒，其中所述人癌性肿瘤表达特异性结合权利要求I的人源化抗体或人CD44结合片段的抗原的至少一个表位，所述片段的特征在于竞争抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力，所述试剂盒包括权利要求1的人源化抗体或人CD44结合片段，和用于检测所述单克隆抗体或其片段是否结合多肽的工具，所述多肽以特定截断水平的存在诊断所述人癌性肿瘤的存在。
6.有效导致哺乳动物肿瘤负荷减少的量的权利要求1的人源化抗体或人CD44结合片段在制备用于在哺乳动物中减少人肿瘤的药物中的应用，其中所述人肿瘤表达特异性结合权利要求1的人源化抗体或人CD44结合片段的抗原的至少一个表位，其中所述片段的特征在于竞争抑制所述人源化抗体与其靶抗原结合的能力。
7.权利要求6的应用，其中所述人源化抗体与细胞毒性部分缀合。
8.权利要求7的应用，其中所述细胞毒性部分是放射性同位素。
9.权利要求6的应用，其中所述人源化抗体或其片段激活补体。
10.权利要求6的应用，其中所述人源化抗体或其片段介导抗体依赖性细胞毒作用。
11.有效导致哺乳动物肿瘤负荷减少的量的权利要求1的人源化抗体或人CD44结合片段在制备用于在哺乳动物中减少易受抗体诱导的细胞毒作用影响的人肿瘤的药物中的应用，其中所述人肿瘤表达特异性结合权利要求1的人源化抗体或人CD44结合片段的抗原的至少一个表位，其中所述片段的特征在于竞争抑制所述人源化抗体与其靶抗原结合的能力。
12.权利要求11的应用，其中所述人源化抗体与细胞毒性部分缀合。
13.权利要求12的应用，其中所述细胞毒性部分是放射性同位素。
14.权利要求11 的应用，其中所述人源化抗体或其片段激活补体。
15.权利要求11的应用，其中所述人源化抗体或其片段介导抗体依赖性细胞毒作用。
16.有效导致哺乳动物肿瘤负荷减少的量的权利要求1的人源化抗体或人CD44结合片段和至少一种化疗剂在制备用于在哺乳动物中减少人肿瘤的试剂盒中的应用，其中所述人肿瘤表达特异性结合权利要求1的人源化抗体或人CD44结合片段的抗原的至少一个表位，其中所述片段的特征在于竞争抑制所述人源化抗体与其靶抗原结合的能力。
17.权利要求16的应用，其中所述人源化抗体与细胞毒性部分缀合。
18.权利要求17的应用，其中所述细胞毒性部分是放射性同位素。
19.权利要求16的应用，其中所述人源化抗体或其片段激活补体。
20.权利要求16的应用，其中所述人源化抗体或其片段介导抗体依赖性细胞毒作用。
21.有效导致哺乳动物的人肿瘤负荷减少的量的权利要求1的人源化抗体或人CD44结合片段在制备用于减少人肿瘤负荷的药物中的应用，其中所述人肿瘤表达特异性结合权利要求I的人源化抗体或人CD44结合片段的抗原的至少一个表位，其中所述片段的特征在于竞争抑制所述人源化抗体与其靶抗原结合的能力。
22.权利要求21的应用，其中所述人源化抗体与细胞毒性部分缀合。
23.权利要求22的应用，其中所述细胞毒性部分是放射性同位素。
24.权利要求21的应用，其中所述人源化抗体或其片段激活补体。
25.权利要求21的应用，其中所述人源化抗体或其片段介导抗体依赖性细胞毒作用。
26.有效导致哺乳动物的人肿瘤负荷减少的量的权利要求1的人源化抗体或人CD44结合片段和至少一种化疗剂在制备用于减少人肿瘤负荷的试剂盒中的应用，其中所述人肿瘤表达特异性结合权利要 求1的人源化抗体或人CD44结合片段的抗原的至少一个表位，其中所述片段的特征在于竞争抑制所述人源化抗体与其靶抗原结合的能力。
27.权利要求26的应用，其中所述人源化抗体与细胞毒性部分缀合。
28.权利要求27的应用，其中所述细胞毒性部分是放射性同位素。
29.权利要求26的应用，其中所述人源化抗体或其片段激活补体。
30.权利要求26的应用，其中所述人源化抗体或其片段介导抗体依赖性细胞毒作用。
31.至少一种权利要求1的人源化抗体或人CD44结合片段在制备用于减少人肿瘤的药物中的应用，所述肿瘤表达与所述人源化抗体或其片段特异性结合的人CD44抗原的至少一个表位， 其中所述至少一种人源化抗体或其片段用于施用给患有所述人肿瘤的个体， 其中所述一个或多个表位的结合导致肿瘤负荷的减少。
32.至少一种权利要求1的人源化抗体或人CD44结合片段联合至少一种化疗剂在制备用于减少人肿瘤的试剂盒中的应用，所述肿瘤表达与所述人源化抗体或其片段特异性结合的人CD44抗原的至少一个表位，其中所述至少一种人源化抗体或其片段联合至少一种化疗剂用于向患有所述人肿瘤的个体施用， 其中所述施用导致肿瘤负荷的减少。
33.至少一种权利要求1的人源化抗体或人CD44结合片段在制备用于确定被所述人源化抗体或其片段特异性结合的选自人肿瘤的组织样品中癌细胞的存在的诊断剂中的应用， 其中至少一种所述人源化抗体或其片段用于与来自所述人肿瘤的组织样品相接触以确定所述至少一种提供的抗体或其片段与所述组织样品的结合； 由此指示所述癌性细胞在所述组织样品中的存在。
34.权利要求1的人源化抗体或人CD44结合片段在制备用于确定表达被所述人源化抗体或其片段特异性识别的CD44的细胞的存在的诊断剂中的应用，其中所述人源化抗体或其片段用于与细胞样品相接触以确定所述人源化抗体或其片段与所述细胞样品的结合； 由此确定表达被所述人源化抗体或所述其片段特异性结合的CD44的抗原的细胞的存在。
35.至少一种权利要求1的人源化抗体或人CD44结合片段在制备用于确定特异性结合所述人源化抗体或其片段的灵长类动物组织样品中细胞存在的诊断剂中的应用， 其中至少一种所述提供的抗体或其片段用于与来自所述灵长类动物的组织样品相接触以确定所述至少一种提供的抗体或其片段与所述组织样品的结合； 由此指示所述组织样品中存在所述癌细胞。
36.权利要求1的人源化抗体或人CD44结合片段在制备用于减少癌细胞生长和存活的药物中的应用，所述癌细胞在细胞表面上表达CD44的至少一个表位，所述至少一个表位，在与所述人源化抗体或由 所述人源化抗体产生的片段结合时，导致细胞毒作用，其中所述人源化抗体或片段用于接触所述癌细胞，由此细胞毒性作为所述人源化抗体或所述其片段与所述⑶44的至少一个表位结合的结果发生。
37.权利要求36的应用，其中所述人源化抗体与细胞毒性部分缀合。
38.权利要求37的应用，其中所述细胞毒性部分是放射性同位素。
39.权利要求36的应用，其中所述人源化抗体激活补体。
40.权利要求36的应用，其中所述人源化抗体介导细胞毒作用。
41.权利要求1的人源化抗体或人CD44结合片段在制备用于减少癌细胞生长和存活的药物中的应用，所述癌细胞在细胞表面上表达CD44的至少一个表位，所述至少一个表位，在与所述人源化抗体或其片段结合时，导致细胞毒作用， 所述人源化抗体或所述片段用于与所述癌细胞相接触， 由此细胞毒性作为所述人源化抗体或所述片段与所述CD44的至少一个表位结合的结果发生。
42.有效导致哺乳动物肿瘤负荷减少的量的特异性结合人CD44的人源化抗体或其人CD44结合片段在制备用于在哺乳动物中减少人肿瘤的药物中的应用， 其中所述单克隆抗体包括SEQ ID NO:9的重链可变区氨基酸序列；和选自SEQ ID NO:8的轻链可变区氨基酸序列； 其中所述人肿瘤表达特异性结合权利要求1的人源化抗体或人CD44结合片段的抗原的至少一个表位，其中所述片段的特征在于竞争抑制所述人源化抗体与其靶抗原结合的能力。
43.权利要求42的应用，其中所述人源化抗体与细胞毒性部分缀合。
44.权利要求43的应用，其中所述细胞毒性部分是放射性同位素。
45.权利要求42的应用，其中所述人源化抗体或其片段激活补体。
46.权利要求42的应用，其中所述人源化抗体或其片段介导抗体依赖性细胞毒作用。
47.有效导致哺乳动物肿瘤负荷减少的量的特异性结合人CD44的人源化抗体或其人CD44结合片段在制备用于在哺乳动物中减少易受抗体诱导的细胞毒作用影响的人肿瘤的药物中的应用，其中所述单克隆抗体包括SEQ ID NO:9的重链可变区氨基酸序列；和选自SEQ ID NO:8的轻链可变区氨基酸序列； 其中所述人肿瘤表达特异性结合权利要求1的人源化抗体或人CD44结合片段的抗原的至少一个表位，其中所述片段的特征在于竞争抑制所述人源化抗体与其靶抗原结合的能力。
48.权利要求47的应用，其中所述人源化抗体与细胞毒性部分缀合。
49.权利要求48的应用，其中所述细胞毒性部分是放射性同位素。
50.权利要求47的应用，其中所述人源化抗体或其片段激活补体。
51.权利要求47的应用，其中所述人源化抗体或其片段介导抗体依赖性细胞毒作用。
52.有效导致哺乳动物肿瘤负荷减少的量的特异性结合人CD44的人源化抗体或其人CD44结合片段和至少一种化疗剂在制备用于在哺乳动物中减少人肿瘤的试剂盒中的应用， 其中所述单克隆抗体包括SEQ ID NO:9的重链可变区氨基酸序列；和选自SEQ ID NO:8的轻链可变区氨基酸序列； 其中所述人肿瘤表达特异性结合权利要求1的人源化抗体或人CD44结合片段的抗原的至少一个表位，其中所述片段的特征在于竞争抑制所述人源化抗体与其靶抗原结合的能力。
53.权利要求52的应用，其中所述人源化抗体与细胞毒性部分缀合。
54.权利要求53的应用，其中所述细胞毒性部分是放射性同位素。
55.权利要求52的应用，其中所述人源化抗体或其片段激活补体。
56.权利要求52的应用，其中所述人源化抗体或其片段介导抗体依赖性细胞毒作用。
57.有效导致哺乳动物的人肿瘤负荷减少的量的特异性结合人CD44的人源化抗体或其人CD44结合片段在制备用于减少人肿瘤负荷的药物中的应用， 其中所述单克隆抗体包括SEQ ID NO:9的重链可变区氮基酸序列；和选自SEQ ID NO:8的轻链可变区氮基酸序列； 其中所述人肿瘤表达特异性结合权利要求1的人源化抗体或人CD44结合片段的抗原的至少一个表位，其中所述片段的特征在于竞争抑制所述人源化抗体与其靶抗原结合的能力。
58.权利要求57的应用，其中所述人源化抗体与细胞毒性部分缀合。
59.权利要求58的应用，其中所述细胞毒性部分是放射性同位素。
60.权利要求57的应用，其中所述人源化抗体或其片段激活补体。
61.权利要求57的应用，其中所述人源化抗体或其片段介导抗体依赖性细胞毒作用。
62.有效导致哺乳动物的人肿瘤负荷减少的量的特异性结合人CD44的人源化抗体或其人CD44结合片段和至少一种化疗剂在制备用于减少人肿瘤负荷的试剂盒中的应用， 其中所述单克隆抗体包括SEQ ID NO:9的重链可变区氨基酸序列；和选自SEQ ID NO:8的轻链可变区氨基酸序列； 其中所述人肿瘤表达特异性结合权利要求1的人源化抗体或人CD44结合片段的抗原的至少一个表位，其中所述片段的特征在于竞争抑制所述人源化抗体与其靶抗原结合的能力。
63.权利要求62的应用，其中所述人源化抗体与细胞毒性部分缀合。
64.权利要求63的应用，其中所述细胞毒性部分是放射性同位素。
65.权利要求62的应用，其中所述人源化抗体或其片段激活补体。
66.权利要求62的应用，其中所述人源化抗体或其片段介导抗体依赖性细胞毒作用。
67.至少一种特异性结合人CD44的人源化抗体或其人CD44结合片段在制备用于减少人肿瘤的药物中的应用，所述肿瘤表达与所述人源化抗体或其片段特异性结合的人CD44抗原的至少一个表位， 其中所述单克隆抗体包括SEQ ID NO:9的重链可变区氨基酸序列；和选自SEQ ID NO:8的轻链可变区氨基酸序列； 其中所述至少一种人源化抗体或其片段用于施用给患有所述人肿瘤的个体， 其中所述一个或多个表位的结合导致肿瘤负荷的减少。
68.至少一种特异性结合人CD44的人源化抗体或其人CD44结合片段联合至少一种化疗剂在制备用于减少人肿瘤的试剂盒中的应用，所述肿瘤表达与所述人源化抗体或其片段特异性结合的人CD44抗原的至少一个表位， 其中所述单克隆抗体包括SEQ ID NO:9的重链可变区氨基酸序列；和选自SEQ ID NO:8的轻链可变区氨基酸序列； 其中所述至少一种人源化抗体或其片段联合至少一种化疗剂用于向患有所述人肿瘤的个体施用， 其中所述施用导致肿瘤负 荷的减少。
69.有效治疗人肿瘤的组合物，包括处于组合形式的: 人源化抗体或其人CD44结合片段； 所述抗体或其抗原结合片段与选自由细胞毒性部分、酶、放射性化合物、细胞因子、干扰素、靶标或报告部分和造血细胞组成的组中的成员的缀合物；和需要量的药用载体； 其中所述组合物有效治疗所述人肿瘤， 其中所述抗体包括SEQ ID NO:9的重链可变区氨基酸序列；和选自SEQ ID NO:8的轻链可变区氨基酸序列。
70.有效治疗人肿瘤的组合物，包括处于组合形式的: 人源化抗体或其人CD44结合片段和需要量的药用载体； 其中所述组合物有效治疗所述人肿瘤， 其中所述抗体包括SEQ ID NO:9的重链可变区氨基酸序列；和选自SEQ ID NO:8的轻链可变区氨基酸序列。
71.有效治疗人肿瘤的组合物，包括处于组合形式的: 人源化抗体或其人CD44结合片段与选自由细胞毒性部分、酶、放射性化合物、细胞因子、干扰素、靶标或报告部分和造血细胞组成的组中的成员的缀合物；和需要量的药用载体； 其中所述组合物有效治疗所述人肿瘤， 其中所述抗体包括SEQ ID NO:9的重链可变区氨基酸序列；和选自SEQ ID NO:8的轻链可变区氨基酸序列。
全文摘要
CD44，即单链透明质酸(HA)结合糖蛋白，其表达在多种正常组织、全部造血细胞和若干癌症组织中。针对来自杂交瘤H460-16-2的CD44的单克隆抗体，以前显示为是减轻癌性疾病的抗体(CDMAB)，在癌症模型包括前列腺癌和乳腺癌中通过细胞毒性抑制肿瘤生长和减小肿瘤负荷，所述杂交瘤H460-16-2以保藏号PTA-4621保藏在ATCC中。还分离和测序了该单克隆抗体的可变区，从而制备具有比该单克隆抗体提高的抗癌活性的嵌合抗体。现在制备与母体PTA-4621单克隆抗体具有相似CD44结合活性的人源化抗体。所述单克隆、嵌合和人源化抗体可以与毒素、酶、放射性化合物、细胞因子、干扰素、靶标或报告部分和造血细胞缀合，从而治疗癌症。这些抗体还用在结合测定中以确定CD44在细胞上的表达。
文档编号A61K39/395GK103204934SQ20131002994
公开日2013年7月17日 申请日期2008年5月23日 优先权日2007年5月30日
发明者戴维·S·F·杨, 海伦·P·芬德利, 苏珊·E·哈恩, 莉萨·M·切凯托, 福尔图娜塔·麦康基 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司